INFORME FINAL PASANTÍA
MICROORGANISMOS PROMISORIOS FIJADORES DE NITRÓGENO,
MOVILIZADORES DE FOSFORO Y POTASIO PARA LA FORMULACIÓN DE
UN BIOINSUMO DE USO AGRÍCOLA
Presentado por:
DANIELA ALEJANDRA FARFÁN RAMOS COD: 20132085291
Presentado a:
ANGELA MARIA WILCHES FLOREZ
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
TECNOLOGÍA EN SANEAMIENTO AMBIENTAL
BOGOTÁ D.C
2017
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Contenido.
Resumen .............................................................................................................................................. 3
Introducción. ....................................................................................................................................... 4
1. Objetivos. .................................................................................................................................... 5
1.1. Objetivo general. ................................................................................................................. 5
1.2. Objetivos específicos. .......................................................................................................... 5
2. Contextualización de la empresa. ............................................................................................... 6
3. Actividades ejecutadas. ............................................................................................................... 6
3.1. Fase 1. Aislamiento de las bacterias nativas de las muestras del suelo. ............................ 6
3.2. Fase 2. Diseño experimental in vitro. .................................................................................. 7
3.2.1. Modelo experimental Diseño Completamente Aleatorizado DCA. ............................ 7
3.2.2. Prueba de hipótesis. .................................................................................................... 8
4. Resultados. .................................................................................................................................. 9
4.1. Fase 1................................................................................................................................... 9
4.1.1. Siembra en placa superficial, agar NFB (Nitrogen Free Broth) y agar SPS. ................. 9
4.1.2. Identificación preliminar (pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®)............................. 10
4.1.3. Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento en Agar sangre, Agar
MacConkey y Agar King A. ......................................................................................................... 10
4.2. Fase 2................................................................................................................................. 12
4.2.1. Ejecución de la fase experimental. ............................................................................ 12
4.2.2. Métodos analíticos. ................................................................................................... 12
4.2.3. Prueba de hipótesis. .................................................................................................. 13
5. Conclusiones.............................................................................................................................. 15
6. Evaluación de la pasantía y recomendaciones. ......................................................................... 16
ANEXOS. ............................................................................................................................................ 17
BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................... 26
3
RESUMEN
TITULO: Microorganismos promisorios fijadores de nitrógeno, movilizadores de
fosforo y potasio para la formulación de un bioinsumo de uso agrícola.
RESUMEN: El uso de insumos químicos sintéticos como fertilizantes y plaguicidas
son importantes para el incremento de la productividad agrícola, sin embargo su
empleo excesivo puede afectar negativamente el ambiente. Una alternativa
favorable son los bioinsumos formulados a partir de microrganismos o extractos
vegetales. Con el objetivo de identificar posibles microorganismos viables en la
formulación de un bioinsumo fertilizante, se aislaron bacterias nativas no patógenas
de los suelos de cultivo con capacidad fijadora de nitrógeno N, y movilizadora de
fósforo P y potasio K; tres cepas seleccionadas se emplearon en experimentación
in vitro basada en el Diseño estadístico Completamente Aleatorizado DCA con
seguimiento semanal durante dos meses, midiendo las concentraciones de N, P, y
K en los suelos inoculados. Para determinar estadísticamente la fijación /
movilización de los nutrientes a los suelos por parte de las bacterias se implementó
un Análisis de Varianza ANOVA empleando el paquete estadístico IBM SPS
Statistics ®.
PALABRAS CLAVE: Bioinsumo, bacterias, nutrientes, suelo.
ABSTRACT: The use of synthetic-chemical compounds such as fertilizers and
pesticides are important to crop productivity increment, however its excessive use
will affect the soil and water environments negatively. A favorable alternative are the
use of microorganisms or plan extracts also known as bioinputs. In order to identify
viable microorganisms in the formulation of a biofertilizer, nitrogen-fixing,
phosphorus mobilization and potassium solubilization bacteria were isolated from
cropland soil with. From the pool of isolated bacteria, three strains were selected
and tested in vitro, based on the Fully Randomized Statistical Design RSD. Weekly
monitoring was performed during two months, measuring the concentrations of N,
P, and K in the inoculated soils. To determine the amount of nutrients bounded to
the soil by the bacteria`s metabolism, a variance analysis (ANOVA) was
implemented using the IBM SPS Statistics ® package.
KEY WORDS: Bioinput, bacteria, nutrients, soil.
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INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos han sido utilizados en la solución de varios problemas
agrícolas con un éxito considerable, sin embargo es necesario que éstos cumplan
con ciertas características como la no patogenicidad o fitotoxicidad para que puedan
ser usados en la agricultura como sustitutos de fertilizantes y pesticidas sintéticos.
Los bioinsumos ofrecen una alternativa a los agroquímicos que pueden afectar
negativamente el ambiente. Para el desarrollo de bioinsumos se parte de la
identificación del problema a solucionar, para posteriormente plantear posibles
alternativas a nivel de laboratorio y finalmente, extrapolar los resultados del
laboratorio a campo.
La microbiota edáfica interactúa en la calidad del suelo, el crecimiento y la
productividad de las plantas. Algunos microorganismos benéficos son fijadores y
movilizadores de nutrientes (nitrógeno, fósforo y potasio), y antagonistas de
fitopatógenos en plantas y en suelos, características que los hacen promisorios
como principio activo en la formulación de bioinsumos (Higa, 2013).
Según la NTC 1927 (2001) existen tres tipos de producción de bioinsumos: (i)
Entomopatógenos, microorganismos utilizados para controlar insectos-plaga en los
cultivos como los hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, (ii)
fertilizantes como las micorrizas, y (iii) biocontroladores, bacterias u hongos
utilizados para el control de microorganismos que causan enfermedades en cultivos
como por ejemplo el hongo Trichoderma harzianum.
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1. OBJETIVOS.
1.1. Objetivo general.
Identificar bacterias nativas de suelos de cultivo fijadoras de nitrógeno,
movilizadoras de fósforo y potasio promisorias para su uso en bioinsumos agrícolas.
1.2. Objetivos específicos.
1. Recuperar y aislar bacterias nativas a partir de suelos de cultivo de papa, que
presenten características de fijación / movilización de nutrientes (nitrógeno, fósforo
y potasio).
2. Determinar la fijación / movilización de nitrógeno, fósforo y potasio, por parte
de tres cepas seleccionadas, mediante la implementación de un diseño
experimental in vitro.
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2. CONTEXTUALIZACIÓN DE LA EMPRESA.
Maquisapa SAS., es una empresa que busca soluciones a problemas ambientales,
sociales y económicos, por medio de la investigación aplicada y el desarrollo
experimental. Otras actividades anexas comprenden procesos de saneamiento
básico rural, diseño y construcción de plantas de tratamiento de agua residuales
para pequeños núcleos descentralizados, formulación de bioinsumos para uso
agrícola empleando microorganismos autóctonos de alta eficiencia. También
desarrollan protocolos y asesorías en la transición de cultivos convencionales hacia
la agricultura orgánica.
3. ACTIVIDADES EJECUTADAS.
3.1. Fase 1. Aislamiento de las bacterias nativas de las muestras del suelo.
Las muestras de las cuales se aislaron las bacterias fueron proporcionadas por el
equipo técnico de investigación de MAQUISAPA SAS, obtenidas de suelos de
cultivo convencional de papa ubicados en la Vereda El Curubital perteneciente a la
localidad 20 – Sumapaz, D.C.
Las actividades específicas ejecutadas en esta fase fueron:
Preparación de agares selectivos y el material necesario para el
aislamiento de las bacterias. Medios selectivos empleados: NFB (Nitrogen
Free Broth) y Agar SPS CONDA para el aislamiento de bacterias
solubilizadoras de fosfato inorgánico
Dilución en serie y siembra en placa superficial en los medios selectivos.
(Anexo 1)
Lectura Macroscópica de las Unidades Formadoras de Colonia UFC.
Tinción de Gram y observación microscópica. (Anexo 2)
Identificación preliminar con pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®.
Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento, en Agar sangre,
Agar MacConkey y Agar King A (Anexo 3)
Tinción de Gram. Verificación aislamiento.
El procedimiento de repique de las UFC y tinción de Gram se repitió hasta
verificar que las bacterias estuvieran completamente aisladas y puras.
Una vez aisladas las bacterias, fueron identificadas molecularmente en
laboratorio externo. (Actividades no correspondientes a la pasantía).
7
Repique en tubo con caldo nutritivo de las UFC aisladas e identificadas
para su conservación.
3.2. Fase 2. Diseño experimental in vitro.
3.2.1. Modelo experimental Diseño Completamente Aleatorizado DCA.
Este diseño consiste en la asignación de los tratamientos de forma aleatoria a las
unidades experimentales, siendo estas lo más homogéneas posibles, minimizando
así la magnitud del error experimental (Díaz, 2009). En la tabla 1 se encuentran las
variables empleadas en el modelo experimental.
Tabla 1. Variables modelo experimental DCA.
Variable Descripción
Unidades experimentales Cajas plásticas de 20 x 15 cm, cada una
con 500 g de suelo estéril
Tratamientos. 4 Pseudomonas fluorescens (A)
Bacillus subtilis (B)
Pseudomonas aeruginosa (C)
Testigo o control (D)
Repeticiones 3 por cada tratamiento
Duración del ensayo 2 meses
Fuente: Autor.
Actividades específicas:
Inoculación de las cepas en las unidades experimentales, concentraciones
según evaluación del equipo de investigación técnico. (Anexo 4)
Toma de muestras de suelo semanales (seis en total), de cada unidad
experimental, 5 gramos aproximadamente. (Anexo 5)
Pre tratamiento de las muestras de suelo. (Anexo 5)
Métodos analíticos empleados:
o Nitrógeno amoniacal - Kjeldahl procedimiento de Bremner (1965) (Anexo
6)
o Fósforo real - Bray II (Boschetti, 2003)– lectura por espectrofotometría UV
(Anexo 7)
o Potasio en suelo, extracción Bray II, cuantificación por espectrofotometría
de absorción atómica. (Campos, 1994) (Anexo 8)
8
3.2.2. Prueba de hipótesis.
Para la obtención del Análisis de Varianza ANOVA y poder comprobar las hipótesis
experimentales propuestas (tabla 2) se utilizó el Software IBM SPSS Statistics ®.
Tabla 2. Hipótesis experimentales planteadas.
H0 No hay fijación – movilización de N, P, K por parte de los tratamientos (Pseudomonas
fluorescens, P aeruginosa, Bacillus subtilis)
H1 Hay fijación – movilización de N, P, K por parte de al menos uno de los tratamientos (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Bacillus subtilis)
Fuente: Maquisapa SAS
El ANOVA se usó para la comparación del conjunto de resultados obtenidos durante
las mediciones de las concentraciones del N, P y K en los suelos de las unidades
experimentales, y probar las hipótesis usando un nivel de significancia α = 0,05 -
confianza del 95%.
Adicionalmente se realizó la prueba Tukey para la comparación estadística entre las
medias de las varianzas de los tratamientos (cepas bacterianas empleadas) y
determinar cuál o cuáles de los tratamientos presentan mejor fijación – movilización
de los nutrientes.
9
4. RESULTADOS.
4.1. Fase 1.
4.1.1. Siembra en placa superficial, agar NFB (Nitrogen Free Broth) y agar SPS.
Se observó crecimiento de 2 UFC en el agar NFB identificadas con los números 1 y
2, y en el agar SPS 5 UFC identificadas con los números del 3 al 7. Las
características macroscópicas y microscópicas de estos microorganismos se
muestran en la tabla 3.
Tabla 3. Características macroscópicas y microscópicas de los microorganismos.
ID - Colonia Morfología Macroscópica Morfología Microscópica
(1 )Agar NFB Colonias de medianas a grandes
y convexas, forma circular y
aspecto granular
Gram (+). Forma de bacilo
medianos, forman cadenas
por pares.
(2) Agar NFB Colonias grandes y planas, forma
irregular, bordes lobulados, color
blancuzco.
Gram (+). Forma de bacilo
grande y grueso forman
cadenas, presentan
esporas centrales.
(3) Agar SPS colonias medianas y brillantes,
borde continuo y ondulado con un
centro opaco
Gram (-). Forma de bacilo
corto, sueltos, no forman
esporas.
(4) Agar SPS Colonias medianas, forma
circular, borde un poco ondulado,
Gram (-). Forma de bacilo
corto, sueltos, no forman
esporas.
(5) Agar SPS Colonias pequeñas a medianas,
forma circular con borde liso,
blanco cremosas
Forma de bacilo corto,
Gram (-), sueltos, no
forman esporas.
(6) Agar SPS Colonias medianas y brillantes,
con forma irregular , bordes
ondulados
Gram (-). Forma de bacilo
corto, sueltos, no forman
esporas.
(7) Agar SPS Colonias grandes, con forma
irregular , bordes ondulados, con
brillo un poco metálico
Gram (-). Forma de bacilo
pequeño, sueltos, no
forman esporas.
Fuente: Autor.
10
4.1.2. Identificación preliminar (pruebas bioquímicas kit BBL Crystal®).
En las pruebas bioquímicas realizadas con el kit BBL Crystal® se obtuvo como
resultado la identificación de los siete microorganismos previamente aislados los
cuales se relacionan en la tabla 4.
Tabla 4. Identificación pruebas bioquímicas kit BBL Crystal
ID Nombre %
Probabilidad ID Nombre
%
Probabilidad
1 Bacillus brevis 94,5 5 Pseudomonas putida 99,5
2 Bacillus subtilis 93,9 6 Erwinia sp 95,6
3 Pseudomonas
fluorescens 99,0 7
Pseudomonas
aeruginosa 94,8
4 Aeromonas spp 98,5
Fuente: Autor.
4.1.3. Selección y repique de las UFC, siembra por agotamiento en Agar sangre,
Agar MacConkey y Agar King A.
De los anteriores microorganismos se seleccionaron tres los cuales corresponden
a los ID 2, 3 y 7 por presentar características de fijación – movilización de nutrientes
(nitrógeno, fósforo y potasio) según bibliografía. Estos fueron sembrados en Agar
sangre, Agar MacConkey y Agar King A, para corroborar su tipificación antes de
enviar las muestras al laboratorio externo para identificación molecular. Los
resultados de los crecimientos se resumen en la tabla 5.
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Tabla 5. Característica de las cepas en Agar sangre, Agar MacConkey y Agar King A
Medio De Cultivo Bacillus subtilis Pseudomonas
aeruginosa
Pseudomonas
fluorescens
Agar sangre Colonias grandes
planas, con
pigmentación
amarilla, beta-
hemolíticas.
Colonias
esparcidas y
planas con brillo
metálico,
pigmentación
verde azulada
beta – hemolíticas.
Colonias
pequeñas y
esparcidas con
brillo metálico
verdoso. Beta-
hemolíticas.
Agar MacConKey
No presenta
crecimiento.
Crecimiento. No
fermentadoras de
lactosa.
Crecimiento. No
fermentadoras de
lactosa.
Agar King A No presenta
crecimiento.
Crecimiento.
Pigmentación
verde - azulado en
luz UV.
Crecimiento.
Pigmentación
verde en luz UV.
Fuente: Autor.
En la identificación molecular se comprobó el género y especie de las tres bacterias
seleccionadas, las cuales correspondientes a Pseudomonas fluorescens, Bacillus
subtilis, y Pseudomonas aeruginosa; presentadas en la figura 1.
Figura 1. Crecimiento en agar tripticasa de soya TSA, previo inoculación en unidades
experimentales.
A - Pseudomonas fluorescens; B Bacillus subtilis; C – Pseudomonas aeruginosa. Fuente: Autor.
12
4.2. Fase 2.
4.2.1. Ejecución de la fase experimental.
Se realizó la implementación del diseño experimental in vitro DCA donde se
inocularon las tres cepas seleccionadas. De las 12 unidades experimentales se
tomaron muestras de suelo semanalmente (figura 2), para los posteriores análisis
químicos en donde se determinó la fijación de nitrógeno, movilización de fósforo y
potasio.
Figura 2. Muestreos de las unidades experimentales
Fuente: Autor
4.2.2. Métodos analíticos.
Resultado de la determinación semanal de N, P y K se obtuvieron los resultados
paramétricos presentados en el anexo 9. Teniendo en cuenta que no fue posible
concluir con la totalidad de los análisis de N y P, faltando los análisis de las últimas
muestras, se realizó un arreglo estadístico según el método de valores faltantes
(Gómez et al, 2006) con el que se solucionó el problema de la carencia de datos
sustituyéndolos por los valores estimados a partir de la información suministrada
por la muestra. Con lo anterior se completó la base de datos (anexo 9), insumo para
el ANOVA.
13
4.2.3. Prueba de hipótesis.
Los resultados del ANOVA para un nivel de significancia α=0.05 y confianza del
95%, se muestran en la Tabla 6.
Tabla 6. Análisis de varianza ANOVA para la base de datos.
Tratamientos
Suma De
Cuadrados Gl
Media
Cuadrática F P Valor
Potasio Entre grupos 17,187 3 5,729 6,100 ,004
Dentro de
grupos 18,785 20 ,939
Total 35,972 23
Fosforo Entre grupos 31,553 3 10,518 5,584 ,006
Dentro de
grupos 37,671 20 1,884
Total 69,223 23
Nitrógeno Entre grupos ,315 3 ,105 11,903 ,000
Dentro de
grupos ,176 20 ,009
Total ,491 23
Salida Software IBM SPSS ®. Fuente: Autor
Según la sentencia: P valor ≤ α; se rechaza H0. En todos los casos se rechaza la Ho,
encontrando que hay evidencia estadística para concluir que hay fijación -
movilización de los nutrientes nitrógeno, fósforo y potasio por parte de al menos un
tratamiento implementado (Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, Bacillus
subtilis).
Para realizar la comparación estadística entre tratamientos se utilizó la prueba de
Tukey. La tabla 7 presenta los resultados del (los) tratamiento(s) que presentó o
presentaron mejor fijación - movilización de nutriente(s) con respecto a los
tratamientos restantes.
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Tabla 7. Comparaciones múltiples por medo del método Tukey
Variable
Dependiente
Tratamiento P Valor
Potasio (1)
P fluorescens
(2) P aeruginosa ,033
(3) B subtilis ,507
(2)
P aeruginosa
(1) P fluorescens ,033
(3) B subtilis ,411
(3)
B subtilis
(1) P fluorescens ,507
(2) P aeruginosa ,411
Fosforo (1)
P fluorescens
(2) P aeruginosa ,009
(3) B subtilis ,018
(2)
P aeruginosa
(1) P fluorescens ,009
(3) B subtilis ,990
(3)
B subtilis
(1) P fluorescens ,018
(2) P aeruginosa ,990
Nitrógeno (1)
P fluorescens
(2) P aeruginosa 1,000
(3) B subtilis ,001
(2)
P aeruginosa
(1) P fluorescens 1,000
(3) B subtilis ,000
(3)
B subtilis
(1) P fluorescens ,001
(2) P aeruginosa ,000
Fuente: Autor
Se encontró evidencia estadística que verifica que las cepas P. fluorescens y P.
aeruginosa movilizan potasio en suelos; siendo P. fluorescens la cepa que presentó
mayor capacidad de movilización de este nutriente. Las cepas Pseudomonas spp y
B. subtilis demostraron capacidad de movilizar fósforo, siendo la cepa P. fluorescens
la que presentó mayor capacidad de movilización de ese nutriente. Por último las
cepas Pseudomonas spp y B. subtilis presentaron fijación de nitrógeno, siendo B.
subtilis la cepa con mayor capacidad de fijación de este nutriente.
Lo anterior se corrobora con Velázquez & Ramos (2015) quienes afirman que
Pseudomonas spp solubilizan fósforo y potasio, y las cepas Bacillus sp, son
fijadoras de nitrógeno.
15
5. CONCLUSIONES.
Se recuperaron siete cepas bacterianas a partir de las muestras de suelo de cultivo
de papa. De las anteriores se aislaron e identificaron tres bacterias nativas
correspondientes a Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas
aeruginosa, promisorias en el uso para la formulación de un bioinsumo de uso
agrícola empleado como fertilizante de suelos.
De las cepas empleadas en la experimentación se encontraron evidencias
estadísticas para concluir que hay mayor incremento de nitrógeno en suelos por
parte de la bacteria Bacillus subtilis, en tanto Pseudomonas fluorescens presentó
mayor movilización - solubilización de potasio y fósforo en suelos.
Con los resultados obtenidos durante la fase de recuperación e identificación (fase
1) y la fase 2 netamente experimental, se demuestra que es posible obtener
microrganismos con capacidad de fijación - movilización de nutrientes como
nitrógeno, fosforo y potasio, viables en la formulación de un bioinsumo para uso
agrícola.
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6. EVALUACIÓN DE LA PASANTÍA Y RECOMENDACIONES.
Teniendo en cuenta el cumplimiento de los objetivos planteados, a pesar de los
inconvenientes ocurridos por el cierre del laboratorio a final de año, se logró la
culminación total de los objetivos propuestos de manera satisfactoria.
Resultado de la pasantía se puede destacar:
Adquisición de nuevos conocimientos de carácter técnico en laboratorio de
microbiología y química.
Sincronía entre el pasante y el director interno durante las diferentes fases
del proyecto.
Cumplimiento de la pasante frente las responsabilidades asignadas por la
empresa.
La empresa Maquisapa SAS., acompañó el proceso y suministró los
elementos necesarios para llevar a cabo la pasantía.
Se recomienda plantear el cronograma con margen de tiempo, previendo posibles
percances logísticos como el cierre temporal del laboratorio en donde se ejecutaron
la mayoría de las actividades planteadas en la pasantía.
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ANEXOS.
ANEXO 1
Dilución en serie - Siembra en placa superficial en los medios selectivos. (Camacho,
2009)
DILUCIÓN EN SERIE Y
SIEMBRA EN PLACA
Preparar la muestra y 4 tubos con
9mL de la solución diluyente.
Homogeneizar un ped (aproximadamente
un gramo de suelo) de la muestra en 9mL
de la solución diluyente.
Homogeneizar un mL de la dilución
anterior en 9mL de la dilución diluyente
Repetir el procedimiento hasta completar 4 diluciones
(siempre tomado un mL de la dilución anterior
Preparar las cajas de Petri con los medios selectivos, dos cajas
con agar NBF (Nitrogen Free Broth) y dos cajas con agar SPS
Verter 0,5 mL de la última dilución en cada una de las cajas,
homogeneizar con asa drigalski hasta que la superficie este seca
Incubar las cajas en posición invertida a 30°C
durante 24 horas
Solución diluyente, Agua peptonada:
Disolver 10g de peptona y 5g de cloruro
de sodio en un litro de agua destilada,
esterilizar en autoclave a 121°C durante
15 minutos.
18
ANEXO 2
Tinción de Gram (Rodríguez, 2005).
19
ANEXO 3
Siembra por agotamiento, en NFB y SPS (Negroni, M. 2000).
Se toma el inóculo que se desea sembrar en el medio de cultivo selectivo, con el
asa microbiológica este se esparce en forma de estría, a medida que se realizan
estas estrías las bacterias pasan del asa al medio en un número menor, como se
muestra en la figura 3. Se incuban a 30°C durante 24 h
Figura 1. Siembra por agotamiento.
Fuente: Negroni, M. 2000.
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ANEXO 4
Preparación del biológico para la inoculación. (Burguet, 2012)
PREPARACIÓN DEL BIOLÓGICO
PARA LA INOCULACIÓN
Preparación medios de cultivo: Caldo Triptona de
Soya (CTS) y Agar triptona de soya (TSA)
Inocular 1 o 2 UFC en el CTS y agitar en Vortex durante 45
segundos
Tomar 20 uL del CTS y distribuir en la superficie del TSA
Incubar a 35°C durante 24 horas
Colectar ¼ del crecimiento de la placa con un asa estéril en un
Erlenmeyer con 100 mililitros de CTS
Incubar a 37°C, 170 rpm durante 2 horas
Con un atomizador estéril esparcir el contenido del
Erlenmeyer en las unidades experimentales
Las concentraciones son de
acuerdo a la evaluación del
equipo de investigación
técnico.
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ANEXO 5
Toma de muestras de suelo para los análisis químicos, 5 gramos aproximadamente.
(NTC, 3656)
Pre tratamiento del suelo. Para los análisis químicos (NTC – ISO, 11464)
22
ANEXO 6
Análisis químico, Nitrógeno amoniacal - Kjeldahl (Bremner, 1965)
DIGESTIÓN
Pesar 0.25 g de suelo pre tratado / poner en matraz
Kjeldahl
Adicionar 2 g de mezcla catalizadores (3)
Adicionar 5 mL H2SO4 concentrado
Calentar a temperatura media hasta que la mezcla
se torne clara. Regular temperatura para que los
vapores se condensen.
SOLUCIONES
SL- (1) ACIDO BORICO + INDICADOR:20 g H2BO3 en 750 mL agua.
Calentar para completa disoluciónDejar enfriar y adicionar 20 mL de
mezcla indicadores
* el pH debe ser 5, corregir con NaOH 0.1 N (sl. 2) hasta obtener color púrpura
Completar el volumen a 1L agua destilada
MEZCLA DE INDICADORES:* 0.099 g verde bromocresol
* 0.066 g rojo metiloEn 100 mL alcohol etílico al 96%
SL- (2) HIDRÓXIDO DE SODIO 0.1 N :4 g de NaOH en agua destilada hasta 1 L
(3) MEZCLA CATALIZADORES:62.5 Sulfato de potasio (KSO4) y 6.25 g
sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4*5H2O)
Homogenizar con mortero
SL- (4) HIDRÓXIDO DE SODIO 10 N:200 g de NaOH en agua previamente
hervida y fría, aforar a 500 mL
SL- (5) ACIDO SULFÚRICO 0.01 N:0.28 mL de H2SO4 en 1 L
*Concentración estandarizada con la solución valorada de Carbonato de sodio
SL- (6) SL. VALORADA DE CARBONATO DE SODIO:
0.25 g NaCO3 (seco a 105°C / 2H) disolver y aforar a 50 mL
SL- (7) NARANJA DE METILO:0.1 g naranja de metilo en 100 mL de
agua
VALORACIÓN NORMALIDAD ACIDO SULFÚRICO 0.01 N
* Tomar 3 alícuotas de 10 mL de la sl. (6)
* Agregar 5 o 6 gotas de la sl. (7)* Titular con la sl. (5)
* Calcular la normalidad real sustituyendo:
N H2SO4 = (0.050 g / 53) * (1/ ẋ mL gastados en las 3 alícuotas)
Hervir la muestra por una hora / apagar / dejar
enfriar
DESTILACIÓN
Añadir al digerido frio 25 mL agua destilada /
mezclar vigorosamente
Transferir a Erlenmeyer de 500 mL. Poner 6 perlas
ebullición
Adicionar 3 granallas de zinc y 15 mL Sl. (4)
sosteniendo el Erlenmeyer inclinado para que el NaOH vaya al fondo
Poner a la salida del destilador un vaso de 50 mL con 10 mL de la sl. (1)
Destilar hasta obtener 20 mL en el vaso de 50 mL
TITULACION
Titular con la sl. (5) hasta que vire de verde a rosado
fuerte
Blanco: ídem pero sin muestra de suelo.
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ANEXO 7
Análisis químico fósforo real - Bray II (Boschetti, 2003), lectura por
espectrofotometría UV
Sl. Oxidante de Molibdato (3):
100 mL Sl. Molibdato (1)150 mL Sl. HsSO4 5 M (2)
Completar a 500 mL
Sl. Molibdato de amonio (1).
12.5 g Molibdato de amonio en 100 mL
agua destilada.
Sol. Ácido sulfúrico 5 M (2)
49.04 mL H2SO4 completar a 100 mL con agua destilada
Conservar en frasco ámbar cerrado
Sl. Reductora (4):1 gr ácido ascórbico
100 mL agua destilada
Sl. Patrón Fosfato de sodio dihidrogeno (5):
1 gr NaHaPO4En 100 mL agua destilada
Soluciones patrón (6):2 ppm = 2 mL Sl. (5)
1.5 ppm = 1.5 mL Sl. (5) 1 ppm = 1 mL Sl. (5)
0.5 ppm = 0.5 mL Sl. (5)0.2 ppm = 0.2 mL Sl. (5)0.1 ppm = 0.1 mL Sl. (5)
Completar 100 mL agua destilada.
LECTURA:Absorbancia 660 nm
VER PRETRATAMIENTO DE MUESTRAS DE SUELO.
1.425 g de suelo10 mL Sl. (3)
Agitar durante 40´´
ANALITO:9 mL de sl. patrón (6) ó agua destilada (blanco)
5 mL Sl. (4)3 mL Sl. (5)
Filtrar inmediatamente a través papel filtro
Tomar 1 mL del extractoMezclar con 9 mL Sl. (4)
Esperar 15 ´
DETERMINACIÓN FOSFORO EN SUELOS
(McKean, 1993)
24
ANEXO 8
Análisis químico potasio en suelo, extracción Bray II, cuantificación
espectrofotometría de absorción atómica. (Campos, 1994)
EXTRACCIÓN
2.85 g de suelo pretratadoadicionar 20 mL sl. (1)
Agitar durante 40 segundos
SOLUCIONES
Sl. (1) Bray II:* 1.11 g NH4F en 16.64 mL de HCl 6 M* Completar a 1 L con agua destilada
Sl.HCl 6 M:218.7 mL HCl completando a 1 L
con agua destilada
Filtrar inmediatamente con papel filtro
Determinación de potasio en el extracto por EMISIÓN
LECTURA
(2) SOLUCIÓN ESTÁNDAR 100 ppm K:0.1907 g KCl (seco a 105°C / 2 h)
Aforar a 1 L con Sl NaHCO3 pH 8.5
Sl NaHCO3 0.5 M pH 8.5:* 42.04 g NaHCO3 en 800 mL agua
destilada* Mezclar hasta disolución
completa* Ajustar pH a 8.5 con NaOH 1 M
* Aforar a 1 L(almacenar en polietileno)
Sl NaOH 1 M: 40.816 g NaOH en 1 litro agua
destilada; sí la pureza es del 98% (40g/0.98)
Espectrofotómetro de Absorción Atómica:
* 766.5 longitud de onda * SLIT: 2.0
* Llama: aire acetileno* Tiempo de lectura 1 segundo
Lectura en meq 100 g-1
SOLUCIONES DE TRABAJO (curva)A partir de la Sl. (2) tomar alícuotas de
0, 1 , 2, 5, 10 y 20 mL y completar a 250 mL de agua
(quedarán estándares de 0, 2, 4, 10, 20 y 40 ppm)
25
ANEXO 9
Base de datos análisis químicos, con arreglo estadístico valores faltantes.
Tratamiento Muestreo Análisis Químicos (ppm)
Potasio (K) Fosforo (P) Nitrógeno (N)
Pseudomonas fluorescens(1)
1
13,59 10,87 0,078
Pseudomonas aeruginosa(2) 13,26 11,07 0,079
Bacillus subtilis(3) 14,01 10,35 0,079
Testigos(4) 12,98 10,38 0,078
Pseudomonas fluorescens(1)
2
13,69 11,98 0,078
Pseudomonas aeruginosa(2) 13,66 10,25 0,078
Bacillus subtilis(3) 14,03 10,38 0,258
Testigos(4) 12,83 10,65 0,080
Pseudomonas fluorescens(1)
3
13,39 11,89 0,080
Pseudomonas aeruginosa(2) 13,06 10,99 0,081
Bacillus subtilis(3) 13,99 09,38 0,250
Testigos(4) 12,56 10,58 0,080
Pseudomonas fluorescens(1)
4
14,58 12,06 0,089
Pseudomonas aeruginosa(2) 13,33 09,65 0,069
Bacillus subtilis(3) 13,55 11,05 0,359
Testigos(4) 12,03 10,33 0,079
Pseudomonas fluorescens(1)
5
15,98 13,58 0,076
Pseudomonas aeruginosa(2) 12,89 09,45 0,066
Bacillus subtilis(3) 13,44 10,58 0,560
Testigos(4) 11,53 11,01 0,078
Pseudomonas fluorescens(1)
6
15,04 18,01 0,075
Pseudomonas aeruginosa(2) 10,03 09,89 0,089
Bacillus subtilis(3) 12,51 10,99 0,550
Testigos(4) 11,03 10,95 0,075
Fuente: Autor
26
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