Importancia de la Calidad Genetica
en Animales de Laboratorio
GENETIC SCIENCES & COMPLIANCE
ANA V. PEREZ, Ph.D.
Objetivos de la Presentacion-1ra Parte
© TACONIC BIOSCIENCES 2
• Quien es Taconic
• Que es Calidad Genetica
• Por que es importante la calidad Genetica
en animales de laboratorio
• Animales geneticamente modificados como
modelo animal de enfermedades humanas
• Ejemplos de generacion de modelos
geneticamente modificados
– Tecnicas Usadas
• Lider Mundial en roedores de laboratorio y servicios cientificos - 60 years en 2012
• Proveedor Global de ratas y ratones de alta calidad con el mismo perfil genetico, fenotipico y de salud
• Lider Mundial en generar ratones geneticamente modificados
• Lider Mundial en producir camadas de animales geneticamente modificados para estudios de investigacion
Taconic Biosciences
3
Historia-Taconic Biosciences
© TACONIC BIOSCIENCES 4
• Fundada en 1952
• Primer Productor comercial de animales de laboratorio que obtuvo acreditacion AALAC-1969
• Primer Productor Commercial que implemento la Barrera de aislamiento en 1981 para mantener los animales de laboratorio con los mas altos niveles de Bioseguridad
• Proveedor de servicios de crianza a pedidos del cientifico investigador desde 1995
• Adquisicion de nuestra subsidiaria en Colonia, Alemania 2007– Lider en diseno y generacion de animales rodeores geneticamente modificados
Taconic Biosciences
• Compania Privada – >600 empleados mundialmente
– Produciion de mas de 200,000 cajas
– AAALACi, ISO 9001+ ISO 14001
(TacBio-DK+ TacBio DE)
• Expertos Cientificos – Veterinarios certificados, Microbiologos, Biologos
Moleculares, Embriologos, Genetistas, Patologo veterinario, Biologo Celular
• Clientes – Companias Framaceuticas, Companias de
Biotecnologia, Universidades, y Organizaciones Gubernamentales
5
Albany, NY
Hudson, NY
Germantown, NY
Cambridge City, IN
Oxnard, CA
Ejby, Denmark
Bomholt, Denmark
Borup, Denmark
Laven, Denmark
Cologne, Germany
Tokyo, Japan
Chungbuk, South Korea
Gyeonggi-do, South Korea
Centros, Singapore
Taconic Biosciences Distribuidores
Presencia Global
Hyderabad, India
Importancia de la Calidad
Genetica
Pureza
Validez
Reproducibilidad
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Calidad Genetica
“Scientists go to tremendous lengths to ensure that reagents are pure and the glassware is clean. They should pay equal attention to the purity of the animals they use.”
- Festing Lab Animal 1974
“In animal research validity and reproducibility are critically influenced by three important variables: genetic background, physical environment, microbial status…”
- Lab An Sci 1998
“Do scientists, veterinarians, animal care personnel and facility managers know that the specific strains of research animals they develop, use, care for and house are genetically sound and truly representative of their assumed genotype or genetic background?”
- Mam Genome 2013 (ICLAS)
Ratones y Ratas Consanguineos o
Endogamicos
• Apareamiento hermano x hermana por 20
generaciones
• Todos los genes alelos son homozygotos
• No hay segregacion de genes de manera que la siguiente generacion es equivalente a la anterior
• Cada cepa es aproximadamente copia multiple de un solo individuo. Cada cepa tiene caracteristicas definidas
– C57BL/6, FVB, 129S6, etc
Colonias Heterogeneas –
Apareamientos No consanguineos
• Outbred Stocks • Maxima variedad genetica
– Tamano deseables, pesos, fecundidad, etc.
– A veces se desarrolla el fenotipo not observado en una cepa consanguinea
– Permite el mantenimiento de mutaciones que produce un efecto severo en cepas consanguineas
• Maxima heterogeneidad por alelo – Segregacion de alelos
– Pequenas colonias de exogmicos se tienen que reemplazar frecuentemente
– Derivaciones pueden ocacionar deriva genica
– Monitoreo genetico consiste en chequear la frecuencia de alelos*
Inbred Genetic Background
C57BL/6NTac
aaBBCCDDPP
129S6/SvEvTac
AwAwBBCCDDPP DBA/2JBomTac
aabbCCddPP
A/a = Agouti locus (a; Chr 2) (banded black/yellow [A] vs. black [a] vs. white-bellied [Aw])
B/b = brown locus (Tyrp1; Chr 4) (black vs. brown pigment)
C/c = albino locus (Tyr; Chr 7) (pigment vs. no pigment)
D/d = dilute locus (Myo5a; Chr 9) (intense pigment vs. diluted pigment)
P/p = pinked-eyed dilution locus (p; Chr 7)
Cual es el Color de Fenotipo que estos
genotipos representan
C57BL/6NTac
Genotipo aaBBCCDDPP
Fenotipo BLACK
129S6/SvEvTac
Genotipo AwAwBBCCDDPP
Fenotipo AGOUTI
DBA/2JBomTac
Genotipo aabbCCddPP
Fenotipo DILUTE BROWN
Open Field Activity (first exposure)
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
129P
3/J
129S
1/S
vlm
J
129S
6/S
vE
vT
ac
129T
2/S
vE
msJ
129X
1/S
vJ
A/J
CrT
ac
B6129F
1T
ac
BA
LB
/cA
nN
Tac
C3H
/HeN
Tac
C57B
L/6
J
C57B
L/6
NT
ac
DB
A/2
NT
ac
FV
B/N
Tac
NO
D/M
rKT
ac
SJL
/JC
rNT
ac
M
F
Tota
l D
ista
nce (
cm
)
Taconic -G. Bothe et al. 2005
Nomenclatura
B6.SJL-Ptprca/BoyAiTac
Inbred
Partner Donador
Linea
Congenica
Gen de
Interes
Subcepa
Por que la Integridad Genetica es
importante?
1
4
Impuridades geneticas o Deriva Genica
pueden arruinar un estudio costando
innecesario tiempo y dinero…..y tu ni te das
cuenta
Que es Monitoreo Genetico?
• Monitoreo Genetico es un programa de pruebas geneticas establecido como manera de verificar que la produccion de animales es de la cepa deseada y del genotipo correcto
• Monitoreo Genetico en Taconic es ejecutado de una de las
siguientes maneras dependiendo del modelo animal – Verificacion del genotipo-verificar la presencia de la mutacion deseada
– Verificacion de la Cepa
– Observando o ensayando el fenotipo
Cual es
el raton
C3H?
Verificacion de Cepas – Tecnicas
usadas
• Pruebas Bioquimicas – Pruebas proteicas
• ADN de Microsatelite
• Polimorfismo de Nucleotido – Single Nucleotide
Polymorphisms or SNPs
Genetic Markers from Tissue Proteins-
“Biochemical Polymorphisms”
Jorde et al, 1995
“Medical Genetics”
Genetic Markers from Tissue Proteins-
“Biochemical Polymorphisms”
Electric field
+
-
Historically, RTI has tested 19 such proteins from blood and kidney for mice
Panel de Marcadores Geneticos-
Bioquimicos
b a a b b a b b a ? b d a a c b b a s DBA/1JBom
a a a b a a a b b a b d b b c b b a s CBA/JBom
b a a b b a b b a a b s a b c b b b s SJL/JCrNTac
b a a b b a b b b a a d a b c b b a s NZM/AegTac
b a a b b a a b b a a s a b c a b a s NOD/MrkTac
b a a b b a a b a b a d b b c a b b s FVB/NTac
b a a b b a b b a a b d a b c b b b s DBA/2NTac
b a a b b a b b a a a d b b c b b b s C3H/HeNTac
b a a b b b a a b a a s b a a a a a f C57BL/6NTac
b a a b a a a a a a a d a b a a b b s BALB/cAnNTac
b a a b a a a b a a a d a b c a b b s A/JCrTac
b a a b b a b b a a a d c a c b b a s 129S6/SvEvTac
Strain
Tr
f
Sod
1
Pn
p
Mpi
1 Gus-s
Gg
c Pgm1
Pep
c Mod1 Ldr1
Idh
1
Hb
b Gpi1
H6p
d Es3
E
s
d
Es
1
Car
2 Acy1 Marker
ADN y Cromosomas
…TGCTAGCTGTACGTACTGAC…..
Jorde et al, 1995
“Medical Genetics”
Encoded information for
a specific function
Specific PCR
primers based on
known gene
sequence
PCR-Reaccion en Cadena de
Polimerasa
© TACONIC BIOSCIENCES 21
Microsatelite de ADN
• ADN microsatelites – Segments cortos de DNA con una sequencis repetitiva
– La longitud de la sequencia repetitiva varia de cepa a cepa
– Es un poco inestable con una tasa de mutacion un poco alta
– Presenta problemas de ensayo cuando se amplifica, presenta
problemas tecnicos
– Es dificil de correr un ensayo con cientos de muestras
Marcadores Geneticos- Microsatelite
de ADN
Polimorfismos de Nucleotidos
• Single Nucleotide Polymorphisms or SNPs
– Son variaciones en la secuencia del ADN que ocurre cuando un unico nucleotido es alterado (A,T,C,or G) en el genoma
– Es mas estable que los microsatelites
– Se pueden correr muestras en el orden de los miles
AAGGCTAA to
ACGGCTAA
– Un Panel de SNPs nos permite diferenciar claramente las cepas
Caracterizacion del Fondo
Genetico
Name Chr 129S6 C57BL/6NTac 1 2 3 4 5 7 8 9
Index1245 16 BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB
Index1246 16 AA BB BB BB BB AB BB AB BB BB
Index1247 16 AA BB BB BB BB BB BB BB BB BB
Index1248 16 AA BB BB BB BB BB BB BB BB BB
Index1249 16 AA BB BB BB BB BB BB BB BB BB
Index1250 16 AA BB BB AB BB AB BB AB BB AB
Index1251 16 BB AA AA AB AA AB AA AB AA AB
Index1252 16 BB BB BB BB BB BB BB BB BB BB
Index1253 16 BB AA AA AA AA AA AA AA AA AA
Index1254 16 AA BB BB AB BB AB BB AB BB AB
Index1255 17 BB AA AA AA AA AA AA AA AA AA
Que es Deriva Genica?
• Es un Proceso Natural que es el resultado de la
replicacion de ADN
• Es la acumulacion de mutaciones espontaneas
en un organismo a lo largo del tiempo
• Deriva Genica se puede fijar en una colonia de
ratones/ratas inadvertidamente
26
Como Evitar la Deriva Genica
• Con Criopreservacion – Proteccion del ADN
– Reduccion de riesgo
– Extension de la vida
Reproductiva de la colonia
• Con Recuperacion de cepas congeladas – Refresco de la colonia
– Obtener nuevo Stock
27
Objetivos de la Presentacion- 2da Parte
© TACONIC BIOSCIENCES 28
• El rol de los animales geneticamente modificados
• Importancia del origin del modelo – Como se genero?
• Ejemplos del uso de modelos animales
• Modelos de raton humanizados
Historia de Modelos Animals- Raton
© TACONIC BIOSCIENCES 29
• Modelos animales como vehiculos de modelos de enfermedades humanas
• Modelos animales para encontrar la medicina-curacion apropiada en humanos
• Modelos Animales para entender el mecanismo biologico/metabolico de la enfermedad humana
• Modelos animales para usarlos como vehiculos de produccion de reactivos
Modelo de Obesidad
© TACONIC BIOSCIENCES 30
• En 1950 se publico el primer modelo animal de
obesidad en raton
– Mutacion genetica recesiva espontanea
– No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion
– Los adultos obesos son esteriles
• En 1995 se publico la mutacion
– La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula
el metabolismo de tejidos
Modelo Lepob de obesidad
© TACONIC BIOSCIENCES 31
• Regulacion del metabolismo de tejidos perifericos y funcion de la leptina
• Secrecion y Accion de la Leptina
Cual es el origen del Modelo animal
Geneticamente modificado que tiene?
© TACONIC BIOSCIENCES 32
• Inyecciones Pronucleares
• Recombinacion Homologa
• Modelos de gen editacion-CRISPR
Biologia del Desarrollo
© TACONIC BIOSCIENCES 33
• En 1950 se publico el primer modelo animal de obesidad en raton – Mutacion genetica recesiva espontanea
– No se sabe cual es el gen responsable de la mutacion
– Los adultos obesos son esteriles
• En 1995 se publico la mutacion – La mutacion trunca la molecula de Leptina que regula el metabolismo de tejidos
Origen de Modelos Animales
Geneticamente Modificados
© TACONIC BIOSCIENCES 34
• En los anos 1960s, Brinster desarrollo el sistema de cultivo in
vitro de embriones de raton
• En los 1970, Brinster empezo a injectar celulas de
teratocarcinomas dentro del blastocisto y obtuvo ratones
chimera
• En los 1980 Brinster and Palmiter hicieron experimentos para
introdujendo ADN en huevos fertilizados de raton y este AND
se incorpora este en el genoma del raton
• En 1985-Smithies, Bradley, Capecchi lograron generar
mutaciones por recombinacion homologa
Injecciones Pronucleares
© TACONIC BIOSCIENCES 35
Characteristicas del Animal Transgenico
© TACONIC BIOSCIENCES 36
• Insercion del ADN en el genoma es al azar
• Integracion del ADN injectado es en el mismo sitio de integracion
• Utiliza para manipular reporteros genes, sobre-expresion, exprsesion de proteinas en tejidos especificos
• Nomenclature is: Tg(Prom-YYY)#Zzz
Tg(PB-Wnt1)1Hev B6.Cg -Tg(PB-Wnt1)1Hev
Mutaciones Dirigidas de Recombinacion
Homologa
© TACONIC BIOSCIENCES 37
Caracteristicas del Raton de Mutacion
Dirigida
© TACONIC BIOSCIENCES
• La insercion del ADN en el genoma es por recombinacion homologa, hay homologia entre el ARN injectado y el gen que se quiere mutar y requiere de celulas madre embrionarias
• Es un lugar unico de insercion en el genoma
• El animal chimaera tiene 2 cepas de raton en un solo especimen (dos genomes)
• La nomenclatura es: YYYtm#Zzz
Bmp1tm1Blh B6.Cg –Bmp1tm1Blh
CRISPR-Clustered Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats
© TACONIC BIOSCIENCES 39
NHEJ HDR
Knockout by frame shift Knockin Point mutation
* * Gene/PM
Doble rotura de
cadena de ADN
SpCas9
DSB
DNA
Microinjection
Wildtype Mutant mutagenesis
sgRNA
Caracteristicas del Metodo CRISPR
© TACONIC BIOSCIENCES
• Insercion de la modificacion genetica ocurre por homologia de RNA y DNA- es inicialmente especifica
• Ocurre por reparcion de alta fidelidad o recombinacion no-
homologa del sistema de reparacion por excision
• Hay off-target integrations y variacion en la secuencia de AND en el lugar de integracion
• Se puede utilizar un huevo fertilizado o celulas madre embrionarias
• La nomenclature es: YYYem#Zzz Bmp1em1Blh B6.Cg –Bmp1em1Blh
Haoyi Wang , Hui Yang , Chikdu S. Shivalila , Meelad M. Dawlaty , Albert W. Cheng , Feng Zhang , Rudolf Jaenisch
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering
Cell, Volume 153, Issue 4, 2013, 910 - 918 http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2013.04.025
CRISPR-Cas9
Tiempo de Generacion del Modelo
Como Mantener la Calidad Genetica
Sistemas de apareamiento definidos
Mantenimiento de datos de la cepa o Stock
Monitoreo del Fondo Genetico
Verificacion del Genotipo
Evitar Deriva Genica
Cuidadoso Diseno Experimental cuando se usa animales geneticamente modificados
4
3
Diseno Experimental cuando se usan
animales geneticamente modificados
44
C57BL/6NTac-Tyrtm1Arte
• Mutante de un sola base - G a C, base 369
C57BL/6NTac-Atm1.1Arte
• Considerar el fondo genetico
•Verificar que los animales controles
del experimento son geneticamente
equivalentes
•Verificar todos los alelos presentes
• Mutante generada sacando un provirus del
genoma
© TACONIC BIOSCIENCES
Importance del Fondo Genetico cuando
se introduce una mutacion
C57BL/6NTac
aaBBCCDDPP
BLACK
Tg(APPSWE)
129S6/SvEvTac
AwAwBBCCDDPP
AGOUTI
Tg(APPSWE)
© TACONIC BIOSCIENCES
• Enfermedad de Alzheimer es un desorden cronico neurodegenerativo caracterizado:
– Disminucion progresiva del conocimiento
– Perdida de la memoria
• Acumulacion de proteina beta amyloide cracteristica importante de la patologia
• APPSWE (Apolipoproteina SWE) es el precursor de la proteina amiloide que contiene la mutacion Sueca (Swedish=SWE) que codifica una doble substitucion de aminoacidos asociada con la suceptibilidad al Alzheimer
• Este modelo no recapitula completamente la enfermedad de Alzheimer pero se usa para investigar los procesos especificos intracelulares de la enfermedad
Modelo APPSWE Transgenico
© TACONIC BIOSCIENCES
• Taconic’s colony was established by transfer of embryos resulting from breeding a hemizygous transgenic male to a C57BL/6NTac female. The resultant male progeny were bred to SJL/JcrNTac
females. The model 001349 colony is now maintained by breeding hemizygous transgenic male mice with female B6SJLF1/Tac mice.
• To generate model 002789, mice from Founder Line 2576 were backcrossed sixteen generations (N16) to 129S6. Taconic received stock in September 2003.
• The mice were derived by embryo transfer and are maintained by backcrossing hemizygous male mice with 129S6/SvEvTac female mice.
…cont Origin of APPSWE Model
© TACONIC BIOSCIENCES
• Early and progressive accumulation of beta amyloid and development
of plaques
• Behavioral deficits that correlate with degree of amyloid deposition
• Neuritic dystrophy and altered synaptic efficacy of plaque-associated
neurons
• No evidence of neuronal loss
• Expression of inflammatory mediators by plaque-associated
microglial cells and astrocytes
• Gender differences in some aspects of physiology and behavior
• Age-correlated elevation in brain levels of apoE and cholesterol
• Deposition of amyloid in cerebral blood vessel walls
Caracteristicas del Modelo APPSWE
Transgenico
© TACONIC BIOSCIENCES
Beta amyloid expression in APPSWE
© TACONIC BIOSCIENCES
Learning Problems in APPSWE
Model
© TACONIC BIOSCIENCES
• Modelo 1349 esta en un background mixto B6;SJL
• Modelo 2789 esta en la cepa 129S6
• En la cepa C57BL/6 la mutacion is letal
• Pink eyed animals, associated with certain coat colors, and the
Pde6brd1 retinal degeneration mutation can cause light sensitivity
and/or blindness in some animals. This may impact the results of
behavioral testing.
• The mixed genetic background of model 001349 can result in pink
eyed animals or homozygosity for the Pde6brd1 retinal degeneration
mutation.
• The 129S6 background of model 002789 does not carry the Pde6brd1
retinal degeneration mutation, and this strain has pigmented eyes.
Diferencias Geneticas que
dependen del Fondo Genetico
Inducible Knockouts via CreER
© TACONIC BIOSCIENCES PROPRIETARY & CONFIDENTIAL 52
Historia de Modelos de
Immunodeficiencia
• Hasta s.19 -cancer contagioso
• 1950’s and 60’s, reconocio que el sistema imunologico
tiene un rol en el cancer
• 1968 se descubre el raton desnudo– critico para
transplantes de tumor
• Raton Scid- Severe combined Immunodeficiency-
descubierto en 1983 en Fox Chase Cancer Center
Composicion del Systema
Immunologico
• Adaptive - B cells produce antibodies. When you are
sick once, your body ‘remembers’ the next time and
produces more of the specific antibody
• Innate - T cells (neutrophils and macrophages) do a lot
of the clean up of foreign matter and are non-specific
• Immunocompromised is the lack of one or both
components of the immune system
Investigacion de Cancer-Oncologia
• Xenoinjerto/transplante – Since they can not reject tissue implants, researchers can put
human tumors in them
• Tumor Take Rates – High Tumor take rates increase speed of research while
reducing number of animals needed
• Study of the infectious disease process – Scid mice
• Autoimmunity
Otros Modelos Immunodeficientes
• Roedores Desnudos – carecen de pelo
• Nude Mutation: Foxn1nu
– Atrofia del crecimiento de pelo y del desarrollo del timo
– El timo nunca es colonizado de celulas T progenitoras
– Es una proteina de union de ADN que se expresa en piel y timo
durante el desarrollo embrionario
• Varios Models – NCr nude, NMRI nude, NIH Swiss, BALB/c, Black 6
– NIH Nude Rat
Rata NIH desnuda
• Lower T cell development compared to other vendors with better take
rates (as presented by Pfizer researchers at AALAS 2008)
• Better suited for imaging studies
• Larger tumor endpoints
• Longer life
• Not always completely
‘nude’
Portafolio de Modelos de
Immunodeficiencia
• Ratones SCID –Deficientes en Celulas T y B algunos
forman anticuerpos incipientes-leaky
– Defective recombination of antigen receptor genes
– Arrest in T and B lymphocyte development
• Several Genetic Backgrounds
– C.B.-17 scid and ICR-scid
– NOD scid-reduced NK cells
– Scid-beige-NK cell deficient
Importancia del Fondo Genetico en el
Modelo SCID
• Mutacion SCID – Prkdcscid (Protein Kinase DNA activated
catalytic polypeptide)
• Endogamico – respuesta consistente
• Exogamico – resistente, animal un poco mas grande puede tolerar
tumores mas grandes
• “Leakiness” de anticuerpos dependera del fondo genetico.
Animales “Leaky” producen niveles bajos de anticuerpos no-
especificos. De menos leaky a mas leaky: Rag2
ICR/SCID
NODSC
CBSCBG
CB17SC
Modelo Rag2 KO
• Rag 2- Recombinant Activating Gene 2 – B and T lymphocytes present a highly variable region that allows
them to recognize different antigens
– This variable region is assembled by joining several genes together
– This is done by two genes Rag1 and Rag 2
• Generated Rag2 KO model
• Fail to generate mature B and T lymphocytes
Immune-Deficient Taconic
Transgenic Models™
• Rag2
– Lacks T and B cells
• Pfp
– Perforin deficient, impaired NK cell function
• Pfp/Rag2
– T, B and NK cell deficient
• Abb & β2M
– MHC class I & II deficient
• CIEA NOG mouse® – Superimmunedeficient
• Jh
– B cell deficient
• Stat1
– Immune response to alpha and
gamma interferon deficient
• Fcer1g & Fcgr2b
– FcγRIII, FcεrI, & FcγRIIβ deficient
CIEA NOG mouse®
• Do you routinely have low take rates for certain cell lines
or primary tumor types?
• Use of a model with superior engraftment rates can
result in more successful xenograft studies and reduce
your overall animal usage, as well as labor costs
© TACONIC BIOSCIENCES
• Modelo animal geneticamente modificado que expresa una proteina
humana y/o injertado celulas humanas o combinacion de estas
• Estos modelos se estan usando en varias aplicaciones:
– Candidatos de drogas
– Analysis de proteinas involucradas en metabolismo de drogas
– Sistema immunologico
– Hematopoiesis
– Enfermedades de infeccion
– Medicina regenerativa
– Cancer
Modelos Humanizados
© TACONIC BIOSCIENCES
Modelos de raton immunodeficientes
© TACONIC BIOSCIENCES
• Animales geneticamente modificados que sustituyen el gen de raton por humano
• Animales que poblan el sistema immunologico con celulas madre hematopoieticas o
celulas mononucleares de la sangre periferica humana o tejidos fetales humanos
Sistema Immunologico Humanizado
© TACONIC BIOSCIENCES PROPRIETARY & CONFIDENTIAL 67
Conclusiones
• La Calidad Genetica es critica para los estudios cientificos y su reproducibilidad
• Los Animales geneticamente modificados juegan un papel critico en la investigacion cientifica
• La ciencia esta en constante avance y mejoramiento de modelos animales
PREGUNTAS