“Identificación de la(s) hexocinasa(s) sensor(es) de
carbohidratos en maíz”
Trabajo de la estudiante de Doctorado en Ciencias Bioquímicas:
Giovanna Paulina Aguilera Alvarado
Tutora: Dra. Sobeida Sánchez Nieto
Para iniciar una investigación, hay que escoger un modelo de estudio…
Gran parte del estudio de la biología moderna se basa en el uso de ORGANISMOS MODELO.
En esencia se asume que a través del estudio detallado de un organismo en particular, se puede
obtener información suficiente que nos ayudará a entender como funcionan otros organismos.
Los organismos modelo deben:
• Ser de tamaño pequeño y fáciles de mantener en el laboratorio.
• Poseer un genoma pequeño.
• Tener un ciclo de vida relativamente corto.
doi:10.1038/nplants.2015.67, Nat Plants (2015).
Escherichia
coli
Saccharomyces
cerevisiae Caenorhabditis
elegans Arabidopsis
thaliana
¡¿Por qué las plantas?!
Las plantas son el esqueleto
de toda la vida en la tierra y
un recurso esencial para la
existencia del ser humano.
Plantas
Agua Alimento
Cambio climático
Hábitat
Aire Medicamentos
http://www.bgci.org/plantconservationday/whyplantsimportant/
Pero ¿Qué es una proteína moonligthing?
1. Una PROTEÍNA
MOONLIGHTHING es aquella
que es capaz de llevar a cabo más
de una función.
2. Muchas de estas proteínas son
enzimas, receptores, canales
iónicos o chaperonas.
3. A través de la evolución estas
enzimas adquirieron funciones no
enzimáticas secundarias por
ejemplo, la transducción de
señales, la regulación
transcripcional, de la apoptosis y
estructural.
http://www.moonlightingproteins.org/results.php?search_text=hexokinase&searching=yes&search=search
La función de la hexocinasa impacta en el metabolismo y también en la señalización
Hexocinasa
G-6P
Metabolismo
Glucólisis
Vía Pentosas
Síntesis de nucleótidos
Biosíntesis de lípidos
Biosíntesis de almidón
Vía de señalización glucolítica
Inducción:
PR1 y PR5; Transportadores nitrato; factores
transcripcionales FTZ
Cambio conformacional independiente de catálisis
Vía de señalización dependiente de HXK
Represión:
1. GENES FOTOSINTÉTICOS
2. Ciclo del glioxilato
3. Algunos transportadores
Inducción:
Factores transcripcionales MYB34, MYB51, MYB122; De respuesta a ABA RAB18
HXKs contribute to regulate the plant development
Aguilera-Alvarado P
promoting germination preventing seedling supporting vegetative growth floriation and restoring transducing senescence
establishment at high male fertility signals
Glc concentration
Se necesita mayor investigación del papel fisiológico de cada HXK para: 1. Avanzar en el entendimiento de los mecanismos de señalización en plantas y 2. Relevante para una aplicación práctica en especies agronómicamente importantes como el maíz.
Lo que se sabía en maíz…
Aguilera-Alvarado & Sánchez-Nieto PCP 2017
Predicción in silico. 1. El experimento o predicción in silico se hace con el análisis mediante un
programa de computo que puede buscar de manera específica: condiciones
experimentales, comparar secuencias, hacer predicciones como de:
localización subcelular, plegamiento de proteínas, unión de sustratos, entre
otros
2. Aunque también en la experimentación in silico se pueden realizar
simulaciones.
Functional characterization of the HXK family in maize
1. ¿los genes que se propone (putativos) codifican para
HXK de acuerdo al análisis in silico si codifican para las
HXKs?
CLONACIÓN MOLECULAR.
La clonación molecular se refiere a los procesos mediante los cuales moléculas de DNA recombinante
son producidos y transferido a un organismo hospedero en el cual serán replicadas.
https://www.neb.com/~/media/NebUs/Files/Brochures/Cloning_Tech_Guide.pdf
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
Embrión
de maíz
Se necesitaba un
molde…
24h
RNA
Transcripción
reversa
cDNA
TRIzol
5’UTR ORF 3’UTR
Mucha similitud entre HXKs
Diseño de primers
¡PCR!
Adenilación
y ligación Miles copias
del cDNA de
las HXKs de
maíz
Transformación
y secuenciación HXKs
aisladas
Clonación mediante
tecnología Gateway. Esta tecnología usa el
sistema de recombinación del
fago lamba para facilitar la
transferencia de secuencias
de DNA heterólogo
(flanqueado por los sitios att)
entre diferentes vectores. Se
basa en dos reacciones de
recombinación.
Vectores de expresión para
producción de proteína
recombinante en:
1. E. coli (His y V5)
2. Levadura (sin tag)
3. Planta (GFP)
INDUCCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE
BL21 (DE3) Codon Plus RIL (pET-DEST42 Gateway: V5, 6X His).
Inducción con IPTG
RNA pol E. coli
lacI
lacI
RNA pol T7 RNA pol T7
lacI
lacI
RNA pol T7
Gen de interés
Inducción con IPTG
pEXP42
Genoma de E. coli BL21 (DE3)
ptRNAR
ptRNAI
ptRNAL
Probar diferentes
condiciones:
o Temperatura
o Tiempo de inducción
o [IPTG]
o Cepa
o Tag
Purificación de proteínas con etiqueta de histidinas
Resina unida a Níquel Proteína con
etiqueta de Histidinas
Maize recombinant HXKs were produced in E. coli
Western Blot
Anti-V5
ZmHXK4 ZmHXK5 ZmHXK6
ZmHXK7 ZmHXK8
HXK-His tagged recombinant protein purification
Insoluble and non-active enzymes
Paulina Aguilera
Alvarado
AtHXK1
AtHXK2
OsHXK5
OsHXK6
OsHXK7
OsHXK8
ZmHXK4
ZmHXK5
ZmHXK6
ZmHXK7
ZmHXK8
ZmHXK9
MEM*
Citosol
*Membrana Externa Mitocondrial
Balasubramanian et al., Plant Physiol (2007); Cheng et al., Biol Plantarum (2011); Cho et al., Plant Physiol
(2009)
ZmHXK4, 5, 6 and 9 have an hydrophobic sequence at the N-terminal
Production and isolation of the truncated versions of recombinant maize HXKs.
ZmHXK430 ZmHXK530
ZmHXK630 ZmHXK930
Western blot
using the anti-
V5 antibody
PAGE-SDS
of His tagged
recombinant
protein
purification
MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. Existen diversas maneras de medir la actividad de una enzima: cuantificando la desaparición del sustrato o la
aparición del producto
Aquí fue mediante un ensayo acoplado a la aparición de un producto.
y = 0.1435x + 0.2075
R² = 0.9998
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 1 2 3
Ab
s 3
40n
m
Tiempo (min)
Curva temporal de actividad de HXK
Fig. 1. Saturation curves for
HXK activity using glucose as
substrate.
HXK activity of maize isoenzymes was
measured for the recombinant versions.
A) ZmHXK4Δ30, B) ZmHXK5Δ30,
C) ZmHXK6Δ30, D) ZmHXK7,
E) ZmHXK8 and F) ZmHXK9Δ30.
The reaction medium contained 2.5 µg of
purified recombinant protein, a fixed
concentration of ATP (2 mM) and Glc
concentration varied from 0.01 to 100 mM. The
data was adjusted to Michaelis-Menten
equation. The graphics were obtained with the
Origin 8.0 software.
Figure S5. Saturation curves of
HXK activity of ZmHXKΔ4-Δ6
and ZmHXKΔ9 for Fru, Man
and ATP. The effect of Fru (A, D, G, J) and
Man (B, E, H, K) in the
hexokinase activity was
determined in an assay medium
containing 2 mM ATP. To
determining the Km for ATP (C,
F, I, L) 5 mM glucose was
included in the reaction medium.
A, B, C) ZmHXKΔ4 activity; D, E,
F) ZmHXKΔ5 activity; G, H, I)
ZmHXKΔ6 activity and J, K, L)
ZmHXKΔ9 activity.
Kinetic parameters of recombinant maize hexokinases
Soluble
proteins in
full
versions
Soluble
proteins
in
truncated
versions
Incorrect protein folding?
Preferencia de sustratos
Man Glu Fru
Gene Name ID number Putative
function
HXK
activity
ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND
ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND
ZmHXK4 GRMZM2G058745 HXK Yes
ZmHXK5 GRMZM2G432801 HXK Yes
ZmHXK6 GRMZM5G856653 HXK Yes
ZmHXK7 GRMZM2G051806 HXK Yes
ZmHXK8 GRMZM2G104081 HXK Yes
ZmHXK9 GRMZM2G171373 HXK No
ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND
ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and
activity demonstrated.
Functional complementation assay
A mutation that confers
growth defects
Successful
complementation
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN:
Es decir se usa un fragmento de DNA (que se sospecha tiene una función específica)
que se usa para transformar un mutante (para la función deseada) para revertir el
fenotipo silvestre. Se utiliza para identificar la función del gen específico.
Análisis in silico de la secuencia de aminoácidos de la proteína: Alineamientos
Adenosina(425-461) G44
1 AtHXK1
AtHXK2
AtHXK3
AtHKL1
AtHKL2
AtHKL3
OsHXK1
OsHXK2
OsHXK3
OsHXK4
OsHXK5
OsHXK6
OsHXK7
OsHXK8
OsHXK9
OsHXK10
ZmHXK3a
ZmHXK3b
ZmHXK4
ZmHXK5
ZmHXK6
ZmHXK7
ZmHXK8
ZmHXK9
ZmHXK10
Gouy et al., Mol Biol Evol (2010).
Maíz
Arroz
Arabidopsis
Maíz
Arroz
Arabidopsis
AtHXK1
AtHXK2
AtHXK3
AtHKL1
AtHKL2
AtHKL3
OsHXK1
OsHXK2
OsHXK3
OsHXK4
OsHXK5
OsHXK6
OsHXK7
OsHXK8
OsHXK9
OsHXK10
ZmHXK3a
ZmHXK3b
ZmHXK4
ZmHXK5
ZmHXK6
ZmHXK7
ZmHXK8
ZmHXK9
ZmHXK10
Gene Name ID number Putative
function
HXK
activity
ZmHXK3a GRMZM2G068913 HKL ND
ZmHXK3b GRMZM2G467069 HKL ND
ZmHXK4 GRMZM2G058745 HXK Yes
ZmHXK5 GRMZM2G432801 HXK Yes
ZmHXK6 GRMZM5G856653 HXK Yes
ZmHXK7 GRMZM2G051806 HXK Yes
ZmHXK8 GRMZM2G104081 HXK Yes
ZmHXK9 GRMZM2G171373 HXK Yes
ZmHXK10 GRMZM2G046686 HKL ND
ID numbers of the maize HXK gene family, in silico assigned function and
activity demonstrated.
¿Cómo determinar que una HXK también es sensora?
ENSAYOS FARMACOLÓGICOS (análogos de Glu)
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN ARABIDOPSIS
Ensayo de complementación en A. thaliana.
¿Cómo se obtiene una mutante de A. thaliana?
MUTAGÉNESIS AL AZAR
Etil metano sulfonato (EMS): Muy mutagénico y poco letal; alquila las bases de G
provocando desapareamiento. Por otro lado, la G alquilada puede aparearse con las T
provocando una transición G/C a A/T.
Maple & Moller, Methods Mol Biol (2007); http://file.scirp.org/Html/8-3000817_48085.htm
Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).
gin2-1
A. tumefaciens
p35:ZmHXK:3HA HygR suspension
T1 Selection
medium (Hyg)
Complementation assay with the maize HXKs using A. thaliana HXK1 mutant, gin 2-1
T4
Genotype:
hxk1 deletion mutant
Phenotype:
Glu insensitive plants
Develop Green
cotyledons in the
presence of Glu
Phenotype:
Glu sensitive plants
Develop purple
cotyledons,
anthocyanin
accumulation in the
presence of Glu
Ensayo de complementación en A. thaliana.
Glu 6%
Cho et al., Plant Phys (2010); Kregten et al., Nature Plants (2016); Moore et al., Science (2003).
ZmHXK
5 Ler - 1 2 1 2
ZmHXK
4
gin2-1
2% Glc
2%
Mannitol
ZmHXK
9 Ler - 1 2 1 2
gin2-1
ZmHXK
8 Ler - 1 2 1 2
ZmHXK
7
gin2-1
ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 restored the Glu sensitivity
ZmHXK4, 5, 6, 7 and 8 seem to be a dual function
proteins
We need to have the repression of the photosynthetic genes
to probe that the HXKs are sensor proteins
ZmHX
K6
HEXOCINASA EN PLANTAS
Citosol
Núcleo
Plastidio
Mitocondri
a
RE
Filamento
s de actina
Tipo
A
Tipo
B
Tipo
C
Tipo
D
Cho et al., Planta (2006); Cheng et al., Biol. Plantarum (2011); Claeyssen y Rivoal, Phytochemistry (2007); Frommer et al., Science (2003); Nilsson et al., BMC
Plant Biol. (2011)
Síntesis de almidón y
ácidos grasos. Tipo A
Metabolón glucolítico.
Protección contra ROS. Tipo B
Síntesis de almidón y
ácidos grasos.
Energía en hipoxia.
Tipo C
Podrían tener las mismas
funciones que las tipo B. Tipo D
PREDICCIÓN DE LA LOCALIZACIÓN CELULAR.
http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/, http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html
Se basa en la
hidrofobicidad de los
aminoácidos.
Se basa en la presencia de
presecuencias en el N-
terminal.
Cruce transmembranal
ZmHXK4 ZmHXK7
Those HXK soluble in full version, with low sensitivity to ADP and G6P are
localized at the cytosol
Bright field GFP Mitotracker Merged
A
B
ZmHXK7
ZmHXK8
GFP
alone
C
HXKs-GFP
The insoluble in full versions of ZmHXK4, 5, 6 and 9, which also are sensitive to ADP and G6P are
mitocondrial proteins
ZmHXK4
ZmHXK5
ZmHXK6
ZmHXK9
AtHXK1
Bright field GFP Mitotracker Merged
A
B
C
D
E
The localization of ZmHXK4-6 and 9 greatly relies on the first 30 amino acids of the N-terminal domain
ZmHXK4Δ30
ZmHXK5Δ30
ZmHXK6Δ30
ZmHXK9Δ30
Bright field GFP Mitotracker Merged
A
B
C
D
OsHXK5
OsHXK6
ZmHXK4
ZmHXK5
ZmHXK6
ZmHXK7
ZmHXK8
ZmHXK9
Nuclear localization
signal
Mitochodrial target peptide
Aki & Yanagisawa, J. Proteome Res. (2009); Cho et al., Planta (2006); Cho et al., Plant Physiol. (2009); Yanagisawa et al., Nature (2003).
Two localization sequences were identified in several plant HXKs
Nuclear localization is related to their sensor function
ZmHXK6
Δ30-GFP
ZmHXK6
Δ30-GFP
Bright field GFP Hoescht Merged
Alejandro
Hernández
Loyola
Colaborators Dr. Arturo Guevara Instituto de Biotecnología, Cuernavaca Morelos Dr. José Luis Hernández Mendoza Instituto de Ciencias Genómicas IPN, Tamaulipas. Dr. Javier Plasencia de la Parra, Dra. Marina Gavilanes Ruíz, Dra. Karina Durán (USAI-Microscopía confocal) Q. Laurel Fabila Ibarra Facultad de Química, UNAM Dra Sara L. Morales-Lázaro Dra. Tamara Rosenbaum Instituto de Fisiología Celular
Colaborators
M. en C. Paulina Aguilera Alvarado
Dr. Fernando Guzmán Chávez
M. en C. Roberto Carvente García
M. en C. Montserrat López Coria
pQA Alejandro Hernández Loyola
QA Itzel Palacios Vargas
QFB Mireya Flores Barrera
QFB Néstor E. Delgado Rubio
pQFB Nancy Hernández Chávez
pQA Méndez Ramírez Moisés
pQA Muñoz Chapul Daniela
M. en C. Beatriz King Díaz
Funding
ENSAYO DE COMPLEMENTACIÓN EN S. cerevisiae.
La genética inversa es una disciplina genética que, partiendo del conocimiento de un fragmento de ADN clonado o secuenciado,
investiga sobre su función biológica alterando dicho ADN mediante mutación, generalmente a nivel masivo. Dicha mutación puede ser
puntual, por sustitución de nucleótidos, o más drástica, por ejemplo mediante silenciamiento de genes completos.
Eason, PNAS (2004); https://es.wikipedia.org/wiki/Gen%C3%A9tica_inversa
¿Cómo se obtiene una mutante de S. cerevisiae?
Deleción
Ronda 1
PCR
Homología
con el gen
de interés
Homología
con el gen
de interés Primer de homología
Primer de homología
Templado
2
Ronda 2
PCR
Cassette de deleción
La levadura perdió un
gen pero adquirió otro,
en este caso uno que le
permite crecer en
presencia de Kan
Confirmació
n por PCR
Primer UPTAG
Homología
con el gen
de interés
Templado
Resistencia
o
prototrofía
Primer DNTAG
Homología
con el gen
de interés
Inserción del cassete
por recombinación
homóloga