Download - HPLC analitica
Universidad del Zulia
Facultad experimental de ciencias
División de Estudios Básicos sectoriales
Departamento de química
Química Analítica III
Prof. Chávez Gerson
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Realizado por:
Marienmy Velásquez
C.I.: 22.606.896.
Maracaibo, febrero de 2015
Introducción
La Cromatografía líquida o de líquidos, es una técnica analítica la cual permite
separar físicamente los distintos componentes de una solución por la adsorción
selectiva de los constituyentes de una mezcla. Consiste en un contacto entre
dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria (puede ser alúmina,
sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles), y una
móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso
es un líquido o mezcla de varios líquidos. Los intercambiadores iónicos son
matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos
ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa), en ellos queda
retenida la muestra sobre el soporte sólido por afinidad electrostática.
Dependiendo de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla
serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, es decir
serán adsorbidos, lo que provocará su separación. Las sustancias que
permanecen más tiempo libre en la fase senil, avanzan más rápidamente con el
fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas
avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir.
Se la denomina cromatografía líquida de alta presión o cromatografía líquida de
alta resolución (high pressure liquid chromatography) (HPLC), para distinguir los
más nuevos de los métodos básicos aún utilizados. El HPLC es una técnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes
tipos de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica. En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna
cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con
pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas en su
superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de
la columna.
Evolución de las bases de la separación cromatográfica.
Cromatografía líquida tal como lo conocemos hoy en día realmente se inició en
1969, cuando la primera HPLC moderno fue diseñado y comercializado como un
analizador de ácido nucleico. Columnas toda la década de 1970 no eran fiables,
las tasas de flujo de la bomba fueron inconsistentes, y muchos compuestos
biológicamente activos escapado a la detección mediante detectores de UV y de
fluorescencia. Centrarse en los métodos de purificación en los años 70 se
transformó en análisis más rápidos en la década de 1980, cuando los controles
computarizados fueron integrados en equipos de HPLC. Un mayor grado de
informatización y luego llevó al énfasis en el equipo más preciso, más rápido y
automatizado en la década de 1990. Atípico de muchas tecnologías de los años
60 y 70, el énfasis en la mejora no fue el "más grande y mejor", sino en "más
pequeño y mejor". Al mismo tiempo, la interfaz de usuario de HPLC estaba
mejorando, era crítico para ser capaz de aislar cientos de péptidos o
biomarcadores de cada vez menor tamaño de las muestras.
Laboratorio de instrumentación analítica sólo ha sido reconocido como una
industria separada y distinta por NAICS y SIC desde el 1987 - Esta segmentación
del mercado incluye no sólo el gas y la cromatografía líquida, sino también la
espectrometría de masas y los instrumentos espectrofotométricos. Desde
reconocido por primera vez como un mercado separado, las ventas de equipos
de laboratorio de análisis aumentaron de alrededor de $ 3.5 mil millones en
1987 a más de $ 26 mil millones en 2004. Los ingresos en el mercado de
cromatografía líquida mundo, en concreto, se espera que crezca de $ 3.4 mil
millones en 2007 a $ 4,7 mil millones en 2013, con un ligero descenso en el
gasto previsto en 2008 y 2009 a partir de la crisis económica mundial y la
disminución o estancamiento del gasto. La industria farmacéutica por sí solo
representa el 35% de todos los instrumentos de HPLC en uso. La principal fuente
de crecimiento de la LC se deriva de las ciencias biológicas y las compañías
farmacéuticas.
Con respecto a la técnica se ha mejorado y sobre-llevado los siguientes
parámetros:
Proceso de ensanchamiento de banda: Existen varios procesos que tienen
lugar en la columna durante una separación cromatográfica y que contribuyen a
la variancia del pico, σ2, o ensanchamiento de la banda. Las teorías de la
dispersión de la banda en cromatografía de gases y de líquidos son
prácticamente idénticas. La altura del plato expresa en términos simples la
magnitud del ensanchamiento de la banda y los factores que lo afectan. Es una
función de procesos termodinámicos y cinéticos dentro de la columna. Estos son
(a) irregularidades del flujo que provocan mezclado convectivo, (b) difusión
transversal y longitudinal en la fase móvil y (c) una velocidad finita en el
equilibrio del soluto entre las fases estacionaria y móvil (transferencia de masa).
Difusión por remolinos: La inhomogeneidad en las velocidades de flujo y en
la longitud de los caminos alrededor de las partículas del empaque es el primero
de los factores. Deben existir caminos de flujo de longitud desigual a través de
cualquier empacado que no sea perfecto. Algunas moléculas de soluto de una
especie única pueden ser barridas a través de la columna cerca de la pared,
donde la densidad del empacado es comparativamente baja, en particular en
columnas de diámetro pequeño. Otras moléculas del soluto pasan por el centro
de la columna, con un empacado más compacto y a una correspondiente menor
velocidad. Las moléculas que siguen un camino más corto eluyen antes que
aquellas que siguen caminos más erráticos (y largos). Esto provoca para cada
soluto un ensanchamiento de la banda de elución. Para minimizar el efecto, las
partículas del empaque deben tener un diámetro promedio tan pequeño y deben
ser empacadas tan uniformemente como sea posible. Por supuesto, conforme las
partículas son más pequeñas, la presión necesaria para impulsar la fase móvil a
través de la columna será mayor y más difícil será empacar la columna de
manera uniforme. De todas formas, debido a la mayor eficiencia que se obtiene
con partículas de menor diámetro, la longitud de la columna puede reducirse en
alguna medida. Debe establecerse un compromiso entre el tamaño de las
partículas, la longitud de la columna y la presión requerida. En cromatografía
gas-líquido, cuando se utilizan películas en el interior de las columnas capilares
el término es despreciable.
Difusión longitudinal: La difusión longitudinal, o axial -esto es, movimiento
molecular aleatorio dentro de la fase móvil .es un segundo proceso que produce
ensanchamiento del pico. La contribución de la difusión longitudinal a la altura
del plato es significativa sólo a velocidades bajas de fase móvil. Entonces, las
velocidades altas de difusión del soluto en la fase móvil pueden causar que las
moléculas se dispersen axialmente mientras emigran lentamente a través de la
columna. Si esto pasa se produce ensanchamiento del pico.
Transferencia de masa: La resistencia a la transferencia de masa del soluto
en la superficie de la fase estacionaria es otro factor que contribuye al
ensanchamiento del pico. El movimiento molecular lento dentro de la fase
estacionaria significa un mayor tiempo de residencia en esta fase de una
molécula de soluto, mientras que otras moléculas avanzan con la fase móvil.
Conforme la fase móvil se mueva más rápidamente a través de la columna y
más lenta sea la transferencia de masa, más ancha será la banda del soluto que
eluye de la columna. Se deben escoger líquidos no viscosos para la fase
estacionaria de manera que el coeficiente de difusión no sea indebidamente
pequeño. Es benéfico reducir el espesor de la fase estacionaria, aunque
disminuye la capacidad de la columna.
Otro término que afecta a la anchura de banda es el correspondiente a la
resistencia a la transferencia de masa radialmente entre líneas de corriente de
fase móvil adyacentes. Disminuir el tamaño de las partículas de la fase
estacionaria siempre es útil para reducir la altura del plato. En cromatografía
líquida en columna, en contraste con la cromatografía gas-líquido, las mayores
diferencias provienen de (1) la disminución en un factor de 10000 en el valor del
coeficiente de difusión del soluto en la fase móvil cuando la fase móvil está
constituida por un líquido en lugar de un gas y (2) la presencia de zonas de fase
móvil estancada, atrapada dentro de los poros y canales de la fase estacionaria.
Las moléculas de soluto se mueven por difusión hacia dentro y hacia afuera de
estos poros. Estas moléculas se retrasan en su movimiento hacia adelante,
relativo a la banda principal de un soluto dado, y nuevamente se produce un
aumento en la dispersión molecular.
También la velocidad de la fase móvil difiere entre un punto y otro debido a las
perturbaciones provocadas por las partículas de soporte. Las líneas de corriente
del líquido de la fase móvil cercanas a los límites de las partículas se mueven
lentamente, mientras que las líneas de corriente cercanas al centro entre
partículas se mueven más rápidamente. Por difusión lateral las moléculas de
soluto se transfieren constantemente a una línea de corriente diferente. Por lo
tanto, la obstrucción del camino de una molécula de soluto se debe tanto a la
difusión entre líneas de corriente, como a la necesidad de viajar alrededor de las
partículas de la fase estacionaria.
El efecto de zonas estancadas se puede minimizar de varias formas. La
estructura interna del empaque se puede hacer impenetrable; un ejemplo son
los empaques peliculares con un núcleo sólido y la superficie recubierta. La
reducción del diámetro de las partículas es muy efectivo. También se puede
elegir soportes que tengan poros muy amplios, de forma que el líquido fluya
fácilmente hacia dentro y hacia afuera y aun a través de los canales de los
poros.
Efecto del tamaño de partícula, tamaño de poro y longitud de
columna en la resolución: El tamaño de partícula juega un papel
importantísimo en la calidad y eficacia de la columna. Como se observa en la
ecuación de Van Deemter, la altura equivalente de plato teórico es función del
diámetro de la partícula de relleno:
Donde dp es el diámetro de las partículas y u la velocidad lineal de la fase móvil.
De la ecuación anterior se desprende la importancia del diámetro de partícula,
ya que a diámetros menores se obtendrá una menor altura equivalente de plato
teórico y, por lo tanto, una mayor eficacia del sistema.
Las partículas utilizadas inicialmente para rellenos en cromatografía liquida eran
bastante grandes (de más de 40 picometros) y totalmente porosas. Este tipo de
partículas presentan una gran superficie específica y, por lo tanto, las columnas
preparadas con ellas presentan una gran capacidad de carga (admiten gran
cantidad de muestra) pero, como contrapartida, dan lugar a un gran
ensanchamiento de la banda cromatográfica ya que influyen significativamente
sobre los términos de transferencia de masa de la ecuación de Van Deemter.
Como solución parcial a este problema, se comenzaron a utilizar los
recubrimientos de estas partículas por capas de fase estacionaria (adsorbente o
intercambiadora de iones). Este tipo de rellenos (rellenos peliculares) dan lugar
a picos más estrechos (figura 1), aunque no son la solución óptima.
Figura 1.- Influencia del tamaño de partícula.
Los mayores avances se han realizado al reducir los tamaños de las partículas
del relleno a unos niveles en los que consiguen grandes incrementos en la
eficacia de la columna sin que por ello se tengan unas presiones tan
excesivamente elevadas en cabeza de columna que hagan inviable el análisis
(figura 1).
En la actualidad, los tamaños de partícula habituales se encuentran
comprendidos entre 10 y 3 picómetros de diámetro, aunque en la gran mayoría
de los casos, los análisis se están realizando con rellenos de 10 o 5 picómetros.
Un último detalle, aunque de gran importancia, es que cuanto menos sea el
tamaño de partícula, la presión en la cabeza de columna se incrementa de forma
proporcionalmente inversa al cuadrado del tamaño de la partícula. Por este
motivo, es fácil comprender el por qué no se encuentran en el mercado rellenos
con un tamaño de partícula de menos de 3 picómetros.
El efecto de la longitud de la columna en la resolución se puede comprobar en
las ecuaciones que rigen los procesos cromatográficos, la eficacia de la columna
depende, entre otros factores, de la longitud de la columna y, a igualdad de
otros parámetros, mayores longitudes de la columna permitirán obtener
mayores eficacias.
Por otra parte, debe tenerse en cuenta que, a mayor longitud de la columna, la
presión en cabeza se eleva considerablemente, por lo que hay que alcanzar un
compromiso, a la hora de seleccionar la columna, entre eficacia y caída de
presión. Las columnas de cromatografía liquida en ningún caso pueden tener
longitudes extremadamente grandes; se ha comprobado que para tamaños de
partículas de 10 a 5µm, resulta difícil conseguir empaquetar buenas columnas
de longitud superior a 30cm; para tamaños de partícula de 3µm, la longitud de
la columna no podrá ser superior a 20cm sin riesgo de que la presión en cabeza
de columna sea excesivamente elevada.
Tipos de cromatografía liquida
Cromatografía de reparto: La cromatografía de reparto ha llegado a ser el
tipo de cromatografía de líquidos más ampliamente utilizado. En el pasado, la
mayoría de las aplicaciones se han referido a compuestos polares no iónicos de
baja a moderada masa molecular < 3000). Sin embargo, recientemente se han
desarrollado algunos métodos que han extendido las separaciones de reparto a
los compuestos iónicos.
La cromatografía de reparto se puede subdividir en cromatografía líquido-líquido
y cromatografía con fases unidas químicamente (enlazadas). La diferencia entre
estas técnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las
partículas soporte del relleno. En líquido-líquido, la fase estacionaria líquida se
retiene sobre la superficie del soporte por adsorción física. En fase unida
químicamente, la fase estacionaria se une químicamente a la superficie del
soporte. La cromatografía de reparto, al principio era del tipo líquido-líquido; sin
embargo, en la actualidad los métodos de fase enlazada son los que predominan
debido a las desventajas de los sistemas líquido-líquidos. Una de esas
desventajas es la pérdida de fase estacionaria por disolución en la fase móvil, lo
que hace necesario un periódico recubrimiento de las partículas del soporte. Por
otra parte, el problema de la solubilidad de la fase estacionaria impide el uso de
los rellenos de fase líquida en la elución con gradiente. La discusión se centrará
exclusivamente en la cromatografía de reparto con fases unidas químicamente.
Cromatografía de adsorción: La cromatografía de adsorción, o líquido-sólido,
es la forma clásica de cromatografía de líquidos que introdujo Tswett por vez
primera a principios de este siglo. Más recientemente, se ha convertido en un
método importante de HPLC.
Las únicas fases que se utilizan en HPLC líquido-sólido son la sílice y la alúmina,
siendo la primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su
mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con
pocas excepciones, las características de adsorción de los dos adsorbentes son
similares. Con ambos, el orden de tiempos de retención es: olefinas <
hidrocarburos aromáticos < haluros = sulfuros < éteres < nitrocompuestos <
esteres = aldehídos = cetonas < alcoholes = aminas < sulfonas < sulfóxidos <
amidas < ácidos carboxílicos.
Cromatografía iónica: La cromatografía iónica está relacionada con los
métodos modernos y eficaces para la separación y determinación de iones que
se basan en el uso de las resinas de intercambio iónico. La cromatografía iónica
empezó a desarrollarse a mediados de los años setenta, cuando se demostró
que mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de intercambio
catiónico o aniónico, se podían resolver fácilmente mezclas de cationes o
aniones. Por entonces, la detección se realizaba por lo general con medidas de
conductividad.
La cromatografía iónica se desarrolló durante el proyecto Manhattan que
optimizaba la separación con resinas de intercambio catiónico de los cationes de
las tierras raras estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el
cual se basa la teoría de las separaciones por intercambio iónico, se extendió
tras la 2ª Guerra Mundial a muchos otros tipos de materiales y al final condujo a
los métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y
otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna
empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por
intercambio iónico se retrasó debido a la inexistencia de un método general y
sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y
alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se
remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la
técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección
conductimétrica de los iones eluidos. Esta técnica se describe posteriormente.
Cromatografía de exclusión por tamaños: La cromatografía de exclusión
por tamaños, que también se ha denominado cromatografía en geles
permeables o de filtración en geles, es una técnica muy valiosa que se aplica
particularmente a especies de alto peso molecular. Los rellenos para la
cromatografía de exclusión por tamaños están constituidos por pequeñas
partículas (de unas 10 µm) poliméricas o de sílice que contienen una red
uniforme de poros en los que pueden difundir las moléculas del soluto y del
disolvente. En los poros, las moléculas son atrapadas efectivamente y
eliminadas del flujo de la fase móvil. El tiempo de residencia medio en los poros
depende del tamaño efectivo de las moléculas de los analitos. Las moléculas que
son más grandes que el tamaño medio de poros del relleno son excluidas y de
esta forma, esencialmente no se retienen y, por tanto, son las primeras que
eluyen. Las moléculas que tienen diámetros que son significativamente menores
que los poros, pueden penetrar a través del laberinto de poros y así resultan
atrapadas durante más tiempo; éstas son las últimas en eluir. Entre estos dos
extremos, están las moléculas de tamaño intermedio cuya penetración media en
los poros depende de su diámetro. Dentro de este grupo, tiene lugar el
fraccionamiento, que está directamente relacionado con el tamaño molecular y
en cierto modo con la forma molecular. Obsérvese que las separaciones por
exclusión por tamaños difieren de los otros procedimientos que se han
considerado, en que no implican una interacción química o física entre los
analitos y la fase estacionaria. De hecho, se procura evitar este tipo de
interacciones dado que originan una mala eficacia de la columna.
Instrumentación:
Conocimiento básico del equipo e instrumental necesario para el análisis
cromatográfico. Discusión de detección de fallas y/o anomalías en el sistema;
corrección y ajustes al mismo.
Figura 2.- Equipo para HPLC
Solventes: La fase móvil puede ser un solvente puro o una mezcla de
solventes. Cuando se trata de una mezcla, puede programarse la bomba para
que tome solventes de diferentes botellas en una proporción determinada y
realice la mezcla en una cámara de mezclado. Dependiendo de la forma en que
se usa el solvente tenemos dos métodos:
Método Isocrático: Cuando, durante toda la separación, se utiliza siempre el
mismo solvente, se denomina isocrática, sin embargo es normal realizar un
gradiente de composición del solvente a lo largo de la cromatografía para
mejorar la eficiencia y acortar la duración del proceso. Estos gradientes de
solvente también son realizados en forma automática por las bombas.
Método de Gradiente de Elución: Es un término que se utiliza para describir
el proceso mediante el cual se cambia la composición de la fase móvil. Pueden
efectuarse de dos maneras:
A baja presión
A alta presión
Cuando se desarrolla un análisis usando el método de gradiente se debe tener
presente dos objetivos:
Obtener la mejor resolución de los componentes de la muestra en el
menor tiempo posible.
Asegurar alta precisión y exactitud.
Para obtener buenos resultados con el método de gradiente debemos seguir
cinco pasos fundamentales:
Determinar la composición inicial y final del solvente.
Ajustar el tiempo del gradiente.
Determinar la forma del gradiente (lineal, cóncava o convexa).
Ajustar la velocidad del flujo para mejorar la resolución.
Regresar a las condiciones iniciales la columna.
La bomba envía el solvente a través de caños de diámetro pequeño,
generalmente de acero inoxidable, hacia la válvula inyectora. Esta consiste en
una válvula de varias vías que permite introducir en el flujo de solvente, la
muestra contenida en un aro o loop de volumen calibrado. Luego de que se
produzca la separación en la columna, los componentes de la mezcla pasan por
el detector. Este produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de
materia y esa señal es enviada al registrador que realiza un gráfico de
intensidad en función del tiempo (cromatograma). Idealmente, se trata de picos
gaussianos y cada pico corresponde a un componente de la muestra original. El
integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es
proporcional a la cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no
destructivos, es posible recuperar los productos que salen de él. De esta
manera, dependiendo del tamaño del loop de inyección, de la columna, y del
tipo de bomba, es posible realizar además de separaciones analíticas,
cromatografías preparativas.
Criterios para la elección del solvente:
Disponible comercialmente
Precio
Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos con productos de calidad
de pureza cromatográfica. Bajo contenido de impurezas.
Disolver la muestra
Miscible con otros solventes para formar mezclas útiles
No degradar o disolver la fase estacionaria
Tener baja viscosidad para reducir las caídas de presión
Ser compatible con el detector utilizado. Transparencia óptica (cuando se
usan detectores UV)
Filtración y Desgasificación de solventes
Filtros: Hay tres métodos comunes que se utilizan hoy en día para la filtración
previa de los Solventes en HPLC:
Filtro a la entrada del solvente: Este tipo de filtro usualmente se construye
de acero inoxidable u otra aleación resistente a la corrosión y se sitúa dentro de
la botella de depósito del solvente (depósito de la fase móvil) donde se une a la
entrada de la presión baja. Está al lado de del HPLC, bombea usando un taladro
pequeño de Teflón u otra tubería inerte. El filtro tiene un poro medio, clasificado
según tamaño que usualmente oscila entre rangos de 1 a 5 micra. Debido a los
métodos industriales de fabricación de estos filtros,, sólo un poro medio clasifica
según tamaño. El tamaño absoluto del poro mínimo es usualmente alrededor de
1 micra, para aquel material por debajo de este mínimo puede alargar el HPLC
bomba, columna, y otro componentes del sistema. Con el tiempo estos tipos de
filtros reducen eficacia de la bomba.
Filtración al vacío: Este aparato consta de un embudo de vidrio, vidrio se filtra
poseedor, y frasco de la recepción del vidrio. Se aplica vacío al frasco y solvente
se filtra cuando pasa por un disco teclea membrana dentro del poseedor del
filtro. Este sistema tiene la ventaja de usar membrana filtra que tiene un muchos
mejor definió poro clasifica según tamaño y puede bajar a 0.2 poro de la micra
clasifica según tamaño. El poro más bajo clasifica según tamaño puede eliminar
la mayoría de materia del [particulate] halló en el HPLC ambiente del laboratorio.
El problema con este sistema es ese que está muy frágil desde se hace fuera de
vidrio y solvente necesita se transferir del frasco al HPLC botella del solvente del
solvente donde se le expone a la atmósfera el solvente y puede ser fácilmente
recontaminado con partículas del polvo y otros partículas de materia en el aire.
Filtración en línea: Este sistema consta de un [polymer] o filtro del [inline]
limpio hecho de acero que tiene un tubo tropieza con la botella solvente de la
fabricante y otro funcionamiento del tubo a una presión baja bombea que dibuja
el HPLC solvente por un disco se filtra albergó dentro del albergue del filtro del
[inline] y lo distribuye en un frasco del almacenamiento o en el depósito
solvente. Este sistema como con el sistema del embudo describió sobre, tiene la
ventaja de usar disco filtra con pues definió poro clasifica según tamaño y un
poro mínimo clasifica según tamaño de 0.2 micra que está 5 chronometra más
bajo que la entrada solvente filtra aparato del tipo. La desventaja si este sistema
es ese que requiere una presión separada baja bombea y si construyó de
[polymers polypropylene] tal como y/ o nilón que contaminaría solventes
seguros orgánicos.
Tuberías: Las tuberías deben ser de acero inoxidable, las cuales son resistentes
a la corrosión, se utiliza PEEK (PoliEterCeterona), que son resistentes a los
disolventes fuertes y fases móviles agresivas.
Características:
Los tubos de PEEK son extremadamente flexibles y pueden cortarse
fácilmente a las longitudes deseadas.
Además puede emplearse para su conexión, además de los conectores de
material polimérico, cualquier rosca o cono de acero inoxidable.
Los tubos de PEEK vienen codificados por su color, el cual gracias al
especial proceso de fabricación es totalmente indeleble.
Los tubos de PEEK pueden trabajar hasta presiones de 5000 psi
dependiendo del diámetro, y hasta temperaturas de 100°C.
Sistemas de bombeo: Sistema isobárico y sistema de gradiente
Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen:
La generación de presiones por encima de 400 kg/cm2.
Un flujo libre de pulsaciones.
Un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.
El control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo.
Componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón).
Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no
constituyen un riesgo de explosión, debido a que los líquidos no son muy
compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema sólo
supone una pérdida de disolvente. Es evidente que esta pérdida puede suponer
un riesgo de incendio.
Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se
denomina una elución isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación
se aumenta notablemente por una elución con gradiente. En este caso se
utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad significativamente
distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de
forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de
etapas escalonadas. Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están
equipados con unos dispositivos que permiten introducir los disolventes desde
dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una velocidad que varía
continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar
lineal o exponencialmente con el tiempo.
La Figura 3 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de
una mezcla de clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática
con metanol/agua 50:50 (v/v). La curva (a) muestra la elución con gradiente,
que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos disolventes y se va aumentando la
concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución con gradiente
acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los
primeros picos. Nótese también que la elución con gradiente produce unos
efectos similares a los producidos por la programación de temperatura en
cromatografía de gases.
Figura 3.- Mejora de la eficiencia de la separación mediante la elución con gradiente.
Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero inoxidable, relleno 1% Permaphase
ODS. Muestra: 5 μL de bencenos clorados en isopropanol. Detector: fotómetro de
UV (254 nm). Condiciones: temperatura 60ºC, presión 80 kg/cm2. (a) Elución con
gradiente: metanol 40% / agua 60% e incremento de la proporción de metanol a
una velocidad de un 8% / min (b) Elución isocrática con metanol 50% / agua
50%.
Sistema de inyección
A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía de
líquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la
columna. El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaña
a la sobrecarga de las columnas. Por ello, los volúmenes que se emplean han de
ser muy pequeños, de unas pocas décimas de microlitro a tal vez 500 µL.
Además, se ha de poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.
Figura 4.- Bucle de muestra para cromatografía de líquidos.
En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para la
introducción de la muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en
la Figura 4. Estos dispositivos están normalmente integrados en el equipo
cromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten la elección de
tamaños de muestra desde 5 a 500 µL. Con bucles de este tipo se puede
introducir la muestra a presiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisión relativa
de unas décimas por ciento. También existen válvulas de inyección de
micromuestras, con bucles con volúmenes de 0,5 a 5 µL.
Tipos de Columnas. Nuevos avances (columnas UPLC)
La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitud
entre 5 y 30 cm. Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si
es necesario, acoplando dos o más columnas. El diámetro interno de las
columnas es a menudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las partículas de los
rellenos más comunes son 3, 5 y 10 µm.
Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y
4.6 mm de diámetro interno, y empaquetada con partículas de 5 µm. Estas
columnas tienen de 40 000 a 60 000 platos/metro. También, se han empezado a
fabricar columnas de alta resolución más rápidas, las cuales tienen menores
dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnas pueden tener
diámetros internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan con partículas de
3 o 5 µm. A menudo su longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienen hasta
100 000 platos/metro y presentan la ventaja de la rapidez y del mínimo consumo
de disolvente. La última propiedad es de considerable importancia, puesto que
los disolventes de alta pureza que se requieren en cromatografía de líquidos son
muy caros.
Pre-columnas: En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna
analítica, se coloca delante una precolumna que elimina la materia en
suspensión y los contaminantes de los disolventes. Además, en cromatografía
líquido-líquido, la precolumna sirve para saturar la fase móvil con la fase
estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columna analítica. La
composición del relleno de la precolumna debe ser semejante al de la columna
analítica; sin embargo, el tamaño de partícula es por lo común mayor para
minimizar la caída de presión.
Termostatos: En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la
temperatura, y las columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo,
muchas veces si se controla la temperatura de la columna en unas pocas
décimas de grado centígrado, se obtienen mejores cromatogramas. La mayoría
de los instrumentos comerciales llevan actualmente hornos para las columnas
que controlan la temperatura de la columna a las décimas de grado, desde la
temperatura ambiente hasta 150 ºC. Para poder controlar con precisión la
temperatura, las columnas también se pueden colocar en camisas con agua que
provenga de un baño a temperatura constante.
Tipos de rellenos de la columna: En cromatografía de líquidos se han
utilizado dos tipos básicos de rellenos, pelicular y de partícula porosa. El primero
consiste en bolas de vidrio o de polímero, no porosas y esféricas con unos
diámetros característicos de 30 a 40 µm. En la superficie de estas bolas se
deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o de una resina de
intercambio iónico. Para algunas aplicaciones se aplica un recubrimiento
adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que se mantiene fija por
adsorción. Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener una
capa superficial orgánica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan
ampliamente en las pre-columnas y no en las columnas analíticas.
Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos están
formados por micro-partículas porosas con diámetros entre 3 y 10 µm y con la
menor dispersión posible para un tamaño determinado. Las partículas son de
sílice, alúmina o resinas de intercambio iónico, aunque la sílice es el material
más común. Las partículas de sílice se sintetizan aglomerando partículas de
sílice de tamaños inferiores al micrón en unas condiciones tales que se forman
partículas mayores con diámetros muy uniformes. Las partículas que resultan se
recubren muchas veces con películas orgánicas, que se unen química o
físicamente a la superficie.
Columnas UPLC
La UPLC es el resultado de una innovación que llevó al diseño holístico
simultáneo de una nueva tecnología de partícula para LC, un nuevo diseño de
columna, inyectores, bombas y detectores. La combinación de la mejora en
prestaciones de las columnas rellenas de material híbrido con tamaño de
partícula inferior a 2-μm y la capacidad única del sistema ACQUITY UPLC de
suministrar la fase móvil a alta presión y con una mínima dispersión, que
permite aprovechar al máximo los beneficios de ese nuevo material, produce
como resultado picos más estrechos y más concentrados. Los Sistemas ACQUITY
UPLC aumentan el rendimiento y reducen el consumo de eluyente sin
comprometer los resultados analíticos.
El lanzamiento de la UPLC, Ultra Performance Liquid Chromatography, ha sido
uno de los avances más significativos en la ciencia de las separaciones en la
última década. El rendimiento de la HPLC limitaba su eficacia. Los laboratorios
ligados al uso del HPLC no podían seguir el ritmo creciente de demandas de
analizar más muestras, más rápidamente y con resultados más fiables. Eso llevó
a inventar una nueva categoría en prestaciones cromatográficas.
Detectores
A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no
hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores
de ionización de llama y de conductividad térmica. Uno de los mayores retos en
el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los
detectores.
Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las
propiedades listadas en relación con la cromatografía de gases, con la excepción
de que un detector para cromatografía de líquidos no es necesario que sea
sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un detector de
HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento
de banda.
Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los
detectores basados en una propiedad de la disolución responden a una
propiedad de la fase móvil, tal como el índice de refracción, la constante
dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por
contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a
alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o
intensidad de difusión, que no son propias de la fase móvil. En la Tabla 1 se
indican los detectores más comunes empleados en HPLC y algunas de sus
propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365 trabajos
publicados en los que tenía un papel importante la cromatografia de líquidos,
reveló que el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la
fluorescencia, el 5,4% el índice de refracción, el 4,3% empleaba medidas
electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas.
Detectores de absorbancia
La Figura 5 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la
medida de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatográfica. A fin
de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumnar, el volumen de estas
cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volúmenes se limitan por lo
común de 1 a 10 µL y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilización de
cubetas de este tipo está restringida a presiones no mayores de unos 50 kg/cm2.
Tabla 1. Características de los detectores de HPLC
Figura 5.- Celda de detector ultravioleta en HPLC
Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno
de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce
su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan
detectores fotoeléctricos contrastados. También se utilizan instrumentos de un
solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan
en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la
absorbancia.
Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros
Los detectores de absorción UV más simples son los fotómetros de filtros con
una lámpara de mercurio como fuente. Lo más común en estos casos es aislar la
línea intensa a 254 nm por medio de filtros; en algunos equipos también se
pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nm empleando otros filtros.
Resulta obvio que este tipo de detector se utiliza de forma restringida para
aquellos solutos que absorben a alguna de estas longitudes de onda. Algunos
grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben una banda
ancha de absorción a una o más de esas longitudes de onda.
Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores
La mayoría de los fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que
consisten en un espectrofotómetro de barrido con óptica de red. Algunos se
limitan a la radiación ultravioleta; mientras que otros abarcan la radiación
ultravioleta y la visible. Se pueden elegir varios modos operacionales. Por
ejemplo, se puede obtener el cromatograma completo a una sola longitud de
onda o alternativamente, cuando los picos que eluyen están suficientemente
separados, se puede elegir distinta longitud de onda para cada pico. En este
caso, debe emplearse el control por ordenador para elegir la mejor longitud de
onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con fines de
identificación, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente
que permita el barrido de la región de longitud de onda que interesa.
Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los
instrumentos de series de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de
instrumentos, que permiten recoger los datos de un espectro completo en
aproximadamente un segundo. De esta forma, los datos espectrales para cada
pico cromatográfico se pueden recoger y almacenar a medida que van saliendo
de la columna. Una de las formas de presentación de los datos espectrales, que
resulta útil para la identificación de las especies y para elegir las condiciones de
la determinación cuantitativa, consiste en un gráfico tridimensional tal como el
que se muestra en la Figura 6 En este caso, los espectros se obtuvieron a
intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición de cada uno de los
esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.
Figura 6.- Espectros de absorción del efluente de una columna de HPLC
tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.
Detectores de absorbancia en el infrarrojo.
Comercialmente se ofrecen dos tipos de detectores de infrarrojo. El primero con
barrido de longitud de onda que proporcionan tres segmentos de filtro
semicirculares. El segundo, mucho más sofisticado, es un tipo de detector
infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier.
Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiación
ultravioleta excepto en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de
fluoruro de calcio. Las longitudes de la cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los
volúmenes de 1.5 a 10 µL. Los instrumentos de infrarrojo más sencillos pueden
trabajar a una o más longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener
los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elución. Los
instrumentos con transformada de Fourier se utilizan de manera análoga a los
instrumentos de series de diodos para las medidas de absorbancia ultravioleta
que se han descrito en la sección anterior.
Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a
la baja transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo,
las bandas anchas de absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden
prácticamente el uso de este detector para muchas aplicaciones.
Detectores de fluorescencia
Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los
fluorímetros y espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se
detecta por medio de un detector fotoeléctrico colocado perpendicularmente
respecto al haz de excitación. Los detectores más sencillos utilizan una fuente
de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación
fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia
probablemente se basarán en el uso de fuentes de láser sintonizables, las cuales
permiten una mayor sensibilidad y selectividad.
Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad,
que resulta ser más de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de
absorbancia. En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja para
la separación y determinación de los componentes fluorescentes de las
muestras.
Detectores de índice de refracción
Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente
que en su camino hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el
efluente de la columna que pasa por la otra mitad. Los dos compartimentos
están separados por una placa de vidrio montada a un ángulo de modo que si
las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una desviación
de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la
superficie fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida,
la cual, una vez amplificada y registrada, proporciona el cromatograma.
Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi
todos los solutos. Es decir, son detectores universales análogos a los detectores
de llama en cromatografia de gases. Además, son fiables y no dependen del
caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de temperatura, y se han
de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de grado
centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros
detectores, y por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.
Detector de dispersión de luz
Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la
HPLC, el detector de dispersión de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la
columna se pasa a un nebulizador donde se convierte en una fina niebla
mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se llevan a través de un
tubo de conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la evaporación
de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de
partículas de analito pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de
silicio se detecta la radiación dispersada perpendicularmente al flujo. Una de las
mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser
aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además es
notablemente más sensible que el detector de índice de refracción.
Detectores electroquímicos
Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de
detectores electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos
electroanalíticos que incluyen la amperometría, la voltamperometría, la
coulombimetría y la conductimetría.
Calibración Tratamiento y Evalucación de datos
El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal
electrónica, y así no es visibles a nuestros ojos. En otros tiempos, la pluma-
papel-registrador gráfico se utilizaba muy popularmente. Hoy en día, una
computadora con un posesor de base de datos (integrador) es más común. Hay
varios tipos de procesadores de datos, e incluye un sistema simple que consiste
en construir la impresora y el procesador de textos, y un tipo de computadora
personal que consta de monitor, teclado e impresora. También hay programas
que están diseñados específicamente para el sistema LC. Ofrece no sólo la
adquisición de datos, pero también cateréticas como máximo de ajuste, la
corrección de línea base, el cálculo automático de la concentración, la
determinación del peso molecular, etc.
Cuantificación
El uso de la cromatografía se ha extendido en todo el mundo, en las últimas
cuatro décadas, no solo por su capacidad de separar compuestos sino porque se
puede realizar un análisis cuantitativo de las especies proporcionadas. En la
cromatografía en columna, el análisis cuantitativo se basa en la comparación de
la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más patrones
inyectados bajo las mismas condiciones cromatográficas. El uso de una u otro
termino dependerá de las características de la banda obtenida, aunque en la
actualidad con el uso de sistemas de integración de área computarizados, la
precisión es muy alta para el cálculo de área, sin embargo siempre es
importante conocer las otras herramientas a utilizar para calcular el área de una
banda y en qué momento es mejor usar altura en vez de área por si llega a
faltarle sistema computarizado.
Para lograr un análisis cuantitativo de los componentes separados de una
muestra existe una gran variedad de métodos de análisis entre los que se
pueden mencionar:
Calibración absoluta
Método del estándar interno y normalización de área (con y sin factor de
respuesta) Cada método tiene sus ventajas y desventajas.
Curva de calibración
Para realizar el cálculo de composición, se inyecta masas exactas del
componente puro al cromatógrafo y se determina el área. Se realiza un gráfico
relacionando el área de pico con la masa, se obtendrá entonces una curva de
calibración que debe ser lineal y pasar por el origen.
Figura 7.- Curva de Calibración.
La ecuación de esta curva vendrá dada entonces por
Entonces se inyecta una masa exacta de la muestra (Winj) y se determina el
área del componente a analizar, por ejemplo el componente A, de la curva
extrapolando la masa de
A por y después se aplica la siguiente ecuación:
Las desventajas de este método son que la inyección de la muestra debe ser
exacta y que las condiciones del sistema no deben cambiar de una inyección a
la otra. Las inyecciones exactas se logran más con un sistema automatizado de
inyección o con el uso de válvulas de inyección manuales con lazo de volúmenes
exactos como el caso de cromatografía liquida de alta resolución.
Cálculo de sensibilidad: Límite de detección y límite de
cuantificación
Sensibilidad: este parámetro se evalúa mediante la estimación del límite de
cuantificación (Lc) y el límite de detección (Ld). Para ello es necesario trabajaron
con diferentes concentraciones, respectivamente.
Límite de detección: “la menor cantidad de analito que puede detectarse en
una muestra, aunque no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones del
experimento indicadas. Así, las pruebas de límite confirman simplemente que la
cantidad de analito se encuentra por encima o por debajo de un cierto nivel.”
Límite de cuantificación: “La menor cantidad de analito en una muestra que
puede determinarse con precisión y exactitud aceptables bajo las condiciones
del experimento establecidas”. En esencia, idéntico a ICH Q2A Límite de
cuantificación (LC) = límite de cuantificación (LOQ). Los métodos mencionados
serán de gran ayuda a la hora de realizar la estandarización del método. Sin
embargo, es importante aclarar que en este documento no se pudo lograr un
tratamiento estadístico completo debido a problemas técnicos presentados con
el cromatógrafo de gases.
Estándar interno
1) Se agrega una cantidad igual del estándar (SI) a la solución de calibrado y
a las muestras de modo de tener la misma concentración del estándar
2) Se inyecta la solución de calibrado (concentración conocida C1 del
componente a cuantificar)
3) Se mide el área de las señales del componente a cuantificar (A1) y del SI y
calculo el factor de respuesta relativo:
4) Se inyecta la muestra problema (que contiene una cantidad conocida de
SI) y mido el área de la señal del componente a cuantificar y del SI.
5) usando el factor F calculo la concentración del componente en la muestra
inyectada C’1
Ventajas
• Es independiente del volumen de inyección
• No requiere precisión en la preparación de la solución de SI ni conocer su
pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solución de calibrado
• Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI
• Es independiente de variaciones en el flujo o en las condiciones de corrida
Desventajas
• Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con ninguno
de los componentes de la muestra y que sea eluida en las mismas condiciones
• La preparación de muestras y soluciones de calibrado es más laboriosa.
Estándar externo
1) Inyecta una masa conocida M1 del componente a cuantificar (solución de
calibrado de concentración C1)
2) se mide el área de la señal (A1) y calculo el factor:
3) inyecto la muestra problema y mido el área de la señal del componente a A’1.
Se Cuantificar.
4) usando el factor calculo la masa del componente en la muestra inyectada y/o
la concentración.
Ventajas
• Sencillo de implementar
Desventajas
• Requiere volúmenes de inyección precisos y reproducibles
• Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema cromatográfico (flujos,
ancho de picos, etc.)
• Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solución de calibración
periódicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para verificar que el sistema
está estable
• El método es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones, etc.
Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente,
debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibración) y/o
inyectar cantidad de estándar externo acorde a cada muestra.
Referencias
• http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquid a
• Skoog W., Holler J., Nieman T, 2001, Principios de análisis instrumental.
Quinta edición, Madrid, España, Editorial Mc Graw-Hill/Interamericana.
• http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8248/4/T4cromatliquid.pd f
• http://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%AD a
• http://es.wikipedia.org/wiki/Coeficiente_de_repart o
• http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/
cromatografia/cr o matografia_liquida_de_alta_eficacia.pd f