Download - Guia Lab Bioquimica, quimica
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
FACULTAD DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES
INGENIERIA AMBIENTAL
GUIA DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA
RECOMENDACIONES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO
Antes de la práctica de laboratorio es obligatorio leer la guía y realizar el flujograma del
procedimiento a realizar. Al iniciar la práctica se realizará un quiz sobre el laboratorio a
desarrollar. Durante la práctica se deben registrar las observaciones y datos obtenidos en
la práctica.
MATERIAL DE LABORATORIO
Cada grupo debe llevar al laboratorio: jabón para lavar el material, papel absorbente. La
falta de los implementos anteriormente mencionados afectará la nota del informe de
laboratorio.
Cada equipo de trabajo es responsable del material que se le asigne, a demás del equipo
especial (por ejemplo centrifugas, balanzas, muflas, estufas, espectrofotómetros, etc.) en
caso de pérdida o daño, deberá responder de ello, y rellenar la correspondiente ficha.
Antes de empezar con el procedimiento experimental o utilizar algún aparato revisar todo
el material, y su manual de funcionamiento en su caso.
El material al igual que el lugar de trabajo debe quedar limpio, si esto no se cumple se
penalizara con la nota del informe.
NORMAS DE SEGURIDAD
El laboratorio debe ser un lugar seguro para trabajar donde no se deben permitir
descuidos o bromas. Para ello se tendrán siempre presente los posibles peligros
asociados al trabajo con materiales peligrosos. Nunca hay excusa para los accidentes en
un laboratorio bien equipado en el cual trabaja personal bien informado. A continuación se
exponen una serie de normas que deben conocerse y seguirse en el laboratorio:
- Durante la estancia en el laboratorio el alumno debe ir provisto de bata con
mangas largas, gafas de seguridad y guantes de látex. La bata deberá emplearse
durante toda la estancia en el laboratorio.
- Las gafas de seguridad siempre que se manejen productos peligrosos y durante la
calefacción de disoluciones. Los guantes deben utilizarse obligatoriamente en la
manipulación de productos tóxicos o caústicos.
- Retírese todos los accesorios personales que puedan comprender riesgos de
accidentes mecánicos, químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares y
sombreros. La responsabilidad por las consecuencias de no cumplir esta norma
dentro del laboratorio es enteramente del estudiante.
- Nunca deben llevarse lentes de contacto sin gafas protectoras, pues estos
retienen las sustancias corrosivas en el ojo impidiendo su lavado y extendiendo el
daño.
- Está prohibido fumar, beber o comer en el laboratorio.
- El pelo largo se llevara siempre recogido.
- Debe conocerse la toxicidad y riesgos de todos los compuestos con los que se
trabaje.
- Los frascos de los reactivos deben cerrarse inmediatamente despues de su uso,
durante su utilización los tapones deben depositarse siempre boca arriba sobre la
mesa.
- No se debe pipetear ninguna sustancia con la boca.
- Mantenga solo el material requerido para la sesión, sobre la mesa de trabajo. Los
frascos de reactivos deben permanecer en las baldas. Los demás objetos
personales o innecesarios deben guardarse o colocarse lejos del área de trabajo.
- Las vitrinas para gases tienen que utilizarse en todo trabajo con compuestos
químicos que pueden producir gases peligrosos o dar lugar a salpicaduras.
- No deben manipularse jamás productos o disolventes inflamables en las
proximidades de llamas.
- Si algún reactivo se derrama, debe retirarse inmediatamente dejando el lugar
perfectamente limpio.
- Las salpicaduras de sustancias básicas deben neutralizarse con un ácido débil
(por ej. Acido cítrico) y las de sustancias acidas con una base débil (bicarbonato
sódico).
- No deben verterse residuos sólidos en los fregaderos, deben emplearse los
recipientes para residuos que se encuentran en el laboratorio.
- Los ácidos y bases concentrados se encuentran en la vitrina del laboratorio. En
ningún caso deben sacarse de la vitrina, cuando se requiera un volumen de estos
reactivos se llevara el recipiente adecuado a la vitrina para tomar allí mismo la
cantidad necesaria.
- Cuando se tengan dudas sobre las precauciones de manipulación de algún
producto debe consultarse al profesor antes de proceder a su uso.
- Los recipientes utilizados para almacenar disoluciones deben limpiarse
previamente, eliminando cualquier etiqueta anterior y rotulando de nuevo
inmediatamente.
- No calentar nunca enérgicamente una disolución. La ebullición debe ser siempre
suave.
- El mechero debe cerrarse, una vez utilizado, tanto de la llave del propio mechero
como la toma del gas de la mesa.
- Las disoluciones y recipientes calientes deben manipularse con cuidado.
- Las heridas y quemaduras deben ser tratadas inmediatamente.
- En el caso de salpicaduras de ácidos sobre la piel lavar inmediatamente con agua
abundante, teniendo en cuenta que en el caso de ácidos concentrados la reacción
con el agua puede producir calor. Es conveniente retirar la ropa para evitar que el
corrosivo quede atrapado entre la ropa y la piel.
- Debe conocerse la ubicación de los elementos de seguridad (lavaojos, ducha,
extintor, salidas de emergencia) en el laboratorio, así como todas las indicaciones
sobre seguridad expuestas en el laboratorio.
- No debe llevarse a la boca ningún material de laboratorio; si algún reactivo es
accidentalmente ingerido, avise de inmediato al profesor o al técnico del
Laboratorio.
NORMAS DE TRABAJO
- Las disoluciones de reactivos, que no sean patrones ni muestras, se almacenan
en botellas de vidrio o plástico que deben limpiarse y rotularse perfectamente.
- Las balanzas deben dejarse a cero y perfectamente limpias después de finalizar la
pesada.
- Cerca de las balanzas solo deben permanecer los estudiantes que se encuentren
pesando (uno por balanza).
- Las sustancias patrón tipo primario anhidras se encuentran en el desecador y solo
deben extraerse el tiempo necesario para su pesada. El desecador debe
permanecer siempre cerrado.
- El material asignado a cada practica debe permanecer en el lugar asignado a
dicha práctica.
- No se debe utilizar material destinado a prácticas distintas a la que se está
realizando.
- Bajo ningún concepto se sacaran reactivos o material de prácticas fuera del
laboratorio.
CALENTAR
- Para recoger recipientes calientes como capsulas, crisoles, vasos, etc., utilizar las
correspondientes pinzas.
- También nos podremos ayudar de un paño del laboratorio.
- Cuando se calienten líquidos, evitar que la posible proyección pueda alcanzar a
cualquier persona o reactivo incompatible. Al calentar una solución en un tubo de
ensayo, debe hacerse bajo el nivel del líquido y constantemente agitando. No debe
apuntarse con el tubo al compañero o a sí mismo, pues puede proyectarse.
- Al calentar vidrio, dejar enfriar antes de cogerlo. Colocarlo sobre un material
térmicamente aislante, el vidrio caliente tiene el mismo aspecto que el vidrio frío.
- No manipular productos inflamables (benceno, tolueno, éter, etc.) en presencia de
mecheros encendidos. No destilar éter con llama o en presencia de mecheros
encendidos.
- Procure mantener la llama del mechero de color azul, ya que la llama amarilla
produce tizne.
PUESTO DE TRABAJO
- Conservar siempre limpios los aparatos y el puesto de trabajo. Evitar derrames de
sustancias, pero si cayera alguna, recogerla inmediatamente.
- Todas las practicas deberan realizarse con limpieza y, al terminar, toda el area de
trabajo deberá quedar ordenada y limpia.
MANEJO DE SUSTANCIAS
- No tocar los productos químicos con las manos. Usar papel, espátulas, etc. Usar
guantes para el manejo de reactivos corrosivos y/o altamente tóxicos. Una vez
finalizada la práctica de laboratorio lavarse las manos.
- Al usar cualquier tipo de reactivos, asegúrese que es el deseado y lea su etiqueta.
Si es transferido de recipiente etiquételo de nuevo.
- Todos los reactivos deberán manejarse con el equipo perfectamente limpio. Al
pipetear líquidos transfiéralos a otro recipiente para su uso. Los reactivos no
usados no se devuelven a los frascos.
- Nunca pipetee directamente del frasco.
- No manejar reactivos sin haber leído sus frases R y S, registrando sus
propiedades su preinforme.
- Dilución de ácidos: añadir lentamente el acido al agua contenida en un vaso,
agitando constantemente y enfriando el vaso receptor. Nunca añadir agua al
ácido.
- Al agitar moderadamente un tubo de ensayo golpee con la punta del dedo la base
del tubo. Cuando requiera una agitación vigorosa por inversión del recipiente,
tápelo con un tapón de vidrio esmerilado o papel Parafil. Nunca lo haga con la
mano.
RESIDUOS
- En el laboratorio se encuentran disponibles contenedores para la disposición de
residuos líquidos (acuosos, orgánicos, con metales, etc.) no se debe arrojar nada
por la cañería ni al piso del laboratorio. Si ocurre algún accidente avise
inmediatamente para aplicar el procedimiento adecuado.
- Todos los desperdicios sólidos y papeles deberán colocarse en los bidones de
basura, el material de vidrio roto deberá descartarse en el recipiente especial para
ese efecto.
LECTURA DE VOLUMEN
- En aquellos recipientes de cuello estrecho (pipeta, bureta, matraz aforado) se
forma un menisco que es la superficie cóncava o convexa que separa a la fase
liquida de la fase gas.
- Las fuerzas de adsorción entre la superficie del vidrio y el líquido provocan la
curvatura del menisco. La lectura del volumen ha de de realizarse de tal modo que
los ojos estén en un plano tangente al menisco. Ver Figura 1.
PRÁCTICA DE LABORATORIO: PH Y SOLUCIONES BUFFERS
Objetivos
1. Identificar el pH de soluciones de interés.
2. Observar el efecto amortiguador de las soluciones buffer.
Materiales
· 2 vasos de precipitado de 50 mL
· 1 probeta de 50 mL
· 2 Pipetas aforadas de 1 mL
· Papel indicador
· Papel tornasol
· pH-metro
Reactivos
· Solucion Buffer*
· Acido clorhidrico 0.1M
· NaOH 0.1M
* Buffer: Mezclar 250mL acido acetico 0.1M y 250 mL de acetato de sodio 0.1M (recien
preparado).
Cada grupo debe llevar al laboratorio leche de magnesio, vinagre, gaseosa
Procedimiento
Experimento I
1. Envasar aproximadamente 10 mL de leche de magnesio en un vaso de precipitado
correctamente lavado.
2. Medir el pH con el papel tornasol y papel indicador universal.
Repita el procedimiento con vinagre, gaseosa y agua.
Experimento II
1. Medir el pH de la solución Buffer.
2. Colocar en la probeta 20 mL del buffer y completar hasta 50 mL con agua destilada.
Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.
3. Colocar en la probeta 25 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la
pipeta graduada 1.0 mL de HCl 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.
4. Colocar en la probeta 25 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0
mL de HCl 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.
5. Colocar en la probeta 25 mL de la solución preparada en el numeral 2 y agregar con la
pipeta graduada 1.0 mL de NaOH 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.
6. Colocar en la probeta 25 mL de agua destilada y agregar con la pipeta graduada 1.0
mL de NaOH 0.1M. Pasar al vaso de precipitado y medir el pH.
Registre sus observaciones
Experimento I: Construir una tabla donde se muestren los valores de referencia de pH
para estas muestras y los valores experimentales. Analizar
Experimento II: Determinar el pH teórico de cada una de las soluciones preparadas y
compararlas con los resultados experimentales. Calcular el error.
PRACTICA DE LABORATORIO: PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE
CARBOHIDRATOS
Objetivo
1. Identificar una muestra problema a partir de reacciones químicas.
2. Identificar los diferentes tipos de carbohidratos
Fundamento
Los carbohidratos son polihidroxialdehidos o polihidroxicetonas, conocidos como aldosas
y cetosas respectivamente, estos grupos funcionales le confieren la base para la mayoría
de las reacciones usadas para su identificación y cuantificación. Asimismo los
carbohidratos se pueden clasificar por el número de carbonos que posee la estructura.
Cuando un carbohidrato es formado por una molécula se conoce como monosacáridos;
por dos, disacárido y por más de dos, polisacárido. Los disacáridos son dos
monosacáridos unidos gracias a un enlace glucosídico.
Si este enlace se efectúa entre dos carbonos anoméricos, el disacárido no tendrá el
potencial aldehído o cetona libre, por lo tanto no dan positivas aquellas pruebas que
involucren la participación de estos grupos, recibiendo el nombre de azúcar no reductor.
Materiales
6 tubos de ensayo
Pinzas para tubo de ensayo
1 Gradilla
1 Mechero
1 Tripode
1 Malla de asbesto
1 Pipeta de 5 mL
1 Pipeta de 1 mL
1 Vaso de precipitado de 250 mL
Reactivos
Muestra problema
Blancos: agua, glucosa, fructosa, ribosa, sacarosa*
Acido sulfúrico concentrado
Acido clorhídrico concentrado
Solucion de NaOH
Reactivo de Molish
Reactivo de Barfoed
Reactivo de Bial
Reactivo de Seliwanoff
Reactivo de Benedict
* Debido a la sensibilidad de las pruebas, la concentración de las muestras de
carbohidratos debe oscilar entre 1 - 10 g/L.
Preparación de reactivos
Reactivo de Molisch: a-naftol al 10% en etanol.
Reactivo de Barfoed: disolver 13.3 g de acetato de cobre en aproximadamente 200 mL de
agua destilada y agregar 1.8 mL de acido acético glacial.
Reactivo de Bial: Anadir 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de H2O destilada, añadir
1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro ferrico al 1%.
Reactivo de Seliwanoff: tomar 3 mL de resorcinol al 0.5 % en agua, añadir 12 mL HCl
concentrado, añadir agua c.s.p. 35mL.
Reactivo de Benedict: disolver 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio en
800 mL de agua caliente, filtrar a través de papel de filtro en una probeta de 1000 mL,
completar hasta 850 mL.
Mientras tanto, disolver 17.3 g de sulfato de cobre en 100 mL de agua, completar hasta
150 mL.
Verter la primera solución en un vaso de precipitado de 2L y añadir lentamente la solución
de sulfato de cobre agitando continuamente.
Prueba de Molisch
Anadir 1 mL de la solución de carbohidrato a un tubo de ensayo rotulado, posteriormente
agregar 2 gotas del reactivo de Molisch, mezclar. Cuidadosamente agregar
aproximadamente 0.5 mL de H2SO4 concentrado por las paredes del tubo, de tal forma
que se formen dos capas. Un color rojo violeta en la interfase entre el ácido y la solución
acuosa indica una prueba positiva para carbohidratos.
Prueba de Barfoed
A 1 mL de reactivo de Barfoed agregar 0.5 mL de solución de carbohidrato en un tubo de
ensayo debidamente rotulado y mezclar. Poner el tubo en baño de agua hirviendo. La
aparición de un precipitado rojo antes de los 6 min indica la presencia de un
monosacáridos. La aparición de un escaso precipitado rojo después de 9 min indica la
presencia de disacárido o polisacárido.
Prueba de Bial
En un tubo de ensayo agregar 2.5 mL de reactivo de Bial y luego agregar
aproximadamente 1 mL de la muestra. Llevar a baño de maría hirviente durante 3 min. La
aparición de un color verde botella, brillante y totalmente transparente, indica la presencia
de una pentosa. Algunos azucares dan con el Bial una coloración verde, pero esta es
opaca.
Prueba de Seliwanoff
Anadir 1 mL del reactivo de Seliwanoff a 0.5 mL de la solución de carbohidrato en un tubo
de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y colocar el tubo en un baño de agua hirviendo
por 4 minutos. Un color rojo intenso es prueba positiva para cetohexosas. El color es más
fuerte si se continúa calentando, pero en este caso las aldohexosas también darán color
rojo.
Prueba de Benedict
A 2 mL del reactivo de Benedict añadir 8 gotas de la solución de la muestra de
carbohidrato en un tubo de ensayo debidamente rotulado. Mezclar y calentar la solucion
en un bano de agua hirviente durante 5 minutos. Un precipitado verde; amarillo o rojo,
indica resultado positivo para azucares reductores. Los diferentes colores que pueden
aparecer se deben al tamaño de las partículas formadas: Las partículas grandes forman
precipitados rojo y las partículas pequeñas un precipitado verde. Examinar el color y la
cantidad de precipitado obtenido. Una pequeña cantidad de precipitado no es prueba
positiva.
Prueba de Sacarosa
A 5 mL de la muestra de carbohidrato agregar 5 gotas de HCl concentrado, calentar
durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo, enfriar y agregar NaOH hasta que la
solución sea neutra o débilmente alcalina. Con la solución hidrolizada realizar la prueba
de Seliwanoff.
Observaciones
No olvide plantear el diagrama de flujo para cada prueba.
PRACTICA DE LABORATORIO: PRUEBAS DE IDENTIFICACION LIPIDOS
Objetivo
Reconocer algunas propiedades físico-químicas representativas de los lípidos.
Fundamento
Los lípidos son aquellos compuestos que son solubles en compuestos orgánicos e
insolubles en agua.
Saponificación
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose
en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Estos se combinan con
los iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las
sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrolisis de los
triglicéridos se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar
a la formación de ácidos grasos y glicerina.
Lieberman-Buchard
El anhídrido acético reacciona con el colesterol en solución clorofórmica para producir un
color característico azul-verdoso. La naturaleza exacta del cromoforo es desconocida pero
la reacción probablemente incluye la esterificación del grupo hidroxilo en la posición 3
junto con otros arreglos en la molécula.
Materiales
· Tubos de ensayo
· Gradilla
· Varillas de vidrio
· Mechero
· Vaso de precipitado
· Pipetas
· Papel de filtro
Reactivos
· Éter etílico
· Cloroformo
· Alcohol etílico
· Solución de NaOH al 20%
· Cloroformo
· Anhídrido acético
· H2SO4 concentrado
· Acido graso (ácido oleico)
· Colesterol
Cada grupo debe llevar al laboratorio aceite de oliva y mantequilla.
PROCEDIMIENTO
Experimento I. Solubilidad
Etiquetar cinco tubos de ensayo con el nombre del disolvente: agua, éter, cloroformo,
alcohol frio y alcohol caliente. Colocar un pedazo de grasa en cada tubo. Verter 1 mL del
solvente en el tubo correspondiente (el alcohol se calienta previamente en el baño María,
tenga en cuenta el punto de ebullición del mismo). Mezclar bien y observar si hay algún
grado de dilución. Colocar en un papel de filtro una gota del líquido contenido en cada
tubo. Esperar a que se seque. Anotar los resultados (clasificar como insoluble, poco
soluble, medianamente y muy soluble).
Repetir el experimento reemplazando la grasa por 1 mL de aceite.
Experimento II. Saponificación
Tomar do tubos de ensayo limpios, en el primero colocar 2 mL de ácido oleico; en el
segundo colocar una muestra de grasa hasta una altura de 0.5 cm aproximadamente.
Agregar 2 mL de NaOH al 20%. Agitar enérgicamente y colocar los tubos al baño María
durante 30 minutos. Después de dejar en reposo, se pueden observar 3 fases: una inferior
clara que contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra
intermedia semisólida que es el jabón formado y una superior lipidia de aceite/grasa
inalterado.
Experimento III. Reacción de Lieberman-Buchard
Agregar 1.5 mL de disolución de colesterol en cloroformo un tubo de ensayo, luego
agregar 5 gotas de anhídrido acético y dos gotas de H2SO4 concentrado (este último por
las paredes del tubo), mezclar suavemente. Observar y anotar los cambios de coloración
que se producen.
PRACTICA DE LABORATORIO: PROPIEDADES FÍSICO – QUÍMICAS DE LOS
AMINOÁCIDOS
Objetivo
Reconocer la presencia de aminoácidos identificando sus características químicas.
Fundamento Teórico
Los aminoácidos son compuestos químicos que cumplen varias funciones dentro de la
célula, entre ellas:
1. Constituyen las unidades monoméricas de las proteínas.
2. Representan la única fuente de nitrógeno metabólicamente utilizable.
3. Aportan entre un 10% y un 20% de la energía que utiliza diariamente la célula.
Desde el punto de vista químico pueden definirse como moléculas orgánicas que poseen
al menos un grupo amino y uno carboxilo. Los aminoácidos proteínicos dictados por el
código genético son veinte y se caracterizan por tener enlazados sus grupos amino y
carboxilo a un mismo átomo de carbono (alfa).
Este grupo de moléculas cuenta con una parte constante representada por el carbono alfa
(Cα), el grupo carboxilo (COOH) y el grupo amino (NH2), por consiguiente todos los
aminoácidos tienen algunas propiedades físico-químicas comunes, aunque debido a que
cada uno posee una cadena lateral o grupo R diferente, los 20 aminoácidos muestran
características especiales y únicas que permiten su clasificación.
Reacciones químicas de los aminoácidos
- Reacción de la Ninhidrina: Esta prueba tiene como finalidad detectar grupos amino
libres. Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina en un pH entre 4 y 8, cuando son
expuestos a un exceso de la misma y sometidos a calentamiento (100ºC); si éstos tienen
un grupo amino libre, reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído
con un átomo de carbono menos que el aminoácido precursor. La ninhidrina reacciona
con el amoniaco liberado, formando un complejo azul o púrpura (llamado púrpura de
Ruhemann).
La prueba de ninhidrina en la prolina, genera coloración amarilla debido a que este
aminoácido presenta un grupo imino en vez de un amino. Los polipéptidos, las proteínas
y otros compuestos aminados pueden también reaccionar con la Ninhidrina dando
coloración azul pero sin liberar CO2.
- Reacción de Admakiewic: Esta prueba es específica para grupos indol, los cuales
tienen la característica de reaccionar con aldehídos mediante condensación en presencia
de un agente deshidratante como el ácido sulfúrico. La reacción genera moléculas con
coloración violeta que se aprecian en la interfase del ácido sulfúrico y la solución.
Las proteínas y péptidos que contengan aminoácidos que contengan este grupo, también
darán resultado positivo a la reacción de Adamkiewicz.
-Reacción Xantoproteica: Esta reacción reconoce el grupo fenil presente en una
molécula, con el cual el ácido nítrico forma compuestos amarillos, debido a la nitración del
grupo fenilo que posea una molécula orientadora para posiciones orto del anillo.
Si en este punto se modifica el pH de la solución adicionando un hidróxido de alguno de
los metales alcalinos, se obtiene la sal correspondiente que toma coloración anaranjada.
Los polipéptidos, las proteínas y otros compuestos que posean grupo fenilo, también
darán resultado positivo en esta reacción.
- Reacción de los tiogrupos: Este ensayo detecta la presencia de grupos sulfhidrilo o tiol
(-SH), presente en algunos aminoácidos, y por consiguiente, en algunos péptidos y
proteínas.
La reacción ocurre en presencia de acetato de plomo en medio alcalino, donde debido a
la presencia del tiol, se da la formación de sulfuro de plomo que se observa en la solución
mediante un precipitado oscuro.
Materiales
Reactivos General
Agua destilada
Acetato de plomo 10%
Ácido nítrico concentrado
Ácido sulfúrico concentrado
Albúmina 1%
Cisteína 0.01M
Fenilalanina 0.01M
Fenol 0.1%
Formaldehído
Hidróxido de potasio 40%
Hidróxido de sodio 20%
Metionina 0.01M
Ninhidrina 0.1%
Sacarosa 0.01%
Solución de aminoácidos
Solución desconocida
Triptófano 0.01M
Gradillas para tubos de ensayo
Pinza para tubo de ensayo
Pipetas de 1mL
Pipetas de 2mL
Pipetas de 5mL
Tubos de ensayo
Vaso de precipitado para baño de agua
Mecheros
Pipeteadores
PROCEDIMIENTO
1. Reacción de la Ninhidrina: Etiquetar cinco tubos de ensayo con el nombre de la
solución: Albúmina, metionina, solución de aminoácidos, sacarosa y solución
desconocida, adicionar 1,5 mL de cada una de las anteriores soluciones en el
respectivo tubo, finalmente en cada uno de los tubos agregar 0,5 mL de reactivo
Ninhidrina, agitar todos los tubos de ensayo y mantenerlos en baño de agua en
ebullición durante 5 min. Observar los resultados obtenidos en cada uno de los
tubos, especificando si el resultado es positivo o no.
2. Reacción de Adamkiewicz: Etiquetar 3 tubos de ensayo con el nombre de la
solución: Albúmina, triptófano y solución desconocida, adicionar 0,5 mL de cada
una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo, adicionar en cada uno de
los tubos 3 gotas de formaldehido, agitar los tubos y adicionar cuidadosamente
1mL de ácido sulfúrico, de forma lenta por la paredes del tubo sostenido en una
gradilla. Es una reacción altamente exotérmica y si no se realiza
cuidadosamente pueden producirse salpicaduras y quemaduras. Una vez
termine la reacción no se deben agitar los tubos. Observar los resultados
obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es positivo o no.
3. Reacción Xantoproteíca: Etiquetar 5 tubos de ensayo con el nombre de la
solución: albúmina, triptófano, fenol, fenilalanina y solución desconocida, adicionar
2 mL de cada una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo y finalmente
adicionar en cada uno de los tubos 1 mL de ácido nítrico (adicionar
cuidadosamente el ácido), mantener los tubos en baño de agua en ebullición
durante 30 segundos. Posteriormente enfriar los tubos y adicionar en cada uno de
los tubos 5 mL de la solución de hidróxido de sodio al 20%. Observar los
resultados obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es
positivo o no.
4. Reacción de los Tiogrupos: Etiquetar 4 tubos de ensayo con el nombre de la
solución: albúmina, cisteína, metionina, solución desconocida, adicionar 1 mL de
cada una de las anteriores soluciones en el respectivo tubo, adicionar a cada uno
de los tubos 1 mL de hidróxido de potasio y 3 gotas de acetato de plomo. Posterior
mantener los tubos de ensayo en agua en ebullición durante 10 minutos. Observar
los resultados obtenidos en cada uno de los tubos, especificando si el resultado es
positivo o no.
Al final de la práctica cada grupo debe entregar una hoja con los respectivos
resultados.
PRACTICA DE LABORATORIO: CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE
AMINOACIDOS
Objetivos:
- Aplicar la cromatografía en la detección de aminoácidos.
- Realizar los cálculos del Factor de Retención (FR).
Fundamento:
La cromatografía es una técnica de separación que presenta distintas variantes. En toda
separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y otra
estacionaria, que se mueven una con respecto a la otra manteniendo un contacto íntimo.
La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de la muestra se distribuyen
entre la fase estacionaria y la móvil. Los componentes de la mezcla a separar invierten un
tiempo diferente en recorrer cada una de las fases, con lo que se produce la separación.
Los métodos cromatográficos pueden aplicarse a la separación, identificación y análisis
cuantitativo de aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos, ácidos nucleicos, lípidos e
hidratos de carbono.
En esta práctica, vamos a utilizar la cromatografía ascendente sobre papel. La fase
estacionaria es la celulosa del papel y la móvil una mezcla de disolventes orgánicos y
agua. La celulosa retiene cierta cantidad de agua entrelazada entre sus fibras y da lugar a
un mecanismo de reparto de los componentes de una muestra que es aplicada sobre ella
y posteriormente se hace fluir un disolvente de polaridad distinta de la del agua. Según la
solubilidad que tengan los componentes de la muestra respecto a las dos fases así será
su movilidad.
Materiales
General Reactivos A cargo de cada
grupo
- 4 Tubos de ensayo
- Pinza para tubo de
ensayo
- 1 Gradilla
- 1 Pipeta 1 mL
- 1 Pipeta 5 mL
- 1 Vaso de precipitado
de 250
- 1 Probeta 100 mL
- 1 vidrio de reloj grande
- Estufa de
calentamiento a 100°C
- Mezcla de solventes para la
cromatografía: n-butanol:ácido
acético glacial: agua (12:3:5) (aprox
5 mL de la mezcla de solventes para
cada grupo) Preparar el mismo día
de la práctica.
- Solución de ninhidrina al 0,5% en
acetona
- Solución 1. lisina, prolina y
fenialanina al 1%. (1mL por cada
grupo)
- Solución 2. Ácido glutámico, valina
y leucina
- 3 Capilares
- Papel aluminio
- Regla graduada
- Atomizador pequeño
Lápiz
Guantes de látex o
nitrilo.
Toallas absorbentes.
PRACTICA DE LABORATORIO: DESNATURALIZACION Y CUANTIFICACION DE
PROTEINAS
Objetivos
1. Comprobar la desnaturalizacion de proteinas por diferentes efectos.
2. Cuantificar una muestra problema en solucion.
Fundamento
Desnaturalización
La estructura covalente de las proteínas posee un carácter informacional secuencial, que
determina la estructura tridimensional biológicamente activa, terciaria o cuaternaria según
la proteína. La función se ejerce mediante el reconocimiento molecular, el cual se
establece en virtud de la disposición espacial de las cadenas laterales de determinados
residuos de aminoácidos; por tanto, el nivel estructural terciario o cuaternario posee un
carácter informacional-conformacional, que permite el funcionamiento de la proteína. La
presencia de determinados agentes físicos o químicos provoca la ruptura de algunas
interacciones no covalentes, y si están presentes, la de los puentes disulfuros y con ello
se produce, en mayor o menor grado, la perdida de la estructura tridimensional de la
proteína y por ende su función. Este fenómeno se conoce como desnaturalización.
Resulta oportuno precisar que la desnaturalización no afecta los enlaces peptídicos, por lo
que se mantiene el nivel primario.
Cuantificación
En la prueba de Biuret el sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que
contienen dos o más enlaces peptidicos dando un complejo de coloración violeta, la
intensidad del color obtenido es una medida del numero de enlaces peptidicos. Las
proteínas reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteau para dar un complejo coloreado,
el color que se forma es debido a la reacción del cobre alcalino con la proteína. La
intensidad del color depende del número de aminoácidos aromáticos presentes y
cambiara según la clase de proteína.
Materiales
· 6 Tubos de ensayo
· Pipeta graduada de 1 mL
· Pipeta graduada de 5 mL
· Termómetro
· Vaso de precipitado de 250 mL
· Gradilla
· Malla de asbesto
· Tripode
· Espectrofotómetro
Reactivos
Proteínas* (5g/L albumina, caseína, gelatina)
Solución de clara de huevo**
Patrón de proteínas (solución de albumina5 mg /mL). Prepárese fresco.
Patrón de proteína (solución de albumina 0.2 mg/mL). Prepárese fresco.
Acido clorhídrico 1 M
Hidróxido de sodio 1 M
Acido nítrico (conc.).
Etanol 96%
Acetona
Reactivo de Biuret. (Disuelva 3 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 9 g de tartrato
sódico potásico en 500 mL de hidróxido de sodio 0.2 M; añada 5 g de yoduro potásico y
complete hasta 1 L con hidróxido de sodio 0.2 M.)
Solución alcalina de carbonato de sodio (Na2CO3 20 gl/L en NaOH 0.1 M).
Solución de sulfato de cobre-tartrato sódico potásico (5 gl/L CuSO4.5H2O en tartrato
sódico potásico 10 g/L). Prepárese fresco mezclando las dos soluciones preparadas por
separado.
'Solucion alcalina'. Preparese el mismo dia mezclando 50 mL de (1) y 1 mL de (2).
Reactivo de Folin-Ciocalteau. (Diluya el reactivo comercial con un volumen igual de agua,
el mismo día que se va a utilizar. Esta es una solución de tungstato de sodio y molibdato
de sodio en acido fosfórico y acido clorhídrico.
*La caseina se disuelve en un poco de NaOH diluido y las otras proteínas en solución
salina.
** diluir 1.0 mL de clara de huevo hasta 25mL con solución salina
PROCEDIMIENTO
Experimento I. Desnaturalización por pH extremo
A 2 mL de la solución de proteína, agregar lentamente por las paredes del tubo 2 mL de
HNO3 concentrado hasta que se formen dos capas; luego mezcle cuidadosamente los
dos líquidos. Anotar sus observaciones.
Realizar las pruebas para todas las proteínas.
Experimento II. Desnaturalización por calor
En un tubo de ensayo colocar 4 mL de solución proteínica, luego colocar el tubo en un
baño de agua hirviendo durante 10 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Anotar sus
observaciones.
Realizar las pruebas para todas las proteínas.
Experimento III. Precipitación por solventes orgánicos
A 2 mL de la solución de proteína, añadir 2 mL de etanol y agitar cuidadosamente. Repetir
el procedimiento pero adicionando 2 mL de acetona en lugar de etanol.
Realizar las pruebas para todas las proteínas.
Experimento IV. Prueba de Biuret
A 3 mL de la solución de proteína (5 mg de albumina/mL), añadir 4.5 mL del reactivo de
Biuret, mezclar y calentar a 37 °C durante 10 minutos. Dejar enfriar y leer la absorbancia a
540 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas
en la Tabla 1. Determinar la concentración de proteínas de una muestra problema
después de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia).
Experimento V. Método de Folin-Lowry para determinación de proteínas
A 1 mL de la muestra (solución de albumina 0.2 mg/mL) agregar 5 mL de 'solución
alcalina'. Mezclar vigorosamente y dejar reposar a temperatura ambiente por 10 minutos o
más. Agregar 0.5 mL de reactivo diluido de Folin-Ciocalteau en forma rápida y mezclando
inmediatamente. Después de 30 minutos leer la absorbancia contra el blanco apropiado a
750 nm. Reportar los datos de la absorbancia de acuerdo a las concentraciones descritas
en la tabla 2. Determinar la concentración de proteínas de una solución problema después
de preparar una curva patrón (grafica de concentración vs absorbancia).
Observaciones
Tabular sus resultados, realizar las curvas de calibración y comparar los métodos de
cuantificación de Folin y Biuret.
PRACTICA DE LABORATORIO: CINETICA ENZIMATICA
Objetivos
1. Identificar los factores que afectan la actividad enzimática de la a-amilasa.
2. Determinar la actividad enzimática de la a-amilasa de acuerdo a las diferentes
propiedades que presentan los reactantes y productos de las reacciones catalizadas.
3. Determinar experimentalmente las condiciones optimas de temperatura, pH y
concentraciones de enzima y sustrato para la a-amilasa.
Fundamento
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones
catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por
los cuales transcurren. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir por:
- la cantidad de sustrato que desaparece en la unidad de tiempo.
- la cantidad de producto que aparece en la unidad de tiempo.
En esta práctica de laboratorio se comprobara la influencia de la concentración del
sustrato (S), de la enzima (E), el pH y la temperatura (T) en la cinética de la enzima a-
amilasa salival en su acción sobre los enlaces a1-4 del almidón. Al reaccionar el almidón
con lugol se produce un color azul, y con base en la desaparición del almidón en la unidad
de tiempo podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación
de los factores que influyen en ella.
Materiales
· 5 Tubos de ensayo
· placa de porcelana con excavaduras
· vasos de precipitado
· bano de agua termostatado
· cronometro
· pipeta graduada 1mL
· pipeta 10mL
· gotero
Reactivos
· Solucion de la enzima*
· Agua destilada.
· Solucion de almidon al 1%.
· Cloruro de sodio 1%
· Disoluciones tampon de pH 5.0; 6.8 y 8.0.
· Reactivo de Lugol diluido (lugol:agua 1:2)
· Hielo
*Solucion de la enzima: Se prepara colectando 0.5 mL de saliva (previo enjuague de la
boca con agua
destilada) y diluyendolo hasta 20 mL con agua destilada.
** Lugol: Se prepara disolviendo 1 g de iodo, 2 g de KI en 200 mL de agua destilada.
Observaciones
Registrar los datos obtenidos de los diferentes experimentos y analice.
Recomendaciones a tener en cuenta para la presentación de Informes
El informe se debe elaborar a mano, hojas tamaño carta y paginadas. El informe será
entregado en la siguiente práctica. Las tablas y figuras deben colocarse en la misma página en que se mencionan o en la siguiente. Para su numeracion se utilizan numeros arabigos en orden consecutivo y no se debe emplear la abreviatura “No.” ni el signo “#”. El titulo de la tabla o figura se debe escribir en la parte superior de la misma. Toda tabla y/o figura se debe relacionar dentro del texto. El informe debe incluir:
- Título de la práctica: debe ir en letra mayúscula. - Fecha de realización de la práctica. - Nombre de los autores. - Numero del grupo y subgrupo. - Resumen: mínimo 5 líneas. - Palabras clave: se plantean 5 a 8 palabras clave o frases que identifiquen los
principales aspectos del trabajo. - Introducción: describir el planteamiento general del tema, dando la información
necesaria en forma concisa y precisa haciendo referencia solamente a la bibliografía directamente relacionada. No se deben incluirrevisiones amplias de bibliografía (no se aceptan páginas de internet, ni repetir lo que está en la guía). En este ítem se incluyen los objetivos de la práctica dentro del texto.
- Datos y cálculos: los datos que se colectan durante la práctica se deben ordenar en tablas (si es posible), asimismo los cálculos se deben presentar en forma ordenada, si un tipo de cálculo se repite, solo se plantea una vez. Siempre que sea posible calcular el error experimental.
- Análisis de resultados: deben presentarse de forma precisa incluyendo, si da a lugar tablas y figuras (las cuales dan origen al análisis y discusión de los resultados), la discusión debe estar enfocada a la interpretación de los datos experimentales. Cuando sea necesario se deben plantear las reacciones.
- Conclusiones: deben estar respaldadas por los resultados y el análisis, una conclusión es clara, corta y concisa.
- Bibliografía: se deben referenciar los autores, titulo, volumen, país y ano de publicación.