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7/25/2019 Fundamento de Viabilidad
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M.C.
Riva y D.
Ldpez
T F C W D F TOXICIDAD
N VlTRO
DF CONTAMINAN-
TEMAS DE DIVULGACION
UTlLlZAClON DE LAS PRUEBAS DE CITOTOXICIDAD IN VlTRO EN LA
VALORACION DE LOS EFECTOS DE LOS CONTAMINANTES AMBIENTALES.
0 1 Resumen
Este artculo pretende dar una visin general
sobre el tema y las tcnicas de toxicidad in vitro con
cultivos celulares, las consideraciones bsicas, las
ventajas y limitaciones, y destacar las posibilidades
que ofrecen este tipo de ensayos en la valoracin
del posible efecto nocivo de los productos qumicos
de uso humano o industrial en el medio ambiente.
M C Riva y
D.
Lbpez**
1 INTRODUCCION
Numerosos contaminantes quimicos de ori-
gen antropognico se introducen en los medios acu-
ticos continentales, estuarios y aguas marinas y su-
ponen un peligro potencial para los hbitats indge-
nas, as como una alteracin del equilibrio de los
ecosistemas acuticos.
A
pesar de que muchos de los compuestos
quimicos son estables, muchos otros son
Palabras clave: Citotoxicidadin vitro, cultivos celulares, efectos
susceptibles de sufrir transformaciones b iolgicas y
ambientales.
no biolgicas dando lugar a una gran variedad de
derivados. Tanto los compuestos qumicos como sus
derivados pueden acumularse en el agua y
0 2 Summary U SE O F /N V lTR O
sedimentos alcanzando niveles txicos. En la
CYTOTOX/C/TYASSAYS N THE EFFECT
determinacin de su toxicidad existe una necesidad
imperiosa de utilizar ensayos relativamente simples
O F
y rpidos para estimar el riesgo de compuestos
POLLUTANTS.
especficos, pape l que juega la toxicidad celular.
This article try to give a general review about
in vitro cytotoxicity assays with cultured cells; basic
considerations, advantages and limitations, and the
possibilities they offer in the effect valuation of
chemicals (of human or industrial use) in the
environment are presented in this paper.
Key words: In vitro, cytotoxicity assays, cultured cells,
environmental risks.
0 3 Rsum USAGE DES ESSAIS DE
CITOTO XICITE A L EVALUATION DES
EFFETS DES POLLUANTS SUR
LJENVIRONNEMENT
On pretend donner une vision gnrale sur
les techniques de toxicit in vitro avec cultures
cellulaires, les considrations basiques, les
avantages et limitations, et dtacher les possibilites
dans I valuation de I effet des produits chimiques
d usage humain et industriel, dans i environnement.
Mots clef: Cirotoxicite, In vitro, cultures cellulaires, effects
I environnement.
Dra. en C ienaas Biolbgicas,
a
Carmen Riva Juan. Investigadora de la
Universidad Politbcnica de Catalunya. Jefa del Laboratorio de Toxiwlog fa
Ambiental del INTEXTER UPC).
La toxicologia celular puede considerarse
como el conjunto de investigaciones cualitativas y
cuantitativas, sobre los efectos nocivos o respuestas
biolgicas no deseadas, que experimenta un cultivo
celular expuesto a un determinado compuesto
qumico, a fin de poder extrapolar los resultados a
nivel de organismo. Este tipo de pruebas pueden
tambin ser utilizadas como alternativa al uso de
animales en ensayos toxicolgicos.
A pesar de que
las pruebas in vivo no podrn ser substituidas por
completo, sta es una rama de la ciencia que avanza,
minimizando en la medida de lo posible la utilizacin
de organismos en los bioensayos.
Los numerosos estudios de este campo, han
permitido que hoy en da se pueda
viabilizar el cultivo
de una gran variedad de lneas celulares de
diferentes rganos y especies, sobre los que realizar
cualquier tipo de estudio de carcter biolgico,
bioqumico o molecular.
Algunas veces ha sido posible demostrar el
riesgo de un determinado producto qumico para el
hombre, pero slo de una manera asociativa causa-
efecto, sin poder entender sus motivos con el empleo
de pruebas con animales.A menudo estas carencias
pueden ser suplidas con la utilizacin de pruebas in
vitro que permiten una comprensin ms profunda
de las causas.
Licenaado en C iencias Bioldgicas Bioquimica). David L6pez R ibas.
Estudiante de Doctorado. Laboratorio de Toxicologia Ambiental del
INTEXTER U.P.C.).
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M C Rrva
y D
Lpez
TECNICAS DE TOXICIDAD N VlTRO DE CONTAMINANTES
abla
Eagle's Minimun Essetial Medium
Ejemplos de re lacin entre propiedades funcionales
Leibovitz's L-15 Medium
y tipo celular segn (E. Walum et al 1990)3)
Estos medios tienen una composicin qumi-
ca definida y una biolgica variable debido a que
necesitan la presencia de 10 -1 5s de suero fetal
T i ~ oe clula Caracterstica bovino como complemento nutritivo esencial. Ade-
hepatocitos actividad P 450
ms y dependiendo del tipo celular es necesaria la
pr. de albmina presencia de otros complementos como: DMSO,
gluconeognesis
cido oxalactico, mercaptoetanol, Hepes, triptosa
fosfato, etc.. En muchos casos la eleccin de me-
nef ronas
dios es obvia o recomendada por la fuente de ob-
tubo proximal microvellosidades prominentes
tencin de las clulas originales, pero en algunos
actividad fosfatasa alcalina
casos es una eleccin puramente emprica y expe-
tubo dista1 microvellosidades cortas rimental.
msculo cardaco contracciones espontneas
receptores B-adrenrgicos
msculo esqueltico receptores nicotinicos de la
2 5 Lneas celulares
acetilcolina
Cualquier tejido o clula no puede ser mante-
clulas endoteliales actividad fosfatasa alcalina
nida en condiciones in vitro debido a caractersticas
linfocitos inmunoglobulina fisiolgicas restrictivas. Se ha podido comprobar ex-
perimentalmente que existe una relacin inversa
Una vez establecido el cultivo se ha de tener
entre el grado de especializacin de la clula y la
en cuenta que las l neas celulares
f 10
son
viabilidad que presenta el cultivo, as por ejemplo
completamente estables geneticamente Por
1
que
es mucho ms factible el uso de clulas poco es-
hay que COmervar un stock- Las clulas pueden ser
pecificas como las embrionanas o tumorales que
congeladas en Presencia de anticongelantes
clulas con un alto grado de diferenciacin como
naturales como e l glicerol o d imetilsulfxido a un 5-
las nerviosas o renales. El empleo de clulas
1O%, para evitar la ormacin de cristales que puedan
tumorales es til en numerosas pruebas in vitro de-
afectar algunas estructuras. Se crean a lcuotas de
bido a su fac ilidad de desarrollar un cultivo, ya que
2-6x1
o6
cluiaS/mi, reducindose la temperatura han perdido la capacidad de control sobre el creci-
lentamente hasta aprOX. -90C y transfirindose a
miento, pero por contra se han de tener en cuenta
un recipiente de nitrgeno liquido O a Un congelador
consideraciones especiales como el hecho de que
de bajas temperaturas.
su condicin de transformadas puede afectar el ni-
vel de respuesta respecto a una clula normal. A
2 4 Medios de cultivo
continuacin se citan algunas de las clulas ms
utilizadas en ensayos de c itotoxicidad:
Coincidiendo con la diversidad de tipos
y
es-
tirpes celulares que pueden ser cultivadas existe
Clulas de mamferos:
tambin una gran variedad de medios, pero la ma-
3T3-L1 clulas embriognicas de ratn
yora de veces la diferencia estriba bsicamente en
BC L-DI clulas embriognicas humanas
un complemento, o como en el caso de clulas de
LS-929 fibroblastos de ratnLLC-RKI
peces marinos en una solucin salina para favore- LLC-RK1 clulas renales de rata
cer la correcta osmolaridad y evitar desrdenes
inicos. En su mayor parte estn compuestos por
Clulas de peces:
agua bidestilada en un 70-80%, una fuente de car-
RTGQ fibroblastos de trucha rainbow
bono, aminocidos, algn antibitico de proteccin
(arcoiris)
como estreptomicinao bencilpenicilina, ya que al ser
FHM
clulas epite liales de
fathead minnow
medios ricos en nutrientes son susceptibles de su-
BF-2
fibroblastos de agallas de sun fish
frir contaminacin por hongos o bacterias, y un tam-
BB fibroblastos de agallas pez gato
pn salino que generalmente es PBS (tampn
fosfato). A partir de esta base pueden hacerse las
variaciones necesarias para adaptarlo a la estirpe
celular en cultivo. Los medios ms utilizados son
2 6 Condiciones de cultivo
comunes y no presentan grandes variaciones entre
pH:
La mayora de clulas crecen a pH fisio-
clulas de peces y de mamferos4),entre e llos cabe
lgico
pero
veces el
ptimo
puede ser diferente,
citar los siguientes:
en cualquier caso es necesaria la presencia de un
tampn salino, generalmente bicarbonato sdico
Dulbecco's Modified Eagle
(pKa:6.1). Tambin puede ser necesaria la creacin
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TECNiCASDE TOXlClDAD N VlTRO DE CONTAMlNANlES
Desde los ltimos diez o quince aos se ha
ofrecen la posibilidad de valorar el efecto de un
producido un incremento en la aceptacin del uso
compuesto qumico sobre la biota de aguas
de cultivos celulares en pruebas de toxicidad, sobre
continentales y marinas. Los primeros trabajos
todo en el campo de la industria farmacutica, donde
realizados en este sentido con clulas de peces
es importante demostrar la inocuidad de un producto
fueron llevados a cabo por Pachlin y Perhumber en
de nueva formacin o en su defecto tener un
1968 y desde entonces los ensayos de citotoxicidad
profundo conocimiento de los posibles efectos
con este tipo de clulas han sido utilizados por otros
secundarios que pueda desarrollar. investigadores4)con el propsito de cubrir los
Existen diferentes proyectos internacionales
siguientes objetivos:
para e l desarrollo y el estudio de las tcnicas in vitro,
Crear un rango de medicin respecto a la
como el caso de la Scandinavian Society for Cell
toxicidad aguda de un determinado
Toxicology quien cre a finales de la dcada de los
compuesto.
ochenta el programa MElC (Multicenter Evaluation
Relacionar la citotoxicidad de una serie de
of In Vitro Citotoxicology), con la intencin de
agentes respecto a algunos de sus
profundizar tanto en el terreno terico como
parmetros f sico-qumicos.
experimental de estas tcnicas, y valorar una amplia Es tud iar la bio trans form ac in d e
variedad de productos nuevos y ya existentes. Otro determinadas toxinas mediante procesos
importante foco es el ERGAlT-FRAME (European metablicos.
Research Group for Alternatives in Toxicity Testing),
Valorar el efecto de la interaccin entre
el cual ha desarrollado ms de cincuenta protocolos combinaciones de diferentes compuestos.
para el estudio y valoracin de citotoxinas. El uso de
La relacin de similitud entre los valores ob-
los ensayos in vitro permite una v isin diferente de
tenidos en estudios in vitro con clulas de peces y
la toxicidad sugiriendo cuestiones nuevas sobre e l
los ensayos in vivo, ha sido establec ida para algu-
efecto de un agente (MEIC 1989) tales como:
nos compuestos analizados por varios autores
loJ1 .
La utilizacin de este tipo de clulas no conlleva gran-
Se puede predecir la concentracin letal
des consideraciones al efectuar cambios significati-
en sangre de aquellos agentes que
vos en los protocolos de trabajo, e igualmente sus
presentan una IC50 significativa?.
resultados son equiparables a los esperados en una
Se pueden combinar los resultados de
valoracin in vitro con clulas de mamfero.
ensayos citotoxicolgicos con parmetros
El amplio volumen de contaminantes genera-
toxicocinticos para predecir la dosis letal dos por el hombre que son eliminados a travs de
aguda humana?. ros es muy importante y afecta especialmente a los
La prediccin de la dosis letal humana con
paises con un alto grado de desarrollo; como ejem-
ensayos citotoxicolgicos es ms efectiva
plo baste mencionar el hecho de que se han podido
que la prediccin convencional con pruebas
identificar ms de 1000 derivados qumicos de ori-
con animales?.
gen industrial en el agua, biota y sedimentos de
Que combinacin de pruebas citolgicas
los Grandes Lagos (EEUU-Canad)
por la
es la mejor para establecer un criterio base?.
lntemationa l Joint Comisin (1983).
Los test LC50 con peces son relativamente
Las caractersticas de estas tcnicas hacen
costosos y de larga duracin, por eso se plante el
que haya un gran inters por parte de las industrias
desarrollo de tcnicas in vitro que sustituyeran par-
qumicas que desarrollan productos de uso d irecto
cialmente el uso de bioensayos, para valorar la cali-
por el hombre o productos que son susceptibles de dad de las aguas y establecer los lmites de presen-
ser eliminados a ros o aguas urbanas. En este lti-
cia de los contaminantes urbanos e industriales.
mo aspecto, existe cada vez ms una fuerte presin
tanto legal como sanitaria que favorecen la imposi-
cin de estas tcnicas en industrias como : l Far-
4
CONCLUSIONES
macutica (medicamentos, cosmticos, etc), l Tex-
Miles de productos qumicos se someten cada
ti1 (tensioactivos, colorantes, auxiliares, etc) e l Qu-
ao a rigurosas pruebas ordenadas a valorar su po-
mica (ferti l izantes, insecticidas, aerosoles,
tencial toxicidad. La inmensa mayora de ellas se
conservantes, etc).
realizan con animales: las reacciones que m uestran
ratas, conejos, ratones y peces ante los preparados
qumicos constituyen por ahora los mejores ensa-
3 1 tilizacin de cultivos de
yos disponibles para predecir los efectos que dichas
clulas
de
peces
sustancias ejercern sobre el organismo.
En la ltima dcada, el problema de las prue-
Los estudios con clulas de peces merecen
bas de toxicidad con animales adqu iri unos tintes
ser tratados especialmente ya que a pesar de ser
apremiantes y polmicas. Las sociedades protecto-
menos numerosos, tienen un gran inters en estudios
ras de animales denunciaron el sufrimiento de m i-
de ecotoxicidad e impacto ambiental. Estos ensayos
llones de estos y las industrias que fabrican produc-
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