Download - Funcionamiento y Uso de Micropipetas
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PIPETAS AUTOMTICAS
Las pipetas son dispositivos que se caracterizan por
carecer de depsito y que se utilizan para medir o transvasar
pequeos volmenes de lquido de un recipiente a otro con gran
exactitud. Inicialmente se fabricaron en vidrio pero hoy en da
existen una gran variedad de opciones. Podramos hacer una
primera divisin en pipetas de volumen fijo y pipetas de volumen
variable. Las de volumen fijo son ms precisas que las de
volumen variable, aunque cuando en un anlisis se usa una de
volumen variable habiendo ajustado el volumen requerido y sin
variarlo ms, su precisin es comparable a la de una pipeta de
vidrio graduada de clase A.
Tambin podramos dividirlas en pipetas manuales y
electrnicas, aunque estas ltimas son mucho menos abundantes
debido fundamentalmente a su precio mucho ms elevado, por lo
que nos centraremos en las manuales. A su vez tambin
podramos distinguir entre pipetas monocanal y multicanal.
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La pipeta mecnica o de pistn funciona generalmente
transmitiendo la fuerza que un operador, de forma manual, ejerce
sobre un mbolo que se encuentra unido a un pistn mediante un
eje que lo desplaza a lo largo de un cilindro de longitud fija,
forzando un volumen predefinido de lquido fuera de la pipeta.
Las pipetas a pistn son en general de dos tipos como
hemos visto antes: las de volumen fijo, que dispensan un volumen
predeterminado de lquido, el cual es conocido como volumen
nominal (Vn) y las de volumen variable que permiten ajustar el
volumen dispensado dentro de un rango determinado en las
especificaciones de la pipeta. La variacin en el volumen se logra
modificando la longitud de la carrera del pistn dentro del mbolo
mediante un micrmetro. En estas de volumen variable el
volumen nominal es el lmite superior del rango de volumen de la
pipeta, de acuerdo con las especificaciones dadas por el
fabricante.
Cada uno de los tipos mencionados se pueden
subdividir en dos subtipos: A y B. Las pipetas del subtipo A se
denominan pipetas de desplazamiento por aire o neumticas,
debido a que existe un volumen de aire entre la cabeza del pistn
y el lquido en el cilindro (este es el tipo ms corriente). A las
pipetas del subtipo B se les denomina pipetas de desplazamiento
positivo o de desplazamiento directo porque el pistn se
encuentra en contacto directo con el lquido.
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Las pipetas de desplazamiento directo se recomiendan
para lquidos con alta densidad, alta viscosidad o alta presin de
vapor. Presentan el inconveniente de que las puntas a utilizar son
mucho ms caras puesto que cada punta lleva su pistn
incorporado (a la manera de una jeringuilla). Es por esta
caracterstica que tambin evitan contaminaciones cruzadas
provenientes de la pipeta o de aerosoles y muestras. Las pipetas
neumticas usan puntas mucho ms baratas pero no son tan
exactas como las de desplazamiento positivo cuando se trabaja
con volmenes muy pequeos de lquido debido a la
compresibilidad del aire.
Todas las pipetas de pistn disponen de puntas
desechables para minimizar los riesgos de contaminacin. Para
facilitar el uso del tipo de punta adecuado los fabricantes han
adoptado un cdigo de color segn el volumen a dispensar y que
en las de uso ms general coincide con el color de las puntas
utilizadas.
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Instrucciones para el manejo de una pipeta automtica
Ajustar el volumen girando la rueda hasta que en la escala aparezca el volumen deseado.
Colocar una punta de plstico (adecuada) en la punta de la
pipeta haciendo una leve presin para lograr un buen ajuste.
1. Oprimir el botn pulsador con el dedo pulgar, hasta el primer tope y sin soltarlo introducir
verticalmente la pipeta, hasta que la punta se
sumerja de 2 a 5 mm dentro del lquido.
2. Liberar lentamente la presin sobre el botn. Despus de 23 segundos retirar, siempre verticalmente, la pipeta del lquido deslizando la
punta contra la pared del recipiente.
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3. Apoyando la punta contra la pared del recipiente donde se quiere colocar el lquido, presionar
lentamente el botn pulsador hasta el primer
tope. Despus de un segundo, y sin soltar el
botn pulsador, terminar de vaciar la pipeta
presionando hasta el segundo tope.
4. Retirar la pipeta deslizando la punta contra la pared del recipiente.
RECOMENDACIONES GENERALES AL PIPETEAR
El empleo de una buena tcnica al utilizar las pipetas puede
incrementar la exactitud hasta en un 5 %. Hay tanto aspectos
instrumentales y de condiciones ambientales como de tcnica de
manejo de la pipeta.
EN LA TCNICA EMPLEADA
+ PROFUNDIDAD DE INMERSIN DE LA PUNTA
La profundidad de inmersin de la punta es especialmente
importante en el uso de volmenes pequeos. Si la punta se
sumerge demasiado, se aspirar ms lquido debido al aumento de
la presin. Si por el contrario, la punta no se sumerge lo
suficiente, se puede cargar aire con las consiguientes burbujas y
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volumen inadecuado. Sumergir la punta a una profundidad
adecuada puede mejorar la precisin hasta un 5%.
+ UNIFORMIDAD AL PIPETEAR
Es fundamental mantener un ritmo, velocidad y tcnica
adecuada al mover el mbolo. Una aspiracin demasiado rpida e
incontrolada puede llevar a la formacin de aerosoles,
salpicaduras y posible contaminacin del eje y del pistn,
pudindose producir incluso prdida de volumen de la muestra.
Una velocidad de pipeteo uniforme puede mejorar la precisin
tambin hasta un 5%.
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+ ANGULO DE INMERSION VERTICAL
Se ha de procurar mantener el ngulo de inmersin de la
pipeta lo ms cercano a la vertical posible. De otra forma, la
columna vertical de lquido ser ms pequea y se aspirar
demasiada muestra. Por el contrario, al dispensar el lquido, la
punta se ha de mantener en un ligero ngulo frente a la pared del
vaso para asegurar un correcto vaciado. Se estima que pipetear de
forma vertical o como mximo dentro de un ngulo menor de 20
de sta, puede mejorar la precisin hasta en un 2,5%.
+ TCNICA DE DISPENSACIN
Para la mayora de aplicaciones se recomienda dispensar
con el extremo de la punta apoyado contra la pared del recipiente.
As se reduce o elimina el hecho de que se quede algo de muestra
en el interior de la punta despus de acabar la dispensacin.
Retirad la pipeta deslizando el extremo de la punta hacia arriba
por la pared lateral para liberar cualquier gotcula restante en el
orificio de la punta. Esta tcnica puede mejorar la precisin hasta
en un 1%.
Otra tcnica consiste en dosificar directamente en la
superficie del lquido. Es crucial usar una punta de pared fina para
que no quede ninguna gotcula en el interior de la punta. Si se
dispensa directamente dentro del lquido tendremos que sacar la
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pipeta mantenindola en el segundo tope para evitar una toma de
muestra despus de la dispensacin.
+ ENJUAGE PREVIO DE PUNTAS
Se recomienda enjuagar previamente las puntas como
mnimo dos veces con el lquido a pipetear para compensar la
pelcula de lquido en el interior de la punta. El enjuage previo
tambin tiene otras ventajas: ayuda a neutralizar los efectos de
capilaridad e iguala la temperatura y humedad del aire del interior
de la pipeta con la temperatura y humedad de la muestra.
Todo esto puede suponer una mejora de hasta el 0,2% de la
precisin.(No es necesaria en pipetas a pistn de desplazamiento
positivo).
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OTROS FACTORES QUE TAMBIN AFECTAN A LOS
RESULTADOS DEL PIPETEO
+ TRABAJAR SIN CAMBIOS BRUSCOS DE
TEMPERATURA
Procurad pipetear a una temperatura constante. La
temperatura ptima sera: que como veremos despus
sera tambin adecuada para calibrarlas. Debemos evitar
repentinos o grandes cambios de temperatura ya que el aire del
interior de la pipeta no se puede adaptar rpidamente y esto puede
afectar al volumen. Pipetear a una temperatura constante puede
mejorar la precisin hasta en un 5%. Es por este motivo que
cuando pipeteamos durante un largo rato nuestra mano puede
calentar el aire del interior de la pipeta, expandindose y pudiendo
reducir la precisin hasta en un 1%. Es por esta razn que se
recomienda no sostener continuamente la pipeta en las manos y
entre ciclos, dejarla en su soporte o en la mesa.
+UTILIZACIN DE UNA PIPETA ADECUADA PARA EL
VOLUMEN QUE SE ASPIRA
La aspiracin al 50% del volumen nominal de las puntas
consigue mejores resultados. Se recomienda trabajar entre el 35%
y el 100% del volumen mximo de la pipeta. Seguir este consejo
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puede hacernos mejorar los resultados hasta en un 1%.
Cometemos mucho mayor error trabajando por debajo del 10%
del volumen nominal de la pipeta que estamos utilizando.
+ AJUSTE CORRECTO DEL MICROMETRO PARA EVITAR
LOS EFECTOS DEBIDOS A LA HOLGURA MECANICA
Cuando cambiemos el volumen de uno superior a otro
inferior simplemente hay que girar la rueda del micrmetro hacia
abajo hasta el volumen deseado. Por el contrario, cuando
incrementamos el volumen a pipetear, hay que subir la rueda
ligeramente por encima del volumen deseado para luego bajarla
hasta el deseado. Esto evitar el juego mecnico de las piezas y
contribuir a una mejora del 0,5% en la precisin.
+ FACTORES ERGONMICOS
Para todos aquellos que pipeteen de forma repetitiva la
mayor parte de la jornada se recomienda usar pipetas
especialmente suaves de accionamiento porque es fundamental
que las manos estn lo ms descansadas posibles. Normalmente
cada fabricante importante tiene en su gama algn modelo de este
tipo.
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PARTE PRCTICA.
Nos centraremos en los dos tipos ms comunes de
pipetas que podemos encontrar en los laboratorios, que son
pipetas tipo Gilson o tipo Eppendorf. Cada tipo tiene sus
particularidades, pero el procedimiento de calibracin es el mismo
para ambas.
Partes especificadas:
A.- Botn de control
B.- Tuerca de conexin
C.- Junta de tefln
D.- Anillo de goma (O-ring)
E.- Caa
F.- Expulsor de la punta
Como diferencia fundamental las de tipo Gilson tienen el
pistn de acero inoxidable, una junta de tefln (C) y un anillo de
goma (D) que son los que garantizan el sello hermtico. En las de
tipo Eppendorf, el mbolo es de un polmero orgnico (Fortron)
altamente resistente al calor, cidos y bases, envejecimiento y
abrasin, y no lleva ni junta de tefln ni anillo de goma. Es una
ligera capa de silicona de vaco alrededor del mbolo la que
asegura la estanqueidad en este caso.
Para el caso en que pipeteemos cidos es mejor usar una
de tipo Eppendorf puesto que slo se nos deteriora con el tiempo
la capa de grasa. En una de tipo Gilson, acaba corroyndose el
mbolo a pesar de acero (ver foto) con lo que tendremos que
sustituirlo para que la pipeta no gotee. Para evitar en lo posible
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este efecto de los cidos, Gilson ha sacado un kit de proteccin
anticorrosin para la P 1000 que consiste en una caa especial que
lleva acoplado un filtro anticidos, siendo ste intercambiable (al
igual que el filtro de proteccin anti-salpicaduras de las P 5000).
Si no disponemos de este kit especial la casa recomienda una vez
despus de haber usado la pipeta con lquidos cidos o corrosivos
que emitan vapores, desmontar la caa y lavar el pistn, el anillo
de goma y la junta de tefln con agua destilada y una vez
completamente secas montar y comprobar funcionamiento.
Por calibracin de pipetas se entiende la comparacin entre
el volumen real y el volumen terico. El volumen real se
determina por va gravimtrica por lo que necesitaremos agua
destilada o desionizada y una balanza adecuada.
Para realizar la calibracin de una pipeta seguiremos las
directrices dadas por la norma ISO 8655 (aparatos volumtricos
operados por pistn). Los premisas pricipales de dicha norma se
centran en 3 puntos fundamentales:
1.- Condiciones ambientales
2.- Utilizar una balanza adecuada
3.-Minimizar el efecto de la evaporacin en volmenes inferiores
a 50 microlitros o tomar medidas adicionales para evitarla.
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- CONDICIONES AMBIENTALES
Las calibraciones se deben realizar en una sala sin
corrientes de aire y con una temperatura comprendida entre 20C
y 25C sin variar ms de C5,0 mientras dure el ensayo.
Asimismo se necesita una humedad relativa mayor del 50%. Con
anterioridad a la calibracin se deber dejar al menos 2 horas todo
el material a emplear para que alcance un equilibrio trmico con
la temperatura de la sala. Nunca deber estar expuesto al sol
directamente. Necesitaremos disponer de un termmetro y
tambin un barmetro si calibramos pipetas de menos de 50 l y
debemos realizar ajustes por el efecto de la evaporacin.
- UTILIZAR UNA BALANZA ADECUADA
Para el caso de calibraciones de pipetas de 10 l o
inferiores habr de emplearse una balanza analtica de 5
decimales. Para pipetas de volmenes ms grandes es suficiente
utilizar una balanza de 4 decimales. Se aconseja el uso de vasos
de vidrio para minimizar los efectos de las cargas electrostticas,
ms importantes cuanto ms pequeos son los volmenes que
estamos midiendo.
- MINIMIZAR EL EFECTO DE LA EVAPORACIN
Para volmenes pequeos (menores de 50 l ) podemos
usar algn recipiente especfico de vidrio con tapa o situar un
vaso de precipitados pequeo con 10 ml de agua en el interior de
la balanza para inhibir la evaporacin. Es ms cmodo emplear el
recipiente especial porque nos simplificar los clculos despus.
Existen marcas que comercializan su propio juego de recipientes
para efectuar las calibraciones de sus distintos modelos.
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PROCEDIMIENTO DE CALIBRACIN
Abriremos la pipeta para comprobar el estado de la junta
de tefln y el anillo de goma (Gilson). Si stos presentan juego,
los sustituiremos. Tambin verificaremos que la caa no est
doblada y en buenas condiciones. En caso contrario, tambin la
cambiaremos.
Para el caso de las Eppendorf, retiraremos la grasa vieja
del pistn y procederemos a reengrasarlo ligeramente de nuevo
(es importante no poner demasiada).
Tras el enjuage previo de la punta al menos dos veces con
agua destilada, haremos un chequeo rpido con 3 medidas del
volumen nominal que nos darn una primera aproximacin del
volumen que dispensa la pipeta. Si ste se desva bastante del
esperado, procederemos al ajuste del micrmetro con la
herramienta adecuada para cada pipeta (en el caso de Eppendorf
se nos suministra al comprarla pero en Gilson tenemos que
adquirirla) y volveremos a hacer otra tanda de 3 medidas hasta
que stas ya sean ms cercanas a lo esperado. Posteriormente y
despus del cambio de punta y enjuages previos de sta al menos
dos veces, realizaremos ya la calibracin propiamente dicha con
tandas de 10 medidas (4 mediciones sera el nmero mnimo
necesario para calcular la exactitud y precisin de una pipeta) de
las siguientes series de volmenes:
+ volumen nominal (mximo admitido por la pipeta)
+ volumen inferior (mnimo o 10% del nominal segn especificaciones del fabricante)
+ volumen medio (del 50% del valor nominal)
Para cada serie de valores obtenidos pasaremos a
calcular el error sistemtico que nos dar la Exactitud
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(proximidad de la medida a su valor real) y el error aleatorio,
que nos expresar la Precisin (grado de reproducibilidad de las
medidas) de la pipeta.
Exactitud
Es posible tener datos muy consistentes aunque estn
consistentemente equivocados. La inexactitud es la diferencia
numrica entre el valor medio de una serie de medidas y el valor
real. Una elevada exactitud (o pequea inexactitud) significara
que existiera poqusima diferencia entre el valor medio y el real.
La exactitud se consigue con una cuidadosa calibracin de un
instrumento preciso.
Precisin
La precisin consistira en la existencia de un buen
grado de reproducibilidad de las medidas realizadas. La precisin
no tiene un valor numrico, se cuantifica por la imprecisin. As
una alta precisin (o pequea imprecisin) significara que
existiese muy poca variacin entre medidas repetidas de la misma
muestra. Para conseguir un instrumento preciso se necesita una
buena tcnica de manejo.
Exacto Preciso Exacto Impreciso
Preciso Inexacto Impreciso Inexacto
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- Clculo del Error Sistemtico ( Exactitud )
Para el caso en que trabajemos con volmenes inferiores a
50 l deberemos tener en cuenta los efectos de la evaporacin
sustituyendo en las anteriores frmulas Xi por: Xi . Z , donde Z es
un factor de correccin dependiente de la temperatura y la presin
y cuyos valores podemos obtener de la tabla de la siguiente
pgina ( Equivalencia: 1000 mbar = 100 kPa ).
Para poder comparar adecuadamente con los datos
facilitados por el fabricante debemos expresar los valores
obtenidos en la balanza en microlitros.
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- Clculo del Error Aleatorio ( Precisin )
Comparando los datos obtenidos con los errores
tolerados para las pipetas ensayadas podemos saber si nuestras
pipetas se encuentran dentro de las tolerancias especificadas por
el fabricante en cuanto a Exactitud y Precisin y por tanto siguen
siendo perfectamente utilizables . Lo ms conveniente es llevar
una anotacin de las calibraciones efectuadas y ponerle algn
adhesivo pequeo a la pipeta que nos indique la fecha de su
ltima revisin o calibracin.
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Podemos ajustar una pipeta para un lquido diferente al
agua pero en este caso deja de ser una pipeta de volumen variable
y pasa a ser una de volumen fijo empleado en la calibracin y
solamente vlida para ese lquido, por lo que si se realiza, hay que
marcar la pipeta convenientemente para que luego no existan
confusiones. Este procedimiento no es vlido para lquidos con
presin de vapor elevada por lo que en estos casos, como se ha
indicado previamente, es aconsejable el empleo de una pipeta de
desplazamiento positivo o directo. De todas formas, cuando esto
no sea posible y para minimizar todo lo posible el error cometido
si usamos una pipeta neumtica, se recomienda saturar la cmara
de aire de la pipeta aspirando y dispensando repetidamente el
solvente antes de aspirar la muestra y luego operando rpidamente
porque aunque nuestra pipeta habitualmente no gotee con
soluciones acuosas s que es muy fcil que lo haga si trabajamos
con un lquido de menor densidad que sta.
Actualmente lo ms avanzado en el tema de las
calibraciones es el sistema de identificacin por radiofrecuencia
que ha sacado Rainin en que la pipeta lleva un chip con el que se
puede seguir toda la vida de cada pipeta como n de serie, fecha
de calibracin, usuario al que pertenece, para qu se utiliza o
cualquier dato que queramos incluir.
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Existen varios fabricantes de balanzas que ofrecen en
sus gamas de balanzas analticas alguna especialmente adaptada
para la calibracin de micropipetas como es el caso de la
mostrada a continuacin que sirve para pipetas de hasta 1 l (tara:
22g, resolucin 1 g), tiene apertura motorizada mediante clula
fotoelctrica y presenta colector de evaporacin integrado y
recipiente para residuos de 10 ml de capacidad para pipetear de
forma rpida y sin interrupciones.