FACULTAD DE FARMACIA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
TRABAJO FIN DE GRADO
HERRAMIENTAS MOLECULARES PARA EL
DESARROLLO DE TRATAMIENTOS BASADOS EN LA
TERAPIA GÉNICA
Autor: Shilpa Lekhraj Peswani Sajnani
Tutor: Prof. Dr. Óscar Escribano Illanes
Convocatoria: Junio 2017
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ÍNDICE
1.Resumen……………………………………………………….......3
2. Introducción y antecedentes……………………………………....3
2.1. Vectores virales……………………………………………….5
2.2. Vectores no virales……………………………………………8
2.3. Aplicaciones de la terapia génica…………………………….9
3. Objetivos……………………………………………………….....11
4. Metodología………………………………………………………11
5. Resultados y discusión……………………………………………11
5.1. Mecanismos de edición génica………………………………13
5.2. Herramientas de edición genómica………………………….14
5.3. Vectores para la introducción de herramientas moleculares para la edición
genómica…………………………………………………………………..18
5.4. Aplicaciones de la edición de genes………………………...19
6. Conclusiones………………………………………………………20
7. Bibliografía…………………………………………………….....20
8. Anexo I……………………………………………………………21
9. Anexo II…………………………………………………………..22
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1. RESUMEN
La terapia génica se ha definido históricamente como la adición de nuevos genes a las
células humanas. Sin embargo, el reciente avance en tecnologías de edición del genoma ha
permitido un nuevo paradigma en el que la secuencia del genoma humano puede manipularse
con precisión para lograr un efecto terapéutico. Esto incluye la corrección de mutaciones que
causan la enfermedad, la adición de genes terapéuticos a sitios específicos en el genoma y la
eliminación de genes deletéreos o secuencias del genoma. Este trabajo pretende revisar los
diferentes mecanismos y estrategias implicados en la edición del genoma, describir los
avances tecnológicos y las distintas aplicaciones diversas áreas de terapia génica y celular.
También se analizan los retos actuales y las perspectivas futuras de la edición del genoma
como tecnología transformadora para el tratamiento de diversas enfermedades.
2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES
El concepto de terapia génica nació durante los años sesenta y setenta y hoy en día sigue
siendo un paradigma relativamente nuevo en la medicina con enorme potencial terapéutico.
Se define como una técnica mediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un
paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva
función. (García Miniet, R.S. et al, 2008). Permite modular la expresión de proteínas
específicas para el tratamiento de enfermedades tanto monogénicas como alteraciones
genéticas adquiridas como cáncer y SIDA, y otras enfermedades multifactoriales como la
diabetes y enfermedad cardiovascular. (Austin-Ward et al, 1998).
En función de la célula diana, existen dos modalidades de terapia génica:
a) Terapia génica de células germinales: consiste en la introduccion de un gen funcional en
células responsables de la formación de óvulos y espermatozoides, generando cambios en la
dotación genética; se transmite a la descendencia. En principio, esta terapia sería la más
adecuada y eficaz para contrarrestar las enfermedades congénitas y trastornos hereditarios,
aunque en la actualidad, debido a que la legislación lo prohibe y a una variedad de
dificultades técnicas y razones éticas, es poco probable que la terapia de línea germinal sea
probada en seres humanos en un futuro próximo.
b) Terapia génica somática: introducción de un gen funcional en células no germinales
(células que no son ni espermatozoides ni óvulos). Cualquier modificación y efecto se limitará
al paciente individual y no será heredado por el descendiente de los pacientes ni por ninguna
generación posterior.
Debido al consenso general entre los investigadores y la legislación vigente, basada en
motivos éticos y de seguridad, solamente se llevan a cabo protocolos clínicos en este tipo de
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terapia génica (Ronchera-Oms et al). La terapia génica somática puede ser motivo de reservas
éticas cuando es utilizado con el fin de potenciar mediante la manipulación genética el
aspecto físico sin llegar a tratar una enfermedad.
Según el lugar donde se produce la manipulación genética, la terapia genética somática
se clasifica en:
a) Terapia in vivo: aborda un conjunto de técnicas que consisten en la introducción del gen
terapéutico directamente en las células del organismo a través de un vector. No se produce la
extracción de las células del paciente. La ventaja que presenta sobre las técnicas in vitro es su
grado de sencillez pero tiene el inconveniente de que el grado de eficiencia de la transferencia
es menor y además es problemático el conseguir la especificidad tisular.
b) Terapia ex vivo: método más común que abarca la totalidad de las técnicas o protocolos en
la que se produce la extraccion de las células del paciente que posteriormente son aisladas y
cultivadas en laboratorio para poder luego ser introducidas de nuevo en el paciente. Son
sometidas al proceso de transferencia in vitro.
Figura 1. Terapia ex vivo vs in vivo (Turitz Cox. D, 2015)
La ventaja principal que presenta esta terapia frente a la terapia in vivo es que permite
especificidad a la hora de elegir el tipo de célula diana que se quiere manipular y tratar.
Además, se puede realizar un control exhaustivo sobre el proceso y existe mayor eficacia en
la transducción genética. Sin embargo, presenta complicaciones por el coste y complejidad
del proceso como puede ser por la dificultad en la transducción de ciertos tejidos que no
crecen idóneamente en cultivo o riesgo de contaminación de células manipuladas.
Para poder llevar a cabo la transferencia del material genético y hacer llegar el gen
terapéutico a la célula diana es necesario basarse en lo que se denomina en inglés “gene
delivery”, proceso mediante el cual se introduce ADN foráneo en células huesped (Isamat,
M). Es necesario la presencia de una molécula portadora denominada vector que transfiera el
gen terapéutico a la célula huésped de forma segura y eficaz, tanto para el paciente como para
el medio ambiente. Además, es importante que tenga una mayor eficacia en la transferencia
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génica, mayor persistencia en la expresión del material transferido, así como una alta
especificidad al tipo celular que se desea transferir. Una de las características más
significativas es que debe ser inocuo, que no despierte en el paciente una respuesta inmune así
como una reacción alérgica.
Una vez llevado a cabo la transferencia génica, los genes insertados tienen la opción de
integrarse en los cromosomas de la célula diana, o bien quedar como elementos genéticos
extracromosómicos (episomas). En este caso, el gen introducido puede no pasar a la progenie
tras divisiones celulares por lo que será necesario tratamientos repetidos para conseguir el
efecto terapéutico. La ventaja que presenta la integración del gen el cromosoma es que
permanece por replicación tras la división celular en células madres obteniendo así una
expresión estable y contínua a largo plazo, generando la posibilidad de curar un trastorno
genético. Por otro lado, la integración presenta diversas complicaciones puesto que ocurre
mayoritariamente al azar (Ronchera-Oms, C.L. et al): puede que los genes no se expresen o
que inciten la muerte de la célula huésped, podrían modificar patrones normales de expresión
de genes que controlan la división o la proliferación celular, por ejemplo a través de la
activación de un oncogén o de la inactivación de un gen supresor de tumores o de un gen
implicado en la apoptosis, aumentando el riesgo de cáncer.
Los vectores utilizados como el método para la transferencia de genes se pueden dividir
en dos categorías, virales y no virales.
2.1.Vectores virales:
Los vectores virales son el medio más eficiente para transferir genes, permiten modificar
específicamente una célula o un tejido, para inducir la expresión de genes terapéuticos
(Legorreta-Herrera et al, 2012). Los virus son elementos genéticos con capacidad infectiva
que se pueden replicar independientemente de los cromosomas de la célula que infectan. Por
ello, tradicionalmente, se ha aprovechado el cromosoma de virus humanos con especificidad
natural para determinados tejidos, después de haber reemplazado algún segmento génico que
confiriera virulencia al virus, por el gen terapéutico. (Isamat, M.)
El inconveniente de la transfección es la pluricelularidad ya que la metodología difiere a
la ahora de modificar una parte del individuo o a la totalidad. Es importante saber si se
requiere que los fenotipos adquiridos se hereden y que no todas las células que contienen el
mismo genoma responden al mismo método de transfección (Legorreta-Herrera et al, 2012).
Algunos de los diferentes tipos de virus utilizados como vectores de terapia génica son:
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A.Retrovirus
Los retrovirus son los primeros virus que se utilizaron como vectores en experimentos de
terapia génica (Misra, S. 2013). Son virus con envuelta que presentan ARN como material
genético que se caracterizan por presentar la enzima transcriptasa inversa que, al infectar una
célula, es capaz de retrotranscribir material genético de ARN a ADN de doble hebra. Para que
este ADN posteriormente se integre como copia simple en el genoma de la célula huésped es
necesario que las células estén en división.
Una de las grandes ventajas del empleo de retrovirus es la estabilidad funcional y
estructural de las formas integradas del vector. Sin embrago, presenta problemas a la hora de
inserción ya que la enzima integrasa puede insertar material genético del virus en cualquier
posición en el genoma del huésped, lo que puede llevar a mutagénesis de inserción o a la
división celular no controlada que conduce al cáncer.
B.Adenovirus
Los adenovirus son viriones sin envuelta y con un genoma constituido por ADN de
doble cadena que se replica en el núcleo de células en división o en células quiescentes. Son
utilizados en terapia génica in vivo ya que pueden infectar de forma eficaz una variedad más
amplia de células que el retrovirus, incluyendo células que se dividen más lentamente, tales
como células pulmonares o células que no se encuentran en fase de división. Facilitan la
expresión de elevada cantidad de virus y son muy estables sin tener que integrarse en el
genoma del tejido diana. Su capacidad para replicarse in vivo depende del tipo de célula
diana. Un inconveniente es que algunas de las proteínas virales pueden ser tóxicas para la
célula (Legorreta-Herrera et al, 2012), pudiendo favorecer una respuesta inmune intensa
contra las células diana. Asimismo, los altos niveles de virus requeridos para el tratamiento, a
menudo provocan una respuesta inflamatoria indeseable.
Actualmente el primer producto de terapia génica con licencia para tratar cáncer de
cabeza y cuello es el producto adenovírico denominado Gendicina (Misra, S. 2013).
C. Virus asociados a los adenovirus (AAV)
Los AAV son virus pequeños de la familia Parvovirus con un genoma de ADN
monocatenario que precisan de la cooperación de otro virus para que se puedan replicar. Son
unos de los vectores más utilizados ya que estimulan una expresión eficaz del transgén por
tiempos prolongados en diferentes tejidos como son: el hígado, el músculo, la retina y el
sistema nervioso central (Legorreta-Herrera et al, 2012). El principal inconveniente de AAV
es que al ser tan pequeño, su carga útil resulta relativamente limitada cuando se realiza a gran
escala, dando como consecuencia una producción viral poco eficiente. En los humanos, existe
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la presencia de una inmunidad preexistente para estos vectores AAV, y en el caso de que se
produzca la integración, sería al azar dando lugar a alteraciones en la activación del gen
endógeno. Diferentes serotipos de AAV tienen distintos patrones de expresión debido a
diferencias en las células y en las actividades intracelulares (Legorreta-Herrera et al, 2012).
Otro hecho interesante de los AAV es que sensibilizan a las células para la actuación de los
fármacos terapéuticos.
Actualmente se están utilizando en estudios preliminares para el tratamiento de la
enfermedad hereditaria de la sangre hemofilia, enfermedad muscular y ocular. También se
han iniciado ensayos clínicos para utilizar vectores AAV para administrar genes al cerebro, ya
que el virus puede infectar células no divisorias como las neuronas en las que se expresa su
genoma durante mucho tiempo.
D. Lentivirus
Últimamente se han desarrollado los lentivirus que son vectores retrovirales, basados en
el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV-1). En contraste con los retrovirus
convencionales, los lentivirus tienen la capacidad de infectar de forma eficiente células que no
están en división debido a que presentan señales de localización nuclear que ayudan a facilitar
la entrada de los virus por poros nucleares. La aplicación principal está enfocada en la
transferencia de genes a neuronas in vivo y a progenitores hematopoyéticos ex vivo.
E. Herpes Simplex Virus (HSV)
Se trata de un virus neurotrópico humano, que se utiliza principalmente para la
transferencia de genes en el sistema nervioso al permanecer en forma de episoma. Tiene un
genoma enorme comparado con otros virus, que permite insertar más de un gen terapéutico en
un solo virus, allanando el camino para el tratamiento de trastornos causados por más de un
defecto genético. HSV hace un vector ideal, ya que puede infectar una amplia gama de tejidos
incluyendo el músculo, el hígado, el páncreas y las células nerviosas y pulmonares.
También existen una serie de vectores no derivados de virus implicados en gene delivery.
2.2.Vectores no virales
Los vectores no virales abarcan aquellas técnicas de transferencia donde el material
genético es introducido utilizando métodos químicos y/o físicos. Las principales ventajas son:
sencillez en la preparación, facilitando producción a gran escala; posibilidad de introducir
DNA de gran tamaño; escasa toxicidad e inmunogenicidad, haciendo posible administrarlo de
forma repetida; y especificidad tisular. En comparación con los vectores virales presentan una
baja eficacia global.
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A.ADN Desnudo
El método más simple de transfección no viral es la del ADN desnudo que supone la
inyección directa de plásmidos de ADN sin ningún revestimiento lipídico o proteico (Isamat,
M.) en el interior de la célula. Aunque presenta problemas de especificidad en la terapia in
vivo, ha sido exitoso en la inmunización frente a ciertos tipos de cáncer y otras enfermedades.
B.Liposomas
Los liposomas están constituidas por una bicapa lipídica concéntrica en cuyo interior
contiene el ADN plasmídico que incluye el gen terapéutico con las señales de secuencia para
su expresión en la célula diana. La transferencia a la célula se lleva a cabo mediante fusión
entre los fosfolípidos del liposoma y los de la membrana celular.
Se clasifican en dos tipos, por un lado están los liposomas catiónicos, que presentan
carga positiva y forman un complejo estable con el ADN, y por otro lado están los liposomas
cargados negativamente que forman una cápsula alrededor del ADN, sin llegar a formar un
complejo. Como ventaja principal, son capaces de llevar grandes fragmentos de ADN a
diferencia de los vectores virales, que están limitadas a llevar un ADN de longitud más
reducida. El principal inconveniente de esta estrategia es la falta de especificidad de las
células diana en terapias in vivo y la baja eficacia de la transferencia. (Ismat, M.)
C. Bombardeo de partículas
Consiste en una técnica física, altamente eficaz de transferencia de genes tanto in
vitro como in vivo. El plásmido o porción de ADN es recubierto en su superficie por gotas de
oro o tungsteno, de 1 a 3 micras de diámetro, que posteriormente son aceleradas por una
descarga eléctrica o por un pulso de gas y disparadas hacia el tejido diana. La capacidad de
penetración es limitada y se utilizan con frecuencia en cultivos de líneas celulares, epidermis,
músculo e hígado.
D. Otros
Los esfuerzos de investigación han dado lugar a otros métodos no virales de
transferencia génica, como la electroporación (creación de poros inducidos por el campo
eléctrico en la membrana plasmática), sonoporación (frecuencias ultrasónicas para interrumpir
la membrana celular) y magnetofección (uso de partículas magnéticas complejadas con
ADN). Cada método tiene sus propias ventajas y desventajas.
2.3. Aplicaciones de la terapia génica
La terapia génica ofrece una multitud de estrategias novedosas para el tratamiento de
numerosas enfermedades causadas por mutaciones genéticas y se distinguen según categorías:
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-Enfermedades monogénicas: originadas por mutaciones en un solo gen, que causan pérdida
de la función de la proteína que codifican y son de naturaleza recesiva. Estas mutaciones son
poco frecuentes en la población, sin embargo, son responsables de numerosas enfermedades
crónicas, por ejemplo, de las hemofilias, la anemia falciforme, las deficiencias inmunológicas,
la hipercolesterolemia familiar y la fibrosis quística (Yunta, E.R., 2003).
Con la introducción de una copia normal del gen mutado en los tejidos afectados se
sintetizaría la proteína correctamente funcional dentro de aquellas células afectadas,
corrigiendo así el error genético. La enfermedad puede llegar a ser curada o paliada
dependiendo del tiempo de expresión adecuada del gen.
-Enfermedades multifactoriales, en el que tanto los genes como el ambiente están
involucrados en la expresión de la enfermedad, siendo las enfermedades coronarias, la
hipertensión y la diabetes las más destacadas.
- Enfermedades adquiridas, como es el caso del cáncer. Se ha visto poca eficacia clínica en la
introducción de copias normales de genes mutados debido a varios factores como puede ser el
efecto dominante de ciertas mutaciones, dificultad de acceder a la masa tumoral y a las
metástasis, y elevado grado de inducción mutagénica. Actualmente se están realizando
numerosos ensayos clínicos para tratar diferentes tipos de cáncer, y algunas de las estrategias
utilizadas incluyen: introducción de citoquinas, TNF-alfa, interleucinas y otras células
inmunomoduladoras que aumentan la actividad antitumoral de células inmunes; introducción
de genes activadores de drogas en células tumorales o “terapia de genes suicidas”; bloqueo de
la expresión de oncogenes mediante terapia antisentido para normalizar el ciclo celular;
introducción de genes supresores de tumores (p53), que inhibe angiogénesis y el crecimiento
celular; manipulación de las células de la médula ósea al introducir genes resistentes a los
fármacos para disminuir la toxicidad de la quimioterapia; introducción de “vacunas
tumorales” para aumentar inmunogenicidad frente a los tumores; e introducción de
adenovirus oncolíticos para eliminar células tumorales (Ronchera-Oms et al).
- Enfermedades infecciosas: incluyen al herpes, la hepatitis y el SIDA.
La infección por VIH, causante del SIDA, se considera una enfermedad genética donde
el virus retrotranscribe su ARN e integra el ADN de doble cadena resultante en el cromosoma
de la célula huésped (Ronchera-Oms et al), haciendo que el SIDA sea un candidato ideal para
la terapia génica. Se están realizando ensayos clínicos, la mayoría de ellos ex vivo, en las que
se llevan a cabo las siguientes estrategias: estimulación del sistema inmune del paciente al
introducir un gen del virus VIH (vacunas anti VIH); introducción de interferón-a a nivel de
linfocitos T y monocitos para inhibir la replicación vírica; transferencia de genes de proteínas
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mutantes del VIH, competidoras con las proteínas nativas, imposibilitando el ensamblaje y/o
la replicación; bloqueo de la traducción mediante parejas de oligonucleótidos antisentido que
complementan las secuencias genéticas del VIH; introducción de genes productores de
ribozimas, que al unirse a secuencias complementarias del ARN diana, degradan el ARN
viral, sin dar lugar a una respuesta inmunológica; introducción en las células diana de genes
codificantes de anticuerpos de cadena única frente a proteínas del VIH, neutralizando así las
proteínas víricas dentro de las células infectadas, incluso antes de que se produzca el
ensamblaje del virus, tratándose pues de una verdadera “inmunización intracelular”(Rochera-
Oms et al).
3. OBJETIVOS
El objetivo de este trabajo es realizar una revisión bibliográfica sobre el avance en los
distintos mecanismos moleculares implicados en terapia génica y las posibles aplicaciones
para el tratamiento de enfermedades tanto monogénicas como poligénicas.
4. MATERIAL Y MÉTODOS
Para llevar a cabo este trabajo se ha realizado una revisión bibliográfica en el que se han
empleado diversos textos científicos referentes al tema de estudio, recogidos en la
bibliografía, los cuales se han obtenido de la base de datos de publicaciones científicas
MEDLINE (PubMed), Elsevier, Scholar Google, así como de otras web de interés científico
con el fin de contribuir a la consecución y desarrollo de los objetivos previamente marcados.
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La terapia génica clásica ha logrado con éxito la introducción de genes exógenos en el
genoma, pero la imposibilidad de controlar el sitio de integración de los vectores virales ha
supuesto una importante limitación. Los recientes avances en el desarrollo de tecnologías de
edición de genomas basadas en nucleasas programables han mejorado significativamente la
capacidad de realizar cambios precisos en los genomas de células eucariotas. Una aplicación
particularmente atractiva de nucleasas programables, es la posibilidad de corregir
directamente las mutaciones genéticas en tejidos y células afectadas para el tratamiento de
enfermedades que son refractarias a terapias tradicionales.
El fundamento para el campo de la edición de genes fue el descubrimiento de que los
cortes de doble hebra en sitios específicos de ADN (DSBs) podrían ser usados para estimular
la maquinaria de reparación celular endógena. Los DSBs, además de aumentar la frecuencia
de recombinación homóloga, también podían estimular la generación de pequeñas inserciones
y deleciones en el sitio específico de corte. Estos dos hallazgos convirtieron a las DSBs en el
principio clave de la edición génica (Chamorro Poyo, C. 2016)
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El paso fundamental de la terapia génica por edición es la formación de DSBs
específicos en sitios precisos del genoma, y que posteriormente, los propios mecanismos de
reparación endógena de la célula repare la rotura. Estas roturas en el ADN se reparan
típicamente a través de una de las dos vías principales-recombinación homóloga (RH) o unión
de extremos no homólogos (NHEJ).
- RH: repara el DSB utilizando una secuencia de ADN molde exógena introducida en la
célula diana, realizando cambios precisos en la secuencia diana. (Maeder, M.L. et al,
2016). Estos cambios pueden implicar un nucleótido o un reducido número de
nucleótidos dando una corrección de mutación puntal, hasta la introducción de un
transgén terapéutico en un locus preciso del genoma (adición génica).
- NHEJ: mecanismo que consiste en reparar DSBs a través de la religación directa de los
extremos escindidos. (Cox, D. B. T et al, 2015). No necesita la presencia de una
secuencia exógena de ADN como molde. Esta vía de reparación es propensa a errores
y con frecuencia resulta en inserciones y/o deleciones (indels) en el sitio de la ruptura,
siendo más frecuente la eliminación de nucleótidos. En el caso de que se formen dos
DSBs simultáneamente en el mismo cromosoma, se formará una deleción entre los
dos puntos de corte.
Figura 2. DSBs inducidas por nucleasas programadas en sitios concretos del genoma que activan los mecanismos de reparación endógena.
(Maeder, M L, 2016)
La eficiencia del mecanismo de reparación por NHEJ y RH varía dependiendo del tipo
celular y del estado de ciclo celular. En general se considera que el mecanismo de NHEJ es
más activo que RH (Charmorro Poyo, C. 2016) ya que se ha visto que la vía NHEJ está activo
durante todo el ciclo celular mientras que RH actúa principalmente durante la fase S/G2 (Cox,
D. B. T et al, 2015).
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5.1.Mecanismos de la edición génica
1. Bloqueo de genes (gene knockout)
Esta forma más simple de edición de genes utiliza la naturaleza propensa a errores de
NHEJ para introducir pequeños indels en el sitio de destino. El NHEJ clásico religa
directamente los extremos sin procesar del ADN mientras que el NHEJ alternativo,
denominado MMEJ (microhomology-mediated end joining), requiere una resección final
seguida de la recombinación de regiones de microhomología cortas y singulares y una
posterior ligadura del extremo del ADN. Activa durante todas las etapas del ciclo celular,
ambas rutas de NHEJ reparan ADN con una alta frecuencia de mutagénesis que da lugar a la
formación de indels en el sitio de la ruptura. Cuando el sitio diana de nucleasa se coloca en la
región de codificación de un gen, los indels resultantes causarán a menudo cambios de marco
de lectura (frameshifts).
La aplicación más común de mutagénesis dirigida implica la inducción de mutaciones
frameshift con el fin de generar knockout genes. En comparación con la terapia génica clásica,
que se limita a la adición de secuencias exógenas al genoma, la capacidad de eliminar genes
endógenos abre una nueva vía de tratamiento terapéutico en el que la función del gen puede
ser permanentemente interrumpido. Una aplicación de este enfoque es el llegar a los genes
dominantes que dan mutaciones de “ganancia de función”, como los que se encuentran en la
enfermedad de Huntington. Esta enfermedad es causada por una repetición de la expansión de
un alelo del gen huntingtina (HTT), lo que conduce a la producción de una proteína tóxica y
mutante HTT. La eliminación de este alelo mutante por la edición de genes basada en NHEJ
podría proporcionar un beneficio clínico a los pacientes de Huntington (Maeder, M.L. et al,
2016). En otras enfermedades, a veces puede ser terapéutico eliminar la función normal de un
gen. El ejemplo más destacado de esto es el método de edición de genes actualmente en
ensayos clínicos para el tratamiento del VIH, en el cual el knockout de CCR5, el principal co-
receptor de VIH, prohíbe la infección viral de células T modificadas. Por último, en lugar de
dirigirse directamente al genoma humano, la eliminación de genes críticos en bacterias
invasoras o virus basados en ADN podría servir como tratamientos antimicrobianos eficaces.
2. Supresión de genes
Además de los indels relativamente menores resultantes de NHEJ, es posible eliminar
grandes segmentos de ADN flanqueando la secuencia con dos DSBs. De hecho, se ha
demostrado que la introducción simultánea de dos roturas dirigidas puede dar lugar a
deleciones genómicas de hasta varias megabases de tamaño. Este enfoque es útil para
estrategias terapéuticas que pueden requerir la eliminación de un elemento genómico
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completo, tal como una región potenciadora, como se ha propuesto para el tratamiento de
hemoglobinopatías por deleción de la región potenciadora específica del eritroide (BCL11A).
3. Corrección de genes
A diferencia de las mutaciones impredecibles resultantes de NHEJ, las DSBs dirigidas
pueden inducir la edición de genes precisos mediante la estimulación de HDR con una
plantilla (template) de donantes suministrados exógenamente. Activo principalmente durante
las fases S y G2 del ciclo celular, RH utiliza la cromátida hermana como plantilla para la
reparación del ADN. Sin embargo, también se puede usar una secuencia donante
proporcionada exógenamente como una plantilla de reparación. De este modo, la introducción
conjunta de nucleasas dirigidas junto con un vector que contiene ADN homólogo al sitio de
rotura permite la edición de genes de alta eficacia basada en HDR. Cualquier diferencia de
secuencia presente en la plantilla donante puede ser incorporada en el locus endógeno para
corregir mutaciones que causan la enfermedad. Aunque tradicionalmente los plásmidos han
sido la fuente más comúnmente utilizada de ADN donante, estudios recientes han demostrado
que los oligonucleótidos monocatenarios (ssODNs) pueden servir como plantillas donantes
eficaces para HDR. Para células que son difíciles de transfectarse, también pueden usar
vectores virales tales como el lentivirus o el virus adenoasociado a la integrasa (AAV) como
fuente de ADN donante.
5.2 Herramientas de edición genómica
Dado que la edición de genes inducida por DSB se basa en los mecanismos de
reparación endógena de la célula, es universalmente aplicable a cualquier tipo de célula u
organismo que emplea estos métodos para la reparación del ADN. El elemento crítico para la
implementación de cualquiera de estos genes de edición es la introducción precisa de un DSB
target. Existen actualmente cuatro endonucleasas para inducir estos DSB específicos de sitio
y se caracterizan por tener un dominio de reconocimiento de ADN y otro dominio con
capacidad de generar cortes en una secuencia definida del genoma.
- ZFNs: Las nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) están constituidas por varios dominios de
dedos de zinc fusionados al dominio nucleasa de la enzima de restricción de tipo IIS, Fokl.
(Cai, M. et al, 2014). Estos dominios están compuestos por un conjunto de tres a seis dedos de
zinc que tienen como función la unión específica al ADN, mientras que el dominio
endonucleasa posee actividad enzimática y mediará la ruptura de la doble cadena de ADN.
Los dedos de zinc contienen un dominio de Cys2-His2 que es uno de los motivos de
unión a ADN más comunes codificados en el genoma humano. Consiste en una configuración
ββα compacta formando una estructura de dedo que se mantiene unida y estable debido a
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interacciones entre dos residuos de cisteína de las láminas β y dos residuos de histidina de la
α-hélice que están tetraédricamente coordinados por un átomo central de zinc. Debido a que la
nucleasa FokI funciona como un dímero, dos ZFNs que unen hebras opuestas de ADN son
requeridos para la inducción de un DSB. Los primeros experimentos mostraron que los DSB
inducidos por ZFN podrían usarse para modificar el genoma a través de NHEJ o HDR y esta
tecnología se ha utilizado posteriormente para modificar con éxito genes en células madre
somáticas y pluripotentes humanas (Maeder, M.L. et al, 2015).
Figura 3. Mecanismo de acción de los ZFNs. (Le Provost, Fabienne et al., 2009)
-TALENs: Son proteínas de unión al ADN específicas de sitio. Presentan un dominio de
reconocimiento de ADN fusionado por su extremo carboxiterminal al dominio con actividad
nucleasa Fokl. Estas nucleasas presentan un dominio denominado TALEs (Gaj,T et al, 2013),
compuesto por múltiples unidades repetidas de aminoácidos (llamadas repeticiones TALE)
dispuestas en tándem. Cada repetición reconoce un único par de bases del ADN. Estas
repeticiones de TALE son casi idénticas en secuencia excepto para dos aminoácidos
altamente variables situados en posición 12 y 13 que establecen la especificidad de
reconocimiento de base de cada unidad. (Maeder, M.L. et al, 2015). Una matriz de cuatro
unidades de repetición diferentes es suficiente para generar TALEs con nuevos sitios de
reconocimiento de ADN. Al fusionarse los TALEs con la nuclease Fok1, los TALEN se unen
y escinden el ADN en parejas.
A diferencia de un dedo de zinc de 30 aminoácidos que une tres bases de ADN, los
TALEN requieren 34 aminoácidos para especificar un solo par de bases y esta diferencia de
tamaño puede prohibir la liberación de ambos monómeros TALEN en un vector viral único
con capacidad de empaquetamiento limitada. Se ha demostrado que los TALEN
administrados por lentivirus son susceptibles a reordenamientos, aunque este fenómeno puede
ser mitigado por la diversificación de codones entre las repeticiones. Los sistemas
adenovirales también se han utilizado para administrar los TALENs con éxito.
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Figura 4. Mecanismo acción TALENs (http://www.nlbiochemex.com/resourse/fasttale-technology.html)
-Meganucleasas: Las meganucleasas son endonucleasas específicas de secuencia que
reconocen secuencias diana grandes. Las endonucleasas homing (HEs) son meganucleasas
naturales y debido a su alta especificidad, se han utilizado para la mutagénesis dirigida en una
variedad de organismos tales como bacterias, hongos, plantas, insectos y metazoarios.
La tecnología de la meganucleasa implica la reingeniería de la especificidad de unión al
ADN de las HEs de origen natural. (Maeder, M.L. et al, 2015). A través de una combinación
de diseño racional y selección, estas HE pueden ser re-dirigidas a nuevas secuencias de
destino. Aunque muchos estudios muestran promesa para el uso de meganucleasas en la
edición del genoma, los dominios de unión a ADN y división de las HE son difíciles de
separar, y la dificultad relativa de la ingeniería de proteínas con nuevas especificidades ha
limitado tradicionalmente el uso de esta plataforma. Para abordar esta limitación, las proteínas
quiméricas que comprenden fusiones de meganucleasas, ZF y TALE han sido diseñadas para
generar nuevas enzimas monoméricas que aprovechan la afinidad de unión y la especificidad
de escisión de meganucleasas (Gaj, T. et al, 2016). Una ventaja asociada con la tecnología de
meganucleasa es que la formación de DSB por estas enzimas da como resultado un saliente 3',
que puede ser más recombinógeno para RH que el saliente 5' generado por la escisión FokI.
Además, las meganucleasas son la clase más pequeña de nucleasas manipuladas, haciéndolas
potencialmente susceptibles a todos los métodos estándar de administración génica.
-Nucleasas CRISPR/Cas9: El sistema CRISPR son repeticiones palindrómicas cortas
agrupadas y regularmente espaciadas (del inglés clustered regularly interspaced short
palindromic repeats) y Cas es la proteína asociada a CRISPR (del inglés CRISPR associated
protein) (Chamorro Poyo, C., 2016), y juntos constituyen un componente esencial de los
sistemas inmunes adaptativos basados en ácidos nucleicos que son comunes en las bacterias y
Archaea. Se trata de un sistema inmune adaptativo microbiano que utiliza nucleasas guiadas
por ARN para escindir elementos genéticos extraños. El método CRISPR/Cas9 ha sido
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diseñado a través de ingeniería genética del sistema CRISPR procariótico de tipo II y utiliza
un gARN para dirigir la nucleasa Cas9 a una secuencia genómica específica (Maeder, M.L. et
al, 2015). Debido a su especificidad, simplicidad y versatilidad, el sistema CRISPR/Cas9 ha
surgido recientemente como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma en
varias especies.
Este sistema consta de dos elementos fundamentales: una endonucleasa no específica
(Cas 9) y una secuencia corta de gARN, este último constituido por un ARN CRISPR
(crRNA) que al emparejarse con el crRNA trans-activante (TracrRNA), forma una estructura
de dos ARN que dirige la endonucleasa Cas9 a las secuencias genómicas que son
complementarias a la secuencia de gARN (Pellagatti, A. et al, 2015). Se produce el
emparejamiento de bases de Cas9-gARN a una secuencia diana próximo al motivo adyacente
al protoespaciador (PAM), componente de orientación esencial para la unión específica del
Cas9 (Singh, V. et al 2017). En estos sitios, Cas9 corta ambas cadenas de ADN con dominios
enzimáticos separados, el dominio de nucleasa de HNH (corta la hebra de ADN en dirección
3’→5’) y el dominio de tipo RuvC (corta la hebra de ADN en dirección 5’→3’), para generar
una rotura de doble cadena.
A diferencia de los tres sistemas de nucleasas previamente definidos, las nucleasas
CRISPR/Cas no requieren la ingeniería de nuevas proteínas para cada sitio diana de ADN
(Gaj, T. et al, 2017) (Ver Anexo I). La relativa facilidad con que se pueden orientar los
nuevos sitios, simplemente alterando la región corta del gRNA que dicta especificidad, hace
de este sistema un método altamente atractivo para la introducción de DSB específicos de
sitio. Además, debido a que el Cas9 proteína no está directamente acoplado al gRNA, este
sistema es altamente susceptible de multiplexing a través del uso concurrente de múltiples
gRNA para inducir DSBs en varios loci.
Los estudios más recientes informan que el sistema CRISPR/Cas9 podría ser diseñado
para la modificación genética eficiente en organismos eucariotas tales como plantas, C.
elegans, Drosophila, pez cebra, ratones y ratas. (Cai, M. et al, 2014).
Figura 5. Edición del genoma dirigida a través del sistema CRISPR-Cas9. (Singh, V et al, 2016)
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5.3 Vectores para la introducción de herramientas moleculares para la edición genómica
El suministro eficiente y seguro a células y tejidos diana hasta ahora ha sido el desafío
más importante para las estrategias de terapia génica exitosas. La duración y la magnitud de la
expresión de la nucleasa es un parámetro crítico para el nivel de la actividad de la nucleasa
tanto en la diana como fuera de la diana. Maximizar la eficiencia de la entrega es
particularmente importante ya que la edición de genes es un evento inherentemente
estocástico que ocurre en sólo una fracción de las células en las que se expresa la nucleasa.
El método para introducir nucleasas en células en estudios de principio prueba (proof of
principle studies) es la transfección de ADN plasmídico que lleva nucleasas y cassettes de
expresión de gRNA (Feng, Z. et al, 2014). Aunque simple y directo, este método no es ideal
para la mayoría de las terapias genéticas y celulares debido a la baja eficiencia de transfección
de células primarias, la citotoxicidad relacionada con el ADN, la presencia de secuencias de
ADN bacterianas en las cadenas plasmídicas y la posibilidad de integración aleatoria de
fragmentos plasmídicos en el genoma. Por consiguiente, la electroporación del ARNm que
codifica las nucleasas y gRNAs generados a través de la transcripción in vitro se ha
convertido en un método preferido para la edición de genes ex vivo de células primarias
relevantes para terapia génica, tales como células T y células madre hematopoyéticas.
(Maeder, M.L., 2015).
Alternativamente, la introducción directa de proteínas nucleadas purificadas o
complejos de proteína Cas9-ARNg también ha tenido éxito, ya sea por electroporación o por
fusión a péptidos penetrantes de células, lo que evita la toxicidad mediada por
electroporación. (Wang, M. et al, 2017). La modificación química de los gRNAs puede
aumentar aún más la robustez de la edición de genes en células primarias aumentando la
estabilidad y/o disminuyendo las respuestas inmunes innatas. Es probable que los futuros
esfuerzos se aprovechen de las nuevas formulaciones de nanopartículas para un suministro
eficiente y no tóxico.
Para muchas aplicaciones, los vectores virales siguen siendo el vehículo óptimo para
maximizar la eficacia de la administración al mismo tiempo que se minimiza la toxicidad. En
particular, los vectores lentivirales han sido optimizados para la transducción altamente
eficiente de células T y células hematopoyéticas. Sin embargo estos vectores también se
integran en el genoma y expresan de forma estable su carga de transgén. Con el fin de
aprovechar la eficiencia de la transducción lentiviral mientras se limita la duración de la
expresión de nucleasa en las células diana, vectores lentivirales deficientes de integrasa se han
utilizado para entregar transitoriamente herramientas de edición del genoma a las células
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diana. De forma similar, los sistemas adenovirales también pueden alcanzar altos niveles de
transducción de una variedad de tipos de células en ex vivo. Ambos vectores lentivirales y
adenovirales también tienen la ventaja de capacidad de envasado suficiente para transportar
múltiples nucleasas o gRNA cassettes de expresión para la edición de varios loci. (Cai, M. et
al, 2014).
La edición de genes in vivo presenta retos adicionales de segmentación específica de
tejido, distribución del vector e inmunogenicidad y biocompatibilidad del portador. Sin
embargo, el suministro de genes in vivo con AAV al hígado, ojo, sistema nervioso y músculo
esquelético y cardíaco ha mostrado una eficacia impresionante tanto en los modelos
preclínicos como en los ensayos clínicos. Por consiguiente, el AAV es también un sistema
prometedor para la administración de nucleasas.
5.4 Aplicaciones de la edición de genes.
-Terapia antiviral: La aplicación más directa de la edición de genes es utilizar el mecanismo
relativamente eficiente de NHEJ para eliminar genes en una terapia ex vivo, donde las células
somáticas pueden ser aisladas, modificadas y transferidas de nuevo al paciente. Por otra parte,
una de las aplicaciones más atractivas es la prevención de la infección viral o la replicación.
La estrategia de edición de genes más avanzada hasta la fecha es la modificación ex vivo de
las células T para eliminar el co-receptor CCR5 (por ZFNs) utilizado para la infección
primaria por VIH.
Además de abordar la infección por el VIH, todas las plataformas de edición de genes
también se han aplicado a otros patógenos virales, incluyendo el virus de la hepatitis B, el
virus del herpes simple y el virus del papiloma humano. Estas estrategias implican la
eliminación de genomas virales por degradación tras escisión por la nucleasa y mediante la
edición de genes esenciales para la estabilidad del genoma, mantenimiento y replicación. Un
reto general de las terapias antivirales es la alta mutabilidad de las dianas virales.
-Inmunoterapia para el cáncer: Una estrategia prometedora para la inmunoterapia implica la
ingeniería de células T para expresar receptores sintéticos conocidos como receptores de
antígenos quiméricos, o CAR, que reconocen epítopos en las células cancerosas. Tales células
T CAR han tenido un éxito particular en el tratamiento del linfoma de células B.
Sin embargo, una limitación de este enfoque es que estas células T modificadas
expresan tanto el receptor endógeno de células T como el CAR modificado. Debido a que
estos receptores funcionan como dímeros, los receptores naturales y modificados pueden
dimerizar e interactuar, dando como resultado una especificidad de epítopo impredecible,
reduciendo la potencia terapéutica. Para abordar esta limitación, varios estudios se han
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centrado en eliminar los receptores endógenos de células T con nucleasas de ingeniería. Un
desafío importante para el desarrollo de inmunoterapias de células T ampliamente traducibles
es la necesidad de utilizar células autólogas para evitar el rechazo inmune, como es en el caso
de eliminar el antígeno de leucocitos humanos (HLA) por el cual el sistema inmunológico
discrimina a las células propias y extranjeras.
-Desórdenes hematológicos: posibilidad de tratar trastornos de coagulación tales como
hemofilia A y hemofilia B, así incluyendo enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher,
enfermedad de Pompe, enfermedad de von Gierke y Hurler y Síndrome de Hunter (Prakash,
V. 2016). Sin embargo, cada una de estas poblaciones de pacientes es relativamente pequeña
y los tipos de mutaciones de cada gen implicado en estas enfermedades son diversos. Por lo
tanto, el costo del desarrollo clínico y la aprobación reglamentaria para desarrollar
herramientas seguras y eficaces de edición de genes para cada una de estas enfermedades
puede ser excesivo. Un enfoque inteligente para abordar cada uno de estos retos es la
integración dirigida de genes terapéuticos al locus de la albúmina downsteam del promotor de
albúmina endógena.
6. Conclusión
La terapia génica debe considerar cada estrategia y adaptarla al tipo celular que debe ser
modificado. No existe una estrategia universal para todos los tipos celulares y todas las
condiciones. Es muy importante regular la actividad precisa del gen en el contexto tisular y
momento necesario. En el caso de producir moléculas nuevas desde un vector de expresión,
ya sean éstas las proteínas terapéuticas o cualquier otra fabricada a partir del mismo vector, es
importante evitar las defensas celulares de inactivacion de proteínas extrañas y finalmente,
cuando ya se entra en protocolos de terapia génica de condiciones que afectan a la especie
humana, mantener siempre y estrictamente el rigor y protocolo de los ensayos clínicos.
7. BIBLIOGRAFÍA
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ANEXO I. Comparación de las diferentes plataformas de nucleasas programables (Cox, D. B.
T et al, 2015).
ZFN TALEN CRISPR/Cas9 Meganuclease
Recognition site Typically 9 to 18bp
per ZFN monomer,
18 to 36 bp per
ZFN pair.
Typically 14 to
20bp per TALEN
monomer, 28 to
40bp per TALEN
pair.
22bp (20bp guide
sequence + 2bp
PAM sequence for
S. pyogenes Cas9);
up to 44 bp for
double nicking.
Between 14 and
40bp.
Specificity Small number of
positional
mismatches
tolerated.
Small number of
positional
mismatches
tolerated.
Positional and
multiple
consecutive
mismatches
tolerated.
Small number of
positional
mismatches
tolerated.
Targeting
constraints
Difficult to target
non-G-rich
sequences.
5’ targeted base
must be a T for
each TALEN
monomer.
Targeted sequence
must precede a
PAM.
Targeting novel
sequences often
results in low
efficiency.
Ease of engineering Difficult, may
require substantial
protein engineering.
Moderate, requires
complex molecular
cloning methods.
Easily re-targeted
using standard
cloning procedures
and oligo synthesis.
Difficult, may
require substantial
protein engineering.
Immunogenicity Likely low, as ZFs
are based on human
protein scaffold.
Fokl is derived
from bacteria and
may be
immunogenic.
Unknown, protein
derived from
Xanthamonas sp.
Unknown, protein
derived from
various bacterial
species.
Unknown,
meganucleases may
be derived from
many organisms
including
eukaryotes.
Ease of ex vivo
delivery
Relatively easy
through methods
such as
electroporation and
viral transduction.
Relatively easy
through methods
such as
electroporation and
viral transduction.
Relatively easy
through methods
such as
electroporation and
viral transduction.
Relatively easy
through methods
such as
electroporation and
viral transduction.
Ease of in vivo
delivery
Relatively easy due
to small size of
ZFN expression
cassettes, allows
use in a variety of
viral vectors.
Difficult due to the
large size of each
TALEN and
repetitive nature of
DNA encoding
TALENs, leanding
to unwanted
recombination
events when
packaged into
lentiviral vectors.
Moderate: The
commonly used
Cas9 from S.
pyogenes is large
and may impose
packaging problems
for viral vectors
such as AAV, but
smaller orthologs
exist.
Relatively easy due
to small size of
meganucleases,
allows use in a
variety of viral
vectors.
Ease of
multiplexing
Low. Low. High. Low.
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ANEXO II. Ejemplos de las aplicaciones de la edición genómica a modelos terapéuticos.
(Cox, D. B. T et al, 2015).
Disease Type Nuclease Platform Employed Therapeutic Strategy
Hemophilia B ZFN HDR-mediated insertion of
correct gene sequence
HIV ZFN and CRISPR NHEJ-mediated inactivation of
CCR5
DMD CRISPR and TALEN NHEJ-mediated removal of stop
codon, and HDR-mediated gene
correction
HBV TALEN and CRISPR NHEJ-mediated depletion of
viral DNA
SCID ZFN HDR-mediated insertion of
correct gene sequence
Cataract CRISPR HDR-mediated correction of
mutation in mouse zygote
Cystic fibrosis CRISPR HDR-mediated correction of
CFTR in intestinal stem cell
organoid
Hereditary tyrosinemia CRISPR HDR-mediated correction of
mutation in liver
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