UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICA
Efecto de la concentración del aceite esencial de las
hojas de Schinus molle sobre el crecimiento micelial
de Colletotrichum gloeosporioides in vitro.
TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO DE BIÓLOGO
Autora: Br. MOSTACERO AHÓN GLORIA MARIA
ASESOR: Dr. MARCO LEONCIO SALAZAR CASTILLO
TRUJILLO – PERÚ
2017
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLLO
QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO
RECTOR
Dr. Orlando Moisés Gonzales Nieves
SECRETARIO GENERAL
Dr. Esteban Ilich Zerpa.
VICE-RECTOR ACADÉMICO
Dr. Rubén Vera Véliz
VICE – RECTOR DE INVESTIGACÍON
Dr. Weider Portocarrero Cárdenas
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Dr. Freddy Roger Mejía Coico
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
CIENCIAS BIOLÓGICAS:
Dr. Freddy Peláez Peláez
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PRESENTACIÓN
Señores miembros del Jurado:
En cumplimiento con las disposiciones de reglamentos de grados y títulos de la
Escuela Académico profesional de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional
de Trujillo, me es honroso someter a vuestra consideración y elevado criterio, el
informe de Tesis titulado: Efecto de la concentración del aceite esencial de las
hojas de Schinus molle sobre el crecimiento micelial de Colletotrichum
gloeosporioides in vitro.
Con el cual cumplo con uno de los requisitos indispensables para obtener el título de
Biólogo.
Trujillo, Abril del 2017
__________________________________
Br. Mostacero Ahón Gloria Maria
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MIEMBROS DEL JURADO
Dr. Julio Roger Chico Ruíz
PRESIDENTE
Dra. Marlene Rene Rodríguez Espejo
SECRETARIA
Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo
VOCAL
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DEL ASESOR
El que suscribe, profesor asesor de tesis titulada “Efecto de la concentración
del aceite esencial de las hojas de Schinus molle sobre el crecimiento
micelial de Colletotrichum gloeosporioides in Vitro deja constancia que esta
ha sido desarrollada de conformidad con los objetivos propuestos en su perfil
académico y que el informe ha sido revisado y acoge las observaciones y
sugerencia alcanzada por los miembros del jurado.
Por lo tanto, autorizo al Br. Mostacero Ahón Gloria Maria a continuar con los
trámites correspondientes.
Dr. Marco Leoncio Salazar Castillo
ASESOR
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A: Dios, por darnos la oportunidad de vivir y por estar
con nosotras en cada paso que damos, por fortalecer
nuestro corazón e iluminar nuestra mente y por haber
puesto en el camino a aquellas personas que han sido
soporte y compañía durante todo el periodo de estudio.
A: Mis padres Bernardo y Emelda por ser el pilar
fundamental en lo que soy, en la educación, tanto
académica, como de la vida, por su incondicional apoyo
perfectamente mantenido a través del tiempo.
A: Mis hermanos: José Antonio, Maria Susana y Maria
Angélica, porque me han brindado su apoyo
incondicional y por compartir conmigo buenos y malos
momento.
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AGRADECIMIENTO:
Agradezco en primer lugar a Dios, por permitirme culminar mi carrera como
también a mis Padres, Hermanos, familiares y amigos quienes me han brindado su
apoyo incondicional.
Agradezco el apoyo brindado que, en este andar por la vida, influyo con sus
lecciones y experiencias en formarnos como personas de bien y preparada para los
retos que pone la vida.
Agradezco de forma muy especial a todos mis queridos maestros quienes con
responsabilidad y alegría me ilustraron en las aulas de esta universidad y de
manera muy especial quiero agradecer a mi asesor Dr. Marco Leoncio Salazar
Castillo y co asesor el Dr. Julio Roger Chico Ruíz, que sin ningún interés me
brindaron sus conocimientos científicos que fueron muy importantes para
culminar con éxito esta investigación. De igual forma dejo constancia de mis
agradecimientos a todos los miembros del laboratorio de Tecnología enzimática y
Productos Naturales, Departamento Académico de Química Biológica y Fisiología
Animal, de la Facultad de Ciencias Biológicas - UNT, a las Sras. Ms. Melchora
Veneros C. y Ms. Doris Asmat P. por bridarme su apoyo y amistad.
Agradezco el apoyo brindado a mi profesor Blgo. Carlos Heli Quijano Jara por
compartir sus conocimientos para poder plasmarlo en su realización.
A las personas que me orientaron en la redacción del proyecto y nos compartieron
sus conocimientos para poder plasmarlo en su realización.
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ÍNDICE
Pág.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE BIÓLOGO ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS iii
PRESENTACIÓN iv
MIEMBROS DEL JURADO v
DEL ASESOR vi
DEDICATORIA vii
AGRADECIMIENTO viii
ÍNDICE ix
LISTA DE FIGURAS Y TABLAS x
RESUMEN xi
ABSTRACT xii
I. INTRODUCCION 1
II. MATERIAL Y MÉTODOS 5
III. RESULTADOS 9
IV. DISCUSIÓN 12
V. CONCLUSIONES 14
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 15
VII. ANEXOS
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LISTA DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1. Velocidad de crecimiento de diámetro micelial de C. gloeosporioides
cuando se enfrentan a diferentes concentraciones de aceite esencial de hojas de S.
molle. 10
Tabla 1. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (ICM) del aceite
esencial de las hojas de S. molle, sobre el crecimiento micelial de C.
gloeosporioides en condiciones in vitro. 9
Tabla 2. Análisis de varianza (ANOVA) de crecimiento micelial de C.
gloeosporioides a los 8 días, por cada concentración de aceite esencial de hojas de
S. molle. 11
Tabla 3. Pruebas de Múltiple Rangos para crecimiento micelial de C.
gloeosporioides a los 8 días, por cada concentración de aceite esencial de hojas de
S. molle. 11
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RESUMEN
Se evaluó el efecto de la concentración del aceite esencial de las hojas de Schinus
molle, sobre el crecimiento micelial de Colletotrichum gloeosporioides, in vitro. Para
ello, se utilizó el medio de cultivo Agar Base Sabouraud más antibiótico, y por
destilación por arrastre de vapor se obtuvo el aceite esencial de S. molle. Se
prepararon concentraciones crecientes de aceite esencial (1, 2, 5, 10 µL/mL)
respectivamente; teniendo como controles el crecimiento micelial positivo al medio
de cultivo con solo agar Sabouraud, y al negativo al medio de cultivo conteniendo
carbendazim (0,2 µL/mL). Se sembraron por puntura fragmentos homogéneos de
micelio C. gloeosporioides. En todos los tratamientos y controles, se incubaron por
8 días a temperatura ambiente observando y midiendo (mm con vernier), el
crecimiento micelial después del cuarto día de incubación. Se encontró que
concentraciones mayores de 2 µL /mL del aceite esencial de S. molle inhiben el
crecimiento micelial de C. gloeosporioides más del 65%, siendo la inhibición más
alta (90.8%), la concentración de 10 µL/mL. Se concluye que el aceite esencial de S.
molle si inhibe el crecimiento micelial de C. gloeosporioides en relación directa a la
concentración y este aceite puede ser utilizado en el control biológico de este
patógeno.
Palabras clave: Aceite Esencial - Schinus molle - Crecimiento micelial -
Colletotrichum gloeosporioides.
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ABSTRACT
The effect of the essential oil concentration of the leaves of Schinus molle on the
mycelial growth of Colletotrichum gloeosporioides was evaluated. For this, the
Sabouraud Base Agar culture medium was used more antibiotically, and the
essential oil of S. molle was obtained. Increasing concentrations of essential oil (1,
2, 5, 10 μL / mL) respectively were prepared; Having as controls the positive
mycelial growth to the culture medium with only Sabouraud agar and negative to
the culture medium containing carbendazim (0.2 μL / mL). Homogeneous
fragments of C. gloeosporioides mycelium were seeded by puncturing. In all
treatments and controls, they were incubated for 8 days at room temperature
observing and measuring (mm with vernier), the mycelial growth after the fourth
day of incubation. It was found that concentrations greater than 2 μL / mL of the
essential oil of S. molle inhibited the mycelial growth of C. gloeosporioides over
65%, with the highest inhibition (90.8%) being the concentration of 10 μL / mL. It
is concluded that the essential oil of S. molle does inhibit the mycelial growth of C.
gloeosporioides in direct relation to the concentration and this oil can be used in the
biological control of this pathogen.
Palabras clave: Essential oil - Schinus molle - mycelial growth - Colletotrichum
gloeosporioides.
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1
I. INTRODUCCION
Schinus molle es una especie vegetal muy difundida en el Perú, siendo su
desarrollo óptimo en los climas de los valles interandinos, esta especie pertenece a
la familia Anacardiaceae1. Es una planta con actividad antifúngica y antibacteriana
principalmente en las hojas2. Además, tiene importancia etnobotánica, pues se la ha
utilizado en el control de plagas agrícolas en varias localidades del Perú3.
Se han evaluado los efectos antibacterianos y antifúngicos de los aceites
esenciales obtenidos de hojas frescas de S. molle, aislados por hidrodestilación
obteniendo actividad contra especies bacterianas totales como: Klebsiella
pneumoniae, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Leuconostroc
cremoris, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris, Echerichia coli y Bacillus
subtilis, entre otras y contra especies fúngicas Aspergillus ochraceus, A.
parasiticus, Fusarium culmorum y Alternaria alternata, mostrando una
sensibilidad significativa a los aceites volátiles4.
Los aceites esenciales surgen como una alternativa al control de plagas y
enfermedades pues su aplicación a nivel de laboratorio ha demostrado eficiencia en
el control de agentes fitopatógenos, creando la posibilidad de contar con productos
que garanticen inocuidad en el medio ambiente y garantizando producciones sanas
y libres de residuos contaminantes5.
Generalmente, los aceites esenciales son mezclas complejas de hasta más de
100 componentes (metabolitos secundarios) que pueden ser compuestos alifáticos
de bajo peso molecular (alcanos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres y ácidos),
monoterpenos, sesquiterpenos y fenilpropanos. Estos metabolitos secundarios
cubren un amplio espectro de efectos farmacológicos mostrando diversas
propiedades biológicas, como propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, y
anticancerígenos5. Otras actividades biológicas también se reportan como biocidas
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en contra de una amplia gama de microorganismos como bacterias, hongos, virus,
protozoarios insectos y plantas6.
En años recientes, se han desarrollado estudios orientados a la búsqueda de
agentes biocontroladores efectivos en la lucha contra plagas agrícolas. Los agentes
de control biológico incluyen hongos e insectos, extractos vegetales y aceites
esenciales. Actualmente existe un renovado interés en el estudio de aceites
esenciales ya que se buscan alternativas de origen natural para la preservación de
alimentos, lucha contra plagas agrícolas y por los problemas que implica la
resistencia de microorganismos a controles químicos y por el creciente rechazo de
la sociedad al uso de compuestos químicos como aditivos de alimentos y
pesticidas7.
Es necesario investigar sobre las concentraciones mínimas que inhiban el
crecimiento de microorganismos, usando métodos sensibles y robustos que nos
permitan reportar estos datos y valorar la capacidad antimicrobiana de los aceites
esenciales. Estos aceites esenciales, son una buena alternativa como
antimicrobianos ya que en la actualidad alrededor del mundo estamos buscando
formas de cuidar y controlar nuestros cultivos de plagas y enfermedades, sin
destruir más el medio ambiente, tratando de obtener tendencia hacia los productos
naturales y dejar a un lado los productos químicos que tanto daño causan.
El género Colletotrichum es causante de enfermedades prácticamente en
todas las cosechas agrícolas del mundo8. Y produce la “antracnosis” que se
caracterizan por el hundimiento necrosado del tejido donde se producen masas de
conidias dentro de un acérvulo9. La antracnosis se presenta en tejidos de plantas en
desarrollo y maduros, afecta frutos durante su desarrollo en el campo, así como
frutos maduros durante su almacenaje10, prevalece durante temporadas de lluvias y
humedad relativa alta (>80%)11, e infecta con temperaturas de 20 a 28 °C 9. Las
etapas de desarrollo de las especies de Colletotrichum pueden separarse en:
deposición en la superficie del hospedante, fijación de la conidia en la superficie,
germinación de la conidia, producción del apresorio, penetración de la epidermis
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de la planta, crecimiento y colonización del tejido del hospedante y producción de
acérvulos y esporulación12.
El cultivo de Persea americana Mill “palta” es una fuente económica muy
importante, es de consumo creciente debido a su incorporación en la dieta y genera
fuentes de empleos directos e indirectos en su cadena productiva. Para el Perú, la
palta ya es uno de los rubros de exportación más importantes y de crecimiento
espectacular, que se ha constituido en una de las estrellas de la agro exportación La
creciente demanda del fruto de palto en el mundo ha sido factor importante para
que se incremente la superficie cultivada.
El palto es afectado por varias enfermedades producidas por bacterias y
hongos principalmente, entre las que destacan por su prevalencia y por los daños
ocasionados al cultivo, C. gloeosporioides “antracnosis” 13, enfermedad con
prevalencia en temporadas lluviosas o con humedad relativa alta. Es un patógeno
de postcosecha del palto que infecta principalmente frutos pequeños durante su
crecimiento en los huertos. Los cambios fisiológicos en el fruto permiten la
activación del patógeno quiescente, ocasionando pérdidas sustanciales por
decaimiento de frutos durante el almacenaje y comercialización9. Es una de las
enfermedades principales que afecta la calidad del fruto y llega a causar pérdidas
cercanas al 20%, por ello, se hace necesario conocer la interacción planta–patógeno
en sus aspectos moleculares y bioquímicos que sirvan como punto de partida para
plantear investigaciones básicas y aplicadas que provean nuevas perspectivas para
el control de la enfermedad.
Los cultivos industriales y de exportación como el cacao, el palto, el mango,
son en algún momento atacados por C. gloeosporioides, el efecto del hongo en
algunos lugares ha sido contrarrestado tratándolo mediante el control químico y
medidas culturales, sin embargo, el uso del aceite esencial de hojas de S. molle,
resulta novedoso para reemplazar a los químicos debido a que no inducen a
resistencia, no contaminan el ambiente y resultan menos costosos.
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El propósito de la presente tesis fue evaluar el efecto de la concentración del aceite
esencial de las hojas de S. molle sobre el crecimiento micelial de C. gloeosporioides
in vitro.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de Tecnología Enzimática y
Productos Naturales, departamento Académico de Química Biológica y Fisiología
Animal, Facultad de Ciencias Biológicas - Universidad Nacional de Trujillo.
Material biológico
Colletotrichum gloeosporioides fue proporcionado por el laboratorio de
fitopatología, del departamento Académico de Ciencias Biológicas, Facultad de
Ciencias Biológicas, de la Universidad Pedro Ruiz Gallo el cual fue aislado de
frutos de palto.
S. molle “molle” fue colectado en el distrito de Otuzco, tanto para los ensayos
biológicos y su identificación taxonómica en el Herbarium Truxillensis (HUT) de
la Universidad Nacional de Trujillo.
Del material recolectado se seleccionaron las hojas sanas (sin signos o síntomas de
enfermedad o ataque de plagas).
Preparación de medio de cultivo
Se realizó la preparación del medio de cultivo Agar Sabouraud Difco14, se esterilizó
a 121°C/15lb/15min y se adicionó el antibiótico (500 g de Doxiciclina), en cada
medio de cultivo preparado15.
Reactivación del hongo
Se realizó a partir de la placa Petri que contuvo el cultivo madre, donado por el
laboratorio de fitopatología, de la Universidad Pedro Ruiz Gallo, realizando los
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repiques sucesivos que garantizó la pureza y viabilidad del patógeno hasta su
aplicación, el cultivo se incubó por siete días16.
Obtención del aceite esencial de las hojas de S. molle.
El aceite esencial se obtuvo a partir del material vegetal fresco de las especies S.
molle. Después de seleccionar y preparar el material, eliminando tallos y hojas
dañadas, se sometió a una extracción por el método destilación por arrastre de
vapor de agua. Luego se colocó en frascos pequeños de color ambar y con tapa
rosca, se recomienda refrigerar (5°C).
Aproximadamente 25 kilos de material vegetal, en un destilador (mL) a escala de
laboratorio se empleó 500 g de muestra por cada extracción, las que se colocarón
en el equipo de arrastre de vapor de agua17. El tiempo medio de extracción fue de
15 minutos, luego de alcanzar la temperatura de ebullición del agua (92°C).
Los hidrolatos que contuvo los aceites esenciales fueron colectados y almacenados
en frascos de vidrio color ámbar de 10 mL de capacidad, hasta la destilación de los
25 kilos del material vegetal colectado.
Se concentraron los aceites esenciales partiendo, en peras de separación, los
hidrolatos con cloroformo y luego se destiló el cloroformo17.
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Diseño experimental
Se utilizó el diseño completamente al azar de estímulo creciente. El diseño
experimental contó con 4 grupos experimentales, un grupo control positivo, un
grupo control negativo (con carbendazim 0,5 cc/L), a cada grupo se le realizó 3
repeticiones. La evaluación de los resultados culminó cuando el micelio del hongo
(control positivo), ocupe toda la extensión (9cm) de la placa Petri18.
Fuente: Autor, C = Agar Sabouraud +Antibiótico(Doxiciclina), C (1,2,3 y 4) = Agar Sabouraud + aceite esencial
+ Antibiótico(Doxiciclina), C + = Agar Sabouraud + Antifungico (Carbendazim).
% ICM= porcentaje de inhibición del crecimiento micelial.
Evaluación del aceite esencial sobre el crecimiento del hongo
El aceite esencial de S. molle “molle”, se mezcló con el medio agar Sabourand
estéril, en las concentraciones de 1, 2, 5 y 10 µL (v/v) y se dispensó en placas Petri.
Luego de la solidificación del medio, se colocó en el centro de cada placa un disco
de micelio de 5 mm de diámetro, extraído del cultivo puro de C. gloeosporioides
incubado a temperatura ambiente 27±2ºC 25 16. Se registraron las medidas del
diámetro de la colonia del hongo estudiado a partir del cuarto día de
experimentación, cada 48 horas, hasta que el crecimiento del tratamiento testigo (0
% de inhibición) complete el diámetro de la placa (9 cm)16. Con los promedios de
los datos obtenidos, se determinó la velocidad de crecimiento de diámetro micelial.
Así mismo se calculó el porcentaje de inhibición mediante la siguiente formula:
Grupos experimentales Crecimiento micelial (mm)
Promedio
crecimiento
micelial
(mm)
% ICM
4 días 6 días 8 días
1 C (AS + A)
2 C1 (AS + A +AE, S. molle) 1 µL/mL
3 C2 (AS + A + AE, S. molle) 2 µL/mL
4 C3 (AS + A + AE, S. molle) 5 µL/mL
5 C4 (AS + A + AE, S. molle) 10 µL/mL
6 C+ (AS + A Carbendazim) 2 µL/mL
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𝑰𝑪𝑴 =(𝒅𝟎 − 𝒅𝒄 )
𝒅𝟎 ×𝟏𝟎𝟎
Dónde:
% ICM = Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial,
do = Diámetro de la colonia del testigo (0 %),
dc = Diámetro de la colonia con la concentración prueba.
Análisis estadístico
Se evaluó la presencia (y dimensión en mm) o ausencia del halo de inhibición del
crecimiento del hongo. Los datos se sometieron a un análisis de varianza
(ANOVA), al haber obtenido una razón F significativa se utilizó el análisis de
comparaciones múltiples de Tukey (p≤0,05), para determinar entre qué tratamientos
se encontrarón las diferencias significativas. Se Utilizó el paquete estadístico IBM
SPSS Statistics vers. 20, para todos los tratamientos18.
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III. RESULTADOS
Según los resultados obtenidos, las concentraciones del aceite esencial de las hojas
de S. molle “molle”, 1, 2, 5 y 10 µL/mL (Tabla 1, Figs. 1)., y según análisis
estadísticos existen diferencias significativas en los tratamientos, causando
inhibición conforme aumenta las concentraciones del aceite esencial.
Tabla 1. Crecimiento micelial y Porcentaje de inhibición micelial (ICM), del
crecimiento de C. gloeosporioides sobre del aceite esencial de las hojas de Schinus
molle en condiciones in vitro.
Fuente: Autor, C = Agar Sabouraud +Antibiótico(Doxiciclina), C (1,2,3 y 4) = Agar Sabouraud + aceite esencial
+ Antibiótico(Doxiciclina), C + = Agar Sabouraud + Antifungico (Carbendazim).
% ICM= porcentaje de inhibición del crecimiento micelial.
Los resultados obtenidos en el trabajo de enfrentamiento de C. gloeosporioides con
las concentraciones al 1, 2, 5 y 10 µL/mL aceite esencial de Schinus molle
permitieron observar halos de control de crecimiento desde 70.6 mm hasta el 6.4
mm respectivamente
Grupos experimentales
Crecimiento micelial
(mm)
Promedio
crecimiento
micelial
(mm)
% ICM
4 días 6 días 8 días
1 C 68.6 70.6 70.0 69.7 0.000
2 C1 (1 µL/mL) 28.6 26.6 27.6 27.6 60.419
3 C2 (2 µL/mL) 25.4 23.4 24.4 24.4 65.008
4 C3 (5 µL/mL) 23.8 21.8 22.8 22.8 67.302
5 C4 (10 µL/mL) 7.4 5.4 6.4 6.4 90.822
6 C+ 0 0 0 0 100.000
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Fig 1. Crecimiento micelial de C. gloeosporioides bajo la acción de diferentes
concentraciones de aceite esencial de hojas de S. molle.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
D I A 0 D I A 4 D I A 6 D I A 8
DIA
MET
RO
(M
M)
CRECIMIENTO DE DIAMETRO MICELIAL
C (0 µL/ml) C ( 1 µL/ml) C (2µL/ml)
C ( 5 µL/ml ) C (10µL/ml) C+
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Tabla 2. Análisis de varianza (ANOVA) de crecimiento micelial de C.
gloeosporioides a los 8 días, por cada concentración de aceite esencial de hojas de
S. molle.
Existe suficiente base estadísticas con una P < 0.05, para afirmar que existe diferencia significativa entre la
media de crecimiento micelial 8 días entre un nivel de tratamiento y otro.
Tabla 3. Pruebas de Múltiple Rangos para crecimiento micelial de C.
gloeosporioides a los 8 días, por cada concentración de aceite esencial de hojas de
S. molle.
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
C - C+ * 69.7333 2.51725
C - C1 * 42.1333 2.51725
C - C2 * 45.3333 2.51725
C - C3 * 46.9333 2.51725
C - C4 * 63.3333 2.51725
C+ - C1 * -27.6 2.51725
C+ - C2 * -24.4 2.51725
C+ - C3 * -22.8 2.51725
C+ - C4 * -6.4 2.51725
C1 - C2 * 3.2 2.51725
C1 - C3 * 4.8 2.51725
C1 - C4 * 21.2 2.51725
C2 - C3 1.6 2.51725
C2 - C4 * 18.0 2.51725
C3 - C4 * 16.4 2.51725 * indica una diferencia significativa.
Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 8951.54 5 1790.31 2125.69 0.0000
Intra grupos 10.1067 12 0.842222
Total
(Corregido.)
8961.64 17
Tratamientos Casos Media Grupos Homogéneos
C+ 3 0.0 X
C4 3 6.4 X
C3 3 22.8 X
C2 3 24.4 X
C1 3 27.6 X
C 3 69.7333 X
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IV. DISCUSION
Los resultados obtenidos en el trabajo de enfrentamiento de C. gloeosporioides con
las concentraciones al 1, 2, 5 y 10 µL/mL aceite esencial de Schinus molle
permitieron observar halos de control de crecimiento desde 70.6 mm hasta el 6.4
mm respectivamente.
Los valores obtenidos en la Tabla 1, muestran la capacidad del aceite esencial de
Schinus molle para inhibir o detener el crecimiento de C. gloeosporioides,
comportándose como efectivo controlador biológico: el “molle” presenta propiedad
antibacteriana y antifúngica y al menos en condiciones experimentales, logra la
inhibición micelial.19
Es necesario mencionar que las concentraciones del aceite esencial de las hojas de
S. molle empleadas en la experimentación: 1, 2, 5 y 10 µL/mL, presenta diferencias
significativas (Tabla 2), lo cual indica que al usar cualquiera de estas
concentraciones se obtendría una inhibición de 60.4, 65.0, 67.3 y 90.8 %
respectivamente.
En la Tabla 3 nos muestra el análisis estadístico de pruebas de Múltiple Rangos
para crecimiento micelial de C. gloeosporioides a los 8 días, por cada concentración
de aceite esencial de hojas de S. molle. Indicando que el crecimiento micelial de C.
gloeosporioides a los 8 días tiene diferencias significativas.
Muchas especies vegetales producen aceites esenciales los cuales juegan un papel
importante en los mecanismos de defensa contra el hongo Colletotrichum. Se ha
demostrado que los aceites esenciales y sus compuestos tienen un efecto fungicida.
Son inocuos para el medio ambiente, para los consumidores y para el control de
enfermedades postcosecha. La necesidad de reducir el uso de químicos sintéticos
en la agricultura ha incrementado el interés por la posible aplicación de aceites
esenciales para el control biológico patógeno20, 21. En otras investigaciones de aceite
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esencial de Schinus molle contra Candida albicans se reporta acción inhibitoria
mayor a 18 mm20, 21. Cabe señalar, que las diferencias observadas en la curva de
crecimiento (Fig. 1) velocidad de crecimiento micelial de podría verse afectadas
también por factores ambientales, cantidad de inóculo, y la susceptibilidad del
hongo22,18.
Es necesario mencionar que las concentraciones del aceite esencial empleadas en la
experimentación: 1, 2, 5 y 10 µL/mL presenta diferencias significativas (Tabla 2),
lo cual indica que al usar cualquiera de estas concentraciones se obtendría una
inhibición alta de 60.4, 65.0, 67.3 y 90.8 % respectivamente. S. molle, tiene una alta
capacidad de acción.
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V. CONCLUSIONES
En relaciones a las concentraciones realizadas se concluye lo siguiente.
El aceite esencial de las hojas Shinus molle “molle” inhibe el crecimiento micelial
de C. gloeosporioides.
La inhibición del crecimiento micelial de Colletotrichum gloeosporioides está en
relación directa a la concentración del aceite esencial de Shinus molle.
El porcentaje de inhibición micelial de Colletotrichum gloeosporioides en la
concentración de 10 µL/mL fue de 90.8%.
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VI. RECOMENDACIONES
Se recomienda profundizar respecto a la utilización del aceite esencial de las hojas
de S molle con concentraciones más altas por ejemplo entre 10 y 20 µL/mL.
Aplicar, en situ, el aceite esencial de S. molle en un cultivo sensible al
Colletotrichum gloeosporioides.
Determinar la actividad fungicida y fungistática.
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carvacrol sobre microorganismos de interés en alimentos. Temas selectos de
ingeniería de alimentos Universidad de las Américas-Puebla. México, 2008;
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ANEXOS
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ANEXO 1. Medidas del diámetro de la colonia del hongo Colletotrichun
gloeosporioides a partir del cuarto día. 1° lectura. Con tres repeticiones.
Concentración /
tiempo MEDIDAD DE DIAMETROS (mm)
PROMEDIO
(mm)
C (0 µL/mL)
40 40 38 40 40 39.6
42 42 40 42 42 41.6
41 41 39 41 41 40.6
C1 (1 µL/mL)
11 18 20 19 20 17.6
9 16 18 17 18 15.6
10 17 17 18 17 15.8
C2 (2 µL/mL)
13 12 14 13 13 13
11 10 12 11 11 11
12 11 13 12 12 12
C3 (5 µL/mL)
12 11 12 10 11 11.2
10 9 10 8 9 9.2
11 10 9 9 10 9.8
C4 (10 µL/mL)
5 5 5 6 5 5.2
3 3 3 4 3 3.2
4 4 4 5 4 4.2
C+
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
ANEXO 2. Medidas del diámetro de la colonia del hongo Colletotrichun
gloeosporioides, sexto día 2° lecturas. Con tres repeticiones.
Concentración medidas de diametro (mm) PROMEDIO (mm)
C (0 µL/mL)
49 41 45 43 43 44.2
51 43 47 45 45 46.2
50 42 46 44 44 45.2
C1 (1 µL/mL)
21 23 22 24 22 22.4
19 21 20 22 20 20.4
20 22 21 23 21 21.4
C2 (2 µL/mL)
18 18 17 18 18 17.8
16 16 15 16 16 15.8
17 17 16 17 17 16.8
C3 (5 µL/mL)
14 14 13 13 15 13.8
12 12 11 12 13 12
13 13 10 11 14 12.2
C4 (10 µL/mL)
6 7 5 6 6 6
4 5 3 4 4 4
5 6 4 5 5 5
C+
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
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ANEXO 3. Medidas del diámetro de la colonia del hongo Colletotrichun
gloeosporioides, octavo día. 3° lecturas. Con tres repeticiones.
ANEXO 4. Velocidad del crecimiento de diámetro micelial de la colonia del hongo
Colletotrichun gloeosporioides, cuarto día 1° lecturas.
ANEXO 5. Velocidad del crecimiento de diámetro micelial de la colonia del hongo
Colletotrichun gloeosporioides, sexto día. 2° lecturas.
Concentración / tiempo Medidas de diámetro micelial (mm) Promedios (mm)
C (0 µL/mL)
68 69 68 71 67 68.6
70 71 70 73 69 70.6
71 70 69 72 68 70
C1 (1 µL/mL)
28 29 28 30 28 28.6
26 27 26 28 26 26.6
27 28 27 29 27 27.6
C2 (2 µL/mL)
27 25 26 24 25 25.4
25 23 24 22 23 23.4
26 24 25 23 24 24.4
C3 (5 µL/mL)
25 23 23 24 24 23.8
23 21 21 22 22 21.8
24 22 22 23 23 22.8
C4 (10 µL/mL)
8 8 7 7 7 7.4
6 6 5 5 5 5.4
7 7 6 6 6 6.4
C+
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0
Tratamientos
Repetiones
Crecimiento Micelial ( 4 dias)
C
(0 µL/mL)
C1
(1µL/mL)
C2
(2 µL/mL)
C3
(5µL/mL)
C4
(10µL/mL) C +
1 39.6 17.6 13 11.2 5.2 0
2 41.6 15.6 11 9.2 3.2 0
3 40.6 15.8 12 9.8 4.2 0
X 1 40.6 16.3 12 10.1 4.2 0
Tratamientos
Repetiones
Crecimiento Micelial (6 días)
C
(0 µL/mL)
C1
(1µL/mL)
C2
(2 µL/mL)
C3
(5µL/mL)
C4
(10µL/mL) C +
1 44.2 22.4 17.8 13.8 6.0 0
2 46.2 20.4 15.8 12.0 4.0 0
3 45.2 21.4 16.8 12.2 5.0 0
X 2 45.2 21.4 16.8 12.7 5.0 0
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ANEXO 6. Velocidad del crecimiento de diámetro micelial de la colonia del hongo
Colletotrichun gloeosporioides, octavo día. 3° lecturas.
ANEXO 7. Velocidad del crecimiento de diámetro micelial promedio con las tres
repeticiones.
ANEXO 8. Porcentaje de inhibición del crecimiento micelial (ICM) del aceite esencial
de las hojas de Schinus molle, sobre el crecimiento micelial de C. gloeosporioides en
condiciones in vitro.
Tratamientos
Repetiones
crecimiento micelial (mm) 8 días C
(0 µL/mL)
C1
(1 µL/mL)
C2
(2µL/mL)
C3
(5µL/mL)
C4
(10µL/mL) C +
1 68.6 28.6 25.4 23.8 7.4 0
2 70.6 26.6 23.4 21.8 5.4 0
3 70.0 27.6 24.4 22.8 6.4 0
X 3 69.7 27.6 24.4 22.8 6.4 0
C
(0 µL/mL)
C1
(1 µL/mL)
C2
(2µL/mL)
C3
(5µL/mL)
C4
(10µL/mL) C +
X 1 40.6 16.3 12 10.1 4.2 0
X2 45.2 21.4 16.8 12.7 5 0
X3 69.7 27.6 24.4 22.8 6.4 0
% Inhibición del Crecimiento Micelial (ICM)
4 DIAS 6 DIAS 8 DIAS C (0 µL/mL)
C1 (1 µL/mL) 59.8 52.7 60.4 C2 (2µL/mL) 70.4 62.8 65.0 C3 (5µL/mL) 75.1 71.9 67.3
C4 (10µL/mL) 89.7 88.9 90.8 C + 100 100 100
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DISEÑO EXPERIMENTAL: ANOVA Simple - Crecimiento Micelial 8 Días
por Tratamientos
Variable dependiente: Crecimiento Micelial 4 Días
Factor: Tratamientos: grupo control positivo (C), 4 grupos experimentales 1, 2, 5,
10µL/ml (C1, C2, C3 y C4) y un grupo control negativo con carbendazim (C+).
Número de observaciones: 18
Número de niveles: 6
ANEXO 9. Comparación de medias para el crecimiento micelial de C.
gloeosporioides en condiciones invitro en 8 días para los diferentes
tratamientos con aceite esencial de las hojas de S molle.
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ANEXO 10. Identificación taxonómica en el Herbarium Truxillensis (HUT)
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MATERIAL Y METODOS
Obtención de C. gloeosporioidesPoporcionado por el laboratorio deFitopatología: 15-09-16.
Preparación del medio de cultivo
Agar Sabouraud, (6,5g/100mL)esterilizar 121°C/15lb/15min,adicionar doxiciclina (0,1mg/mL),servir en placas esteriles.
Reactivar el hongo
Del cultivo madre, repicar porpuntura en OGA (pureza yviabilidad del patógeno).
Diseño experimental
4 grupos experimentales,1 grupo control positivo,1 grupo control negativo
grupo control positivo
Sin AE, ni Carbendazin
Grupos experimentales:
AE
0,1 µL/mL0,2 µL/mL0,4 µL/mL0,8 µL/mL
grupo control negativo
(con carbendazim (0,2 µL/mL).
Colección S. molle “molle”Distrito de Otuzco: 14-08-16
Identificación taxonómica en el Herbarium Truxillensis (HUT)
seleccion hojas S. molle
sanas (sin signos o síntomas deenfermedad o ataque de plagas).
Obtención del aceite esencial
Según método de arrastre de vaporde agua.
Destilación por arrastre de vapor
Destilar del material vegetal,(500g) los AE por 15 minutos.
Recoger en frascos ambar yconservar en refrigeración.
MATERIALBIOLOGICO
ANEXO 11. Flujograma: Efecto de la concentración del aceite esencial de las hojas de
Schinus molle sobre el crecimiento micelial de Colletotrichum gloeosporioides in
vitro.
Incubación
4, 6 y 8 días / T°ambiente
Medición del crecimiento/24h
RESULTADOS
Registrar datos de medición de crecimiento micelial del hongo.
Realizar Tablas y figuras e interpretar dichos resultados
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ANEXO 12. El aceite esencial se obtuvo a partir del material vegetal fresco
de las especies S. molle. se sometió a una extracción por el
método destilación por arrastre de vapor de agua.
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ANEXO 13. Colletotrichum gloeosporioides fue proporcionado por el laboratorio de
fitopatología, del departamento Académico de Ciencias Biológicas,
Facultad de Ciencias Biológicas, de la Universidad Pedro Ruiz Gallo.
ANEXO 14. Preparación del medio de cultivo Agar Sabouraud Difco.
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ANEXO 15. Dispensando el medio de cultivo en las placas y tubos para repicar el
cultivo madre de C. gloeosporioides.
ANEXO 16. Reactivación del hongo C. gloeosporioides del cultivo madre
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ANEXO 17. Reactivación del hongo C. gloeosporioides del cultivo madre para
sembrar en las diferentes concentraciones del aceite esencial de hojas S.
molle.
ANEXO 18. Se dispensó el medio de Agar Sabouraud Difco esterilizado a 121
°C/15lb/15 min, en placas Petri.
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ANEXO 19. Aceite esencial de las hojas de S.
molle, agregado al medio.
ANEXO 20. Medición del diámetro de la colonia del hongo C. gloeosporioides (vista
base placa).
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IOLO
GICAS
ANEXO 21. Crecimiento micelial de C. gloeosporioides cuando se enfrenta a las
diferentes concentraciones de aceite esencial de S. molle. Después de 4
días; vista frontal: A. placa control C, B. C1 (1 µL/mL), C. C2 (2
µL/mL), D. C3 (5 µL/mL), E. C4 (10 µL/mL), F. placa con anti fúngico.
A B
C D
E F
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E CIE
NCIAS B
IOLO
GICAS
ANEXO 22. Crecimiento micelial de C. gloeosporioides cuando se enfrenta a las
diferentes concentraciones de aceite esencial de S. molle. Después de 8
días; vista frontal: A. placa control C, B. C1 (1 µL/mL), C. C2 (2 µL/mL),
D. C3 (5 µL/mL), E. C4 (10 µL/mL), F. placa con anti fúngico C+.
B A
C D
E F
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ANEXO 23. Crecimiento micelial de C. gloeosporioides cuando se enfrenta a las
diferentes concentraciones de aceite esencial de S. molle. Después de 8
días; vista base placa: A. placa control C, B. C1 (1 µL/mL), C. C2 (2
µL/mL), D. C3 (5 µL/mL), E. C4 (10 µL/mL), F. placa con anti fúngico
C+.
B A
C D
E F
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