Practica 2: EXTRACCIN DE DNA A PARTIR DE CULTIVO HOMOGENEO DE BACTERIAS

IntroduccinUn cultivo homogneo de bacteria, es cuando en una placa de cultivo crecen colonias de una cepa, es decir todas las colonias deben de ser iguales en cuanto a color, forma y tamao; es decir las colonias que se observan deben ser uniformes (homogneas), esto permite que el ADN que se obtiene pertenezca a una sola variedad de bacteria (cepa pura), lo que garantizara que una posterior secuenciacin del gen amplificado (RNAr 16S), sea limpia.Un cultivo homogneo se obtiene despus de 6 repiques, a partir de una colonia que haya sido aislada de una muestra (tejido, liquido, tierra, etc) usando los protocolos estndar.La extraccin de ADN utiliza una solucin Fenol:cloroformo para precipitar protenas y Lpidos del lisado de proteinas, dejando en la solucin acuosa (fraccin acuosa) los cidos nucleicos que son precipitados con etanol. El precipitado luego de un breve secado puede ser resuspendido en agua o solucin TE y analizado mediante electroforesis en geles de agarosa.

Objetivo:Extraer ADN de bacterias, para amplificacin del gen RNAr16S, mediante PCR.

Material y Mtodos Buffer de lisis10 mM Tris pH 8.01 mM EDTA100 mM NaCl1% SDS2% Triton Glass beads (perlas de vidrio) Buffer TE

Procedimiento.

1. A un tubo eppendorf que contiene 100 ul de suspensin bacterian, aadir 0.3 g de perlas de vidrio, 200 ul de buffer de lisis y 200 ul de la mezcla 1:1 Fenol-Cloroformo2. Vortex el tubo por 2 min.3. Adicionar 200 ul de TE y Vortex otra vez por 2 minutos4. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una micro centrifuga.5. Transferir la fase acuosa (380 ul) a un nuevo tubo eppendorf, use tip nuevo para cada muestra. Descarte el tubo con las perlas de vidrio.6. Adicionar 2 volmenes de 100% etanol a temperatura ambiente, mezclar.7. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.8. Descarte el sobrenadante9. Enjuague en pellet con 0.5 ml etanol fro al 70%, el etanol de debe aadir muy despacio sin destruir o disolver el pellet.10. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.11. Remover el sobrenadante, deje los tubos abiertos e invertidos para secar los pellet.12. Resuspender el pellet en 50 ul de aguas desionizada o TE. 13. Esta muestra de ADN, contiene tambien plasmidos, Tambin se puede utilizar para hacer la PCR (5 ul) para el anlisis de secuenciacin del gen de inters (RNAr16S).

RESULTADOS Esquematizar el procedimiento

Correr 15 ul de muestra en gel de agarosa al 1.5% junto a un marcador de peso molecular.

Dibujar y comentar los resultados.