EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA
LA DETECCIÓN DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y
AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, SANTANDER
2018
EVALUACIÓN DE NUEVAS SONDAS DE OLIGONUCLEÓTIDOS PARA
LA DETECCIÓN DE BACTERIAS SULFATO REDUCTORAS
MARIA ANGELICA SANMIGUEL TARAZONA
Trabajo de grado
presentado como requisito para optar al título de
MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
DIRECTOR
WILFREDO VALDIVIESO QUINTERO, Msc.
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, NATURALES Y
AGROPECUARIAS
PROGRAMA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BUCARAMANGA, SANTANDER
2018
I
DEDICATORIA
A Dios por haberme permitido llegar a este punto y concederme salud,
sabiduría y perseverancia para lograr mis objetivos.
A mis padres María E. Tarazona y Carlos Sanmiguel, por ser el pilar
fundamental de mi vida, ellos quienes han sido mi guía y mi apoyo
incondicional, han formado una persona llena de valores y buenos
principios, capaz de hacer todo lo que se proponga, gracias por darme una
carrera profesional para mi futuro, todo esto se lo debo a ustedes.
A mi abuela Angelica Reyes de Sanmiguel, quien me ha cuidado por
siempre y se ha preocupado por mí.
A mi hermano Andrés Sanmiguel por sus consejos y apoyo.
II
AGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus más sinceros agradecimientos a:
El director del presente trabajo de grado MSc. Wilfredo Valdivieso, por
brindarme la oportunidad de ser parte de su grupo de trabajo y poder
vincularme a su semillero, por instruirme sobre biología molecular, por
compartirme sus conocimientos, por su acompañamiento, dedicación,
sabiduría, disponibilidad, asesoría, por tenerme paciencia, confianza y
creer en mí. Por ser un excelente ser humano y gran profesional.
El MSc. Miguel Suarez y MSc. Nohora Juliana Rueda por la ayuda brindada
para poder revelar los resultados del trabajo de grado y por los consejos.
El semillero MicroMol por acogerme y ofrecerme la oportunidad de
aprender sobre biología molecular. A los integrantes del semillero
Candelaria y Alejandra por enseñarme, ayudarme y apoyarme.
El semillero Mikrosostenible por impulsarme a investigar, y por haberme
ayudado a obtener habilidades en el área de la microbiología.
A mis compañeros y amigos Nathalia, Juliana, María Cristina, Diego y
Edgar por brindarme su amistad y apoyo. A los docentes que depositaron
sus conocimientos y creyeron en mí.
A la Universidad de Santander por permitirme el desarrollo de mi trabajo de
grado, y poder contar con la disposición de instalaciones, equipos,
materiales y reactivos.
III
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN _________________________________________ 1
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA _________________________ 4
3. JUSTIFICACIÓN _________________________________________ 6
4. HIPÓTESIS _____________________________________________ 7
5. OBJETIVOS ____________________________________________ 8
5.1 Objetivo general ________________________________________ 8
5.2 Objetivos específicos ____________________________________ 8
6. MARCO TEÓRICO _______________________________________ 9
6.1 Bacterias sulfato reductoras _______________________________ 9
6.2 Metabolismo de las BSR _________________________________ 10
6.3 BSR y su impacto en la Industria __________________________ 13
6.4 Afectación de las BSR en la Industria de Petróleo _____________ 15
6.4.1 Corrosión en sistemas de transporte. ___________________ 15
2.4.1.1 Sweet corrosión (CO2 corrosión). ___________________ 16
2.4.1.2 Corrosión ácida (corrosión H2S). ____________________ 17
2.4.1.3 Corrosión por oxigeno (O2). ________________________ 18
2.4.1.4 Corrosión de grietas. _____________________________ 18
2.4.1.5 Corrosión por erosión. ____________________________ 19
2.4.1.6 Corrosión galvánica. _____________________________ 19
2.4.1.7 Corrosión bajo tensión. ___________________________ 19
6.4.2 Corrosión inducida por microorganismos (MIC) o Biocorrosión.
______________________________________________________ 20
6.4.3 Clasificación de las BSR. _____________________________ 21
6.4.3.1 Desulfovibrionaceae. _____________________________ 21
6.4.3.2 Desulfobacteriaceae. _____________________________ 22
6.4.3.3 Gram negativas mesófilas. ________________________ 22
6.4.3.4 Gram positivas formadoras de esporas. ______________ 22
IV
6.5 Métodos para la detección de bacterias sulfato reductoras ______ 24
6.5.1 Microbiológicos. ____________________________________ 24
6.5.1.1 Técnica de número más probable (NMP). ____________ 24
6.5.1.2 Medio de cultivo BSR 10. _________________________ 24
6.5.1.3 Prueba BART. __________________________________ 25
6.5.2 Enzimáticos. _______________________________________ 26
6.5.2.1 Kit QuickChekTM BSR. ____________________________ 26
6.5.2.2 RapidChek® II SRB Test Kit. _______________________ 27
6.5.3 Basados en el ADN. _________________________________ 27
6.5.3.1 Lista de oligonucleótidos diseñados. _________________ 28
7. METODOLOGÍA ________________________________________ 32
7.1 Ubicación ____________________________________________ 32
7.2 Diseño del estudio______________________________________ 32
7.3 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos. ___ 32
7.3.1 Análisis en BLAST. __________________________________ 32
7.4 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR. ___________________________________________ 33
7.4.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 33
7.4.2 Extracción de ADN. _________________________________ 34
7.4.3 Detección molecular (gen 16s). ________________________ 34
7.4.3.1 Agua de producción. _____________________________ 35
7.4.4 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ____ 35
7.4.4.1 Prueba de amplificación con diferentes polimerasas. ____ 36
7.4.5 Condiciones base para la amplificación del gen dsrA. ______ 36
7.4.5.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos. ______________________________________ 37
7.5 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 37
7.6 Límite de detección _____________________________________ 38
8. RESULTADOS _________________________________________ 39
8.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 39
V
8.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR. ___________________________________________ 42
8.2.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 42
8.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 43
8.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 43
8.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos. ________________________________________ 43
8.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 44
8.5 Límite de detección _____________________________________ 44
9. DISCUSIÓN ____________________________________________ 46
9.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos _____ 46
9.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR. ___________________________________________ 48
9.2.1 Microorganismos de referencia. ________________________ 48
9.2.2 Detección molecular (gen 16s) ________________________ 49
9.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control. ________ 50
9.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos. ________________________________________ 50
9.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA ________________ 51
9.5 Límite de detección _____________________________________ 51
10. CONCLUSIONES _____________________________________ 54
11. RECOMENDACIONES _________________________________ 55
12. BIBLIOGRAFÍA _______________________________________ 56
13. ANEXOS ____________________________________________ 63
VI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árbol de evolución de bacterias reductoras de sulfato basado en
la diversidad de rRNA 16S. Recuperado de: Wagner, et al (1998). _____ 9
Figura 2. Ruta del metabolismo del sulfuro descrita en las bases de datos
de KEEG. Recuperado de: KEGG PATHWAY (2018). ______________ 11
Figura 3. Esquema general de la ruta de desasimilativa del sulfato.
Recuperado de: Friedrich (2002). _______________________________ 12
Figura 4. Vínculos del sector petrolero en la economía nacional de
Colombia. Recuperado de: López et al, (2013).____________________ 14
Figura 5. Corrosión por picadura. Recuperado de: Popoola et al. (2013).
_________________________________________________________ 17
Figura 6. Tubería con corrosión acida. Recuperado de: Popoola et al.
(2013). ____________________________________________________ 17
Figura 7. Corrosión inducida por oxígeno. Recuperado de: Popoola et al.
(2013). ____________________________________________________ 18
Figura 8. Corrosión por grietas. Recuperado de: Popoola et al. (2013). 19
Figura 9. Corrosión causada por microorganismos. Recuperado de:
Popoola et al. (2013). ________________________________________ 20
Figura 10. Mecanismo de las bacterias sulfato reductoras en el acero.
Recuperado de: Makhlouf et al. (2018). __________________________ 21
Figura 11. Diferentes formas celulares de las bacterias sulfato reductoras.
Recuperado de: Sánchez (2005). _______________________________ 23
Figura 12. Controles positivos y negativo del medio de cultivo BSR.
Recuperado de: Aqualab (2015). _______________________________ 25
Figura 13. Dilución por extinción. Recuperado de: Aqualab (2015). ____ 25
Figura 14. Prueba BART. Recuperado de: (HACH, s.f.). ____________ 26
Figura 15. Kit QuickChekTM BSR. Recuperado de: (ANSAC, s.f.). _____ 26
Figura 16. Alineamientos múltiples locales de los oligonucleótidos
potenciales para amplificar el gen dsrA, con las secuencias de las BSR
VII
prevalentes en sistemas de producción y transporte de petróleo. Programa
Bioedit, algoritmo ClustalW. ___________________________________ 41
Figura 17. Formación de heterodímeros de los oligonucleótidos control. 41
Figura 18. Productos de la amplificación por PCR del gen 16S del ADN de
Desulfovibrio vulgaris. ________________________________________ 43
Figura 19. Optimización de condiciones de PCR para los oligonucleótidos
de referencia para el gen dsrA y los evaluados en este trabajo. _______ 43
Figura 20. Especificidad de oligonucleótidos evaluados. ____________ 44
Figura 21. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen
dsrA con los oligonucleótidos control. ___________________________ 45
Figura 22. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen
dsrA con los oligonucleótidos en evaluación. ______________________ 45
VIII
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Ingresos y valor de mercado del Petróleo de las principales
compañías del mundo en el año 2017. Recuperado de: (Colmen, 2017). 13
Tabla 2. Lista de los oligonucleótidos reportados por literatura para detectar
bacterias sulfato reductoras. __________________________________ 28
Tabla 3. Lista de los oligonucleótidos capaces de detectar BSR al amplificar
el gen dsrA utilizando PCR. ___________________________________ 39
Tabla 4. Microorganismos que presentaron alineamientos significativos con
los oligonucleótidos potenciales para amplificar el gen dsrA. _________ 39
Tabla 5. Propiedades termodinámicas de los oligonucleótidos. _______ 41
Tabla 6. Sondas de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento
del gen dsrA. _______________________________________________ 42
Tabla 7. Concentración de ADN extraído para los microorganismos de
referencia (tres mediciones). __________________________________ 42
IX
LISTA DE ANEXOS
Anexo A. Alineamientos significativos de microorganismos obtenidos en
el análisis de BLAST con los oligonucleótidos. ____________________ 63
Anexo B. Propiedades termodinámicas de los posibles oligonucleótidos.
_________________________________________________________ 64
Anexo C. Alineamiento múltiple local de oligonucleótidos control. _____ 64
Anexo D. Fragmento de la secuencia de Desulfovibrio vulgaris (ATCC
29579) con los alineamientos locales de los oligonucleótidos control. __ 65
Anexo E. Combinaciones de los oligonucleótidos para determinar el
tamaño de amplificación y la formación de homodímeros y heterodímeros.
_________________________________________________________ 66
Anexo F. Especificidad de reconocimiento de los oligonucleótidos pre-
seleccionados con respecto las BSR. ___________________________ 71
Anexo G. Especificidad de reconocimiento primer 2. _______________ 71
X
LISTA DE ABREVIATURAS
BSR Bacterias sulfato reductoras
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
dsrA Gen que codifica la subunidad alfa de la enzima
desasimilativa sulfito reductasa
DSV Desulfovibrio vulgaris
XI
RESUMEN
Título: Evaluación de nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección
de bacterias sulfato reductoras.
Autores: Sanmiguel Tarazona María Angelica.
Palabras clave: Bacterias sulfato reductoras, Oligonucleótidos, gen dsrA,
PCR.
Descripción: Las bacterias sulfato reductoras son las principales
causantes de la corrosión inducida por microorganismos en la industria
petrolera debido a que generan ácido sulfhídrico y de este modo se ven
afectados estructuras, equipos y maquinarias de metal, así como el crudo
mismo, ocasionando daños y pérdidas económicas. La enzima responsable
de la reducción desasimilatoria del sulfato es codificada por diferentes
genes, entre ellos el más estudiado el gen dsrA, utilizado para la detección
y cuantificación de estas bacterias. En este trabajo se estandarizó la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del gen
dsrA, utilizando nuevos oligonucleótidos diseñados previamente por el
joven investigador Karen Angarita. Para esto, se hizo un análisis “in silico”
de los oligonucleótidos control y los oligonucleótidos con potencial para
amplificar el gen de interés, se evaluaron tres polimerasas diferentes y se
determinaron los respectivos límites de detección. Los productos
amplificados se analizaron mediante geles de agarosa al 1,5 %. Como
control positivo se usó el ADN genómico de Desulfovibrio vulgaris (ATCC
29579). Los resultados muestran que los oligonucleótidos diseñados tienen
el potencial de ser utilizados para detectar bacterias sulfato reductoras,
dado que no mostraron amplificación del ADN de otras posibles bacterias
presentes en muestras de interés en la industria del petróleo y con un límite
de detección de 1×10−5 ng de ADN de Desulfovibrio vulgaris.
XII
ABSTRACT
Title: Evaluation of new oligonucleotides probes for the detection of sulfate
reducing bacteria.
Authors: Sanmiguel Tarazona María Angelica.
Key words: Sulfate reducing bacteria, oligonucleotides, gene dsrA, PCR.
Description: Sulfate reducing bacteria are the main cause of corrosion
induced by microorganisms in the oil industry because they generate sulfide
acid and thus are affected structures, equipment and machinery of metal,
as well as crude causing damage and economic losses. The enzyme
responsible for the reduction of sulfate disassimilation is encoded by
different genes, including the most studied gene dsrA, used for the detection
and quantification of these bacteria. In this work, was standardized the
polymerase chain reaction (PCR) technique for the detection of the DsrA
gene, using new oligonucleotides previously designed by the young
investigator Karen Angarita. For this, an analysis was made "in silico" of the
control oligonucleotides and the oligonucleotides with potential to amplify
the gene of interest, three different polymerases were evaluated, and the
respective detection limits were determined. The amplified products were
analyzed using agarose gels at 1.5%. The genomic DNA of Desulfovibrio
vulgaris (ATCC 29579) was used as a positive control. The results show
that the oligonucleotides designed have the potential to be used to detect
sulfate reducing bacteria, since they showed no DNA amplification of other
possible bacteria present in samples of interest in the industry Oil and with
a detection limit of 1×10−5 ng of Desulfovibrio vulgaris DNA.
1
1. INTRODUCCIÓN
Las bacterias sulfato reductoras son microorganismos anaerobios estrictos
presentes en una amplia variedad de ambientes, tales como suelos, lodos
de estuarios, aguas dulces, aguas de alcantarillado, aguas marinas, aguas
termales, áreas geotermales, depósitos de sulfuro, pozos petroleros y de
gas, y también como comensales del intestino de mamíferos e insectos
(Mardhiah, Yahaya, Bakar, & Noor, 2014).
Este grupo de bacterias es reconocido por la capacidad de oxidar
compuestos orgánicos como el lactato (C3H6O3) o hidrógeno (H2) y
acoplarlo a la reducción del sulfato (SO42-) a ácido sulfhídrico (H2S) con el
fin de obtener la energía suficiente para sintetizar ATP, esta reacción se
conoce como la reducción desasimilatoria del sulfato (Rabus, Hansen, &
Widdel, 2006).
El ácido sulfhídrico, es producto del metabolismo energético, es una de las
principales razones que justifica el estudio de estos microorganismos
debido a que esta molécula ha sido asociada al proceso de corrosión
microbiológica en sistemas de transporte en la industria petrolera.
La reducción desasimilatoria es catalizada por la enzima sulfito
reductasa (Código EC: 1.8.99.5), la cual está constituida por una estructura
terciaria, compuesta por dos subunidades α (alfa) y β (beta), codificada por
los genes dsrA y dsrB. De estos genes el dsrA ha sido
ampliamente estudiado dado que presenta segmentos conservados en su
secuencia de ADN (Dhillon, Teske, Dillon, Stahl, & Sogin, 2003). Estas
características lo han convertido en un marcador útil para la detección y
cuantificación de estas poblaciones en diferentes tipos de muestras como
aguas de producción, sedimentos y drenaje de minas (Cook, Whitehead,
Spence, & Cotta, 2008).
2
En la industria petrolera, las BSR inducen una doble afectación: I) son
responsables de la corrosión y el taponamiento de los sistemas de
transporte y otras estructuras metálicas (Kleyböckera, et al., 2017) e II)
inducen cambios en las propiedades del crudo transportado, adicionando
compuestos parafínicos que disminuyen la calidad (Stott, 2018).
Según Itävaara (2008) la corrosión de las superficies metálicas es causada
por la actividad metabólica de microorganismos que usa metales como
aceptores de electrones, lo cual incluye el proceso de reducción
desasimilatoria de sulfato como un posible agente causal de la corrosión
en la industria petrolera.
La presencia de estos microorganismos esta principalmente asociada a los
sistemas de tratamiento de agua, especialmente en las tuberías de
producción de petróleo y en las tuberías de inyección de agua, estas
tuberías son eliminadas por problemas de corrosión interna a causa de la
corrosión microbiológica, esto ocasiona pérdidas económicas anuales
aproximadamente de 26 mil millones de pesos (ASEDUIS, 2013), lo cual
impulsa la necesidad de estudiar métodos de detección oportunos para su
control y prevención.
Un buen número de especies pertenecientes a los órdenes
de Desulfovibrionales y Desulfobacterales han sido identificadas en
ambientes petroleros (Guan, 2013), y esta pluralidad es la que dificulta la
detección por métodos rápidos, los cuales ofrecen una baja sensibilidad y
especificidad cuando se utilizan en diferentes campos petroleros (Eckert &
Skovhus, 2018). Actualmente los métodos más utilizados para la detección
de BSR en campos petroleros de Colombia son microbiológicos, que
dependen de la capacidad de adaptación de los microorganismos a los
medios de cultivo utilizados, y además el tiempo de entrega de resultados
que puede estar desde semanas o meses (Ben-dov, Brenner, & Kushmaro,
2007).
Por esto, se hace importante identificar las principales especies reportadas
en campos petroleros colombianos y con base en esta información diseñar
3
estrategias específicas y sensibles como las basadas en la PCR para
permitir una detección rápida y sensible de estos microorganismos basados
en el gen que codifica la subunidad alfa (dsrA).
4
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Las BSR son causantes de problemas en la industria petrolera colombiana,
puesto que pueden afectar de forma directa e indirecta la integridad de
materiales metálicos empleados en los campos de explotación como
tuberías, máquinas de bombeo, estructuras y tanques de almacenamiento
provocando corrosión microbiológica (Ruiz, Duque, & Aperador, 2016).
Debido al ambiente anoxigénico las BSR pueden llevar acabo sus procesos
metabólicos, los cuales implican la reducción de sulfato a ácido sulfhídrico,
que de forma directa afectan el metal por medio de la producción del H2S,
porque provoca la corrosión microbiológica o biocorrosión. Y de forma
indirecta por medio de su metabolismo tienen la capacidad de generar
metabolitos secundarios los cuales son capaces de formar depósitos
incrustantes y esto genera dificultades en el intercambio de fluidos en las
tuberías, lo cual afecta la eficiencia (Santegoeds CM, 1998). También
generan contaminación de los productos del petróleo y aumenta los niveles
de azufre (Chavez, 2008).
Los estudios relacionados para la identificación y caracterización de las
BSR tienen un alto grado de dificultad, porque la manipulación de dichas
bacterias por técnicas convencionales microbiológica tienen una tasa de
crecimiento bacteriano tardío (Ben-dov, Brenner, & Kushmaro, 2007) y
algunas bacterias no crecen de forma in vitro, debido a que los medios de
cultivo no brindan las condiciones óptimas para su crecimiento (Chavez,
2008).
Debido a las complicaciones en sus cultivos, las BSR son más accesibles
a ser identificadas por métodos moleculares, mediante el análisis de los
ácidos nucleicos, empleando marcadores, como el gen 16S o usando
sondas de oligonucleótidos para amplificar el gen dsrA que codifica la
subunidad α de la enzima 2 desasimilativa sulfito reductasa, encargada de
catalizar la reducción del (bi) sulfito a sulfuro (Spence C, 2008).
5
Ben-dov et al, (2007) utilizaron sondas de oligonucleótidos con la
competencia de identificar y cuantificar al menos cuarenta y dos
microorganismos con la presencia del gen dsrA. Pero se generó la
necesidad de evaluar nuevas sondas de oligonucleótidos diseñadas por el
laboratorio de Biotecnología, que tienen la posible capacidad de detectar
BSR que se encuentren presentes en los sistemas de producción y
transporte de petróleo en Colombia.
Por lo anterior, en esta investigación se planteó la siguiente pregunta:
¿Pueden los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permitir la
detección de BSR en bacterias modelo con un mayor límite de detección
que los oligonucleótidos utilizados convencionalmente?
6
3. JUSTIFICACIÓN
Teniendo en cuenta la problemática causada por las BSR en la industria
del petróleo, es indispensable fomentar el uso de herramientas en biología
molecular que presentan una alternativa promisoria más rápida para la
detección, identificación y cuantificación de las BSR, con una mayor
sensibilidad y en menores tiempos de respuesta (Eckert & Cookingham,
2002).
El mejorar los sistemas de detección de las bacterias sulfato reductoras
ayudaría a identificar oportunamente la presencia y multiplicación de estos
microorganismos con lo cual se pueden diseñar mejores y más oportunos
sistemas de prevención, intervención y control que derivarán en la mejora
de la integridad de equipos, en la seguridad industrial y del personal
involucrado en los procesos de producción y transporte, cumplimiento con
regulaciones ambientales, reducción de costos de mantenimiento y
conservación de la calidad del crudo transportado (Eckert & Skovhus,
2018).
7
4. HIPÓTESIS
H1: Los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permiten la detección
del ADN de bacterias sulfato reductoras en concentraciones menores que
los oligonucleótidos usados convencionalmente cuando son utilizados en
microorganismo modelo.
H0: Los oligonucleótidos diseñados por el laboratorio permiten la detección
de ADN de bacterias sulfato reductoras en concentraciones similares o
menores a las obtenidas con oligonucleótidos usados convencionalmente
cuando son utilizados en microorganismos modelo.
8
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
✓ Evaluar nuevas sondas de oligonucleótidos para la detección de
bacterias sulfato reductoras.
5.2 Objetivos específicos
✓ Seleccionar por medio de herramientas de bioinformática los
oligonucleótidos con mejores características para la amplificación
del gen dsrA de bacterias sulfato reductoras.
✓ Identificar las mejores condiciones de detección de ADN de BSR por
medio de la PCR utilizando los oligonucleótidos seleccionados.
✓ Determinar el límite de detección de ADN de bacterias modelo por
medio de la técnica de PCR.
9
6. MARCO TEÓRICO
6.1 Bacterias sulfato reductoras
Las Bacterias Sulfato Reductoras (BSR) son un grupo de microorganismos
metabólicamente versátiles provenientes de varias familias y diferentes
géneros (Sanchez, 2005). Se han detectado más de 150 especies de
bacterias reductoras de sulfato, y están divididas en 40 géneros (Garrity,
Bell, & Lilburn, 2004).
Las BSR cuando se encuentran en condiciones anaeróbicas, utilizan sulfato
como aceptor de electrones terminal en la degradación de la materia
orgánica, lo que resulta en la producción de ácido sulfhídrico que es un
compuesto altamente reactivo, corrosivo y muy tóxico. Las BSR se
encuentran principalmente en ambientes anóxicos, pero también se
pueden encontrar en las interfaces de ambientes anóxicos (Loy, 2003).Se
han dividido en seis grupos taxonómicos diferentes en función de su
diversidad filogenética (figura 1).
Figura 1. Árbol de evolución de bacterias reductoras de sulfato basado en la diversidad
de rRNA 16S. Recuperado de: Wagner, et al (1998).
10
6.2 Metabolismo de las BSR
La mayoría de los BSR son degradadores de la materia orgánica, también
existen especies autótrofas que pueden fijar el CO2 y utilizar el hidrógeno
como fuente de energía en sus procesos metabólicos. Algunas especies
pueden ser capaces de fijar nitrógeno y reducir el fosfito a fosfato (Schink
& Friedrich, 2000). Asimismo, tienen la capacidad para reducir el nitrato
(NO3) a dióxido de nitrógeno (NO2), también se ha demostrado que el
oxígeno es un aceptor de electrones potencial a bajas concentraciones, a
pesar de que las BSR se han considerado especies estrictamente
anaeróbicas (Rabus, Hansen, & Widdel, 2006). Las BSR utilizan una
variedad de compuestos inorgánicos de azufre como aceptores de
electrones tales como azufre elemental (S), sulfito (SO3), y el tiosulfato
(S2O3 2-).
Las BSR obtienen energía para la síntesis celular y el crecimiento,
acoplando la oxidación de compuestos orgánicos a la reducción de sulfato,
como aceptor final de electrones para generar el H2S. Este proceso es
conocido como reducción desasimilativa, el ácido sulfhídrico es producido
en el interior celular y luego es expulsado al ambiente; mientras que, en el
proceso asimilativo, el ácido sulfhídrico es inmediatamente transformado
en compuestos orgánicos de azufre (figura 2), para la formación de
aminoácidos y proteínas (Jong & Parry, 2006).
11
Figura 2. Ruta del metabolismo del sulfuro descrita en las bases de datos de KEEG.
Recuperado de: KEGG PATHWAY (2018).
En la reducción del sulfato de forma desasimilativa ha sido estudiada
especialmente en especies de Desulfovibrio, para realizar este proceso son
necesarias tres enzimas citoplasmáticas para reducir ocho electrones, la
ATP sulfurilasa (2.7.7.4), APS reductasa (1.8.99.2) y la sulfito reductasa
(1.8.99.5) (Barton & Fauque, 2009).
El sulfato es un ion estable que para ser reducido se debe activar. En la
figura 3, la enzima ATP sulfurilasa cataliza la unión del ion sulfato a un
grupo fosfato adenosina trifosfato (ATP), de este modo se forma adenosina
5-fosfosulfato (APS), seguidamente la enzima APS reductasa procede a
realiza la reducción del APS a sulfito (S032-) y se libera el adenosín
monofosfato (AMP) (Madigan, 2009).
12
La reducción del sulfito a ácido sulfhídrico (H2S), se puede realizar por la
vía metabólica que es la reducción directa de seis electrones, la cual es
catalizada por medio de la enzima sulfito reductasa, que es codificada por
el gen dsrA o dsrB, cuya subunidades son y , han sido ampliamente
usadas como marcadores moleculares, para identificar, detectar y
cuantificar bacterias sulfato reductoras (Moreau, Zierenberg, & Banfield,
2010).
Figura 3. Esquema general de la ruta de desasimilativa del sulfato. Recuperado de:
Friedrich (2002).
Como producto del metabolismo desasimilativo se obtiene el ácido
sulfhídrico, el cual es un factor de importancia en la industria del petróleo y
el gas y que afecta las superficies de los metales. El H2S es producido por
el proceso metabólico de las bacterias anaeróbicas. Las bacterias y el
sulfato producirán un proceso electroquímico donde el sulfato se reduce a
ácido sulfhídrico corrosivo. El H2S es un gas fuerte con altas
concentraciones de hidrógeno que se difunde en el metal a través de los
límites del grano, disminuyendo la ductilidad del metal haciéndolo
quebradizo y eventualmente agrietándose (Ossai, Boswell, & Davies,
2015).
13
6.3 BSR y su impacto en la Industria
El petróleo ha jugado un papel importante en la historia social, económica
y política del mundo, debido a que las industrias petroleras son una
importante fuente de ingresos para los países con yacimientos petrolíferos.
Estas industrias exportan a diferentes países del mundo, dado que la
mayoría de las economías dependen de las formas de energía como el
carbono, el petróleo y los productos derivados del petróleo, obteniendo
ingresos para los países y proporcionando empleo a sus ciudadanos. La
formación de petróleo ocurre por varios hidrocarburos que se combinan con
ciertos minerales como el azufre bajo presión extrema (Nielsen & Hejny,
2003).
La producción mundial de petróleo ha venido incrementándose
paulatinamente a través de los años, y es ligeramente superior a la
demanda. Los ingresos anuales en el año 2017 y el valor en el mercado del
petróleo (fabla 1) demuestra que Estados Unidos es el mayor productor de
petróleo y gas del mundo, liderando con la compañía ExxonMobil (Colmen,
2017).
Tabla 1. Ingresos y valor de mercado del Petróleo de las principales compañías del mundo
en el año 2017. Recuperado de: (Colmen, 2017).
Rango Nombre de la compañía Ingresos
2017 (US$
billón)
Valor del
mercado ($
billón)
1 Exxon Mobil (Estados
Unidos)
236.8 363.3
2 Petro China (China) 274.6 203.8
3 Chevron (Estados Unidos) 129.9 192.3
4 Total (France) 143.4 121.9
5 Sinopec (China) 283.6 89.9
6 Royal Dutch Shell
(Netherlands)
264.9 210
7 Gazprom (Rusia) 102.1 57.1
14
8 Rosneft (Rusia) 80.08 51.1
9 Reliance Industries (India) 42.2 50.6
10 LukOil (Rusia) 90.4 36.8
Existe una entidad fundada para coordinar y unificar las políticas petroleras
respectivas, con el fin de acordar las acciones más convenientes, y
determinar los medios más idóneos de resguardar, colectivamente e
individual los intereses de los estados miembros (Zanoni, 2010), es
conocida como Organización de Países Exportadores de Petróleo (OPEP),
los países que actualmente forman parte de esta entidad son los
siguientes: Argelia, Angola, Arabia Saudita, Katar, Ecuador, Emiratos
Árabes Unidos, Gabón, Guinea Ecuatorial, Irán, Irak, Kuwait, Libia, Nigeria,
Venezuela (OPEP, 2018). También existe los países NO OPEP entre los
cuales se encuentran: Azerbaiyán, Baréin, México, Guinea Ecuatorial,
Kazajistán, Malasia, Omán, Rusia, Sudán, Sudán del Sur.
En Colombia históricamente la actividad petrolera fue construyendo
múltiples relaciones con la economía nacional, la renta petrolera de nuestro
país se distribuye entre el Estado colombiano y el sector privado, la
empresa estatal productora de petróleo en Colombia es Ecopetrol. Los
ingresos del sector productor de petróleo y gas se originan en las
exportaciones y ventas internas de crudo y gas (figura 4).
Figura 4. Vínculos del sector petrolero en la economía nacional de Colombia.
Recuperado de: López et al, (2013).
15
El país exporta sus excedentes de producción después de satisfacer la
demanda interna de petróleo, la cual se carga principalmente en las
refinerías principales las cuales son Barrancabermeja y Cartagena con el
fin de obtener los productos refinados necesarios para suplir la demanda
interna. Desde los últimos 10 años, la demanda de las refinerías locales se
ha mantenido relativamente estable, con lo cual las ventas externas de
crudo colombiano han dependido del volumen adicional producido y los
precios internacionales (Lopez, Montes, Garavito, & Collazos, 2013).
6.4 Afectación de las BSR en la Industria de Petróleo
Las BSR por medio de su metabolismo además de causar corrosión
microbiológica, también causa acidificación (agriamento) del crudo de
petróleo, es debido a la producción indeseable del ácido sulfhídrico,
problema común durante la recuperación de petróleo cuando se inyecta
agua de inundación para producir algún subproducto (Hubert & Voordouw,
2007).Estas operaciones de inundación de agua, se inyecta en el fondo del
pozo para volver a presurizar el depósito después de la presión natural y
para barrer el aceite hacia los pozos de producción, de este modo se
extiende la vida de producción de un yacimiento petrolífero. Esto lleva al
aumento de las concentraciones de sulfuro en el agua, el aceite, y gas
(Gieg, Jack, & Foght, 2011).
6.4.1 Corrosión en sistemas de transporte.
La corrosión es un problema común que se encuentra en la industria del
petróleo y el gas, afectando las tuberías de petróleo y gas, las refinerías y
las plantas petroquímicas. La corrosión en la industria del petróleo y el gas
generalmente es causada por el agua, el dióxido de carbono (CO2) y el
ácido sulfhídrico (H2S), y también puede agravarse por la actividad
microbiológica (Mohammed Nuri & Kannan, 2014).
16
El impacto de la corrosión en la industria petrolera se ha visto afectada en
términos de gastos de capital, gastos operacionales, de salud, seguridad y
medio ambiente. Según la Asociación Nacional de Ingeniería de la
Corrosión (NACE), la industria está tomando la mayor parte del gasto total
en solucionar los problemas relacionados con la corrosión en los Estados
Unidos, lo cual tiene un costo anual de $1.372 mil millones del monto total,
la industria está gastando $589 millones en tuberías de superficie y costo
de planta, $463 millones anuales en tubería de fondo de pozo y $320
millones en todo lo demás relacionado con la corrosión. Este es un
problema económico que está afectando la estabilidad de la industria y
poniendo en riesgo la vida de los empleados (Makhlouf, Herrera, & Muñoz,
2018). Los tipos de corrosión son:
2.4.1.1 Sweet corrosión (CO2 corrosión).
La corrosión por CO2 ha sido un problema reconocido en las instalaciones
de producción y transporte de petróleo y gas durante muchos años. El CO2
es uno de los principales agentes de corrosión en los sistemas de
producción de petróleo y gas (Nalli, 2010). El gas CO2 seco no es en sí
mismo corrosivo a las temperaturas encontradas en los sistemas de
producción de petróleo y gas, pero sí cuando se disuelve en una fase
acuosa a través de la cual puede promover una reacción electroquímica
entre el acero y la fase acuosa en contacto (Popoola, Grema, Latinwo,
Gutti, & Balogun, 2013). El CO2 se mezclará con el agua, formando ácido
carbónico (H2CO3), haciendo que el fluido sea ácido. La corrosión por CO2
está influenciada por la temperatura, aumento en el valor del pH,
composición de la corriente acuosa, presencia de fases no acuosas,
condición de flujo y características del metal y es la forma de ataque más
frecuente en petróleo y gas producción (Kermani & Smith, 1997).
A temperaturas elevadas, la escala de carburo de hierro se forma en la
tubería de petróleo y gas como una escala protectora, y el metal comienza
17
a corroerse en estas condiciones. La corrosión por CO2 puede aparecer en
dos formas principales: picadura (ataque localizado que resulta en
penetración rápida y remoción de metal en una pequeña área discreta
(figura 5)) y ataque en mesa (una forma de corrosión localizada por CO2
bajo condiciones de flujo medio).
Figura 5. Corrosión por picadura. Recuperado de: Popoola et al. (2013).
2.4.1.2 Corrosión ácida (corrosión H2S).
El deterioro del metal es debido al contacto con el ácido sulfhídrico (H2S) y
la humedad se denomina corrosión ácida, que es la más perjudicial para la
tubería de perforación. Aunque el H2S no es corrosivo por sí solo, se
convierte en un agente severamente corrosivo en presencia de agua, lo que
lleva a la fragilización de la tubería (Nalli, 2010). El ácido sulfhídrico cuando
se disuelve en agua es un ácido débil y, por lo tanto, es una fuente de iones
de hidrógeno y es corrosivo. Los productos de la corrosión son sulfuros de
hierro (FeSx) e hidrógeno. El H2S forma una escala que a baja temperatura
puede actuar como una barrera para desacelerar la corrosión. Las formas
de corrosión agria son uniformes, picaduras y grietas escalonadas (figura
6).
Figura 6. Tubería con corrosión acida. Recuperado
de: Popoola et al. (2013).
18
2.4.1.3 Corrosión por oxigeno (O2).
El oxígeno es un oxidante fuerte y reacciona con el metal muy rápidamente.
El oxígeno disuelto en los fluidos de perforación es una causa importante
de corrosión en las tuberías de perforación (figura 7). La entrada de oxígeno
ocurre en los fluidos del pozo a través de fugas en los sellos de la bomba,
la carcasa y las aberturas de proceso y las compuertas abiertas. Como un
despolarizador y aceptor de electrones en las reacciones catódicas, el
oxígeno acelera la destrucción anódica del metal (Stott, 2018).
Figura 7. Corrosión inducida por oxígeno. Recuperado de: Popoola et al. (2013).
2.4.1.4 Corrosión de grietas.
Es una corrosión localizada que tiene lugar en espacios estrechos o grietas
en el metal y el fluido se estanca en el espacio. Esto es causado por
diferencias de concentración de corrosivos sobre una superficie de metal.
Las diferencias de potencial electroquímico resultan en grietas selectivas o
ataques de corrosión por picaduras (figura 8). El oxígeno disuelto en el
fluido de perforación promueve el ataque de hendiduras y picaduras de
metal en las áreas blindadas de la sarta de perforación y es la causa común
de deslaves y destrucción bajo protectores de tubos de caucho (Roberge,
2000).
19
Figura 8. Corrosión por grietas. Recuperado de: Popoola et al. (2013).
2.4.1.5 Corrosión por erosión.
El mecanismo de corrosión por erosión aumenta la velocidad de reacción
de corrosión al eliminar continuamente la capa pasiva de productos de
corrosión de la pared de la tubería. La corrosión por erosión siempre se
experimenta cuando hay un régimen de flujo de alta turbulencia con una
tasa de corrosión significativamente mayor y depende del caudal del fluido
y de la densidad y morfología de los sólidos presentes en el fluido
(Abulnoun Ajeel & Abdullatef Ahmed, 2008).
2.4.1.6 Corrosión galvánica.
Este tipo de corrosión ocurre cuando dos materiales metálicos con diferente
potencial electroquímico están en contacto y están expuestos a un entorno
electrolítico. El metal con menos potencial o el más negativo se convierte
en el ánodo y comienza a corroer (Popoola et al., 2013).
2.4.1.7 Corrosión bajo tensión.
El agrietamiento por corrosión bajo tensión (SCC) es una forma de
corrosión localizada que produce grietas en los metales por acción
simultánea de una tensión corrosiva y de tensión. Depende de la
combinación de aleación y ambiente involucrado. SCC es el craqueo
20
inducido por la influencia combinada del esfuerzo de tracción y un medio
corrosivo. El impacto de SCC en un material parece caer entre el craqueo
(fraccionamiento o descomposición) en seco y el umbral de fatiga de ese
material (Saracin, Paraschiv, Pandia, & Bozga, 2015).
6.4.2 Corrosión inducida por microorganismos (MIC) o
Biocorrosión.
La corrosión inducida microbiológicamente (MIC) es un tipo de corrosión
que degrada el metal por organismos biológicos. Las BSR son un tipo de
corrosión inducida microbiológicamente. La presencia de estas bacterias
se encuentra comúnmente en diversos atributos de la industria del petróleo
y el gas, tan profundos como los pozos de una planta petrolera costa afuera,
hasta llegar a las refinerías. Las bacteria sulfato reductoras pueden estar
presentes en cualquier entorno acuoso o en el suelo y es un problema
común en las instalaciones de la industria del petróleo y el gas debido a la
naturaleza omnipresente de los microorganismos y los productos
corrosivos en las tuberías (Popoola et al., 2013).
La presencia de las BSR en el petróleo crudo en forma de microbios utiliza
el sulfato como un aceptor de electrones para generar ácido sulfhídrico
corrosivo (H2S) como su producto. Las bacterias utilizan H2S para corroer
el metal y despolariza la superficie del metal (figura 9) debido al producto
de sulfuro de hidrógeno (Whitby & Lund Skovhus, 2011).
Figura 9. Corrosión causada por microorganismos. Recuperado de: Popoola et al.
(2013).
21
En el caso de las estructuras de acero cuando entran en contacto con el
ácido sulfhídrico (H2S) forman varias cadenas de sulfuros de hierro e
hidrógeno. El hidrógeno alimenta a las BSR, y esto les permite continuar
creciendo y reproduciéndose, aumentando las tasas de ácido sulfhídrico
(figura 10). La presencia de BSR también influye en el pH y la concentración
de oxígeno para aumentar los resultados en ataques localizados, como la
grieta y la corrosión por picadura, e iniciar el agrietamiento por corrosión
por estrés (Makhlouf, Herrera, & Muñoz, 2018).
Figura 10. Mecanismo de las bacterias sulfato reductoras en el acero. Recuperado de:
Makhlouf et al. (2018).
6.4.3 Clasificación de las BSR.
6.4.3.1 Desulfovibrionaceae.
El género Desulfovibrio es el más diverso, sus células tienen formas más o
menos curvadas y frecuentemente presentan motilidad (figura 11), la
característica más importante es su capacidad para tolerar oxígeno y en
algunos casos, incluso consumirlo (Loubinoux, Bronowicki, Pereira,
Mougenel, & Faou, 2002). Además, el género Desulfomicrobium también
está dentro de este grupo y es muy similar a Desulfovibrio, en cuanto a sus
características fisiológicas, tiene forma de bastoncillo y carece de
desulfoviridin.
22
6.4.3.2 Desulfobacteriaceae.
Los miembros de esta familia presentan características filogénicas o
filogenéticas y morfológicas muy variables. Algunas especies del género
Desulfobulbus son de forma ovalada y pueden tener o no movilidad, pueden
usar el etanol, lactato o propionato como sustrato para su metabolismo.
Las Desulfobacter generalmente son de forma ovalada y su principal
característica es que tiene la capacidad de usar el acetato completamente.
Por otro lado, las Desulfobacterium tiene una forma de bastoncillos y
presenta una gran capacidad para degradar compuestos orgánicos y
además son capaces de descomponer hidrocarburos, son
microorganismos anaerobios estrictos (King, Kostka, & Fris, 2001).
Desulfococcus y Desulfosarcina pueden presentar forma ovalada o en
bastoncillo, Desulfococcus pueden reducir el sulfato lentamente, pueden
tolerar el oxígeno (figura 11).
6.4.3.3 Gram negativas mesófilas.
Las mesofílicas son representantes de la subdivisión delta de
proteobacterias, dentro de la que se han identificado dos familias. La
primera familia es Desulfovibrionaceae que incluye a los géneros
Desulfovibrio (figura 11) y Desulfomicrobium, y han sido incluidos otros dos
géneros Desulfohalobium y Desulfonatronum. La segunda familia es
Desulfobacteriaceae, compuesta por Desulfobacter, Desulfobacterium,
Desulfonema, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfobulbus (Daly, Sharp
RJ, & McCarthy, 2000).
6.4.3.4 Gram positivas formadoras de esporas.
Este grupo está conformado por el género Desulfotomaculum, el cual es
posiblemente homogéneo morfológica y metabólicamente. Presenta la
capacidad para formar esporas (figura 11), lo cual le permite sobrevivir
23
mejor que otras BSR a la desecación y oxidación del medio ambiente y
pueden subsistir en una gran variedad de medios (Smit, 2001).
Figura 11. Diferentes formas celulares de las bacterias sulfato reductoras. Recuperado
de: Sánchez (2005).
24
6.5 Métodos para la detección de bacterias sulfato reductoras
6.5.1 Microbiológicos.
6.5.1.1 Técnica de número más probable (NMP).
El método de cultivo para detectar y cuantificar bacterias sulfato reductoras
más utilizado es el número más probable (NMP), en el cual se asume que
en las diluciones seriadas los microorganismos se encuentran distribuidos
al azar, y que al menos uno crecerá, produciendo una respuesta positiva
como turbidez o producción de metabolitos específicos. Para el caso de las
BSR, existen medios de cultivo recomendados como Postgate,
principalmente formado de sales de sulfato y de hierro, al entrar en contacto
con el sulfuro producido por las BSR, genera un precipitado negro (FeS).
El resultado se determina contando el número de tubos positivos según el
método de ceros de Poisson (Whitby & Lund Skovhus, 2011).
Es una técnica muy utilizada para determinar recuentos de BSR, pero
existen varias limitantes, primero se debe realizar un gran número de
réplicas por cada dilución para reducir los intervalos de confianza, esta
metodología tiende a subestimar el número de microorganismos, puesto
que la mayoría de los organismos no son cultivables y el NMP es una
metodología muy laboriosa y requiere largos períodos de incubación
(Whitby & Lund Skovhus, 2011).
6.5.1.2 Medio de cultivo BSR 10.
Es un medio muy utilizado para el recuento de BRS planctónicas, son
utilizados mediante la técnica de dilución por extinción (figura 13) y sus
rangos de pH y Eh lo hacen analíticamente confiable. Su aspecto es claro,
incoloro o ligeramente ambarino. Un medio positivo muestra un precipitado
negro (figura 12), o un mucílago negro sobre el clavo, el limitante principal
es que debe tener un tiempo de incubación de más de 21 días a
temperaturas que oscilen entre 30 y 32°C.
25
Figura 12. Controles positivos y negativo del medio de cultivo BSR. Recuperado de:
Aqualab (2015).
Figura 13. Dilución por extinción. Recuperado de: Aqualab (2015).
6.5.1.3 Prueba BART.
La prueba BART es de Presencia o Ausencia (figura 14) debe tener un
tiempo de incubación de 5 días a una temperatura entre 30 y 32°C, la cual
consiste en un biodetector que es una herramienta de diagnóstico que
ayudan identificar la presencia y actividad de varios tipos de BSR, es un
método simple pero efectivo para controlar el tamaño y la actividad de la
población de un grupo específico de bacterias, también cuenta con una
facilidad de uso, y no requiere equipos caros ni complicados ni capacitación
especializada y es una prueba efectiva y económica que es fácil de
interpretar y que pueden llevarse a cabo a temperatura ambiente en casi
cualquier entorno (HACH, s.f.).
26
Figura 14. Prueba BART. Recuperado de: (HACH, s.f.).
6.5.2 Enzimáticos.
6.5.2.1 Kit QuickChekTM BSR.
Es un método rápido de inmunoensayo enzimático que detectan bacterias
reductoras de sulfato (figura 15), por medio de la detección de la enzima
adenosina-5'-fosfosulfonato (APS) reductasa que es común a todas las
cepas de las bacterias sulfato reductoras, es un kit que permite la prueba
de muestras sólidas y semisólidas, los resultados de las pruebas no se ven
comprometidos por interferencias químicas o de salinidad que a menudo
se encuentran en muestras de campo. No es necesario pretratar o diluir
muestras y no existen limitaciones especiales para la eliminación de
desechos peligrosos. Los resultados disponibles en 8-10 minutos, tiene un
límite de detección de 103 células / ml (ANSAC, s.f.).
Figura 15. Kit QuickChekTM BSR. Recuperado de: (ANSAC, s.f.).
27
6.5.2.2 RapidChek® II SRB Test Kit.
Es un método que emplea anticuerpos policlonales purificados para
detectar la enzima adenosin-5'-fosfosulfato (APS) reductasa, común a
todas las bacterias sulfato reductoras. Se considera que la cantidad de
enzima presente es directamente proporcional a la cantidad de bacterias
viables capaces de producir biocorrosión. Los resultados se expresan en
bacterias/ml (Expotech USA, s.f.).
6.5.3 Basados en el ADN.
En la industria del petróleo y el gas se ha aumentado el uso de aplicaciones
de métodos moleculares para el identificar, cuantificar, diagnosticar y
conocer el tipo de corrosión microbiológica (MIC) en la última década,
debido a que se quiere averiguar y establecer cuales condiciones ayudan
a la proliferación de las BSR y conocer más sobre los mecanismos de
corrosión.
El uso de estas herramientas fomenta a detectar con una mayor
sensibilidad y en menores tiempos de respuesta la detección de estas
bacterias. Esto presenta una ventaja frente a los métodos convencionales.
El método de FISH (Hibridación fluorescente in situ) emplea una sonda de
un fragmento de ARNr (Ácido ribonucleico ribosómico) de tamaño 16S
marcado con fluorescencia, esta técnica identifica los microorganismos de
interés (Lorenzana, Fernandez, & Garcia, 2002).
Se han diseñado sondas de oligonucleótidos y cebadores de DNA o
RNA tomando como blanco los genes 16s rDNA, dsrA, dsrB, aps entre
otros como puede apreciarse en la tabla 2. Cuando se utiliza el
gen dsrA como marcador, se ha podido realizar filogenia, identificación y
cuantificación debido a que este gen es asociado a las BSR y es el
encargado de codificar la subunidad α de la enzima 2 desasimilativa sulfato
reductasa, es la enzima clave que se encarga de catalizar la reducción del
28
sulfito a sulfuro (Cook, Whitehead, Spence, & Cotta, 2008), pueden utilizar
como un marcador filogenético para la identificación de los BSR (Rabus,
Hansen, & Widdel, 2006).
6.5.3.1 Lista de oligonucleótidos diseñados.
Tabla 2. Lista de los oligonucleótidos reportados por literatura para detectar BSR.
Especie Oligonucleótidos (5' a 3') Gen
Desulfovibrio sp
27f (GAGTTTG(AC)TCCTGGCTCAG) 1541r (AAGGAGGTGWTCCARCC)
ARNr 16S
341f-GC (CCTACGGGAGGCAGCAG) 907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT)
DSV230 (GRG YCY GCG TYY CAT TAG C) DSV838 (SYC CGR CAY CTA GYR TYC ATC )
27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 1522R (AAGGAGGTGATCCAGCCGCA).
DSR1F (AC [C/G] CACTGGAAGCACG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrA dsrB
dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC) /
dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)
dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG)
Desulfobulbus sp
(DBB) (CGCGTAGATAACCTGTCYTCATG, GTAGKACGTGTGTAGCCCTGGTC).
ADNr 16S
DBB121 (CGC GTA GAT AAC CTG TCY TCA TG) DBB1237 (GTA GKA CGT GTG TAG CCC TGG TC)
dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC) dsrBbacR
(TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrB
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG)
dsrA
Desulfobacter sp
(DSB) (GATAATCTGCCTTCAAGCCTGG, CYYYYYGCRRAGTCGSTGCCCT).
ADNr 16S
Cebadores 27F y 530R ARNr 16S
DSB127 (GAT AAT CTG CCT TCA AGC CTG G) DSB1273 (CYY YYY GCR RAG TCG STG CCC T)
ARNr 16S
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG)
dsrA
29
Desulfovibrio desulfuricans
dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)
dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG) /
dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC)
dsrAB
Desulfovibrio vulgaris
DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG)
dsrA
385f (CGGCGTCGCTGCGTCAGG) 907r (CCGTCAATTCCTTTRAGTTT)
ARNr 16S
DSR1F (AC [C/G] CACTGGAAGCACG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrAB
dsrAvibF (ACCCACTGGAAGCACGGCG) dsrAvibR (TTATCTCTGATGGYGTTTRCGGTAATCC)
dsrA
Desulfomicrobium
sp
(DSV-DMB) (GRGYCYGCGTYYCATTAGC, SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC)
ADNr 16S
DSR1F (AC [C/G] CACTGGAAGCACG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrAB
Desulfobacterium sp
(DBM) (CTAATRCCGGATRAAGTCAG, ATTCTCARGATGTCAAGTCTG).
ADNr 16S
DBM169 (CTA ATR CCG GAT RAA GTC AG) DBM1006 (ATT CTC ARG ATG TCA AGT CTG)
ARNr 16S
Desulfobulbus rhabdoformis
dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)
dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrB
Desulfobulbus propionicus
Desulfococcus
olevorans
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG) / dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)
dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrAB
Desulfobacter curvatus
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG
dsrA
Cebadores 27F y 530R ARNr 16S
Desulfovibrio
acrylicus
DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG)
dsrA
Desulfovibrio simplex
dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)
dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG)
dsrB
Desulfovibrio piger
Desulfovibrio halophilus
DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG)
dsrA
Desulfovibrio termiditis
30
Desulfovibrio dechloracetivorans
27F (AGRGTTTGATCTGGCTGGCTCAG) 530R (CCGCNGCNGCTGGCAC)
344F (CGGGGYGCAGCAGGCGCGA) 915R (GTGCTCCCCCGCCAATTCCT)
ARNr 16S
Desulfovibrio indonesiensis
Desulfovibrio oxamicus
dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)
dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG)
dsrAB
Desulfomicrobium norvegicum
Desulfomicrobium apsheronum
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG) / dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)
dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrAB
Desulfomicrobium baculatum
dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC) dsrBbacR
(TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrB
Desulfomicrobium escambiense
Desulfomicrobium macestii
dsrBvibF (ATGGCWTTYRTTTCTTCCGGGTACAATCCC)
dsrBvibR (GTGTAGCAGTTACCGCAGAACATGCAGCG)
dsrA
Desulfomicrobium thermophilum
DSRp2060F (CAACATCGTYCAYACCCAGGG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrB
Desulfohalobium utahense
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG)
dsrA
Desulfohalobium retbaense
DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG) /
DSRp2060F (CAACATCGTYCAYACCCAGGG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrAB
Desulfonatronum sp
DSRp2060F (CAACATCGTYCAYACCCAGGG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrB
Desulfobacterium vacuolatum
DSR1F (AC [C/G] CACTGGAAGCACG) DSR4R (GTGTAGCAGTTACCGCA)
dsrA
Desulfobacterium autotrophicum
Desulfocurlus sp Cebadores 27F y 530R ARNr 16S
Desulfococcus sp (DCC-DNM-DSS) (GATCAGCCACACTGGRACTGACA, GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC).
ADNr 16S
Desulfobacter postgatei
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG) / dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)
dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrAB
Desulfobacter psychrotolerans
Cebadores 27F y 530R ARNr 16S
31
Desulfosarcina sp (DCC-DNM-DSS) (GATCAGCCACACTGGRACTGACA, GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC).
ADNr 16S
Desulfosarcina sp
dsrAbacF (ACCCACTGGAAACACGGYGG) dsrAbacR (TTATCTCTGATGGTGTTTTCTGTATTCG) / dsrBbacF (ATGGCTTTTATTTCHWCDGGTTATAATCC)
dsrBbacR (TGTGTAGCAGTTACCGCAGTACATGCAKC)
dsrAB
DCC305 (GAT CAG CCA CAC TGG RAC TGA CA) DCC1165 (GGG GCA GTA TCT TYA GAG TYC)
ARNr 16S
Desulfosarcina varabilis
DSRAVibF (CGGCGTTATCGGCCGTTACTG) DSRAVibR (GA[A/G]CCCGAACCGCCGAGGTCGG)
dsrA
Desulfosarcina cetonicum
Desulfotomaculum sp
(DFM) (TAGMCYGGGATAACRSYKG, ATACCCSCWWCWCCTAGCAC).
ADNr 16S
Desulfotomaculum halopilum
27F (AGRGTTTGATCTGGCTGGCTCAG) 530R (CCGCNGCNGCTGGCAC)
ARNr 16S Thermotoga
subterranea
Thermogota martitima
Geotoga subterranea
Cebadores 27F y 530R/ 344F y 915R ARNr 16S
32
7. METODOLOGÍA
7.1 Ubicación
Universidad de Santander (UDES), Campus Universitario Lagos del
Cacique, edificio de biotecnología, laboratorio de biología molecular y
genética, Calle 70 No 55-210 Bucaramanga.
7.2 Diseño del estudio
El tipo de diseño de este trabajo de grado es de tipo experimental.
7.3 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos.
El grupo de investigación Ciencias Básicas y Aplicadas para la
Sostenibilidad (CIBAS) realizo un proyecto previamente en el cual se
diseñaron sondas de oligonucleótidos para la identificación de las BSR por
medio de la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucles (PCR-
LAMP), teniendo en cuenta los microorganismos reportados en Colombia
en sistemas de producción y transporte de petróleo. Por tal motivo fue
necesario analizar el potencial uso de las sondas de oligonucleótidos en la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional.
7.3.1 Análisis en BLAST.
Inicialmente se evaluaron los posibles oligonucleótidos en el programa
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre, para
seleccionar las secuencias que se identificaron con BSR. Del estudio
anterior se seleccionaron que no incluyeran bases degeneradas. Se
tomaron las secuencias sentido (5’ a 3’) y para las secuencias anti-sentido
(3’ a 5’) se halló la secuencia complementaria y se realizó la inversión de la
33
secuencia. Posterior a esta revisión se identificaron los mejores
oligonucleótidos se realizó usando la herramienta online Multiple Primer
Analyzer de Thermo Fisher Scientific (Scientific, s.f.), adicionalmente se
hicieron combinación de posibles parejas de oligonucleótidos para
determinar la posible formación de homodímeros, heterodímeros y conocer
las propiedades termodinámicas (porcentaje de guanina – citocina,
temperaturas de hibridación de los oligonucleótidos, número de pares de
bases) y el tamaño de amplificación.
Luego de seleccionar la mejor pareja de oligonucleótidos se realizaron
alineamientos locales múltiples de un fragmento de secuencia del gen dsrA
de la BSR obtenida de la base de datos National Center for Biotechnology
Information (NCBI), con los oligonucleótidos seleccionados usando el
programa BioEdit Sequence Alignment Editor y el algoritmo ClustalW, con
esto se determinó la similitud de pares de bases de los oligonucleótidos con
la secuencia de ADN y el tamaño de amplificación.
7.4 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR.
7.4.1 Microorganismos de referencia.
Se usó una BSR de referencia Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579), y
como testigos negativos suministrados por el cepario de la Universidad de
Santander se usaron: Klebsiella pneumoniae (ATCC:10031), Klebsiella
oxytoca (ATCC:43165), Pseudomonas aeruginosa (ATCC:27853),
Enterobacter cloacae (ATCC: 13047), Pseudomonas putida
(ATCC:49128), Burkholderia cepacia (ATCC:25416), Alcaligenes faecalis
(ATCC:35655), Pseudomonas putida.
34
7.4.2 Extracción de ADN.
La extracción del ADN genómico se realizó mediante el kit comercial Wizard
Genomic DNA purification kit (Promega, Ref. A1120), y se usó de acuerdo
con el protocolo del fabricante. Para esto, los cultivos bacterianos, se
resuspendieron en 480 μl de EDTA 50mM. Se les agrego 60 μl de lisozima
(20 mg/mL) y se incubaron a 37°C durante 60 minutos. Posteriormente se
centrifugaron a 1400 rpm por 2 minutos y luego se descartó el
sobrenadante, después se les agrego al pellet 600 μl de solución de lisis l,
se incubaron durante 5 minutos a 80°C, se les adiciono 3 μl de solución de
RNAsas y se incubaron durante 15 minutos a 37°C.
Seguidamente se les agrego 200 μl de solución de precipitación de
proteínas, se incubaron en hielo durante 5 minutos, luego se centrifugaron
los cultivos y se prosiguió a transferir los sobrenadantes a otros tubos de
micro centrifuga. Seguidamente se añadió 600 μl de isopropanol y se
mezcló hasta evidenciar la formación de la malla de ADN, se retiró
completamente el isopropanol por centrifugación y se adicionó 600 μl de
etanol 70%. Finalmente se centrifugaron, se retiró el etanol, se dejó secar
hasta evaporar completamente y el ADN de los microorganismos se
resuspendieron en 100μl de solución de rehidratación de ADN.
Posteriormente se conservó a -20°C.
7.4.3 Detección molecular (gen 16s).
Como control positivo se realizó la amplificación del gen 16s mediante la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), esperando un
tamaño de amplificación de aproximadamente 890 pb. Para ello se
emplearon los oligonucleótidos 17A (5’-TGCCAGCAGCCGCGATA-3’) y
18A (5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’). La amplificación se llevó a cabo
en un termociclador Bio-Rad T100TM y las condiciones de la amplificación
fueron las siguientes: Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM, dNTPs 200μM,
35
oligonucleótidos 17ª – 18A 0.5μM y 1U/μl de Taq polimerasa (Thermo
Fisher Scientific) para un volumen final de 20μl.
El programa de amplificación utilizado consistió en una desnaturalización a
95°C durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C (40 seg), 73°C (30
seg) y 72°C (2 min.), por último, un ciclo de extensión final a 72°C (5 min).
Posteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1.5%, teñido
con el colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen s33102), con buffer
TAE 1X y se corrió a 60 V.
7.4.3.1 Agua de producción.
Se obtuvo una muestra de agua de cabeza de pozo, la cual fue donada por
Ecopetrol. La empresa pidió reserva sobre las condiciones de toma, uso y
sitio de toma. Esta muestra fue fraccionada de la siguiente forma: la primera
fracción correspondió a la muestra homogenizada por agitación y la
segunda fracción corresponde a la misma agua, pero decantada a 4°C
durante aproximadamente 6 meses. El tiempo y temperatura de
decantación obedecen a las condiciones de almacenamiento descritas por
el oferente. El agua de producción fue usada para diluir el ADN de
Desulfovibrio vulgaris, para determinar si presentaba inhibición en la
amplificación por medio de la técnica de PCR.
7.4.4 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.
Se realizó con las condiciones estándar del programa de amplificación y del
mix de reactivos descritas por Ben-dov (2007). Para cada reacción se
empleó ADN de Desulfovibrio vulgaris ATCC 29579 como control positivo y
como control negativo, agua libre de nucleasas (Promega Corporation,
Madison USA). Las amplificaciones se realizaron en el termociclador
modelo BIO RAD T100 THERMAL CYCLER, y los productos se analizaron
por medio de electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %, teñido con el
36
colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen s33102), con buffer TAE
1X.
Las sondas oligonucleótidos control empleadas fueron las reportados por
Ben-dov (2007), dsrA1F (5’-ACSCACTGGAAGCACG-3’) y RH3-dsr-R (5’-
GGTGGAGCCGTGCATGTT-3’), específicos para amplificar un fragmento
del gen dsrA de un tamaño de 222 pb. El programa de amplificación
utilizado consistió en una desnaturalización a 95°C durante 10 minutos,
seguido de 40 ciclos de 95°C (20 seg), Melting°C (20 seg) y 68°C (30 seg),
finalmente un ciclo de extensión final a 68°C (5 min.). Y los componentes
del master mix fueron: Agua de PCR, Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM,
dNTPs 200μM, oligonucleótidos forward y reverse 0.5μM y 1U/μl de Taq
DNA polimerasa Thermo Scientific (recombinant Lote 00355220) para un
volumen final de 20μl.
7.4.4.1 Prueba de amplificación con diferentes polimerasas.
Para los oligonucleótidos control se usaron tres enzimas polimerasas
provenientes de diferentes casas comerciales las cuales fueron: Thermo
Fisher Scientific (recombinant Lote 00355220), Biorad (Sso advancedTM
Universal – SBRY- Green super mix (Lote:1893A)) y Biolabs One Taq
Quick-Load 2X MM w/ Std Buffer (Lote:0251712).
7.4.5 Condiciones base para la amplificación del gen dsrA.
Se usó inicialmente una mezcla de reacción con los siguientes reactivos:
Agua de PCR, Buffer de reacción 1X, MgCl2 1,8 mM, dNTPs 200μM,
oligonucleótidos sentido y anti-sentido 0.5μM y 1U/μl de Taq DNA
polimerasa Thermo Scientific (recombinant Lote 00355220) para un
volumen final de 20μl.
El programa de amplificación utilizado consistió en una desnaturalización a
95°C durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95°C (20 seg), Melting°C
37
(30 seg) y 68°C (30 seg), finalmente un ciclo de extensión final a 68°C (5
min.). Posteriormente se realizó electroforesis en gel de agarosa al 1.5%,
teñido con el colorante SYBR Safe DNA Gel Stain (invitrogen s33102), con
buffer TAE 1X y se corrió a 60 V.
Para la estandarización de la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa se evaluó:
7.4.5.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos.
Se evaluaron diferentes temperaturas de anillamiento de los
oligonucleótidos control dsr1F y RH3-dsr-R, las temperaturas usadas
fueron: 60°C - 62°C – 63,8°C - 66°C y 67,4°C. Y para las oligonucleótidos
en evaluación A1F Y K1R, las temperaturas usadas fueron: 60°C - 61,6°C
- 64,9°C - 66,4°C y 68 °C.
La curva melting se basó en desarrollar un análisis de hibridación de los
oligonucleótidos con el ADN bacteriano de Desulfovibrio vulgaris, para
verificar la especificidad del producto amplificado, y además se evaluó la
concentración de los oligonucleótidos que fue 0,4 μM y 0,2 μM.
7.5 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA
La especificidad para la detección del gen dsrA asociado a las BSR por los
oligonucleótidos seleccionados, se evaluó utilizando ADN de otros
microorganismos como Klebsiella pneumoniae (ATCC:10031), Klebsiella
oxytoca (ATCC:43165), Pseudomonas aeruginosa (ATCC:27853),
Enterobacter cloacae (ATCC: 13047), Pseudomonas putida
(ATCC:49128), Burkholderia cepacia (ATCC:25416), Alcaligenes faecalis
(ATCC:35655), Pseudomona putida, utilizando las condiciones definidas
anteriormente para los reactivos y programa de amplificación.
38
7.6 Límite de detección
Se cuantificó el ADN de Desulfovibrio vulgaris utilizando el equipo nanodrop
de Thermo Fisher Scientific. A partir de la cuantificación se realizaron
diluciones seriadas desde 1 nanogramo hasta 1 × 10−8 nanogramo (ng)
del ADN de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) y se amplificaron por
medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa con el fin de
determinar la mínima concentración de ADN con presencia del gen drsA
que puede ser detectado por la técnica de PCR previamente estandarizada.
39
8. RESULTADOS
8.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos
Tabla 3. Lista de los oligonucleótidos capaces de detectar BSR al amplificar el gen dsrA
utilizando PCR.
Nombre Secuencias Descripción inicial
Primer 1 AAGTACTACCACACCGACTACCT
Sentido
Primer 2 AGTACTACCACACCGACTAC
Primer 3 GTACTACCACACCGACTACC
Primer 4 GAATACGCCTGCTACGACAC
Primer 5 CGAATACGCCTGCTACGACA
Primer 6 CATGGAATACCAGGACGAAC
Primer 7 GGAATACCAGGACGAACTGC
Primer 8 GGAAGGACGACATCAAGATC
K1R TCCTTCCAGGTACCGATGAC Anti-sentido
K2R TTTGCCTTCTTCCATCACC
K3R TCCTTGATTTCGTCGTAGGG
Tabla 4. Microorganismos que presentaron alineamientos significativos con los
oligonucleótidos potenciales para amplificar el gen dsrA.
Sequence ID
Microorganismo
U16723.1
Desulfovibrio vulgaris dissimilatory sulfite reductase alpha (dsvA), dissimilatory sulfite reductase beta (dsvB) and dsvD genes, complete cds
AB061542.1 Desulfovibrio termitidis dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds
AF418185.1 Desulfovibrio termitidis HI1 strain DSM 5308 dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase beta subunit (dsrB) genes, partial cds
AB061543.1 Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds
EU127914.1 Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds
KJ801803.1 Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds
40
41
Figura 16. Alineamientos múltiples locales de los oligonucleótidos potenciales para
amplificar el gen dsrA, con las secuencias de las BSR prevalentes en sistemas de
producción y transporte de petróleo. Programa Bioedit, algoritmo ClustalW.
Tabla 5. Propiedades termodinámicas de los oligonucleótidos.
Nombre Tm°C CG% nt A T C G Coeficiente de
extinción (l/(mol·cm)
Peso molecular
(g/mol)
nmol µg/OD260
dsr1FA 62.3 62.5 16 5.0 1.0 5.5 4.5 156150.0 4880.2 6.4 31.3
RH3-dsr-RA
67.8 61.1 18 2.0 5.0 3.0 8.0 170700.0 5586.7 5.9 32.7
A1FB 60.0 47.8 23 8.0 4.0 9.0 2.0 221300.0 6921.6 4.5 31.3
K1RB 64.3 55.0 20 4.0 5.0 7.0 4.0 185200.0 6053.0 5.4 32.7
A. Oligonucleótidos control, B. Oligonucleótidos evaluados
Figura 17. Formación de heterodímeros de los oligonucleótidos control.
Este análisis se realizó utilizando el software Multiple Primer Analyzer de la casa comercial
Thermo Fisher Scientific, https://www.thermofisher.com/co/en/home/brands/thermo-
42
scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-
resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html.
Tabla 6. Sondas de oligonucleótidos para la amplificación de un fragmento del gen dsrA.
Nombre Secuencia (5' a 3') Gen reconocido
Sitio de
uniónC
Producto amplificado
Referencia
dsr1FA ACSCACTGGAAGCACG
dsrA
189 - 204
222 pb
(Eitan Ben-Dov, 2007) RH3-
dsr-RA GGTGGAGCCGTGCATGTT 411 -
428
A1FB AAGTACTACCACACCGACTACCT 520 -542
384 pb
En este estudio K1RB TCCTTCCAGGTACCGATGAC 904-
923 A Oligonucleótidos control, B Oligonucleótidos en evaluación, C Sitio de unión de los
oligonucleótidos en la secuencia de ADN Desulfovibrio vulgaris (ATTC: 29579).
8.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR.
8.2.1 Microorganismos de referencia.
Tabla 7. Concentración de ADN extraído para los microorganismos de referencia (tres
mediciones).
Microorganismos Concentración de ADN
(ng / μl)
Desulfovibrio vulgaris 62,9 ng
Klebsiella pneumoniae 18,4 ng
Klebsiella oxytoca 13,9 ng
Pseudomonas aeruginosa 106,4 ng
Enterobacter cloacae 15.7 ng
Pseudomonas putida 73.8 ng
Burkholderia cepacia 26,2 ng
Alcaligenes faecalis 66,6 ng
Pseudomonas putida 11,5 ng
43
8.2.2 Detección molecular (gen 16s)
Figura 18. Productos de la amplificación por PCR del gen 16S del ADN de Desulfovibrio
vulgaris.
-) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus (Thermo),
Carril 1 al 4) ADN diluido desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng. Carril 5 al 8) ADN diluido en agua
de producción homogenizada desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng. Carril 9 al 12) ADN diluido
en agua de producción decantada desde 1 ng hasta 1 × 10−3 ng.
8.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.
8.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos.
Figura 19. Optimización de condiciones de PCR para los oligonucleótidos de referencia
para el gen dsrA y los evaluados en este trabajo.
A
B
44
A. Oligonucleótidos control dsr1F y RH3-dsr-R.
B. Oligonucleótidos seleccionados A1F Y K1R. -) Control negativo, +) Control positivo, M)
Marcador Generuler 100 pb plus (Thermo).
8.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA
Figura 20. Especificidad de oligonucleótidos evaluados.
-) Control negativo, +) Control positivo Desulfovibrio vulgaris, Dn) Desulfotomaculum
nigrificans, Af) Alcaligenes faecalis, Pp) Pseudomonas putida, Pa) Pseudomonas
aeruginosa, Kp) Klebsiella pneumoniae, Ko) Klebsiella oxytoca, Ec) Enterobacter cloacae,
Bc) Burkholderia cepacia, M) Marcador de peso molecular de 100 pb plus (Thermo).
8.5 Límite de detección
45
Figura 21. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen dsrA con los
oligonucleótidos control.
Se uso ADN de Desulfovibrio vulgaris diluido en agua libre de nucleasas desde 1 ng hasta
1 × 10−8 ng. -) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus
(Thermo), A) Taq polimerasa de Biolabs, B). Taq polimerasa de Biorad, C). Taq polimerasa
de Thermo Fisher Scientific.
Figura 22. Límite de detección de la amplificación de un fragmento del gen dsrA con los
oligonucleótidos en evaluación.
Se uso ADN de Desulfovibrio vulgaris diluido en agua libre de nucleasas desde 1 ng hasta
1 × 10−8 ng. -) Control negativo, +) Control positivo, M) Marcador Generuler 100 pb plus
(Thermo).
46
9. DISCUSIÓN
9.1 Análisis “in silico” para la selección de los oligonucleótidos
Se evaluaron inicialmente ocho sondas de oligonucleótidos con posible
potencial para amplificar el gen dsrA por PCR convencional (tabla 3). Debe
aclararse que la selección de oligonucleótido diseñados obedece a que
estos fueron desarrollados para su uso en LAMP-PCR, lo que cambia las
condiciones de alineamiento, porcentaje de guanina y citocina (%G-C) y
longitud (Abd-Elsalam, 2003). Cada uno de los oligonucleótidos descritos
en la tabla 3, fueron analizados en Blast (Basic Local Alignment Search
Tool) para determinar la especificidad de reconocimiento y de este modo
comenzar a seleccionar los posibles oligonucleótidos, que presentaran la
capacidad de detectar solo BSR con un porcentaje de identificación del
100%.
De este primer alineamiento se obtuvieron seis secuencias reconocidas por
los diferentes oligonucleótidos con un porcentaje de identidad no inferior al
90% (U16723.1- AB061542.1- AF418185.1- AB061543.1- EU127914.1-
KJ801803.1), que corresponde a los microorganismos descritos en la tabla
4.
Cada uno de los oligonucleótidos se alineó por separado con las
secuencias de los seis microorganismos descritos anteriormente, para
determinar, la complementariedad entre los pares de bases de las
secuencias y los oligonucleótidos (anexo A). Luego de identificar el
reconocimiento de los oligonucleótidos con las secuencias seleccionadas
se identificaron las posiciones en las cuales pueden hibridarse con el fin de
establecer el tamaño de amplificación esperado, los posibles tamaños
esperados se hallaron al realizar alineamientos múltiples locales teniendo
en cuenta los microorganismos reportados por literatura que se encuentran
prevalentes en los sistemas de producción y transporte del petróleo (anexo
E).
47
Este indicador es de gran importancia para que estudios posteriores
puedan utilizar estos resultados en pruebas de PCR cuantitativa (qPCR).
Se hicieron combinaciones de los oligonucleótidos para determinar
tamaños de amplificación, formación de homodímeros y heterodímeros
entre las parejas (anexo E).
Para los oligonucleótidos control también se realizó el alineamiento Multiple
local con los microorganismos prevalentes en los sistemas de producción
y transporte del petrolero en Colombia (anexo C), y el alineamiento local de
los oligonucleótidos con respecto al microorganismo de referencia
Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579) (anexo D).
Como resultado del análisis in silico por medio de la herramienta online
Multiple Primer Analyzer (Scientific, s.f.), se fueron descartando los posibles
oligonucleótidos teniendo en cuenta la especificidad de reconocimiento de
los oligonucleótidos con respecto las BSR (anexo F), el primer 2 se
descartó como posible oligonucleótido teniendo en cuenta que podría
reconocer microorganismos diferentes a las BSR con un porcentaje entre
el 85% y 95% (anexo G). y en el anexo B, se muestran todas las
propiedades de los posibles oligonucleótidos. Se logró seleccionar una
pareja de oligonucleótidos que cumplía con todos los criterios y las
características termodinámicas, se presentan en la tabla 4 y 5, para los
oligonucleótidos control dsrA1F y RH3-dsr-R descritos por Ben-dov (2007)
y los oligonucleótidos seleccionados A1F y K1R, los cuales cumplen con
los criterios de aceptación para ser usados.
Según Orozco, et al. (2016) los oligonucleótidos deben tener una longitud
ideal de pares de bases que debe estar entre 15 y 25 pb; con un porcentaje
de guanina y citosina >40%, y además deben tener temperaturas de
hibridación (Tm °C) entre 50°C y 68°C. Además, no debe formar estructuras
secundarias (homodímeros y heterodímeros) y deben amplificar
fragmentos menores de 500 pb, para en un futuro poder usarlos para
qPCR.
48
En la tabla 5, se presenta las secuencias de los oligonucleótidos de (5’ a
3’), el sitio de unión de los oligonucleótidos con respecto al microorganismo
de referencia Desulfovibrio vulgaris (ATCC: 29579), el gen que debe
reconocer (dsrA) y el tamaño de amplificación esperado y obtenido en el
estudio.
Igualmente, por medio de esta herramienta se evidencia la posible
formación de heterodímeros entre los oligonucleótidos control (figura 17),
lo cual puede generar estructuras secundarias no deseables, y como
consecuencia los oligonucleótidos se pueden unir entre sí. Pero por otro
lado los oligonucleótidos en evaluación no generan ninguna formación de
homodímeros y heterodímeros.
Las sondas de oligonucleótidos reportadas por Ben-dov (2007) están
diseñadas para la identificación y cuantificación de 42 microorganismos con
la presencia del gen dsrA; por otro lado las sondas de oligonucleótidos en
evaluación fueron diseñadas para tener la capacidad de detectar BSR,
teniendo en cuenta los microorganismos reportados en Colombia por otros
estudios, de los cuales se identificaron 37 microorganismos prevalentes en
los sistemas colombianos, pertenecientes a las familias
Desulfovibrionaceae y Desulfobacteriaceae. En comparación con Ben-dov
se excluyen algunas especies de Desulfovibrio y se incluyen especies
diferentes de los géneros Desulfovibrio, Desulfobulbus, Desulfobacterium,
Desulfobacter, Desulfococcus.
9.2 Definición de condiciones base de amplificación del gen dsrA
utilizando PCR.
9.2.1 Microorganismos de referencia.
Se extrajo entre 11,5 y 106,4 ng/μL de ADN de los diferentes
microorganismos de referencia como se muestra en la tabla 7. Para el
49
testigo positivo Desulfovibrio vulgaris se obtuvo una cuantificación de 62,9
ng/μl.
9.2.2 Detección molecular (gen 16s)
La identificación molecular de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) por
medio del gen 16s, permitió obtener una banda aproximadamente de 890
pb, al usar los oligonucleótidos 17A y 18A. Estos oligonucleótidos son
universales, y se usaron como control positivo de las reacciones de PCR,
dado que permite identificar la presencia de ADN bacteriano, con esto se
descartan falsos negativos de amplificación para el gen dsrA con cualquiera
de los oligonucleótidos en estudio.
En la figura 18, se muestra los amplificados del gen 16s con la presencia
del ADN de D. vulgaris. Teniendo en cuenta el potencial uso de la técnica
para la detección de BSR en la industria del petróleo, se realizó una primera
aproximación diluyendo el ADN de Desulfovibrio vulgaris y se realizó límite
de detección utilizando concentraciones de ADN desde 1 ng hasta 1 × 10−8
ng. Se observó la amplificación del gen 16s utilizando agua libre de
nucleasas y cuando se utilizó agua de producción como diluyente del ADN
para la PCR en las dos fracciones utilizadas en este estudio, homogenizada
y decantada. La amplificación fue mayor cuando se utilizó agua de cabeza
de pozo como diluyente del ADN de Desulfovibrio vulgaris pudiéndose
obtener amplificación hasta 1 × 10−3 ng de ADN. El agua de cabeza de
pozo es el agua que se obtiene tras el bombeo de un pozo de producción
de petróleo y esta puede contener gran cantidad de material particulado
(Martinez, y otros, 2011). Por esta razón, se probaron dos condiciones de
esta agua, centrifugada y sin centrifugar con el fin de observar un posible
efecto inhibitorio en la PCR. Por el contrario, se observó una mayor
amplificación cuando se utilizó el agua de cabeza de pozo sin centrifugar.
Esta prueba es de gran valor para este trabajo teniendo en cuenta que no
50
se observó amplificación del gen 16s en el agua de cabeza de pozo en
ninguno de los dos tratamientos (Duque, y otros, 2004).
9.3 Amplificación del gen dsrA con oligonucleótidos control.
9.3.1 Temperaturas de hibridación y concentración de
oligonucleótidos.
La mejor temperatura de hibridación de los oligonucleótidos control para el
gen dsrA utilizando el ADN de Desulfovibrio vulgaris fue 66,4°C debido a
que se observó una única banda definida del peso esperado de 222 pb,
además se pudo identificar la mejor concentración de los oligonucleótidos
la cual corresponde a 0,4 μM (figura 19A). Esto concuerda con los
resultados descritos por Ben-dov (2007), quien en una investigación diseño
pares de oligonucleótidos con la capacidad de detectar bacterias sulfato
reductoras por medio del gen dsrA, se buscaron las BSR en aguas
industriales producidas por varias industrias químicas y mediante PCR
obtuvieron una amplificación del mismo tamaño obtenido en este estudio,
empleando como control positivo Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris
(AE017285).
La identificación de las BSR ha sido objeto de estudio en varias
investigaciones, la primera fue realizada por Wagner et al (1996), se
buscaba conocer la filogenia de la sulfito reductasa disimilatoria, la cual
sustentan los orígenes tempranos de la respiración con sulfato, como
control positivo usaron el ADN molde de Desulfovibrio vulgaris y fue el
estudio inicial en el cual diseñaron el oligonucleótido forward dsr1F (5’-
ACSCACTGGAAGCACG-3’). Recientemente Blazejak & Schippers (2011),
reportaron el análisis de diversidad de los genes funcionales para las
enzimas adenosina 5'-fosfosulfato reductasa (aprA) y sulfito reductasa
disimilatoria (dsrA) de procariontes reductores de sulfato presentes en
sedimentos marinos del margen continental del Perú y el Mar Negro,
incluyendo muestras de la biosfera profunda, como resultado obtuvieron
51
que el gen metabólico para la reducción de sulfatos de forma desasimilativa
se podría detectar en todas las capas de sedimentos analizadas y que los
microorganismos encontrados pertenecían a las
familias Desulfobacteriaceae y Desulfovibrio.
Con respecto a los oligonucleótidos en evaluación se seleccionó la
temperatura de 62°C, puesto que se observa una banda definida de 384 pb
(figura 19B). Es de importancia resaltar que la temperatura de hibridación
del producto depende principalmente de la composición de la base y la
longitud del ADN, y, por lo tanto, los productos específicos se pueden
distinguir de los productos no específicos por la diferencia en sus
temperaturas (Orozco, Franco, & Olivo, 2016).
Con respecto la concentración de oligonucleótidos se halló que la mejor
concentración correspondía a 0,4 μM, puesto que al disminuir la
concentración de oligonucleótidos se obtenía una mínima visibilidad de las
bandas, debido a que la intensidad disminuía, a tal punto de no observar
las bandas.
9.4 Especificidad de reconocimiento del gen dsrA
Se utilizaron los ADN de los microorganismos de referencia en una
concentración de 10 ng/μl. En la figura 20, se muestra una única banda sin
interferencias de la amplificación del gen dsrA con el peso esperado de
aproximadamente 384 pb. No se observó amplificación de ningún tipo
cuando se utilizaron los ADN de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca,
Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida,
Burkholderia cepacia, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas putida.
9.5 Límite de detección
La identificación del límite de detección permite tener un valor de referencia
de la posible sensibilidad que tendrán los oligonucleótidos al ser utilizados
52
en la detección de BSR en muestras de campo. En este trabajo el límite de
detección fue evaluado utilizando inicialmente los oligonucleótidos de
referencia para amplificar el ADN de Desulfovibrio vulgaris utilizando tres
polimerasas de ADN diferentes para demostrar si el uso de ellas influía en
la capacidad de amplificación del gen dsrA. Es de importancia resaltar que
la prueba de polimerasas solo fue realizada a los oligonucleótidos control,
y al seleccionar la mejor condición, esta se replicó para los oligonucleótidos
seleccionados en el presente trabajo.
En la figura 21-A, se pudo demostrar que al usar la Taq polimerasa
OneTaq® Quick-Load® 2X Master Mix with Standard Buffer de la casa
comercial Biolabs, logró detectar hasta la concentración de 1 × 10−2 ng,
debido a que es una polimerasa que tiene una combinación de Taq y Deep
VentR™, esto favorece a la amplificación debido a que tiene una actividad
de exonucleasa de corrección de 3'→ 5', de manera que aumenta la
fidelidad y la amplificación de la Taq con el ADN, es altamente termoestable
(New England Biolabs, 2018).
Por otro lado, al usar la Taq polimerasa SsoAdvanced™ Universal SYBR®
Green Supermix de la casa comercial Biorad se logró detectar la mínima
concentración de 1 × 10−6 ng (figura 21-B), este resultado se da a causa
que la polimerasa contiene una enzima pequeña de 7 kD obtenida de
Sulfolobus solfataricus y es conocida como Sso7d, la cual es capaz de
unirse covalentemente al ADN sin ninguna preferencia por secuencias
específicas (Biorad, s.f.). Y como beneficios ayuda a aumentar la
sensibilidad y detección del ADN, mejora la tolerancia a inhibidores
presentes en la PCR, minimiza el error mediante la amplificación, y se
mejora le eficiencia en la PCR.
Por último, se observa que al usar la Taq polimerasa convencional de la
casa comercial Thermo Fisher Scientific la mínima concentración que se
detecta es de 1 × 10−2 ng, esta polimerasa no cuenta con actividad de
exonucleasas para realizar correcciones, como limitación o desventaja
tiene una tasa de error de Taq ADN polimerasa en PCR es de 2,2 × 10−5
53
errores por nt por ciclo. En consecuencia, la precisión de la PCR es
4,5 × 104 y no presenta desoxinucleotidil transferasa terminal para
adicionar adeninas al extremo 3’ (Thermo Fisher Scientific, s.f.) (figura 21-
C).
Cabe resaltar que es de suma importancia conocer la mínima
concentración de ADN con presencia del gen dsrA, debido a que se puede
establecer que posiblemente si existe la presencia de BSR, pero la
concentración de ADN no es la suficiente para ser detectada por la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Asimismo, es de
importancia resaltar que el límite de detección es ampliamente usado para
qPCR, pero para PCR convencionales no se usa, teniendo en cuenta que
no todos los laboratorios cuentan con los recursos necesarios para hacer
qPCR, es importante el desarrollo de una técnica convencional con bajos
requerimientos de ADN molde.
Teniendo en cuenta el resultado anterior, se seleccionó la Taq polimerasa
de Biorad, con la que se observó que la mínima concentración de ADN
detectada es de 1 × 10−5 ng (figura 22), un orden de magnitud anterior a
los oligonucleótidos control.
Ben-dov (2007) por medio de la técnica qPCR reporto un límite de
detección en número de copias teóricas del ADN genómico de Desulfovibrio
vulgaris por cada ensayo, el número de copias fue calculado en función de
la concentración de ADN medida (ng/ml), una masa molecular promedio de
660 para un par de bases en un ADN bicatenario y el tamaño del genoma
de Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris (3,570,858 pb), como resultado
expreso que el número de copias estaba entre 1,21 × 104 y 5,56 × 103.
Por otro lado, Kondo (2004) reportó el límite de detección de su estudio el
cual se basó en la detección y enumeración de bacterias reductoras de
sulfato en sedimentos estuarinos mediante PCR competitiva, como
resultado describió que el límite de detección fue de 10 copias por reacción
de PCR si se usaba 40 ciclos de PCR.
54
10. CONCLUSIONES
En este estudio se identificaron los posibles oligonucleótidos competentes
de detectar BSR, se evaluaron dos sondas de oligonucleótidos que
presentaron la capacidad de amplificar el gen dsrA es asociado a las
bacterias sulfato reductoras, por lo cual se cumplió con el objetivo
planteado.
Por lo tanto, este es el primer reporte sobre sondas de oligonucleótidos que
fueron diseñadas y evaluadas con el fin de detectar BSR.
El análisis “in silico” ayudó a conocer las posibles formaciones de
estructuras secundarias entre los oligonucleótidos, y además ayudó a
conocer cuales oligonucleótidos presentaban las condiciones óptimas para
su selección y evaluación.
Por medio de la curva melting se identificó las mejores temperaturas en las
cuales los oligonucleótidos se hibridaban a las secuencias de ADN, para
los oligonucleótidos control fue de 66,4°C y para los oligonucleótidos
evaluador fue de 62°C.
Además, se identificó una única banda del tamaño esperado para las
sondas de oligonucleótidos.
Se obtuvo una alta especificidad de reconocimiento del gen dsrA usando
los oligonucleótidos evaluados, debido a que solo amplifico la bacteria
sulfato reductora usada en este estudio Desulfovibrio vulgaris.
La mejor concentración de oligonucleótidos en los productos de
amplificación fue de 0,4 μM.
La polimerasa de la casa comercial Biorad, presenta el mayor límite de
detección de la mínima concentración de ADN con presencia del gen dsrA,
hasta la dilución de 1 × 10−5 ng para los oligonucleótidos evaluados y
1 × 10−6 ng para los oligonucleótidos control.
55
11. RECOMENDACIONES
Para estudios posteriores se recomienda amplificar el gen dsrA
directamente de muestras de agua de producción, debido a que las aguas
asociadas a los crudos constituyen medios naturales donde se desarrollan
bacterias capaces de facilitar la formación de metabolismo que ocasionan
daños por corrosión a los equipos de producción de la industria petrolera
Además, evaluar más oligonucleótidos que detecten microorganismos
prevalentes en los sistemas de producción y transporte de Petróleo en
Colombia.
Recuperar las bandas amplificadas y secuenciarlas para tener la certeza
de que los oligonucleótidos, amplificaron el gen de interés.
Finalmente, futuros trabajos deberán evaluar el límite de detección con más
de un par de oligonucleótidos control y usar en las pruebas más
microorganismos de referencia pertenecientes a las bacterias sulfato
reductoras.
56
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63
13. ANEXOS
Anexo A. Alineamientos significativos de microorganismos obtenidos en el análisis de
BLAST con los oligonucleótidos.
64
Nombre Tm°C CG% nt A T C G Coeficiente de
extinción (l/(mol·cm)
Peso molecular
(g/mol)
nmol µg/OD260
Primer 1 53.7 50.0 20 7.0 3.0 8.0 2.0 194300.0 6015.0 5.1 31.0
Primer 2 56.6 55.0 20 6.0 3.0 9.0 2.0 188000.0 5990.9 5.3 31.9
Primer 3 62.7 55.0 20 6.0 3.0 7.0 4.0 191200.0 6071.0 5.2 31.8
Primer 4 66.4 55.0 20 6.0 3.0 7.0 4.0 191900.0 6071.0 5.2 31.6
Primer 5 62.3 50.0 20 8.0 2.0 5.0 5.0 204900.0 6144.1 4.9 30.0
Primer 6 63.8 55.0 20 7.0 2.0 5.0 6.0 201700.0 6160.1 5.0 30.5
Primer 7 61.6 50.0 20 8.0 2.0 4.0 6.0 209300.0 6184.1 4.8 29.5
Primer 8 64.3 55.0 20 4.0 5.0 7.0 4.0 185200.0 6053.0 5.4 32.7
K2R 63.1 47.4 19 2.0 8.0 8.0 1.0 158000.0 5640.7 6.3 35.7
K3R 64.3 50.0 20 2.0 4.0 8.0 3.0 184600.0 6130.0 5.4 33.2
Anexo B. Propiedades termodinámicas de los posibles oligonucleótidos.
Anexo C. Alineamiento múltiple local de oligonucleótidos control.
B
A
65
Fragmento de las secuencias de las BSR prevalentes en sistemas de producción y
transporte de petróleo, con los alineamientos locales de los oligonucleótidos control. A).
Alineamiento local del Forward dsrA1F. B). Alineamiento local del Reverse RH3-dsr.
Anexo D. Fragmento de la secuencia de Desulfovibrio vulgaris (ATCC 29579) con los
alineamientos locales de los oligonucleótidos control.
A). Alineamiento local del forward dsrA1F.
B). Alineamiento local del reverse RH3-dsr-R.
A
B
66
Anexo E. Combinaciones de los oligonucleótidos para determinar el tamaño de
amplificación y la formación de homodímeros y heterodímeros.
El posible tamaño de amplificación se determinó realizando alineamientos múltiples
locales usando los microorganismos reportados en colombia en sistemas de producción y
transporte de petróleo.
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CT
AC
CA
CA
CC
GA
CT
AC
C -
TT
TG
CC
TT
CT
TC
CA
TC
AC
C28
pb
00
PC
R 3
- K
3RG
TAC
TAC
CA
CA
CC
GA
CTA
CC
- TC
CTT
GA
TTTC
GTC
GTA
GG
G24
5 pb
12
PC
R 4
- K
1RG
AA
TAC
GC
CTG
CTA
CG
AC
AC
- TC
CTT
CC
AG
GTA
CC
GA
TGA
C44
9 pb
00
PC
R 4
- K
2RG
AA
TA
CG
CC
TG
CT
AC
GA
CA
C -
TT
TG
CC
TT
CT
TC
CA
TC
AC
C30
pb
0
0
PC
R 4
- K
3R
GA
ATA
CG
CC
TGC
TAC
GA
CA
C -
TCC
TTG
ATT
TCG
TCG
TAG
GG
449
pb1
2
PC
R 5
- K
1RC
GA
AT
AC
GC
CT
GC
TA
CG
AC
A -
TC
CT
TC
CA
GG
TA
CC
GA
TG
AC
450
pb
00
PC
R 5
- K
2RC
GA
AT
AC
GC
CT
GC
TA
CG
AC
A -
TT
TG
CC
TT
CT
TC
CA
TC
AC
C45
0 p
b0
0
PC
R 5
- K
3RC
GA
ATA
CG
CC
TGC
TAC
GA
CA
- TC
CTT
GA
TTTC
GTC
GTA
GG
G45
0 pb
12
PC
R 6
- K
1RC
ATG
GA
ATA
CC
AG
GA
CG
AA
C -
TCC
TTC
CA
GG
TAC
CG
ATG
AC
405
pb1
1
PC
R 6
- K
2RC
ATG
GA
ATA
CC
AG
GA
CG
AA
C -
TTTG
CC
TTC
TTC
CA
TCA
CC
405
pb1
1
PC
R 6
- K
3RC
ATG
GA
ATA
CC
AG
GA
CG
AA
C -
TCC
TTG
ATT
TCG
TCG
TAG
GG
405
pb2
1
PC
R 7
- K
1RG
GA
ATA
CC
AG
GA
CG
AA
CTG
C -
TCC
TTC
CA
GG
TAC
CG
ATG
AC
402
pb0
1
PC
R 7
- K
2RG
GA
AT
AC
CA
GG
AC
GA
AC
TG
C -
TT
TG
CC
TT
CT
TC
CA
TC
AC
C40
2 p
b0
0
PC
R 7
- K
3RG
GA
ATA
CC
AG
GA
CG
AA
CTG
C -
TCC
TTG
ATT
TCG
TCG
TAG
GG
402
pb1
1
PC
R 8
- K
1RG
GA
AG
GA
CG
AC
ATC
AA
GA
TC -
TCC
TTC
CA
GG
TAC
CG
ATG
AC
280
pb
12
PC
R 8
- K
2RG
GA
AG
GA
CG
AC
ATC
AA
GA
TC -
TTTG
CC
TTC
TTC
CA
TCA
CC
280
pb
13
PC
R 8
- K
3RG
GA
AG
GA
CG
AC
ATC
AA
GA
TC -
TCC
TTG
ATT
TCG
TCG
TAG
GG
280
pb
21
67
Primer 1 Forward
AAGTACTACCACACCGACTACCT nt: 23 Tm: 60.0
BLAST
Sequence ID Microorganismos
nt % # C
Longitud
KJ801803.1
Desulfovibrio sp. Subgénesis reductasa de sulfito disimilatorio wpp1 A (dsrA) y genes de la subunidad reductasa de sulfito B (dsrB), CD parcial
23 100 1 1857
EU127914.1
Desulfovibrio vulgaris str. Subunidad alfa de desulfoviridina 'Miyazaki F', subunidad beta de desulfoviridina y genes de la subunidad gamma de desulfoviridina, cds completos
23 100 1 3787
CP001197.1
Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F', genoma completo
23 100 1 4040304
AF418185.1
Desulfovibrio termitidis HI1 cepa DSM 5308 sublimación disimilatoria de la sulfita reductasa alfa (dsrA) y genes de la subunidad beta reductasa de sulfito asimiladora (dsrB), CD parcial
23 100 1 1899
AB061543.1
Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes para sulfito reductasa alfa y subunidades beta, CD parcial
23 100 1 1943
Primer 1 Reverse
TCCTTCCAGGTACCGATGAC nt: 20 Tm: 64.3
BLAST
68
Sequence ID
Microorganismos nt %
# C
Longitud
KJ801803.1
Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds
20 100 1 1857
CP002297.1
Desulfovibrio vulgaris RCH1, complete genome
20 100 1 3532052
GU060532.1
Fusobacterium sp. SRBBR 3 gen dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA), CD parc
20 100 1 589
EU127914.1
Desulfovibrio vulgaris str. Subunidad alfa de desulfoviridina 'Miyazaki F', subunidad beta de desulfoviridina y genes de la subunidad gamma de desulfoviridina, cds completos
20 100 1 3787
DQ826729.1
Desulfovibrio vulgaris subsp. vulgaris dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsvA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsvB) genes, partial cds
20 100 1 1910
Primer 2 Forward
GTCCATCAAGACCACCGAGT nt: 20 Tm: 64.5
BLAST
Sequence ID Microorganismos
nt % # C Longitud
KJ801803.1
Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds
19 95 1 1857
69
EU127914.1
Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds
19 95 1 3787
AB061542.1
Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds
19 95 1 1943
FO203522.1
Desulfovibrio hydrothermalis AM13 = DSM 14728 chromosome, complete genome
<15 75 104 3703034
CP003220.1
Desulfovibrio desulfuricans ND132, complete genome
<15 75 314 3858580
Primer 2-3-4 Reverse
TTTGCCTTCTTCCATCACC nt: 19 Tm: 63.1
BLAST
Sequence ID Microorganismos nt % # C Longitud
CP023415.1
Desulfovibrio sp. G11 chromosome, complete genome
16 84 179 3414934
CP001358.1
Desulfovibrio desulfuricans subsp. desulfuricans str. ATCC 27774, complete genome
16 84 159 2873437
70
KJ801799.1
Desulfovibrio sp. SR22 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds
16 84 1 1859
CP006585.1
Desulfovibrio gigas DSM 1382 = ATCC 19364 genome
16 84 216 369399
CP014229.1
Desulfovibrio fairfieldensis strain CCUG 45958, complete genome
16 84 154 3699310
Primer 3 Forward
GTACTACCACACCGACTACC nt: 20 Tm: 56.6
BLAST
Sequence ID Microorganismos
nt % # C
Longitud
KJ801803.1
Desulfovibrio sp. wpp1 dissimilatory sulfite reductase subunit A (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase subunit B (dsrB) genes, partial cds
20 100 1 1857
EU127914.1
Desulfovibrio vulgaris str. 'Miyazaki F' desulfoviridin alpha subunit, desulfoviridin beta subunit, and desulfoviridin gamma subunit genes, complete cds
20 100 1 3787
AF418185.1
Desulfovibrio termitidis HI1 strain DSM 5308 dissimilatory sulfite reductase alpha subunit (dsrA) and dissimilatory sulfite reductase beta subunit (dsrB) genes, partial cds
20 100 1 1899
71
AB061543.1
Desulfovibrio vulgaris oxamicus dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds
20 100 1 1943
AB061542.1 Desulfovibrio termitidis dsrA, dsrB genes for sulfite reductase alpha and beta subunits, partial cds
20 100 1 1943
Anexo F. Especificidad de reconocimiento de los oligonucleótidos pre- seleccionados con respecto las BSR.
Usando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre. nt)
Numero de pares de bases, #C) Numero de coincidencias, %) Porcentaje de identificación.
Primer 2 Forward
GTCCATCAAGACCACCGAGT nt: 20 Tm: 64.5
BLAST
Anexo G. Especificidad de reconocimiento primer 2.
Usando el programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) de acceso libre. nt)
Numero de pares de bases, #C) Numero de coincidencias, %) Porcentaje de identificación.
Sequence ID Microorganismos nt % # C Longitud
CP015810.1 Microbacterium chocolatum strain SIT 101, complete genome
19 95 1 3117902
CP022862.1 Parastagonospora nodorum isolate Sn79-1087 chromosome 13, complete sequence
18 90 1 1396077
LN006619.1 Spirometra erinaceieuropaei genome assembly S_erinaceieuropaei, scaffold SPER_scaffold0006551
18 90 1 14303
CP023141.1 Aeromonas dhakensis strain KN-Mc-6U21, complete genome
17 85 1 4868053
LT629687.1 Pseudomonas koreensis strain BS3658 genome assembly, chromosome: I
17 85 1 6123913