Download - Esterilizacion de Biorreactores
4.1. Introducción
En las fermentaciones industriales se requiere de un alto grado de limpieza y asepsia
No existe un método cuantitativo seguro y confiable para medir el número o la concentración de contaminantes en el sistema
Posibles elementos de contaminación en un proceso fermentativo:
El medio El inóculo y el proceso de
inoculación El suministro de aire La adición de nutrientes, antiespu-
mantes, etc. durante el proceso El fermentador en sí
4.2. Esterilización de medios de cultivo
A. Eliminación físicaa) Filtraciónb) Centrifugaciónc) Flotaciónd) Atracción electrostáticae) Intercambio iónicof) Adsorción por carbón de virus
4.2. Esterilización de medios de cultivo
B. Destrucción
a) Calor húmedob) Calor secoc) Radiación electromagnéticad) Radiación sónicae) Agentes químicos
4.2. Esterilización de medios de cultivo
La técnica de mayor aplicación a nivel industrial es el tratamiento térmico que se puede llevar a cabo en procesos intermitentes y continuos
El vapor es el recurso utilizado universalmente para la esterilización del medio de fermentación
Cinética de esterilización
La destrucción de microorganismos por vapor (calor húmedo) puede ser descrita como una reacción química de primer orden:
- dN = KN (1) dDonde:
N No. de m.o. viables presentes Tiempo del tratamiento de esterilizaciónK Constante de reacción
Constantes de velocidad de reacción (K) y tiempos de reducción decimal de diferentes esporas bacterianas suspendidas en buffer a 121°C
Especie Ka 121°C(min-1)
Da 121°C(min)
Bacillus subtilis FS 5230
Bacillus stearothermophilus FS 1518
Bacillus stearothermophilus FS617
Clostridium sporogenes PA 3679
3.8-2.6
0.77
2.9
1.8
0.6-0.9
3.0
0.8
1.3
Cinética de esterilización
Integrando la ecuación (1):
N = e-K (2)
N0
Donde:N No. de m.o. viables al tiempo
N0 No. de m.o. Viables presentes al inicio del tratamiento de
esterilización
Cinética de esterilización
Otra forma de expresar la ecuación (2):
ln N = -K (3)
N0
Donde:N No. de m.o. viables al tiempo
N0 No. de m.o. viables presentes al inicio del tratamiento de
esterilización
Cinética de esterilización
La esterilización total nunca puede alcanzarse
Valores de N < 1 se deben considerar en términos de la probabilidad de que un microorganismo sobreviva al tratamiento
Las gráficas representadas anteriormente sólo se observan cuando se lleva a cabo la esterilización de un cultivo puro bajo condiciones ideales de esterilización
Cinética de esterilización
El valor de K no sólo depende de las especies, sino también depende de la forma fisiológica de la célula
Ejemplo: las endoesporas del género Bacillus son más resistentes que las células vegetativas
Richards generó una serie de gráficas ilustrando las desviaciones que en la práctica se presentan de la teoría
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas
ln (N/N0)
La activación de esporases significativamente mayor que su destrucción durante los primeros estados del proceso
a)
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas
ln (N/N0)
La activación de esporases balanceada por su muer-te durante los primeros estados del proceso
b)
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de una población de endoesporas
ln (N/N0)
La activación de esporases menor que su muer-te durante los primeros estados del proceso
c)
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados
ln (N)
Mezcla constituida princi-palmente por el microorga-nismo menos resistente térmicamente
d)
Microorganismo sensitivoMicroorganismo resistente
Efecto del tiempo de tratamiento térmico sobre la sobrevivencia de cultivos mezclados
ln (N)
Mezcla constituida princi-palmente por el microorga-nismo más resistente térmicamente
e)
Microorganismo sensitivoMicroorganismo resistente
Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius
d ln K = Ea (4) dT RT2
Donde:Ea Energía de activaciónR Constante de los gasesT Temperatura absoluta
Relación entre la temperatura y la constante de reacción: tipo Arrhenius
Integrando la ecuación (4):
ln K = ln A - Ea (5) RT
Ecuación para la esterilización térmica de un cultivo puro:
Combinando las ecuaciones (3) y (5):
ln N0 = A e-E/RT (6)
N
Factor DEL o Factor NABLA (V)
Definido por Deinoerfer y Humprey (1959) como un criterio de diseño para la esterilización:
V = ln N0 (7)
N
De donde: V = A e-EA/RT
(8)
ˉ
ˉ
ˉ
Factor DEL o Factor NABLA (V)
Rearreglando la ecuación (8):
ln = E + ln V (9)
RT A
Este factor es una medida de la reducción fraccional de organismos viables producido por un cierto régimen de tiempo y temperatura
ˉ
ˉ
Efecto del tiempo de esterilización y de la temperatura sobre el factor DEL alcanzado en el proceso
1/T
ln Factores DEL
2.3
4.6
23
69
Diseño de proceso de esterilización de medios de fermentación
El mismo grado de esterilización se puede obtener a partir de un gran número de combinaciones de tiempo y temperatura
De acuerdo a Deindoerfer y Humprey (1959), Richards (1968) y Banks (1979) un factor de riesgo de que un batch de mil esté contaminado se utiliza frecuentemente en la industria de las fermentaciones
ˉ
Diseño de proceso de esterilización de medios de fermentación
Se supone que los únicos contaminantes presentes son esporas de Bacillus stearothermophilus, que es de los microorganismos más termorresistentes, cuyas características son:
Ea = 67.7 Kcal/molA= 1 x 10 36.2 seg-1
Una serie de reacciones deteriorativas pueden presentarse en el medio durante su esterilización, resultando en una pérdida de la calidad nutritiva
ˉ
Efecto deteriorativo del incremento del tiempo de tratamiento sobre la productividad del proceso de fermentación
Duraciónde la esterilización (min)
% d
e la m
áxim
a p
rod
uct
ivid
ad
Pérdida de calidad nutritiva del medio durante la esterilización
Dos tipos de reacciones básicas contribuyen a la pérdida de calidad nutritiva durante la esterilización:
i. Interacciones entre nutrientes constituyentes del medio, Ejem: reacción de Maillard
ii. Degradación de componentes termolábiles como vitaminas y aminoácidos
Para evitar reacciones deteriorativas se recomiendan sistemas de esterilización continuos de alta temperatura y corto tiempo (HTST)
4.2.1. Esterilización intermitente
Existen diferentes tipos de equipo utilizado para la esterilización del medio de cultivo, dependiendo del método empleado para el calentamiento
Perfiles de temperatura en esterilización batch
Tipo Ecuación de perfil
1
2
3
4
T = T0 1 + t
1 +t
Hiperbólico
T = T0 (1 + t)
Lineal
T = TH (1 +e-t)
Exponencial
T = TCo (1 +e-t)
Exponencial
= hs = S/M
MCpT0
= q
MCpT0
= UA = T0 – TH
MCp TH
= WCp’ 1 – exp -UA
MCp WCp’
= (T0 –TCo)/TCo
Terminología
A área de transferencia de calor (m2)Cp calor específico del medio (Kcal/Kg °C)Cp’ calor específico del refrigerante (Kcal/Kg
°C)h contenido entálpico del vapor (Kcal/Kg)M masa inicial del medioq velocidad de transferencia de calor (Kcal/seg)S flujo másico de vapor (Kg/seg, Kg/min, Kg/hr)T0 temperatura inicial del medio (°K)
TH temperatura de la fuente de calor (°K)
TCo temperatura inicial del refrigerante (°K)U coeficiente global de transferencia
(Kcal/m2 hr °C)
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch
total = ln N0 = Kdt = ’ e-E/RT dt
N
total = calent + reten + enfr
∫ ∫0 0
tt
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch
calent = ln N0 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt
N1
reten = ln N1 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt
N2
enfr = ln N2 = Kdt = ’ e-Ea/RT dt
N
∫ ∫0 0
t1t1
∫ ∫0 0
t2t2
∫ ∫0 0
t3t3
Criterio de diseño ( total) de esterilizaciones batch
Donde:
t = t1 + t2 + t3
N nivel de esterilidad (No. de m.o. después de la esterilización)
N0 nivel de contaminación (No. de m.o. antes de la esterilización)
N1 No. de m.o. contaminantes después del período de calentamiento, t1
N2 No. de m.o. contaminantes después del período de retención, t2
4.2.2. Esterilización continua
Menos utilizados en la industria que los intermitentes
Equipo más utilizado para la esterilización continua del medio de fermentación:
Esterilizador tipo inyección Intercambiador de placas
Esterilización continua por inyección
Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.
Esterilización continua con intercambiadores de calor
Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. Butterworth-Heinemann,Gran Bretaña.
Ventajas de la esterilización
CONTINUA sobre la BATCH
Mantenimiento superior de la calidad del medio
Fácil escalamiento Fácil control automático Reducción del tiempo de
esterilización Reducción de corrosión en el
fermentador
Ventajas de la esterilización
BATCH sobre la CONTINUA
Control manual simple
Fácil de aplicarse a un medio que contenga una alta proporción de material sólido
4.3. Esterilización del aire
En los procesos de fermentación se necesita aire estéril, por lo que es común el uso de un sistema de filtración y uno de esterilización
El tamaño de los microorganismos varía desde unas milimicras hasta cientos de micras
Los microorganismos más pequeños suelen ser absorbidos en el polvo del aire, lo que facilita su eliminación durante la filtración
4.3. Esterilización del aire Durante el proceso de esterilización del
aire se eliminan las partículas de tamaño entre 0.5 y 1.0 micra
Para poder diseñar un sistema de esterilización es necesario conocer el tamaño de las partículas y el número de microorganismos presentes en el aire, así como la cantidad de otras partículas.
En Inglaterra se han reportado valores promedio de 3 a 9 x 103 partículas/m3 y en Japón 12 x 103
El proceso de esterilización del aire más utilizado es el de FILTRACIÓN
Requisitos de un sistema de filtración
1. El sistema debe ser de diseño sencillo
2. Su operación debe ser barata
3. Debe ser estable y resistente a varias esterilizaciones con vapor
4. Debe acondicionar el aire, ajustando temperatura y humedad
Tipos de filtros
Escala pequeña: Filtros millipore, de asbesto o porcelana Filtros fibrosos de lana de vidrio o
materiales similares
Escala mayor: Filtros granulados, partículas de carbón Filtros fibrosos
4.3.1. Análisis fundamental
El comportamiento de un filtro para aire se define de la siguiente manera:
= N – N0 x 100 (%) (10)
N0
Siendo la eficiencia total de retención del filtro
-
-
Mecanismos de retención de partículas finas por filtros de aire
a) Impacto
b) Intercepción
c) Difusión
d) Sedimentación
e) Atracción electromagnética
Impacto inercial (1)
La retención por este método se expresa como:
1 = b/Df (11)
b = Df + 2Dp (12)
Donde:b ancho específico de la corriente
(, cm)Df diámetro de la fibra (, cm)
Dp diámetro de la partícula (, cm)
Impacto inercial (1)
Masa de partículamuy pequeña
oVelocidad de aire
muy baja
Fuerza inercial insuficiente para que la
partícula choque con la
fibra
Velocidad crítica, Vc, en la que los efectos inerciales se vuelven mínimos
Velocidad Crítica (Vc)
Vc = 1.125 a Df (13)
C p Dp2
Donde:Vc velocidad superficial crítica del airea viscosidad del aire
p densidad de la partícula
C factor de correlación basado en la Ley de Stokes
Velocidad Crítica (Vc)
Para bacterias de 1 micra de diámetro:
Vc = 0.066 Df (14)
Vc en ft/segDf en micras
Intercepción (2)
Para partículas esféricas:
2 = 1 [(1+Re)ln(1+Re)2 – (1+Re) + 1/(Re+1)]
2(2-lnRe) (15)
Donde: Re = Df v (16)
v velocidad del aire
Difusión (3)
La difusividad de las partículas finas, D, puede expresarse como una función de Dp y considerando como Do el diámetro efectivo de desplazamiento de la partícula por difusión se tiene:
3 = 1 [2(K)lnK – K + 1/K] (17)
2(2-lnRe)
-
Difusión (3) Donde:
K = 1 + 2 Do/Df (18)
Do/Df = 2.24 (2 – lnRe) D 1/3
(19)
VDf
D = C K T (20) 3Dp
K constante de Boltzman (1.38x10-16 erg/°K)T temperatura absoluta
-
-
Relación entre la eficiencia total () y las eficiencias de una sola fibra (0)
0 = 1 + 2 + 3 (21)
Para un filtro real, la eficiencia se define:
= (1 – ) Df ln 1 (22)
4 L 1 - 0 Eficiencia de colección de una sola fibra
cuya fracción volumétrica es
Eficiencia total de recolección de un filtro
-
-
-
Relación entre la eficiencia total () y las eficiencias de una sola fibra (0)
Experimentalmente se ha encontrado:
= (1 – 4.5 ) 0 (23)
Para: 0 < < 0.1
-
4.3.2. Diseño de filtros
La penetración de microorganismos en un filtro es de naturaleza logarítmica:
dN = – K’ N (24) dL
ln N = -K’ L (25)
N0
4.3.2. Diseño de filtros
Donde:
N0 Número de microorganismos que entran al filtro
N Número de microorganismos que salen del filtroL Longitud del filtroK’ Constante de filtración
4.3.2. Diseño de filtros
K’ es función de: La velocidad del aire Densidad del filtro Tamaño de las fibras Tamaño y densidad del microorganismo
eliminado K’ se puede expresar en términos de la
profundidad del filtro, como la longitud para eliminar el 90% de N0, L90.
4.3.2. Diseño de filtros
ln N0 = 2.3 (L) (26)
N L90
ln N0 = 1.23 0 (1 + 4.5) L (27)
N (1 – ) Df
Criterio de diseño: N = 10-3