UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGIA Y
PARASITOLOGIA
Efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y
el crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”
TESIS
PARA OBTENER EL TITULO PROFESIONAL DE:
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
AUTORA: Br. MAYTE DORIS GALVAN LEON
ASESORA: Dra. BERTHA SOLEDAD SORIANO BERNILLA
TRUJILLO – PERÚ
2014
Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo
Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis.
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
QUE OTORGAN EL TITULO PROFESIONAL DE
BIÓLOGO – MICROBIÓLOGO
Dr. Orlando Velásquez Benites
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dra. Vilma Julia Méndez Gil
VICERRECTORA ACADÉMICA
Dr. Santiago Uceda Duclos
SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. José Mostacero León
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. William Zelada Estraver
SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Bertha Soriano Bernilla
DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE
MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA.
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO:
En cumplimiento a las disposiciones establecidas por el reglamento de Grados y Títulos
de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, presento a
vuestra consideración y claro discernimiento la presente Tesis titulada: Efecto in vitro
de Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento de Spinacia oleracea
“espinaca” para obtener el Título de Biólogo- Microbiólogo.
Trujillo, Mayo 2014
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MIEMBROS DEL JURADO
Ms.C. Juan Wilson Krugg
Presidente
Dra. Bertha Soriano Bernilla
Secretaria
Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza
Vocal
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APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que la
presente tesis ha cumplido con los requerimientos formales y fundamentos teóricos,
siendo aprobada por UNANIMIDAD
Ms.C. Juan Wilson Krugg
Presidente
Dra. Bertha Soriano Bernilla
Secretaria
Ms.C. Eduardo Muñoz Ganoza
Vocal
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DEL ASESOR
La que suscribe, Asesora de la presente tesis titulada: Efecto in vitro de
Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”
CERTIFICA:
Que la investigación ha sido ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por
la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en
conformidad con su correspondiente proyecto y que el informe ha sido redactado
acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo a Mayte Doris Galván León, continuar el trámite del
reglamento correspondiente.
Trujillo, Mayo del 2014
Dra. Bertha Soriano Bernilla
Asesora
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DEDICATORIA
Dedico este trabajo a mis padres,
por su apoyo, comprensión,
cariño demostrado en cada
momento de mi vida, la
culminación de este trabajo es mi
regalo para ellos
También quiero dedicar este
trabajo a mis dos únicos
hermanos que siempre me
apoyaron, demostrándome que
nunca estuve sola en la realización
de esta tesis.
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AGRADECIMIENTO
A mi asesora Dra. Bertha Soriano Bernilla por la confianza brindada, apoyo
incondicional, enseñanza y orientación durante el transcurso del proceso y ejecución de
la tesis.
A mis amigos que me brindaron su apoyo y entusiasmo durante, por brindarme
su compañía e incondicional amistad.
A mis profesores de la Escuela Académica Profesional Microbiología y
Parasitología, por su dedicación y entrega, por transmitir y enseñarme cuán valiosa es la
profesión que escogí.
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RESUMEN
Se evaluó el efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y el crecimiento
de Spinacia oleracea “espinaca”. Para lo cual se reactivó el cultivo de R. etli en agar
extracto de levadura manitol rojo de congo a 28ºC por 4 días. El efecto de R. etli sobre
la germinación de semillas de S. oleracea L. se realizó inoculando 100 uL de una
suspensión bacteriana de R. etli Rf 167-01 aproximada a 1,2x109 cel/mL a las semillas
y 100 uL de agua destilada estéril a las semillas que constituyeron el control; se dejó
germinar por 10 días, evaluando luego el porcentaje de germinación, longitud de
hipocotilo y radícula. El efecto sobre el crecimiento de las plántulas de S. oleracea L, se
realizó inoculando 1 mL de la suspensión de R. etli Rf-167-01 a una concentración de
1,2x109 cel/mL, a cada semilla germinada de S. oleracea L. y 1 mL de agua destilada
estéril a las semillas que constituyeron el control, posteriormente cada semilla
inoculada fue sembrada en cada pocillo del germinador que contenía tierra estéril. A
los 20 días de inoculación se evaluó la longitud de tallo, hoja, raíz, peso seco total, peso
seco de la parte aérea y peso seco de la parte radicular de las plántulas. Estos datos
obtenidos fueron procesados estadísticamente, obteniéndose sólo diferencia significativa
en el peso seco de la parte radicular en el tratamiento inoculado con R. etli Rf 167-01.
Según los resultados obtenidos se tiene que la bacteria de R. etli Rf-167-01 tiene un
efecto positivo sobre el crecimiento de la raíz de las plántulas de S. oleracea L
“espinaca”.
Palabras Clave: Rhizobium etli, Spinacia oleracea, inoculación
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ABSTRACT
The in vitro effect of Rhizobium etli on germination and growth of Spinacia
oleracea “spinach " was evaluated. For which the culture of R. etli was reactivated
yeast extract agar mannitol congo red at 28 ° C for 4 days . R. etli effect on germination
of seeds of S. oleracea L. was performed by inoculating 100 uL of a bacterial
suspension of R. etli Rf 167-01 approximately 1.2 x109 cells / ml to seed and 100 uL of
water sterile distilled seeds within the control ; allowed to germinate for 10 days, then
evaluating the germination percentage , radicle and hypocotyl length . The effect on
seedling growth of S. oleracea L , was made by inoculating 1 mL of the suspension of
R. etli Rf -167- 01 at a concentration of 1.2 x109 cells / mL , to each germinated seed of
S. oleracea L. and 1 mL of sterile distilled water to the seeds within the control , then
each inoculated seed was sown in each well containing sterile soil germinator . At 20
days of inoculation the length of stem, leaf , root, total dry weight , dry weight of shoot
and root dry weight of the seedlings was evaluated. These data were statistically
processed , yielding a significant difference in the dry weight of the root part in the
treatment inoculated with R. etli Rf 167-01 . According to the obtained results, the
bacterium of R. etli Rf -167 -01 has a positive effect on root growth of seedlings of
S. oleracea L " spinach " .
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INDICE
Pág.
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
QUE OTORGAN EL TÍTULO DE BIOLÓGO-MICROBIÓLOGO………..………….i
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS………………ii
PRESENTACIÓN………………………………………………………………………iii
MIEMBROS DEL JURADO.……………………………………………………..……iv
APROBACIÓN……………………………………………………………..…………...v
DEL ASESOR…………………………………………..………………………………vi
DEDICATORIA……………………………………………………………………......vii
AGRADECIMIENTO……………………………………………...………………….viii
RESUMEN……………………………………………………………...………………ix
ABSTRACT……………………………………………………………………………..x
INDICE GENERAL.……………………………………………………………………xi
I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………….1
II. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………..7
2.1. MATERIAL DE ESTUDIO………………………………………………...7
2.2. PROCEDIMIENTO………………………………………………………....7
2.2.1 Reactivación del cultivo bacteriano……………………………….....7
2.2.2 Determinación de la pureza del cultivo………………………….......7
2.2.3 Propagación del cultivo ……………………………………………..8
2.2.4 Preparación de la suspensión bacteriana de R. etli Rf 167-01……….8
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2.2.5 Tratamiento de las semillas de S. oleracea L.……………….………8
2.2.6 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la
germinación de semillas de S. oleracea L…………………………...8
2.2.7 Evaluación del efecto de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de
S. oleracea L…………………………………………………………9
2.2.8 Tratamiento del suelo………………………………………………..9
2.2.9 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el
crecimiento de semillas de S. oleracea L…………………………..10
2.2.10 Evaluación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el
crecimiento de plántulas de S. oleracea L………………………….10
2.2.11 Recolección de datos……………………………………………….10
2.2.12 Análisis de datos……………………………………………………11
III. RESULTADOS………………………………………………………………...12
IV. DISCUSIÓN……………………………………………………………………23
V. CONCLUSIONES ……………………………………………………………..28
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………....29
ANEXOS
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I. INTRODUCCIÓN
El suelo es uno de los recursos más utilizados en la agricultura para satisfacer las
necesidades de alimento de la población; además de su gran complejidad y debido a su
estructura, función y a la forma en que sus componentes biológicos y minerales se
organizan, el suelo presenta diferentes regiones funcionales. [1]
Actualmente es de gran
interés restaurar la microflora del suelo mediante estrategias que permitan mejorarlo en
relación a la productividad agrícola y de una manera no contaminante. Sin embargo, la
forma más común de incorporar nutrientes al suelo ha sido, en las últimas décadas, en
forma de fertilizantes químicos. [2]
Los fertilizantes son componentes esenciales en la agricultura moderna, no
obstante, el abuso en su utilización genera residuos que producen salinización,
problemas en el drenaje, compactación del suelo y disminución de la actividad
microbiana comprometida en la nutrición vegetal. Cada año se incrementa la cantidad
de fertilizantes aplicados debido a la menor eficiencia de adsorción en el suelo y
absorción por la planta, aumentando los costos de producción. Asimismo, se genera un
problema ambiental debido a la producción de gases tóxicos que se desprenden de los
fertilizantes como los óxidos de nitrógeno que dañan la capa de ozono. [3]
El uso indiscriminado de estos insumos inorgánicos ha alterado también los
constituyentes orgánicos y vivos del suelo, y con ello su equilibrio ecológico,
modificando principalmente las actividades metabólicas de las diferentes poblaciones
microbianas del agroecosistema.[2]
Debido al impacto negativo sobre el medio ambiente
y al alto precio en el mercado internacional que tienen los fertilizantes y pesticidas
químicos, los agricultores del mundo entero, especialmente los de países
subdesarrollados se interesan cada día más por la biofertilización de los cultivos con el
fin de mejorar el rendimiento.[2]
Como una alternativa a los fertilizantes químicos está la posibilidad de utilizar
bacterias del suelo, que como parte de su metabolismo incrementan la fertilidad y
benefician a las plantas.[3]
El suelo en un hábitat complejo donde un gran número de
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poblaciones microbianas interactúan con los diversos sustratos, estando muchas de estas
poblaciones asociadas a las raíces de las plantas en la zona rizosférica.[2]
En los
microambientes de esta zona están asentadas poblaciones microbianas asociadas a la
presencia de los exudados radicales y que participan en la formación de los
microagregados rizosféricos ricos en metabolitos microbianos principalmente del tipo
aminoácidos y polisacáridos.[2]
Todas aquellas bacterias que habitan en las raíces de las plantas y que influyen
sobre el crecimiento de éstas de manera positiva indirecta o directamente por cualquier
mecanismo, se denominan o refieren como rizobacterias promotoras del crecimiento
vegetal (PGPR) término propuesto por Kloepper .[4]
, al incrementar la disponibilidad de
nutrientes al producir sustancias biológicamente activas como hormonas
vegetales.[2,3,5,6]
La rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) son
bacterias benéficas que se presentan como una alternativa a los fertilizantes químicos y
plaguicidas. Estas poblaciones microbianas rizosféricas son capaces de ejercer efectos
específicos sobre el crecimiento vegetal como la producción de fitohormonas,
disolución y mineralización de los fosfatos, fijación asimbiótica del nitrógeno
atmosférico y producción de sideróforos y antibióticos. [2, 3,5]
Un amplio número de
géneros bacterianos están considerados dentro de esta clasificación: Agrobacterium,
Alcaligenes, Arthobacter, Erwinia, Flavobacterium, Hafnia, Kliebsiella, Serratia,
Xanthomonas, Azospirillum, Clostridium, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia,
Bacillus, Burkholderia, Bacillus, Rhizobium, Herbaspirillum, Enterobacter y
Azotobacter, Rhizobium entre otros. [7]
Según Kloepper las PGPR pueden ser: Bioprotectores (supresión de
enfermedades de plantas), Biofertilizantes (aumentar la capacidad de adquisición de
nutrientes) y Bioestimulantes (producción de fitohormonas).[4]
Posteriormente, Bashan
y Holguin propusieron una nueva clasificación para las PGPR, que incluye a todas las
bacterias benéficas teniendo en cuenta su papel particular, de tal forma, que el termino
se divide en PGPB (Plant growth promoting bacteria- bacterias promotoras del
crecimiento de las plantas) y biocontrol-PGPB (Biocontrol-plant growth promoting
bacteria-bacterias promotoras del crecimiento de las plantas con actividad de
biocontrol).[8]
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La competencia por nutrientes genera en la rizósfera interacciones microbianas
acordes al metabolismo de la planta debido a la liberación de sustancias difusantes,
secreciones, lisados, gases y mucilagos. El establecimiento de poblaciones competitivas
de microorganismos promotores del crecimiento de las plantas depende principalmente
de aspectos puntuales como la colonización rizosférica de la planta, dada por la
liberación de sus exudados radicales y la capacidad de respuesta genética y
quimioatrayente del microrganismo hacia la rizósfera.[2]
La conjunción de ambos
mecanismos de acción han dado como resultado la promoción evidente del crecimiento
en plantas; observándose un incremento en la emergencia, el vigor y el peso, un mayor
desarrollo en sistemas radiculares y un incremento hasta el 30% en la producción de
cultivos de interés comercial, tales como papa, rábano, trigo y soja.[9]
Dentro del grupo de rizobacterias promotoras del crecimiento en plantas (PGPR)
se incluyen a los rizobios. [10,11]
Estas bacterias se caracterizan por su habilidad de
facilitar directa o indirectamente el desarrollo de la raíz y del follaje de las plantas. La
estimulación indirecta del crecimiento de plantas incluye una variedad de mecanismos
por los cuales la bacteria inhibe la acción fúngica sobre el crecimiento y desarrollo de la
planta. [2,11]
En la estimulación directa se encuentra: la producción de promotores de
crecimiento vegetal, como auxina, giberelinas, etileno, ácido abscísico y citoquinas, [9]
pequeñas moléculas que afectan el desarrollo y crecimiento vegetal a muy bajas
concentraciones. Las auxinas son reguladores esenciales del crecimiento y desarrollo
vegetal. El ácido indol acético (AIA) es la auxina más estudiada debido a su clara
acción en la formación de dominios apicales, diferenciación vascular y en el desarrollo
de órganos. [12,13]
Varios géneros bacterianos han sido reportados como productores de
AIA, entre los cuales se pueden citar Azotobacter sp., Pseudomonas sp., Bacillus sp.,
Azospirillum sp. y Rhizobium sp. [14]
La capacidad PGPR de Rhizobium sp. ha sido estudiada por varias décadas, sin
embargo, en los últimos años este estudio ha sido intensificado, porque la agricultura
sustentable demanda mejorar la eficiencia de la fijación de nitrógeno a través de uso de
bacterias competitivas capaces de extender la ventaja de las simbiosis a otros cultivos
no leguminosas. [11, 15,16]
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Rizobacterias simbióticas como Rhizobium sp. u otras de vida libre han sido
empleadas extensivamente como biofertilizantes para mejorar la el crecimiento en
hortalizas como tomate (Lycopersicum esculentum), cebolla (Allium cepa L.) y maíz
(Zea mays L). [10,11]
Las asociaciones entre rizobios y plantas no leguminosas pueden
mejorar el crecimiento de las plantas, aunque no se ha demostrado que sea mediante la
fijación de nitrógeno, sino más bien con la capacidad de aumentar la disponibilidad de
nutrientes en el suelo, como el fósforo, mediante la producción de ácidos orgánicos
capaces de solubilizar los fosfatos que forman complejos insolubles con las bases del
suelo. Los ácidos orgánicos producidos por las bacterias promotoras del crecimiento
incrementan también la disponibilidad de micronutrientes como el hierro (Fe) en la zona
de la rizósfera. El hierro a su vez puede ser captado por sideróforos, moléculas
orgánicas secretadas por estas bacterias, con las que forman quelatos que pueden ser
asimilados por las plantas. [17,18]
Algunos investigadores reportaron efectos positivos en cultivos de alfalfa después
de la inoculación de sideróforos producidos por Pseudomonas, Rhizobium y
Azospirillum (bacterias cultivadas en condiciones limitantes de hierro) se inóculo en las
semillas de alfalfa incrementando su germinación así como el peso seco de la raíz y
tallo. [19]
En el 2006 autores como Graciano, aislaron 43 cepas de Azospirillum spp. y
50 cepas de Rhizobium spp. de la rizósfera, rizoplano, raíz estéril, tallo y semillas de
maíz, todos estos aislamientos sintetizaron diferentes proporciones de sustancias
reguladoras del crecimiento vegetal además se detectó la producción de sideróforos en
20 y 90% de las cepas estudiadas. [20]
Entre las plantas, las hortalizas constituyen un grupo de cultivos fundamentales de
la producción agrícola, representando un renglón importante desde los puntos de vista
tanto económico como social para muchos países, al jugar un papel importante en la
alimentación humana por su riqueza en vitaminas, ácidos orgánicos fácilmente
asimilables, sales minerales y aceites esenciales, lo que ha motivado el incremento
continuo de su producción a escala mundial. [2, 21,22]
Spinacia oleracea “espinaca” es uno de los cultivos hortícolas más importantes.
[23] Es una hortaliza perteneciente a la familia Chenopodiaceae, originaria del centro de
Asia, donde se ha cultivado por más de 1300 años. [24, 25,26]
Tiene un alto valor
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nutricional debido a sus valores de Fe y vitamina A, así como una elevada actividad
antioxidante, por su contenido en ácido ascórbico, tocoferol, carotenoides y diversos
compuestos fenólicos. [24,25]
En el Perú, la producción de espinaca está en crecimiento, tanto en superficie
como en productividad con un rendimiento promedio anual de 18 561 t/ha. [23]
Uno de
los principales limitantes de su produccion son las plagas y enfermedades, entre las
cuales se reportan : mildeo velloso (Peronospora farinosa), Cladesporium sp.,
Phythium sp. y Alternaria sp. El mildiu o “cenicera” (Peronospora farinosa) es la
principal enfermedad que afecta la espinaca, debido a las condiciones climáticas que
favorecen su desarrollo y a que este patógeno puede sobrevivir en suelo y en semillas
por largo tiempo. [27]
Pese a su importancia, son escasas las investigaciones en este cultivo, debido a
que se siembra en rotación con cultivos de más largo periodo y se cultiva en pequeñas
áreas. Por su rápido crecimiento y ser un cultivo de hoja, la producción es muy
dependiente de fertilización nitrogenada o aplicación de estiércol antes de la siembra,
factores que pueden ser limitantes en cuanto a costo y disponibilidad. [25]
Si bien podría mejorarse la producción usando la fertilización química; en la
actualidad el mercado internacional muestra una tendencia a dejarlos de lado.
Recientemente, se encontró que, el uso de biofertilizantes es un medio barato para
suministrar a las plantas nitrógeno y fósforo durante el crecimiento, y así sustituir en
parte la costosa aplicación de fertilizantes químicos conduciendo a la significativa
disminución de los costos de producción. [28]
El uso de biofertilizantes y bioestimulantes
ha mejorado la comprensión de la relación planta microorganismo en su contribución a
minimizar los riesgos de degradación de suelos y a maximizar el regreso de energía a
los sistemas de producción. Estas consideraciones han tomado importancia en los
últimos años para establecer las fronteras a la agricultura, no solo desde el punto de
vista de lograr una máxima producción sostenida, sino buscando la estabilización de los
sistemas de producción a largo plazo. [29]
Actualmente existen muchas publicaciones del
uso de estos microorganismos en cultivos como el tomate, arroz, lechuga, maíz entre
otros. [30]
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La cuarta región con la mayor producción de espinaca es La Libertad, siendo su
producción anual de espinaca de 901 toneladas.[31]
En comparación con otros cultivos
sembrados en esta región, la producción de espinaca es menor, debido a que esta
hortaliza es una especie exigente en cuanto a calidad de suelo y nutrientes, requiriendo
cantidades elevadas de nitrógeno y fósforo, los cuales son suministrados a través de
fertilizantes químicos suponiendo de esta manera un gran costo para la economía de los
agricultores y produciendo consecuencias negativas en el ambiente que repercute sobre
todo en la degradación de los suelos de cultivo de esta hortaliza. En la última década ha
tomado auge, tanto por razones económicas como ecológicas, el empleo de los
biofertilizantes en la producción agrícola de la espinaca, sin embargo en la región los
estudios relacionados con la aplicación de biofertilizantes para este cultivo son escasos.
Numerosos reportes han descrito la asociación benéfica entre plantas y rizobios,
en las que aplicados a la semilla, al suelo o a la planta, colonizan la raíz, la rizósfera o
ambos, promueven el crecimiento de las plantas e incrementan la absorción y
disponibilidad de nutrientes del suelo, estos microorganismos pueden ser empleados
como biofertilizantes en cultivos. Se ha reportado que ciertas cepas de Rhizobium
inoculadas en plántulas de hortalizas como el tomate y la lechuga aumentaron su
germinación y crecimiento debido a la producción de hormonas que promueven el
desarrollo radical o vegetativo [6,11]
, sin embargo el efecto de cepas Rhizobium para
promover la germinación y el crecimiento de plantas no leguminosas como S. oleracea
“espinaca” no es aun conocida.
En una búsqueda de estrategias enmarcadas en el manejo sostenible de rubros
hortícolas, se pretende utilizar a especies del género Rhizobium, a fin de que este
microorganismo sea utilizado como fertilizante biológico en el cultivo de esta hortaliza;
por ello y según los antecedentes que se presentan, el presente trabajo tiene como
objetivo determinar el efecto in vitro de Rhizobium etli sobre la germinación y el
crecimiento de Spinacia oleracea “espinaca”; evaluando los parámetros agronómicos:
porcentaje de germinación, así como longitud de hipocotilo y radícula a los 10 días
después de inoculadas las semillas; la longitud de tallo, hoja, raíz, peso seco total, aéreo
y radicular de las plántulas a los 20 días después de inoculadas; contribuyendo de esta
manera en mejorar su rendimiento, y producción en la región.
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II. MATERIAL Y MÉTODOS
2.1. MATERIAL DE ESTUDIO
2.1.1 R. etli Rf-167-01 aislado a partir de nódulos de leguminosas de la región
Norte del Perú, procedente del Laboratorio de Microbiología
Ambiental, Departamento Académico de Microbiología y Parasitología,
Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional de Trujillo.
2.1.2 Semillas de Spinacia oleracea L. “espinaca” HORTUS S.A. obtenidas en
la Agropecuaria Chimú S.R.L. ubicado en Av. César Vallejo 220,
Trujillo.
2.2. PROCEDIMIENTO
2.2.1. Reactivación del cultivo bacteriano
A partir de un cultivo puro de R. etli Rf 167-01 se sembró por la
técnica de estría en placas Petri que contenían 15 ml de agar extracto de
levadura manitol rojo de congo (ELMARC) y se incubó a 28º C durante
4 días (Anexo 01).
2.2.2. Determinación de la pureza del cultivo
Se determinó la pureza a partir de una colonia aislada de R. etli Rf
167-01 la cual se sembró por la técnica de estría en frascos de penicilina
que contenían 5 ml de los siguientes medios: agar peptona glucosa-
púrpura de bromocresol (PG-PBC), se utilizó para diferenciarlos de los
contaminantes (Anexo 02); agar extracto de levadura lactosa (LLA).
Después de sembrada la colonia se incubó a 28º C durante 4 días. Al
medio LLA se le añadió el reactivo de Benedict (Anexo 03).
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2.2.3. Propagación del cultivo
A partir del cultivo puro de R. etli Rf 167-01 se procedió a la
propagación en frascos planos de vidrio conteniendo Agar ELMA y se
incubó a 28°C, respectivamente, durante tres días
2.2.4. Preparación de la suspensión bacteriana de R. etli Rf-167-01
A partir de los frascos de propagación de la bacteria se realizó una
suspensión de R. etli Rf-167-01 en un volumen de 60 mL y a una
concentración aproximada de 1,2x109
cel/mL, comparado con el tubo N°
04 del sistema de Mac Farland (Anexo 04). Se sembró al mismo tiempo
por incorporación en Agar ELMARC para recuento inicial de UFC/mL.
2.2.5. Tratamiento de las semillas de S. oleracea L.
Las semillas se lavaron dos veces con agua corriente para eliminar las
impurezas presentes en su superficie. Luego, se sumergieron en alcohol
al 70% durante 30 segundos, se lavó las semillas tres veces con agua
destilada estéril, se desinfectó con hipoclorito de sodio al 2.25% durante
3 minutos y luego se lavaron cinco veces consecutivas con agua destilada
estéril.
2.2.6. Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la
germinación de semillas de S. oleracea L.
En una placa petri se colocó una capa de algodón recubierta con
papel de filtro estéril y se agregó 5 mL de Agua destilada estéril (ADE).
En la placa se colocó 10 semillas de S. oleracea L, se inoculó 100 uL de
suspensión de R. etli Rf 167-01 por semilla, la placa se tapó y se dejó a
temperatura ambiente, constituyendo el grupo experimental.
Simultáneamente se instaló un grupo control al cual se agregó ADE a las
semillas. Se realizó tres repeticiones por cada grupo y se emplearon tres
placas petri por repetición. Se realizó observaciones diarias y se tomó
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mediciones a partir de la aparición visible de la radícula durante 10 días
(Anexo 05).
2.2.7 Evaluación del efecto de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de
S. oleracea L.
La evaluación del efecto de R. etli Rf-167-01 sobre la germinación
de semillas de S. oleracea L. se realizó teniendo en cuenta:
Criterio de germinación : la aparición visible de la radícula
(2 mm de longitud).[31]
Porcentaje de germinación (Anexo 06).
Se tomó medida tanto del hipocotilo como de la radícula
(Anexo 07, Anexo 08).
2.2.8 Tratamiento del suelo
2.2.8.1 Evaluación de los parámetros físicos - químicos del suelo.
Se determinó los parámetros físicos y químicos del suelo como:
textura, pH, conductividad eléctrica, materia orgánica, concentración de
nitrógeno, fósforo y potasio en Laboratorio de Servicios a la Comunidad
e Investigación (LASACI), Universidad Nacional de Trujillo (Anexo 09).
2.2.8.2 Preparación del suelo para la siembra de semillas.
El suelo utilizado para la siembra de las semillas en un
volumen aproximado de 8 kg, se tamizó y esterilizó en autoclave por 45
minutos. Luego se distribuyó en los recipientes para los diferentes
tratamientos de estudio.
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2.2.9 Determinación del efecto in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre el
crecimiento de S. oleracea L.
2.2.9.1 Inoculación de la suspensión bacteriana en S. oleracea L.
La inoculación de los tratamientos se realizó de la
siguiente manera (Anexo 10):
Tratamiento 1: Control, se inoculó 1 mL de agua destilada
estéril a cada semilla germinada de S. oleracea L.
Tratamiento 2: Se inoculó 1 mL de la suspensión de R. etli Rf-
167-01 a una concentración de 1,2x109 cel/mL, a cada semilla
germinada de S. oleracea L.
2.2.9.2 Siembra de las semillas de S. oleracea L. en el suelo.
Las semillas se sembraron en los recipientes con suelo
agrícola estéril a una profundidad de 0.5 cm y a razón de 1
semilla por pocillo. Se regó con solución de Jensen stock 1/5 y
ADE.
2.2.10 Evaluación del efecto in vitro R. etli Rf 167-01 sobre el crecimiento de
plántulas S. oleracea L.
La evaluación del efecto de R. etli Rf-167-01 sobre las plántulas de
S. oleracea L. se determinó mediante la evaluación de variables
agronómicas: longitud de las hojas, tallo, raíz así como el peso de la
materia seca de la parte aérea, radicular y total de la plántula (Anexo 11).
2.2.11 Recolección de datos
A los 20 días de la inoculación bacteriana se cosecharon las
plántulas de S. oleracea L. y se procedió a la recolección de datos de
cada una de las variables agronómicas descritas anteriormente. Las
plántulas fueron lavadas con agua corriente para eliminar los restos del
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suelo presentes en las raíces, se midió la longitud del tallo y de las hojas
(Anexo 12 - 14).Posteriormente, la parte aérea fue separada de la raíz
para ser secadas en el horno a 60ºC por 48 h y se determinó el peso seco
en una balanza analítica (Anexo 15-17). Los valores obtenidos de la
evaluación se organizaron en tablas y figuras.
2.2.12. Análisis de datos
Los datos obtenidos de la evaluación de la germinación de
semillas y de los parámetros agronómicos evaluados en las plántulas de
los tratamientos control y experimental se procesaron mediante la prueba
de Análisis de Varianza Unidireccional (ANOVA) para determinar las
diferencias significativas entre los tratamientos (Anexo 18 - 22).
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III. RESULTADOS
En la figura 1 se muestra el porcentaje de germinación de las semillas de
S. oleracea L. a los 10 días de la inoculación bacteriana in vitro con Rhizobium etli Rf
167-01, donde se aprecia un mayor porcentaje de germinación el inoculado con R. etli
Rf 167-01 en relación al control.
En la figura 2 se muestra la longitud promedio de hipocotilo de semillas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro y
donde se observa una mayor longitud en la inoculación con la bacteria en comparación
al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
En la figura 3 se muestra la longitud promedio de radícula de semillas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro y
donde se observa una mayor longitud radicular en el inoculado con la bacteria en
comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
En la figura 4 se muestra el promedio de la longitud de tallo de plántulas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01
in vitro, donde se observa una mayor longitud en el inoculado con la bacteria en
comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
En la figura 5 se muestra el promedio de la longitud de hojas de las plántulas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01
in vitro, donde se observa una mayor longitud en el inoculado con la bacteria en
comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
En la figura 6 se muestra el promedio de la longitud de la raíz de las plántulas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01
in vitro, donde se observa una mayor longitud en el inoculado con la bacteria en
comparación al control, no existiendo diferencia significativa entre ambos.
En la figura 7 se muestra el promedio de peso seco total de las plántulas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01
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in vitro, donde se observa un mayor peso en el inoculado con la bacteria en
comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
En la figura 8 se muestra el promedio de peso seco de la parte radicular de las
plántulas de S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con
R. etli Rf 167-01 in vitro, donde se observa un mayor peso seco radicular en el
inoculado con la bacteria en comparación al control, existiendo diferencia significativa
entre ambos.
En la figura 9 se muestra el promedio de peso seco de la parte aérea de las
plántulas de S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli
Rf 167-01 in vitro, donde se observa un mayor peso seco aéreo en el inoculado con la
bacteria en comparación al control, pero no existe diferencia significativa entre ambos.
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Figura 1. Porcentaje de germinación de S. oleracea L. “espinaca” después de
inoculados con R. etli Rf 167-01 in vitro.
0.0%
10.0%
20.0%
30.0%
40.0%
50.0%
60.0%
70.0%
80.0%
90.0%
100.0%
Control R. etli
78.00% 84%
Po
rce
nta
je d
e g
erm
inac
ion
(%
)
p>0,05
Control
R. etli
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15
15.5
16
16.5
17
17.5
18
18.5
19
Control R.etli
16.81
18.53
Lon
gitu
d h
ipo
coti
lo(m
m)
p>0,05
Control
R.etli
Figura 2. Longitud promedio de hipocotilo (mm) de S. oleracea L. “espinaca” a los
10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro.
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Figura 3. Longitud promedio de la radícula (mm) de S. oleracea L. “espinaca” a los
10 días de inoculación con R. etli Rf 167-01 in vitro.
20.5
21
21.5
22
22.5
23
23.5
Control R. etli
21.68
23.19
Lon
gitu
d r
adic
ula
(mm
)
p>0,05
Control
R. etli
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Figura 4. Promedio de la longitud de tallo (mm) de plántulas de S. oleracea L.
“espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in
vitro.
47
48
49
50
51
52
53
54
55
CONTROL R. etli
49.9
54.85
Lon
gitu
d d
e t
allo
(mm
)
p>0,05
CONTROL
R. etli
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Figura 5. Promedio de la longitud de hojas (mm) de plántulas de S. oleracea L.
“espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in
vitro.
28.6
28.7
28.8
28.9
29
29.1
29.2
29.3
29.4
29.5
CONTROL R. etli
28.9
29.45
Lon
gitu
d d
e h
oja
(mm
)
p>0,05
CONTROL
R. etli
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Figura 6. Promedio de la longitud de raíz (mm) de plántulas de S. oleracea L.
“espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in
vitro.
.
18
19
20
21
22
23
24
25
CONTROL R. etli
20.19
24.04
Lon
gitu
d d
e r
aiz(
mm
)
p>0,05
CONTROL
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Figura 7. Promedio del peso seco total (mg) de las plántulas de S. oleracea L.
“espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in
vitro.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
control R.etli
3.56
4.61
Pe
so s
eco
to
tal(
mg)
p>0,05
control
R.etli
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Figura 8. Promedio del peso seco (mg) de la parte radicular de las plántulas de
S. oleracea L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli
Rf 167-01 in vitro.
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
CONTROL R. etli
0.75
1.04
Pe
so s
eco
rai
z(m
g)
p<0,05
CONTROL
R. etli
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Figura 9. Promedio del peso seco (mg) de la parte aérea de las plántulas de S. oleracea
L. “espinaca” a los 20 días después de la inoculación con R. etli Rf 167-01 in
vitro.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
CONTROL R. etli
2.9
3.6
Pe
so s
eco
ae
reo
(m
g)
p>0,05
CONTROL
R. etli
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IV. DISCUSIÓN
En la actualidad, la agricultura, plantea reducir la utilización de fertilización
química sobre la hortaliza S. oleracea, mediante el uso de microorganismos
competitivos, capaces de ser usados como biofertilizantes promotores de crecimiento de
estas plantas. Se ha demostrado que cepas de Rhizobium pueden estimular la
germinación de semillas y promover el crecimiento de hortalizas como el tomate,
lechuga, cebolla. [6, 10,11]
Dado que un buen crecimiento y desarrollo de la planta se encuentra
influenciado por la capacidad de la semilla de poder germinar y alcanzar un buen
desarrollo de raíces en sus primeras etapas de vida; en este trabajo se determinó el
efecto de la inoculación in vitro de R. etli Rf 167-01 sobre la germinación de semillas de
S. oleracea; al evaluar su porcentaje de germinación, longitud de su hipocotilo y
radícula respectivamente (Fig. 1, 2 y 3)., no existiendo diferencia significativas (p>0,05)
en la evaluación de las variables mencionadas anteriormente (Anexo 18, 19 y 20). Estos
resultados darían a entender que la actividad de la bacteria R. etli Rf 167-01 dependería
de la quimiotaxis generada por las sustancias excretadas por las raíces de S. oleracea, es
decir la bacteria dependería de la presencia de la raíz de la plántula para poner
interactuar ; dado que la actividad de los microorganismos promotores de crecimiento
vegetal como Rhizobium se inicia con mecanismos de quimiotaxis que están
relacionados con la presencia de flagelos, quimiorreceptores y sistemas de regulación
codificados genéticamente. Estos factores tienen gran importancia sobre la habilidad de
colonizar la rizósfera y mantener la comunicación entre las células de la raíz. Las
bacterias capaces de interactuar con las raíces de las plantas son atraídas por sustancias
excretadas por la raíz, que ocasionan el movimiento de la bacteria hacia el rizoplano de
la planta y de esta forma dar inicio a una relación de beneficie mutuo. [32,33]
Se bien no existe una diferencia significativa en relación al porcentaje de
germinación de las semillas de S. oleracea, se pudo observar una tendencia positiva en
la germinación dando un porcentaje superior al 80% en las semillas inoculadas con R.
etli Rf 167-01 en comparación al control (Fig. 1). Este aumento en el porcentaje de
germinación corrobora lo encontrado por diversos autores con relación al empleo del
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género Rhizobium en la germinación de especies no leguminosas, como lo es en el caso
de Gholami quien encontró que la inoculación de semillas con Rhizobium aumentó la
germinación y el vigor de las plántulas de maíz, sin embargo, la tasa de mejora varió de
acuerdo a la cepa bacteriana usada [34]
; estudios como los realizados por Díaz en donde
al evaluar el efecto de 30 cepas bacterianas en la germinación y el crecimiento de
lechuga (L. sativa), obtuvo un incremento en la germinación del 36.5% con respecto al
control sin inocular,[35]
Ogata también encontró que la cepa rP2N3, perteneciente al
género Rhizobium, incrementó el porcentaje de germinación de tara y alfalfa de las
semillas evaluadas en contraste al control sin inocular. [36]
En la evaluación sobre el crecimiento de plántulas de S. oleracea al inocular con
R. etli Rf 167 -01, los resultados obtenidos de los parámetros agronométricos: longitud
de tallo, hoja, raíz, peso seco total y aéreo de las plántulas de S. oleracea (Fig. 4, 5 , 6, 7
y 9), no demostraron que exista diferencias estadísticamente significativas comparadas
con el control sin inocular (Anexo 21,22), esto podría deberse a que la acción de las
cepas de Rhizobium en plantas no leguminosas esta relacionado con la producción de
sustancias promotoras del crecimiento vegetal que activan varias repuestas en la célula
vegetal, a nivel bioquímico, fisiológico y morfológico[32]
, sin embargo las asociaciones
entre rizobios y plantas no leguminosas a pesar que pueden mejorar el crecimiento de
las plántulas no se ha demostrado que sea mediante la fijación de nitrógeno[11]
;
S. oleracea “espinaca” es una de las especies hortícolas más exigentes en nitrógeno,
tanto para suplir sus necesidades bioquímicas, como para la obtención de una buena
calidad, contenidos altos de nitrógeno incrementan las tasas de división y diferenciación
celular y la actividad fotosintética, esto se traduce en mayor biomasa vegetativa o
reproductiva en los cultivos por una alta eficiencia en la intercepción y conversión de la
radiación, se ha demostrado que altas dosis de nitrógeno repercute en un mayor
desarrollo de área foliar, altura del tallo, raíz, acumulación de masa seca de hojas y total
de la planta[37]
.
Se considera además que el terreno de cultivo de la espinaca debe ser fértil, rico
en materia orgánica , nitrógeno, fosforo y potasio; según el análisis realizado en el suelo
utilizado en la presente investigación (Anexo 9); este poseía bajos niveles de nitrógeno,
cantidad moderada de materia orgánica , niveles normales de fósforo y potasio;
encontrándose estos valores por debajo de los requerimientos óptimos de los suelos de
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cultivo de esta hortaliza que son de 1.6% a 4.5% de nitrógeno, 5 ppm a 15 ppm de
fósforo y 300 ppm a 500 ppm de potasio [38]
. Todo esto, sumado al escaso contenido
inicial de nitrógeno en el suelo así como el que la bacteria R. etli no tiene como
mecanismo de acción la producción de nitrógeno en especies no leguminosas
necesarias para esta hortaliza, podrían ser motivo de que los resultados obtenidos no
sean estadísticamente significativos en las plántulas de S. oleracea inoculadas con
R. etli Rf 167-01.
Si bien no se ha demostrado que R. etli ejerza un efecto estimulante y significativo
sobre el crecimiento de esta hortaliza, se ha reportado investigaciones en donde la
aplicación de cepas de Rhizobium a plantas de cebada y maíz, tienen solo un efecto
positivo y significativo principalmente sobre el crecimiento y el desarrollo de la raíz,
debido a que la principal fitohormona producida es el AIA, la cual interviene en el
desarrollo de la parte radicular, produciendo de este modo un crecimiento en la raíz de
las plantas. [10, 15, 39,40]
En la Figura 8 se evidencia un efecto positivo y significativo de R. etli Rf 167-
01 en el peso seco de la raíz de las plántulas de S. oleracea a comparación del control
sin inocular, esto evidenciaría la capacidad de la bacteria de ejercer un efecto promotor
sobre el crecimiento radicular de las plántulas. Wang et al., reportó algunas evidencias
directas de la colonización de raíces y la actividad PGPR de Rhizobium con no
leguminosas, en donde existen diversos mecanismos directos o indirectos. [41]
En cuanto
a los mecanismos directos realizados por Rhizobium se encuentra la producción de
fitohormonas como las auxinas, citosinas, giberelinas y la enzima 1-aminociclopropano-
1-acido carboxílico (ACC) - desaminasa que cumplen propiedades de regulación y
crecimiento de las plántulas. [40,42,43]
La auxina producida mayormente es el ácido indo
acético (AIA) el cual se sintetiza a partir del triptófano en el meristemo apical y en las
hojas jóvenes de donde se transporta a través del floema al resto de los tejidos vegetales,
el AIA producido por las rizobacterias es el principal metabolito que induce el
crecimiento radicular de las plántulas , al aumentar la división celular y la
diferenciación de los tejidos provocando en primera instancia un alargamiento y
posteriormente su engrosamiento, efectos que se ven reflejados en un mayor contenido
de biomasa. [44]
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Según Tsavkelova et al. los más eficientes productores de auxinas son las
bacterias habitantes de la rizósfera de las plantas. El AIA producido por las bacterias
representa una capacidad PGPR importante ya que beneficia a la planta contribuyendo
con el crecimiento radicular, sin embargo el efecto de ésta sobre la planta depende de
su concentración y el tipo de cultivo en el que éste se evalúe. Existen investigaciones
donde se reporta a las bacterias del género Rhizobium como
Productoras de ácido indol acético (AIA), una de las auxinas más estudiadas hasta el
momento. [13]
El AIA absorbido por las raíces de las plantas también podría estimular la
actividad de la enzima ACC sintasa, la cual está involucrada en la síntesis del etileno.
Se ha encontrado que bajas concentraciones de etileno promueven el crecimiento de los
pelos radicales de las plantas, y así aumentan el área superficial de la raíz para una
mayor absorción de nutrientes. Las bacterias promotoras del crecimiento evitan las altas
concentraciones de etileno, las cuales tienen efectos inhibitorios en el desarrollo de las
plantas. [44]
Las rizobacterias productoras de AIA frecuentemente poseen la enzima 1-
aminociclopropano-1-acido carboxílico (ACC)-desaminasa, la cual degrada al ACC,
precursor del etileno. El Etileno es una hormona vegetal producida bajo estrés, que en
altas concentraciones inhibe el crecimiento vegetal. Se ha reportado que la reducción en
los niveles de etileno por acción de las rizobacterias promotoras del crecimiento, podría
resultar en un mayor desarrollo de las raíces de las plantas inoculadas, dado y que al
disminuir el ACC de la raíz, no se produce suficiente etileno para detener el crecimiento
de esta y su engrosamiento como lo observado en esta investigación. [45,46]
Los resultados obtenidos corroboran a otros autores en donde la inoculación de
Rhizobium en plantas no leguminosas incrementan la materia seca de la raíz [37, 38,40]
, así
como lo obtenido en esta investigación en donde la inoculación de R. etli Rf 167 - 01
en plántulas de S. oleracea L “espinaca” estimula el desarrollo de la raíz dando lugar a
un mayor incremento de la materia seca de la parte radicular de las plántulas. Teniendo
en cuenta entonces las capacidades de R. etli Rf 167 - 01 sobre el peso seco de la raíz
de plántulas de S. oleracea en esta investigación; sería recomendable futuras
investigaciones en las que, considerando la capacidad productora de AIA que posee
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Rhizobium se realice una interacción entre bacterias de este género con especies
fijadoras de nitrógeno asimbióticamente como Azotobacter [39]
, de las cuales se ha
demostrado su acción promotora sobre el crecimiento de hortalizas en diferentes
investigaciones[45]
; y de esta manera poder disminuir la cantidad de fertilizantes
aplicados al suelo del cultivo , mejorando así las practicas agrícolas cotidianas.
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V. CONCLUSIONES
Según los resultados obtenidos se concluye que:
La inoculación de R. etli Rf-167-01 in vitro sobre la germinación de S. oleracea
“espinaca”, no tiene efecto estimulante y significativo al evaluar el porcentaje de
germinación, longitud de radícula e hipocotilo, a los 10 días después de su inoculación.
La inoculación R. etli Rf-167-01 in vitro sobre el crecimiento de las plántulas de
S. oleracea “espinaca”, no tiene efecto estimulante y significativo al evaluar longitud de
tallo, hoja, raíz, peso seco total y peso seco aéreo de las plántulas a los 20 días después
de su inoculación.
La inoculación R. etli Rf-167-01 in vitro tiene un efecto estimulante y
significativo sobre el peso seco radicular de las plántulas de S. oleracea “espinaca”
evaluadas a los 20 días después de su inoculación.
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Anexo 01. Morfología de R. etli Rf 167-01. A: Observación macroscópica de colonias
de R. etli. B: Observación microscópica de bacterias R. etli coloreadas con
Gram (1000 X).
A
B
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Anexo 02. R. etli Rf 167-01 en medio de control de pureza A. Medio Peptona-Glucosa-
Púrpura de Bromocresol (Ausencia de crecimiento); B. Agar Extracto de
Levadura Lactosa (Presencia de crecimiento).
A B
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Anexo 03. Composición de los medios utilizados para el aislamiento, purificación,
caracterización bioquímica y fisiológica y de los reactivos de lectura para
los cultivos aislados.
AGAR EXTRACTO DE LEVADURA ROJO DE CONGO
(ELMARC)
Manitol 10.0g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4.7H2O 0.2g
NaCl 0.1g
Extracto de levadura 0.4g
Agar – agar 15.0g
Agua destilada 1000 mL
Rojo de Congo 10 gotas
pH 6.8± 0.2 a 25°C
AGAR PEPTONA-GLUCOSA-PURPURA DE BROMOCRESOL
(PG-PBC)
Glucosa 10.0 g
Peptona 0.5 g
Agar-Agar 15.0 g
Agua destilada 1000 mL
*Solución Stock de Púrpura de Bromocresol 10.0 mL
*Solución Stock de Púrpura de Bromocresol: Disolver 1 g del indicador en
100 mL de etanol al 70%.
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AGAR EXTRACTO DE LEVADURA LACTOSA (LLA)
Lactosa 1.0g
K2HPO4 0.5 g
MgSO4.7H2O 0.1g
NaCl 0.2g
Extracto de levadura 0.5g
Agar – agar 15.0g
Agua destilada 1000.0g
pH 6.8± 0.2 a 25°C.
REACTIVO DE BENEDICT
Solución A Solución B
Citrato de sodio 17.3 g Sulfato de cobre 17.3 g
Carbonato de sodio 10.0 g Agua destilada 10.0 mL
Agua destilada 60.0 mL
Uso: Como reactivo de lectura en el medio LLA, para evidenciar la formación
de la enzima cetolactasa.
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Anexo 04. Suspensión de R. etli Rf- 167 – 01 a una concentración aproximada de
1,2 x109
ufc/ml, comparado con el tubo Nº 04 del sistema de MacFarland
(A) y por recuento en placa en agar ELMARC (3,4 x109 ufc/ml).
A B
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Anexo 05. Promedio del porcentaje de germinación de semillas de S. oleracea
inoculadas con R. etli Rf 167-01 (Tratamiento) y sin inocular ( control).
ENSAYOS (%)
E- 1 E-2 E-3 PROMEDIO
CONTROL 78.12 78.00 78.83 78.31
TRATAMIENTO 86.00 83.63 83.71 84.45
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OMUNICACIÓ
N
Anexo 06. Crecimiento de la radícula e hipocotilo de las semillas de S. oleracea L
inoculadas con R. etli Rf 167-01 (Tratamiento) y sin inocular (control) a los
diez días. (A) Primer ensayo (B) Segundo y Tercer ensayo
A
B
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Anexo 07. Longitud de hipocotilo de semillas de S. oleracea L inoculadas con R. etli
Rf 167-01 y sin inocular (control) a los diez días.
HIPOCOTILO (mm)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 17,2 16,6 16,7 16,81
Rhizobium etli 21,48 16,2 17,93 18,54
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Anexo 08. Longitud de radícula de semillas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf
167-01 y sin inocular a los diez días.
RADICULA (mm)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 21,61 21,58 21,85 21,68
Rhizobium etli 26,98 19,3 23,3 23,19
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Anexo 09. Características físicas y químicas de suelo agrícola obtenido del distrito
Moche - La Libertad: Laboratorio de Servicios a la Comunidad e
Investigación (LASACI), Universidad Nacional de Trujillo.
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Anexo 10. Inoculación de semillas de S. oleracea con R. etli Rf 167-01(A:
Tratamiento) y sin inocular (Control) para su evaluación a los 20 días.
A
B
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Anexo 11. Plántulas de S. oleracea a los 20 días después de la inoculación con R. etli
Rf 167-01 y sin inocular (control)
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Anexo 12. Longitud del tallo de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf
167-01 y sin inocular a los 20 días.
TALLO (mm)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 52,0 49,80 47,79 49,90
Rhizobium etli 58,90 65,75 39,9 54,85
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Anexo 13. Longitud de hoja de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf
167-01 y sin inocular a los 20 días.
HOJA (mm)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 26,89 33,67 27,16 28,90
Rhizobium etli 25,57 40,25 22,53 29,45
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Anexo 14. Longitud de raíz de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf
167-01 y sin inocular a los 20 días.
RAIZ (mm)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 16,56 20,16 25,67 20,19
Rhizobium etli 19,76 25,70 26,67 24,04
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Anexo 15. Peso seco total de plántulas de S. oleracea L inoculadas con R. etli Rf 167-
01 y sin inocular a los 20 días.
PESO SECO TOTAL(mg)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 3.90 3.40 3.40 3.60
Rhizobium etli 5.00 4.60 4.30 4.60
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Anexo 16. Peso seco de la parte aérea de plántulas de S. oleracea L inoculadas con
R. etli Rf 167-01 y sin inocular a los 20 días.
PESO SECO PARTE AEREA(mg)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 3.00 2.90 2.70 2.90
Rhizobium etli 4.10 3.70 2.80 3.60
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Anexo 17. Peso seco de la parte radicular de plántulas de S. oleracea L inoculadas con
R. etli Rf 167-01 y sin inocular a los 20 días.
PESO SECO PARTE RADICULAR(mg)
ENSAYOS E1 E2 E3 Yi
Control 0.80 0.70 0.60 0.70
Rhizobium etli 0.80 0.90 1.40 1.00
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Anexo 18. Análisis de varianza del porcentaje de germinación de S. oleracea al décimo
día de inoculado con R. etli Rf 167-01.
tto Media N Desv. típ. Mínimo Máximo Varianza % de la suma
total
Sig
1,00 733,0000 1 . 733,00 733,00 . 71,0%
2,00 100,0000 1 ,00000 100,00 100,00 ,000 29,0% ,342
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Anexo 19. Análisis de varianza de longitud de hipocotilo de S. oleracea al décimo día
de inoculado con R. etli Rf 167-01.
ANOVA de un factor
Longitud hipocotilo
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 52,343 1 52,343 ,833 ,364
Intra-grupos 6915,887 110 62,872
Total 6968,230 111
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Anexo 20. Análisis de varianza de longitud de radícula de S. oleracea al décimo día de
inoculado con R. etli Rf 167-01.
ANOVA de un factor
Longitud radícula
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 40,449 1 40,449 ,272 ,603
Intra-grupos 16339,620 110 148,542
Total 16380,069 111
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Anexo 21. Análisis de varianza de longitud de tallo, longitud de hoja y longitud de raíz
de plántulas de S. oleracea de inoculado con R. etli Rf 167-01.
ANOVA de un factor
Longitud tallo
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 24,766 1 24,766 ,109 ,742
Intra-grupos 18622,222 82 227,100
Total 18646,988 83
ANOVA de un factor
Longitud hoja
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 62,004 1 62,004 ,825 ,366
Intra-grupos 6162,413 82 75,151
Total 6224,417 83
ANOVA de un factor
Longitud raíz
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 217,286 1 217,286 2,738 ,102
Intra-grupos 6506,667 82 79,350
Total 6723,952 83
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Anexo 22. Análisis de varianza de peso seco total, peso seco de la parte aérea y peso
seco de la parte radicular de plántulas de S. oleracea inoculado con R. etli
Rf 167-01.
ANOVA de un factor
Peso seco total
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos ,000 1 ,000 1,477 ,228
Intra-grupos ,001 82 ,000
Total ,001 83
ANOVA de un factor
Peso seco raíz
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos 116,036 1 116,036 4,521 ,036
Intra-grupos 2104,381 82 25,663
Total 2220,417 83
ANOVA de un factor
Peso seco aéreo
Suma de
cuadrados
gl Media
cuadrática
F Sig.
Inter-grupos ,000 1 ,000 ,553 ,459
Intra-grupos ,001 83 ,000
Total ,001 84
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