Download - Electricidad electroforesis ii
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MÓDULOMÓDULO III
ELECTRICIDAD Y ELECTRICIDAD Y ELECTROFORESISELECTROFORESIS
IIII
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• carga de la partícula (pH)carga de la partícula (pH)
•fuerza iónica del mediofuerza iónica del medio
•tamaño (radio) y forma de la partículatamaño (radio) y forma de la partícula
• viscosidad del medioviscosidad del medio
•temperaturatemperatura
Entonces, la movilidad electroforética depende de:Entonces, la movilidad electroforética depende de:
= v / E = q / kf
Repasemos:
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¿Qué ocurre con la movilidad electroforética si...
• se modifica la caída de potencial aplicada?se modifica la caída de potencial aplicada?
• se modifica la longitud del soporte?se modifica la longitud del soporte?
= v / E
• se modifica el tiempo de corrida?se modifica el tiempo de corrida?
= d . L / t . Vab
Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.
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¿Qué ocurrió con la movilidad electroforética a altos valores de diferencia de potencial?de potencial?
Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.
d
V
EFECTO JOULE
Q/tpo = k.V.i
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1
2
R
tiempo de corrida
Variación de la resistencia del soporte durante la corrida
• Papel
• Acetato de celulosa
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Voltaje constante vs Intensidad constante
Voltaje constante
V = R.i = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R i Q/t evaporación de solvente Fuerza iónica
Refrigerar
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Voltaje constante vs Intensidad constante
Intensidad constante
i = R/V = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R V Q/t pero como V :
= d . L / t . V
d debo t difusión resolución
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Equilibrio de disociación o ionización de un ácido débil en solución acuosa
HA H+ + A-
[H+] [A-]
KA=
[HA]
Constante de disociación
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Ecuación de Henderson Hasselbach
[A-]
pH = pKA + log
[HA]
Tomando el log negativo de ambos miembros y sustituyendo - log [H+] por pH y - log Ka por pKA y ordenando:
[H+] [A-]
KA=
[HA]
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Entonces...
COO
H3N – C – H
R
+
- COOH
H3N – C – H
R
+ COO
H2N – C – H
R
-
pH ácido Punto isoiónico alcalino
Forma iónica Catión Ión anfótero Anión
Migración Hacia el cátodo Nula Hacia el ánodo
Distancia Negativa Nula Positiva
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Variación de la movilidad electroforética con el pH del medio
+
-
+
- COO
H3N – C – H
R
COO
H2N – C – H
R
COOH
H3N – C – H
R
pH < pI pH = pI pH > pI
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Movilidad electroforética en función del pH
-25
-20-15
-10
-50
5
10
1520
25
0 5 10 15
pH
Mo
vili
da
d
ele
ctr
ofo
rética
curva corregida por efecto electroendosmóticocurva experimentalTestigo neutro
pI
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Se dispone de un aminoácido que posee los siguientes grupos ionizables:
COOH
H2N – C – H
R (NH2)
pKa = 2.0
pKa = 10.0
pKa = 12.0
a) Esquematice las estructuras predominantes a pH: 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14.
b) Calcule carga neta exacta a cada pH.
c) Estime el pI aproximado a partir de los pKa.
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Se desea determinar el pI de una proteína. Los datos experimentales obtenidos en las distintas corridas son:
pH intensidad (mA)
tiempo (minutos)
distancia recorrida por
la proteína (cm)
distancia recorrida por
el dextrano (cm)
2.0 4.0 20 - 7.0 0.0
4.0 4.0 25 - 4.0 0.0
6.0 7.0 40 - 1.0 - 0.5
8.0 3.0 25 2.0 - 1.0
10.0 3.0 30 5.0 - 2.0
Longitud de cada tira = 20.0 cm. Resistencia de cada tira = 105 .
a) Determine el campo eléctrico aplicado en cada corrida.b) Calcule las movilidades de la proteína a cada pH.c) Calcule pI de la proteína.
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Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
Neutros
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Neutros
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
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Ácidos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
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Básicos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
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Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: polipéptidos y proteínas
Son polímeros de aminoácidos unidos por uniones peptídicas
Polipéptidos: 10 -100 aminoácidos
Proteínas: más de 100 aminoácidos
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Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: ácidos nucleicos (ADN y ARN)
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Según su objetivo, la electroforesis puede ser:
• Preparativa:
AISLAMIENTO de las distintas fracciones (utiliza mayor cantidad de muestra)
• Analítica:
ANÁLISISde las bandas obtenidas (utiliza poca muestra)
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La electroforesis puede realizarse en forma:
• Vertical
• Horizontal
• Unidireccional
• Bidireccional
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Tipos de electroforesis de uso más frecuente en la actualidad
• Electroforesis en medio soporte:
- convencional
- SDS-PAGE: densidad de carga
uniforme separación de proteínas por pesos
moleculares
- isoelectronfoque: gradiente de pH
alta resolución
• Electroforesis capilar
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Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
1) Objetivo de la electroforesis: tipo de electroforesis.
2) Soporte y buffer de corrida.
3) Modo y lugar de siembra de la muestra.
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Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
4) Condiciones de corrida: voltaje (bajo, mediano o alto) e intensidad. Si se trabaja con voltajes medianos y altos debe refrigerarse la corrida para evitar el efecto Joule.
Puede trabajarse a voltaje o intensidad constante.
5) Tiempo de corrida
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Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
6) Revelado:
•colorantes
•inmunofijación
•enzimático
•transferencia a una membrana de nitrocelulosa y posterior revelado (inmunoblot) : Westernblot (proteínas), Southernblot (ADN), Northenblot (ARN)
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ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS LIBRELIBRE
1937
Tiselius
CROMATOGRAFÍA
Avance Tecnológico
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS EN SOPORTESEN SOPORTES
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CAPILARCAPILAR
2004
AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDADAUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD
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Electroforesis en aElectroforesis en acetato de celulosa
Proteinograma de suero
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SDS-PAGESDS-PAGE
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Isoelectroenfoque (IEF)Isoelectroenfoque (IEF)
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Electroforesis Electroforesis bidimensionalbidimensional
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Electroforesis Capilar
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Electroforesis Capilar
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Páginas a consultar:
1)http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro_Sim.html
2)http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java/electrophoresis/
3)http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html
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FIN