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Práctica 1:El Microscopio Óptico.Observación Microscópica de los Organismos
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Tipos de microscopiosTipos de microscopios
Microscopio óptico
Campo luminoso
Campo oscuro
Contraste de fases
Interferencia
Fluorescencia
Polarización
Microscopio electrónico
de Transmisión (TEM)
de Barrido (SEM)
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Microscopio de campo luminosoMicroscopio de campo luminoso
! El campo de observación se encuentra iluminado; los microorganismos aparecen más oscuros que el fondo debido a que absorben luz.
! Partes del microscopio óptico.
! Poder de resolución: capacidad de una lente para mostrar dos objetos muy cercanos como distintos, discretos y separados.
! Apertura Numérica (AN): expresión matemática que describe la forma en que la luz es concentrada por el condensador y captada por el objetivo. AN = n x sen θθθθ
■ n = índice de refracción del medio entre las lentes y la muestra (1.0 para el aire; 1.56 para el aceite de inmersión).
■ θ θ θ θ = ángulo formado por el eje óptico y los rayos de luz más externos que son captados por el objetivo
! Amplificación: La amplificación de un microscopio es el producto de número de aumentos del objetivo por los del ocular. Aumentos útiles: x1000 a x2000
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Microscopio de campo luminosoMicroscopio de campo luminoso
! Límite de resolución (d): distancia más pequeña por la cual dos objetos pueden estar separados y ser todavía distinguibles como dos objetos separados." d, depende de la AN y de la longitud de onda de la luz
empleada:
d = λ λ λ λ / (AN obj + AN cond) = λ λ λ λ / (2AN)
" Formas de reducir el límite de resolución:#Disminuyendo la longitud de onda.#Aumentando la Apertura Numérica.
"El límite de resolución máximo que se consigue en los microscopios de campo luminoso se sitúa en 0.22-0.25 µµµµm.
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Microscopio de campo luminosoMicroscopio de campo luminoso
! Área de campo: diámetro de la parte de la preparación que se está viendo al microscopio.
! Profundidad de campo: espesor de la preparación enfocada en cualquier momento (mayor a pequeños aumentos).
! Distancia focal: es la relación existente entre la longitud del tubo del microscopio empleado y la amplificación usada en un momento dado.
DF Longitud del tuboAmplificacion
=
! Distancia de trabajo: espacio existente entre el punto más bajo del objetivo y el objeto enfocado.
! Características de los objetivos. Resumen.
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Observación de muestras al microscopio óptico
• Epidermis de cebolla• Hoja de musgo• Pulpa de tomate
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Microscopía de campo luminoso
Profase
Anafase
Micrografía de un squash de meristemo apical radical de cebolla teñido con orceína mostrando distintas fases de la mitosis.
Metafase
Telofase
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Oculares
Portaobjetos cruzado acoplable
Brazo
Tubo binocular
Revolver
Objetivos
Platina portaobjetos
Condensador
Mandos movimiento de la platinaDiafragma iris
Filtro
Iluminación por proyección
Base o pie
Mandos de ajuste fino y grueso
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Fotografía del cabezal binocular de un microscopio.
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Vista lateral del revolver con los objetivos enroscados
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Vista inferior del revolver, pieza donde se enroscan los objetivos de un microscopio.
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Fotografía de la platina. Se observan la platina móvil, los tornillos de movimiento de la platina móvil, y los tornillos macro y micrométrico.
Fuente luminosa
Platina móvil
Platina
Tornillos de movimiento de la platina móvil
Tornillos macro y micrométrico
Objetivos
Condensador
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Fotografía lateral de la platina. Se observan la platina móvil, los tornillos de movimiento de la platina móvil, y los tornillos macro y micrométrico.
Fuente luminosa
Platina móvil
Platina
Tornillos de movimiento de la platina móvil
Tornillos macro y micrométrico
Condensador
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Detalle del condensador y la fuente luminosa.
Condensador
Fuente luminosa
Platina
Diafragma iris
Tornillos de movimiento de la platina móvil
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Amplificación en un sistema de dos lentes
Condensador
Objetivo
Ocular
Ojo Muestra
Imagen realformada porel objetivo(invertida)
Imagenvirtual
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Ref
racc
ión
de la
luz
a tr
avés
del
ai
re y
del
ace
ite d
e in
mer
sión
-1Lente objetivo
Condensador
PortaobjetosAireAceite
Eje óptico
Rayos de luz refractados
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Ref
racc
ión
de la
luz
a tr
avés
del
ai
re y
del
ace
ite d
e in
mer
sión
-2Lente objetivo
CondensadorPortaobjetos
Cubreobjetossobre la muestra
Eje óptico
Rayos de luz refractados
Aire Aceite
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Lente frontal del objetivo
La apertura numérica
Eje óptico
θθθθ = ángulo que formanel rayo de luz másexterno captado porel objetivo y el ejeóptico del mismo.
Fuente de luz
θθθθ
Porta de vidrio
θθθθ
Objetivo delmicroscopio
Lente frontal del objetivo
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Determinación de la apertura numérica
AN = n x sen θθθθEjemplos:Objetivo seco:AN = 1.00 x sen 40ºAN = 0.64 (<1)
Objetivo de inmersión:AN = 1.52 x sen 58ºAN = 1.29 (>1)
Aire, n = 1Aire, n = 1
n = 1.52
θθθθ = 40ºθθθθ = 58º
Aceite, n = 1.52
Porta de vidrio n = 1.52
Aire, n = 1
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Poder de resolución El ojo humano puede separar puntos
distantes 0.25 mm 0.25 mm
El microscopio óptico puede separarpuntos de 0.25 µµµµm de separacíón
0.25 µµµµm
El microscopio electrónico puede sepa-rar puntos de una distancia inferior a 5unidades Angstrom.
5 A
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Profundidad de campo
10x 1 µµµµm
P.c.
7 µµµµm 40x 1 µµµµm
P.c.
1.3 µµµµm
100x 1 µµµµm
P.c.
0.5 µµµµm
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Área de campo
Aspecto del área de campo de una muestra. Observarcomo a medida que la amplificación aumenta, el objetotambién lo hace, pero el área del campo disminuye.
x4
3.5 mm
x10
1,5 mm
x40
0.35 mm
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Los objetivos
Aumentos: x 5, x10, x20, x45, x100Apertura Numérica: 0.12, 0.17, 0.54,
0.65, 1.3Longitud del tubo: 160 mmGrosor del cubreobjetos: 0.18 mm
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Características típicas de los objetivos
ObjetivosSeco de pocos
aumentos(10 x)
Seco de muchosaumentos
(40 x)De inmersión
(100 x)Amplificación
(con un ocular de 10 x) 100 aumentos 400 aumentos 1000 aumentosDistancia focal 16 mm 4 mm 1.8 mm
Distancia de trabajo 4 - 8 mm 0.2 - 0.6 mm 0.11 - 0.16 mmApertura Numérica 0.25 0.85 1.25
Límite de resolución 1.10 µµµµm 0.32 µµµµm 0.22 µµµµmProfundidad de campo 7.0 µµµµm 1.3 µµµµm 0.5 µµµµm
Área de campo 1.5 mm 0.35 mm 0.17 mm
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Imagen 1
Portaobjetos
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Imagen 2
Gota de agua
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Imagen 3
Epidermis
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Imagen 4
Epidermis
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Imagen 5
Cubreobjetos
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Imagen 6
Presionar el cubreobjetos
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Células epidérmicas de cebolla (Allium sp)
Núcleos
Pared celular
Observación al microscopio (x40)
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Imagen 7
Colorantes
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Imagen 8
Verter una gota de colorante en el borde del cubreobjetos
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Imagen 9
Con ayuda de una tira de papel de filtro hacer pasarel colorante a través de la muestra por capilaridad
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Imagen 10
Musgo
Gota de agua
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Imagen 11
Coger una hojita con las pinzas
Gota de agua
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Imagen 12
Colocar la hojita encima de la gota
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Imagen 13
Colocar un cubreobjetos y añadir másagua si es necesario
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Imagen 14
Pulpa del tomate
Gota de agua
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Imagen 15
Pulpa de tomate
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Imagen 16
Poner un cubre y presionar ligeramente
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Imagen 18
Añadir una gota de colorante
Adsorber con una tira de papel