Download - Dra Cristina García (UB) - QUORUM SENSING REGULA LA FORMACIÓ DE BIOFILM ENVIBRIO SCOPHTHALMI
El quorum sensing regula la formacióde biofilm enVibrio scophthalmi
13 de juliol de 2012
Què és el quorum sensing?
RESPOSTA
- Producció d’antibiòtics- Alliberació de factors de virulència- Swarming- Formació d’endòspores- Formació de biofilm- Síntesi d’exopolisacàrids
Tipus d’autoinductors
Vibrio fischeri
Engebrecht J & Silverman M (1984) Identification of genes and gene products necessary for bacterial bioluminescence. Proc Natl Acad Sci U S A 81: 4154-4158.
Diversitat de circuits de QS…
Waters, C.M. and Bassler, B.L. 2005. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 21:319-346.
V. harveyi, V. cholerae…
El cas de Vibrio scophthalmi…
* Cerdà-Cuéllar et al. 1997. Vibrio scophthalmi sp. nov., a new species from turbot (Scophthalmus maximus).
International Journal of Systematic Bacteriology 47(1); 58-61.
Especificitat alta amb el turbot tot i que no és l’espècie més abundant a l’aigua de mar on viuen aquests peixos*
La colonització de l’intestí del turbot per aquesta espècie podria estar regulada per mecanismes de quorum sensing?
HIPÒTESI DE TREBALL
Objectius
- Quins circuits de quorum sensing presenta?
- Quines funcions regulen?
Materials i mètodes
Detecció d’AHLs Detecció de l’AI-2
- Extracció d’AHLs
- Separació AHLs mitjançantcromatografia en capa fina idetecció amb el biosensord’AHLs A. tumefaciens NTL4
- Identificació mitjançant espectrometriade masses
- Detecció en el sobrenedantutilitzant la soca biosensora de l’AI-2 de V. harveyi BB886 (AI-1 +, AI-2 -).
- Detecció i seqüenciació de la sevasintasa, luxS, mitjançant PCR utilitzant encebadors degenerats.
Materials i mètodesDETECCIÓ DE GENS IMPLICATS EN LA TRANSDUCCIÓ DEL SENYAL
luxR V. harveyi-like, luxR V.fisheri-like, luxN
- Detecció gens mitjançantencebadors degenerats.
Con
trol
neg
atiu
V. s
coph
thal
mi
V. v
ulni
ficus
PhiX
174H
aeIII
luxR
- Seqüenciació complerta del gen mitjançant PCR inversa.
ER: enzim de restricció
Regió desconegudaSeqüència ADN coneguda
Encebador1 Encebador 2ERER
Digestió i lligació
Seq. coneguda
PCR
Seq. desconeguda
Materials i mètodes
SEQÜENCIACIÓ GENÒMICA DE V. scophthalmi (soques A089 i A102)Sequenciador 454 (Roche Diagnostics) i ensamblatge amb el programa Newbler
Identificació d’altres gens relacionats amb circuits de quorum sensing en vibris
Materials i mètodesIDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING
Creació de mutants amb els gens luxS i luxR delecionats
Creació de recombinants productors de la lactonasa Aiia de Bacillus sp.
Materials i mètodes
IDENTIFICACIÓ DE FUNCIONS REGULADES PER QUORUM SENSING
- Cinètica de creixement
- Motilitat
- Formació de biofilm en microplaques de poliestirè
Resultats
Detecció d’autoinductors
- Detecció de 3 molècules activadores del biosensor A. tumefaciens NTL4
A089 A102
1
2
3
- Identificació de la molècula 3 com a una AHL amb una m/z de 300.2414 corresponent amb una N-(3-hidroxi-dodecanoil)-L-homoserin lactona
Resultats
- Detecció de l’autoinductor AI-2 en els sobrenedants de V. scophthalmi
- Detecció i seqüenciació del gen codificant per la seva sintasa (519 bp amplimer):
Similitud del 78% amb el gen luxS de V. vulnificus.
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
hours
rela
tive
light
uni
ts
00,20,40,60,81
1,21,41,61,82
OD
600
nm
Resultats
Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (PCR)
-Detecció i seqüenciació del gen luxR V. harveyi-like (615 bp):
Similitud del 75% amb el gen luxR de V. vulnificus.
-Els gens luxR V. fischeri-like i luxN no van ser detectats mitjançant l’amplificaciómitjançant PCR utilitzant encebadors degenerats.
Resultats
Detecció de gens implicats en la transducció del senyal (seqüenciació genòmica)
- En el cas de la soca A089 es van obtenir un total de 287 contigs que es van agrupar en 20 scaffolds representant un total de 4.5 Mb.
- En el cas de la soca A102 es van obtenir un total de 223 contigs que es van agrupar en 4 scaffolds representant un total de 4.45 Mb.
- En ambdues soques es van detectar homòlegs dels següents gens implicats en la transducció del senyal:
Resultats
Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi
Efecte de les AHLs en el creixementpACYC pACYC-aiiA
% motilitat 100 49,39SD 16,76
Efecte de les AHLs en la motilitat
Resultats
Funcions regulades pels circuits QS en V. scophthalmi
C- ∆luxR ∆luxSwt
Efecte de la deleció de luxR i luxS en la formació de biofilms
ResultatsEfecte de la deleció de luxR i luxS en les proteïnes de membrana externa
∆luxS
∆luxR
wt
Conclusions
- Vibrio scophthalmi presenta uns circuits de quorum sensing similarsals que presenta V. harveyi.
-V. scophthalmi produeix 3 molècules del tipus AHL una de les quals es vaidentificar com a N-(3-hidroxi)-L-homoserin lactona, tot i que es desconeixla seqüència de la seva sintasa.
- La disminució de la concentració d’aquestes AHLs mitjançant la lactonasa AiiAde Bacillus sp. provoca una disminució en la taxa de creixement.
- El regulador luxR regula positivament la formació de biofilm a elevadesdensitats cel·lulars.
- La deleció del gen luxS disminueix la formació de biofilm.
- V. scophthalmi té un gen codificant pel receptor de l’autoinductor CqsA, el gen cqsS, tot i que no s’ha identificat el gen codificant per aquest autoinductor.
AGRAÏMENTS: