Download - Documento

5/16/2018 Documento - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/documento-55ab546580d57 1/5

La prueba de Elisa es sencilla y confiable y permite detectar el VIH enla sangre de personas portadorasEl examen de ELISA es una de las pruebas más eficaces para detectar el virusdel VIH.Se realiza en las enzimas y su nombre viene del término inglés "Enzyme-linkedimmunosorbent assay", que quiere decir “ensayo inmonoenzimático ligado a

enzimas".Este estudio es muy rápido, efectivo y confiable y sus resultados son tratadoscon toda la confidencialidad que el paciente requiere.

También se puede detectar el virus por medio de otro análisis, llamado por“aglutinación” y se realiza también por medio de la toma de una muestra desangre.Otras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos delVIH, incluyen la inmunoelectrotransferencia o examen de Western Blot, lainmunofluorescencia y la radioinmnoprecipitación o RIPA.

Técnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay)Universidad Nacional Autónoma de México.Facultad de Estudios Superiores ZaragozaLaboratorio de Inmunología L-121,

Campus IPérez Pérez José Manuel1

____________ Pérez Sevilla Alma Beatriz2

____________ Equipo 3, Grupo 2802 Introducción: La técnica de ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay) es unprocedimiento de ensayoinmunoenzimático. Se basa en la detecciónantígeno(Ag) o anticuerpo (Ac), inmovilizado sobre una fasesólida y medianteanticuerpos que directa oindirectamente producen una reacción, lapruebarecurre al empleo de inmunógenos, haptenos óanticuerpos marcadoscon una enzima cuyo productocolorido, puede ser medidoespectrofotométricamente.Este principio tiene las propiedades deuninmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en surealización, empleareactivos económicos y consigue,mediante el uso de la fase sólida, de unaseparaciónfácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Lasenzimasutilizadas se muestran en el cuadro 1.Cuadro 1 Cromogenos utilizados para las enzimas fosfatasaalcalina y

Peroxidasa y el color que se obtieneEnzima Cromogeno ColorFosfatasaAlcalinap-nitrofenil fosfato (pNPP) amarillo5-bromo-4-cloro-3indolil fosfato/nitroazul de tetrazolium (BCIP/NBT)PurpuraNaftolAS-TR fosfato/fast red RC RojoPeroxidasa 2,2-azino-bis (3-etilbenziazoline-6acido sulfonicoverdeo-fenilamino (OPD) Naranja3,3’5,5’-tetrametilbencidina base odihidrocloruro (TMB)Azul3,3’-deaminobencidina (DAB) Marrón3-amino-9-etilcabazole (AEC) Rojo4-cloro-1-



naftol (4C1N) AzulFases de realización de una ELISA Sensibilización de la placa.

Bloqueo de espacios vacíos. El Ag o el Ac se fija a una superficie. Aplicación del espécimen de prueba.Controles positivo y negativo Detección y caracterización por Ac. 2°marcado.

Incubación con la muestra. Incubación con el sistema de detección. Adición del sustrato.Los diferentes tipos de ELISA son los que seenumeran acontinuación:Anticuerpos Marcados ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA Sandwicho Doble (DAS)o

Heterologo (HADAS)Antígenos Marcados ELISA CompetitivoELISA Directo.Consta de las siguientes etapas:Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenosespecíficos. Lavado para eliminar los antígenosfijados deficientemente o nofijados. Adición deanticuerpos marcados (“conjugados”) con unaenzima; si los anticuerpos reaccionan con losantígenos, el complejo quedará



solubilizado. Lavado

Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 20091.Elaboro

,2 Reviso,2para eliminar los anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición deun substrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puedepararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto finalcoloreado.ELISA Indirecto.Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de antígenosespecíficos para los anticuerpos objeto de estudio.Lavado para eliminar losantígenos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición del sueroproblema, detal forma que sus anticuerposreaccionarán específicamente con losantígenosfijados al soporte. Lavado para eliminar losanticuerpos marcados queno hayan reaccionado.Adición de anti-anticuerpos conjugados con unaenzima,los cuales reaccionan con los anticuerposespecíficos añadidos en el pasoanterior y que seencuentran fijados a los antígenos. Lavado paraeliminar losanti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de un substratosobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puede pararlareacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto finalcoloreado.ELISASándwich “DAS” (Double AntibodySandwich).Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de anticuerposespecíficos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar losanticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición de lamuestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal formaque si está presente el agentepatógeno de diagnóstico (antígeno),reaccionaráespecíficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado paraeliminar los antígenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra nofijados.Adición de anticuerpos específicos del antígeno adetectar (deben tenerun epítopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado elsoporte)conjugados con una enzima, los cuales reaccionan conlos antígenosañadidos con la muestra problema y quese encuentran fijados a losanticuerpos. Lavado paraeliminar los anticuerpos marcados que no

hayanreaccionado. Adición de un substrato sobre el que seacapaz de actuar laenzima marcadora. Se puede pararla reacción si se desea. Lectura visual ocolorimétricadel producto final coloreado.ELISA Sándwich “HADAS”.Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de anticuerposespecíficos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar losanticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición de lamuestraproblema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma,etc.), de tal forma



que si está presente el agentepatógeno de diagnóstico (antígeno),reaccionaráespecíficamente con los anticuerpos fijados al soporte.Lavado paraeliminar los antígenos que no hayanreaccionado y los restos de la muestra nofijados.Adición de anticuerpos específicos del antígeno adetectar (deben tenerun epítopo diferente de losanticuerpos con los que se han tapizado elsoporte),los cuales reaccionan con los antígenos añadidos conla muestra

problema y que se encuentran fijados a losanticuerpos. Lavado para eliminarlos anticuerpos queno hayan reaccionado. Adición de anticuerposconjugadoscon una enzima anti-anticuerposempleados en el paso anterior. Lavado paraeliminarlos anti-anticuerpos marcados que no hayanreaccionado. Adición de unsubstrato sobre el que seacapaz de actuar la enzima marcadora. Se puedepararla reacción si se desea. Lectura visual o colorimétricadel producto finalcoloreado.ELISA Competitivo.Consta de las siguientes etapas:• Fijación al soporte insoluble de anticuerposespecíficos del agente patógeno a detectar. Lavadopara eliminar losanticuerpos fijadosdeficientemente o no fijados. Adición enconcentraciónconocida de una mezcla de antígenosdel anticuerpo utilizado en el pasoanterior, marcadoscon una enzima y antígenos desconocidos objeto deestudio.Paralelamente, añadir únicamente antígenosdel anticuerpo usado en el pasoanterior, marcadoscon una enzima. Lavar para eliminar los antígenos quenohayan reaccionado. Adición de un substrato sobreel que sea capaz de actuar laenzima marcadora. Sepuede parar la reacción si se desea. Lectura visualocolorimétrica del producto final coloreado de ambaspruebas y comparar losresultados. Si las lecturas de

Técnica de ELISA (Enzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Mayo 20, 20091.Elaboro,2 Reviso,3ambas pruebas son análogas, el antígeno a estudiono tienen nada que vercon los anticuerposempleados para tapizar el soporte. Si haydiferencia en laslecturas de ambos pocillos, elantígeno objeto de estudio, estárelacionadoserológicamente con el anticuerpo empleado paratapizar el soportey la diferencia de densidad óptica,es proporcional a la concentración delantígenoproblema en la muestra.Todos los tipos de ELISAs descritos sepuedenresumir en dos grandes grupos:

• ELISAs para detectar antígenos: ELISAs sándwich.• ELISAs para detectaranticuerpos: ELISAsindirectos.La fase sólida debe ser de un tipo que permita un fácilmanejo(especialmente en los procesos de lavado) y lareproducibilidad de la unión deantígenos oanticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96pocillos y unvolumen de 350µL son especialmenteventajosas para procesar un elevadonúmero demuestras y un vez tapizadas, el material inmovilizadopermanecereactivo mucho tiempo siempre que semantenga seco y a baja temperatura.Normalmente seutilizan microplacas de poliestireno de fondo planoque pueden



adquirirse estériles y con o sin tapa. Lastécnicas de ELISA se realizan mediantela adiciónsecuencial de todos los reactivos necesarios separadospor etapas delavado. Cada una de las operacionespuede realizarse manualmente conmicropipetas o conequipamiento para la automatización de todas y cadauna delas etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad deprocesar y analizarun gran número de muestras y necesitar unaelevada

repetibilidad de resultados.La enzima escogida como marcador debeunirsefácilmente a antígenos y anticuerpos, encontrarse enestado puro a unprecio razonable y tener un substratocromogénico o fluorogénico convenientey de fácilpreparación. Las enzimas más utilizadas son fosfatasalcalina,peroxidasa de rábano y ß-galactosidasa; acontinuación se muestra una tablacon las ventajas ydesventajas de cada una así como los substratos queseemplean con cada una de ellas.La búsqueda de la concentración óptima deusodepende ligeramente del tipo de ELISA empleado;para cualquier ELISA queutilice anti-anticuerposconjugados, se suele probar diferentes dilucionesdelconjugado (desde 1:100 hasta 1:2000) frente asucesivas diluciones deantisuero en placas tapizadascon antígeno a concentración idóne a.Aquelladilución del conjugado que produzca menor reaccióninespecífica (menor color de fondo o “background”)con muestras negativas e implique una claradistinción de las muestraspositivas, será la óptima. Laelección de una concentración de conjugadoóptimava completamente ligada a planteamientoseconómicos en los que se hade procurar el mayor ahorro del conjugado aún a costa de aumentar eltapizado.La elección del substrato es de gran importancia paralaestandarización del método ELISA y hay que tenervarios factores en cuenta,como son sensibilidad,especificidad, repetibilidad, facilidad de lecturaycomplejidad de preparación, así como estabilidaddespués de la parada de lareacción.Hoy en día existen muchas variaciones en cuanto a lossubstratos y,por lo tanto, el método de detección delos complejos antígeno-anticuerpocomo los sistemasde detección colorimétricos, fluorescentes yluminiscentes.Este método ha tenido una enormeaplicación en todos aquellos campos en losque seprecisaba la cuantificación de productos medianteanticuerpos:diagnóstico clínico, detección viral,clasificación de anticuerpos en isotipos,búsqueda deanticuerpos monoclonales, etc.

Download - Documento

Top Related