Diagnóstico Genético Prenatal
Defectos CongénitosFrecuencia: 3% de los Recién Nacidos Vivos
. Genéticos: . Cromosómico . Monogénico
. Poligénicos o Multifactoriales
. Ambientales: . Agentes Físicos. Agentes
Biológicos . Agentes Químicos
. Aún Desconocidos
Defectos CongénitosAgentes ambientales -Teratología
Un teratógeno es un agente ambiental (droga o
químico, radiación, infección, etc.) que interfiere
con el desarrollo normal del embrión o feto y
que da como resultado la pérdida de embarazo,
malformaciones, restricción del crecimiento
intrauterino (RCIU) o cambios conductuales en
el recién nacido.
Factores ambientales
Anomalías de origen ambiental
• Agentes físicos: Radiaciones ionizantes
• Agentes químicos: Alcohol
Medicamentos
Exposición laboral
• Agentes biológicos: Citomegalovirus (CMV)
Toxoplasmosis
Rubeola
Parvovirus B19
• Métodos no invasivos
• Métodos invasivos
• Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD)
Clasificación del diagnóstico prenatal
En el feto
En el embrión previo a la implantación
• El screening es un método que aplicado a nivel masivo
evalúa riesgos individuales. Un screening positivo indica
que el paciente tiene riesgo elevado para la enfermedad
buscada, y que por lo tanto se podría beneficiar con un
procedimiento diagnóstico más preciso como la
amniocentesis o la aspiración de vellosidades coriónicas.
• Actualmente el screening prenatal de anomalías de
cromosomas incluye la edad materna y los antecedentes
reproductivos, análisis bioquímicos en sangre de la madre
y datos de la ecografía (ej.: translucencia nucal).
Tendencia actual: screening a todas las embarazadas que deseen realizar algún tipo de estudio
• Imágenes - Ecografía (2D, 3D, 4D)
- Doppler
- Resonancia Magnética
- Tomografía Computada Helicoidal
• Marcadores bioquímicos en sangre materna
• Ácidos nucleicos fetales en sangre materna
Métodos No Invasivos de Diagnóstico Prenatal
Translucencia Nucal y Hueso Nasal
Feto de 12 semanas con hueso nasal presente (flecha corta) y translucencia nucal de 1,9 mm (flecha larga).Interpretación: bajo riesgo para anomalías de cromosomas.
Translucencia Nucal (TN) y Hueso Nasal (HN)
Feto de 12 semanas con HN presente y TN de 1,2 mm. Bajo riesgo para anomalías de cromosomas
Feto de 12 semanas con HN ausente (flecha) y TN de 8 mm (*). Alto riesgo para anomalías de cromosomas. Luego del asesormiento se realizo aspiración de vellosidades coriónicas.Cariotipo: 47,XY,+21
*
Ácidos nucleicos libres en sangre materna
•ADN y ARN
•Real-time PCR
•A partir de la 6ta semana de amenorrea
•Permite identificar secuencias no presentes en la madre
• Factor Rh del feto en madres Rh negativas sensibilizadas
• Sexo fetal (enfermedades ligadas al X)
• Mutaciones paternas: dominantes y recesivas
•Se podría realizar diagnóstico prenatal de anomalías de cromosomas
Seguimiento de la paciente Rh negativa sensibilizada
Curva de Amplificación
Rh neg
Rh pos
ADN fetal libre en sangre materna
AMNIOCENTESISAMNIOCENTESIS
PUNCIÓN DE PUNCIÓN DE VELLOSIDADES VELLOSIDADES
CORIÓNICASCORIÓNICAS
CORDOCENTESISCORDOCENTESIS
OTROSOTROS
Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal
Aspiración de vellosidades coriónicas
Amniocentesis
Cordocentesis
Cariotipo fetalIdentifica enfermos
Respuesta definitiva
MUESTRA: Cualquier tejido con células nucleadas que estén en división celular
Laboratorio en diagnóstico prenatal
Citogenética clásica
Citogenética molecular (FISH)
Análisis bioquímicos
Análisis moleculares
PCR
Real-time PCR
QF-PCR
CGH
Microarrays
Cariotipo con bandeo G: 46,XY
Metafase Cariotipo
Trisomía 21: 47,XX,+21
• tienen poca disponibilidad
• tienen un costo elevado
• presentan riesgos fetales
Métodos Invasivos de Diagnóstico Prenatal
Tienen certeza, pero ...
Indicaciones Principales de Diagnóstico Prenatal Invasivo
• Edad materna avanzada
• Hijo previo con anomalía de cromosomas
• Padres portadores de rearreglos cromosómicos
• Detección ecográfica de una malformación
• Riesgo elevado por screening prenatal
• Obtención de material para análisis de ADN
Aspiración de Vellosidades
coriónicasAmniocentesis Cordocentesis
Edad gestacional
a partir de las 11 semanas
A partir de las 16 semanas
A partir de las 18 semanas
Tiempo para el resultado
7 días 21 días 5 a 10 días
Riesgos de pérdida de embarazo
0,5%-1% 0,3%-1% 2%-3%
Certeza 99,5% 99,9% 99,9%
Características de los estudios de cariotipo prenatal
Mosaicismo en Vellosidades Coriónicas
Presencia de más de una línea celular, con distintos cariotipos, en
el tejido estudiado.
46,XY46,XY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA
46 46 XYXY46 46
XYXY46 46 XYXY
46 46 XYXY46 46
XYXY46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY46 46
XYXY46 46 XYXY
46 46 XYXY
46,XY46,XY 45,X45,X
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46,XY46,XY
45 45 XX
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
45 45 XX
45 45 XX
45 45 XX
45 45 XX
45 45 XX
45 45 XX
46 46 XYXY
46 46 XYXY
46 46 XYXY
Error mitótico Error mitótico postcigóticopostcigótico 45,X/46,XX45,X/46,XX
Mosaicismo Confinado a la Placenta
Mosaicismo Confinado a la Placenta
47,XY,+247,XY,+2
4477
4477
4477
4477
44
77
44
7744
7744
7744
66
44
66
44
7744
77
EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY44
6 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
46 ,XY46 ,XY 46, XY46, XY 47, XY,+247, XY,+2
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
46 ,XY46 ,XY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
Error meiótico y Error meiótico y rescate trisómicorescate trisómico
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
44
7744
7744
7744
77
446 6 XXYY
44
7744
7744
77
47474747
4747
4747
46,XY/47,XY,+246,XY/47,XY,+2
Mosaicismo placentario y fetal
47,XY,+2147,XY,+21
4477
4477
4477
4477
44
77
44
7744
7744
7744
66
44
66
44
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77
EMBRIÓNEMBRIÓN PLACENTAPLACENTA
446 6 XXYY44
6 6 XXYY
446 6 XXYY44
6 6 XXYY
446 6 XXYY
46 ,XY46 ,XY 46, XY46, XY 47, XY,+2147, XY,+21
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
46 ,XY46 ,XY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
Error meióticoError meiótico
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
446 6 XXYY
44
7744
7744
7744
77
446 6 XXYY
44
7744
7744
77
47474747
4747
4747
46,XY/47,XY,+2146,XY/47,XY,+21
47, XY,+2147, XY,+21
44
77
44
7744
77 44
7744
77 44
7744
77
MOSAICISMO en Vellosidades Coriónicas
Implicancia clínica
•Cromosoma involucrado
•Causa por la que se realizó el estudio prenatal
•Ecografía fetal normal o patológica
•¿Qué hacer?
•Amniocentesis: cariotipo y FISH
FISH en diagnóstico prenatal
• Mosaicismo de trisomía 21 en
vellosidades coriónicas.
• Amniocentesis + FISH: en células
de líquido amniótico se observan 3
señales rojas que indican que hay
3 cromosomas 21 y 2 señales
verdes que indican que hay 2
cromosomas 13.
• Diagnóstico final: trisomía 21
FISH en diagnóstico prenatal
Ventajas
• No necesita cultivo celular
• Se pueden analizar
muchas células (>100)
• Resultados en 24-48hs
Desventajas
• Menor exactitud que el
cariotipo convencional
• Alto costo
En diagnóstico prenatal
Detecta TRISOMÍASMONOSOMÍASTRIPLOIDÍAS
• SENSIBILIDAD 95,65 % 99,2 – 100 %
• ESPECIFICIDAD 99,97 %
QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
Amplifica selectivamente secuencias del ADN
Determina el número de copias de una secuencia determinada de ADN
ADN extraído de células NO cultivadas de Vellosidades Coriónicas o Líquido Amniótico
Amplificar regiones de ADN (marcadores polimórficos) específicos de cromosoma (13, 18, 21, X, Y)
Computadora mide la intensidad de la señal fluorescente: determina cantidad de copias
QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
La amplificación de los marcadores genera un producto fluorescente que es directamente proporcional a la cantidad de secuencia target en la muestra inicial
Evaluar simultáneamente hasta 15 STR de loci preseleccionados de ciertos cromosomas
QF – PCRQuantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction
QF – PCRResultado
Resultado: valor numérico correspondiente al área y altura de los picos
En normales heterocigotas para el STR, la misma cantidad de fluorescencia se genera por ambos alelos.
TRISOMÍA:
3 PICOS
2 PICOS DISTINTOS
Tener por lo menos 2 marcadores informativos por cromosoma
VENTAJAS
Resultado RÁPIDO de anomalías cromosómicas numéricas:
Detecta TRIPLOIDÍA
Detecta MOSAICISMO 20 – 30 %
Lectura computarizada
Automatización
Puede amplificar en forma simultánea aproximadamente 15 loci
QF – PCR
VENTAJAS
Mejor que cariotipo convencional y FISH en detectar contaminación materna celular
Procesa muestras simultáneamente
Menor costo
QF – PCR
EUPLOIDE: 46,XX
TRISOMÍA 21
Otras técnicas moleculares aplicadas al diagnóstico prenatal
• MLPA: Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification
• ARRAY – CGH: Array comparative genomic hybridization
MLPAMultiplex Ligation-Dependent Probe
Amplification
VENTAJAS
• Mejor que secuenciación en que detecta deleciones y duplicaciones de exones completos
• Mejor que FISH en que detecta mutaciones pequeño tamaño
• Mejor que PCR ya que ésta no puede evaluar secuencias tan pequeñas
Array-CGH
ARRAY – CGHArray comparative genomic hybridization
• Evalúa cambios en el número de copias (CNV) en el genoma entero causadas por DELECIONES, DUPLICACIONES, ANEUPLOIDIAS, TRANSLOCACIONES DESBALANCEADAS.
• Resolución 50-100 kb
• Análisis simultáneo de 10 a 100 loci
• Algunas plataformas evalúan cambios tan pequeños como un exón.
• No necesita cultivo
• Resultado: 48hs
ARRAY - CGHARRAY - CGH
TIPO ESTUDIO RESOLUCION TIEMPO Cant loci por muestra
COSTO
CARIOTIPO “clásico”
5 – 10 Mb VC: 7 – 10 días
Amnio: 15 – 21 días
Bajo
FISH 1 – 5 Mb 24 – 48 hs Sólo algunas sondas por muestra
Caro
QF-PCR 24 hs HASTA 15 loci Bajo
MLPA 130 – 500 bp 24 hs Hasta 50 loci Muy caro
Array 50 – 100 kb 48 hs Hasta 180.000 loci Muy caro
Reproducción Médica Asistida
Conceptos claves• Conjuntos de métodos biomédicos que conducen a
facilitar o sustituir en parte a los procesos biológicos naturales, deteriorados o inexistentes, que se desarrollan durante la procreación humana.
• No suplantan mediante elementos artificiales o no biológicos al organismo masculino o femenino en la función procreativa.
• Implican la participación de los gametos masculinos y femeninos en el proceso generativo.
• No curan la infertilidad.• Incluyen la intervención de un tercero (el médico, el
biólogo, la sociedad, etc.) en la generación de un nuevo ser humano, por lo cual presentan intensas implicancias bioéticas.
Clasificación
• Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida
• Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida
Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (I)
• Inseminación artificial (IA)
-Indicaciones: Subfertilidad o infertilidad masculina, vasectomía, oligo / azoospermia, ac. anti-esperma, impotencia. Normalidad anatómica y funcional del aparato reproductor femenino.
-Metodología: 1. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 2. Transferencia de los espermatozoides mediante un catéter hasta la vagina.
-Porcentaje de Éxito: 5 a 10% por tratamiento / por ciclo.
Técnicas intracorpóreas de reproducción asistida (II)
- Indicaciones: Infertilidad por razones inmunológicas que impiden la capacitación natural del espermatozoide, existencia de un factor cervical femenino que altere a los espermatozoides, anovulación.
- Metodología: 1. Inducción de la ovulación por hiperestimulación ovárica y recogida de los ovocitos por vía transvaginal. 2. Obtención de los espermatozoides y capacitación de los mismos en un medio apropiado 3. Transferencia, mediante un catéter del óvulo y los espermatozoides hasta la porción ampular de la trompa.
• Transferencia intratubárica de gametos (GIFT)
- Porcentaje de Éxito: 24.5% por tratamiento / por ciclo.
Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (I)
• Fecundación In Vitro con Transferencia de
Embriones (FIVET)
Técnicas extracorpóreas de reproducción asistida (II)
Indicaciones y Factores Pronóstico
Nº de embriones transferidos
Éxito de embarazo
1 11.5%
2 27.5%
3 33.8%
4 36.1%
5 35.1%
6 38.2%
Edad materna Éxito de Embarazo
< 35 años 33.8 %
35 – 39 años 27.5%
> 40 años 11.5 %
Complicaciones de las Técnicas de Reproducción Asistida
• Embarazos múltiples
• Morbi-mortalidad materna y fetal aumentada (abortos, partos prematuros, anemia, eclampsia, polihidramnios, endometritis, malformaciones congénitas, etc.)
• Incremento en los gastos de los servicios de maternidad y neonatología.
• Efectos psicológicos en la madre, pareja y familia
Diagnóstico Genético de
Pre-implantación
Diagnóstico Genético de Pre-implantación (PGD)
• Surgió en la década de 1960, pero a partir de su asociación a IVF, se convirtió en un método de “prevención” de desórdenes genéticos.
• Se encuentra indicado en: edad materna ≥ 36 años, parejas con ≥ 3 IVF fallidos, parejas con MESA o TESA y ≥ 1 IVF fallido, abortos recurrentes, desórdenes monogénicos, anormalidades cromosómicas, cariotipo alterado debido a mosaicismo cromosómico o translocaciones balanceadas.
• En todos los casos en que se efectúe PGD, es imprescindible contar con hiperestimulación ovárica previa y técnicas de reproducción asistida extracorpóreas con el objetivo de generar in vitro múltiples embriones para seleccionar aquellos que no se encuentran afectados.
Desorden genético excluido
Desorden genético detectado Embrión descartado
Incubación
(3 días)
HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SITU (FISH)
Cromosoma 13: rojo
Cromosoma 21: verde
Cromosoma 18: celeste
Cromosoma X: azul
Cromosoma Y: dorado
Complicaciones de la PGD
• Daño estructural al embrión (raro)
• Sólo ¼ de los embriones biopsiados puede implantarse satisfactoriamente
• No descarta el mosaicismo genético
• Errores diagnósticos
• El resultado de la PGD debe confirmarse por amniocentesis y biopsia de vellosidades coriónicas