UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS, FÍSICAS, MATEMÁTICAS, FARMACIA E INFORMÁTICA
CARRERA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TESIS PRESENTADO POR:
Br. AMILCAR PUMA CÁRDENAS
PARA OPTAR AL TÍTULO PROFESIONAL
DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
ASESORA:
MCs. CARLA DEL CARPIO JIMÉNEZ
COASESORA: MCs. FLAVIA CAROLL MUÑIZ PAREJA
CUSCO - PERÚ2011
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA IN VITRO DE LOS EXTRACTOS DE LAS HOJAS DE Ambrosia arborescens
Mill “MARCU” FRENTE A Fasciola hepatica
DEDICATORIA
A mi madre L. Marina, por todo su apoyo
sobre todo el económico.
A mi hermana Mildred y mi abuelita Rosenda,
por sus buenos consejos.
A todos mis compatriotas que luchan
cada día por salir adelante.
Amilcar
AGRADECIMIENTOS
A mi asesora, Mcs. Carla del Carpio Jimenez, docente de la Carrera
Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de San
Antonio Abad del Cusco, por su colaboración y el tiempo dedicado para la
realización del presente trabajo.
A mi coasesora, Mcs. Flavia Caroll Muñiz Pareja, docente de la Carrera
Profesional de Biología de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del
Cusco, por su colaboración y facilitarme el uso del laboratorio de Parasitología.
Al Lic. Médico Veterinario Michael Paez, por el acceso al camal de San
Jerónimo, Cusco.
A la Lic. Matemática-Estadística, Rocio Callahui Pagan, por su apoyo en el
análisis estadístico de la presente investigación.
Al Br. Hugo Inocencio Caceres, por facilitarme el uso del laboratorio de
Industria Farmacéutica de la Carrera Profesional de Farmacia y Bioquímica de
la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
A mi primo Waldir Cárdenas, por su apoyo como asistente de tesis.
INDICE
RESUMEN
SUMMARY
GLOSARIO DE TÉRMINOS
INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO I
GENERALIDADES
1.1 Planteamiento del problema 1
1.2 Formulación del problema 3
1.3 Objetivos
3
1.3.1 Objetivos generales 3
1.3.2 Objetivos específicos
3
1.4 Limitaciones de la investigación
3
1.5 Justificación e importancia
3
1.6 Hipótesis
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO CONCEPTUAL
2.1 Antecedentes 6
2.1.1 Antecedentes etnofarmacológicos 6
2.1.2 Antecedentes fitoquímicos 6
2.1.3 Antecedentes farmacológicos 7
2.2 Bases teórico científicas
10
10
2.2.1 Aspectos botánicos de la especie en estudio 10
2.2.1.1 Identificación botánica
10
2.2.1.2 Descripción botánica
11
2.2.1.3 Hábitat y distribución
11
2.2.1.4 Fitoquímica 11
2.2.1.5 Usos medicinales populares
11
2.2.2 Fasciola hepatica
13
2.2.2.1 Posición sistemática de Fasciola hepatica
13
2.2.2.2 Aspectos morfológicos y fisiología
14
2.2.3 Fasciolosis
19
2.2.3.1 Fasciolosis animal
20
2.2.3.2 Fasciolosis humana
26
2.2.4 Principios de los ensayos biológicos de toxicidad
30
2.2.4.1 Principios generales
30
2.2.4.2 Principios de metodología toxicológica experimental
30
2.2.4.3 Concentración respuesta en los ensayos toxicológicos
31
2.2.4.4 Curva dosis-respuesta
31
2.2.4.5 Parámetros fármaco-toxicológicos
32
2.2.4.6 Determinación de la concentración letal media 33
2.2.4.7 Potencia frente a toxicidad 34
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Material biológico 35
3.1.1 Muestra vegetal
35
3.1.2 Muestra parasitológica
35
3.1.3 Medio de cultivo
35
3.2 Materiales e instrumentos de laboratorio
35
3.2.1 Materiales de campo 35
3.2.2 Materiales de laboratorio
36
3.2.3 Instrumentos de laboratorio 36
3.2.4 Reactivos
36
3.2.5 Otros materiales
37
3.3 Recursos e infraestructura
37
3.4 Metodología
37
3.4.1 Tipo de investigación
37
3.4.2 Diseño de la investigación 38
3.4.3 Variables 41
3.4.3.1 De la actividad antihelmíntica de los extractos 41
3.4.3.2 De la concentración letal media de los extractos 43
3.5 Procedimiento 45
3.5.1 Preparación de la muestra 46
3.5.1.1 Recolección 46
3.5.1.2 Secado y molienda 46
3.5.2 Obtención de los extractos y porcentaje rendimiento 46
3.5.3 Obtención de los parásitos 47
3.5.4 Pruebas in vitro para determinar la actividad antihelmíntica 48
3.5.5 Pruebas in vitro para determinar la concentración
letal media sobre fasciola adulta 49
3.5.6 Análisis estadístico
50
CAPITULO IV
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Tabla Nº 01 Porcentaje de extracción de los extractos acuoso, etanólico 70°
y clorofórmico de las hojas de Ambrosia
arborescens Mill "Marcu”
51
Tabla Nº 02 Tiempo promedio de muerte de los miracidios con los extractos
acuoso, etanólico 70° y clorofórmico al 0.25% de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
52
Tabla Nº 03 Tiempo promedio de muerte de los miracidios con los extractos
acuoso, etanólico 70° y clorofórmico al 0.125% de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
53
Tabla Nº 04 Tiempo promedio de muerte de los miracidios con los extractos
acuoso, etanólico 70° y clorofórmico al 0.0625% de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
54
Tabla Nº 05 Tiempo promedio de muerte de las fasciolas adultas con los
extractos acuoso, etanólico 70° y clorofórmico al 1% de las
hojas Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
55
Tabla Nº 06 Tiempo promedio de muerte de las fasciolas adultas con los
extractos acuoso, etanólico 70° y clorofórmico al 0.5% de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
56
Tabla Nº 07 Tiempo promedio de muerte de las fasciolas adultas con los
extractos acuoso etanólico 70° y clorofórmico al 0.25% de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
57
Tabla Nº 08 Valores de la CL50-18hrs estimadas por el metodo probit de los
extractos acuoso, etanólico 70° y clorofórmico de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente a fasciola adulta 58
DISCUSIÓN 60
CONCLUSIONES
62
SUGERENCIAS 63
BIBLIOGRAFÍA 64
ANEXOS 71
INDICE DE ANEXOS
Anexo Nº 01: Certificado de la planta 72
Anexo Nº 02: Medio de cultivo 73
Anexo Nº 03: Reporte de morbilidad de fasciolosis Dirección Regional
de Salud Cusco 74
Anexo Nº 04: Reporte de morbilidad de fasciolosis Servicio Nacional
de Sanidad Agraria Cusco 75
Anexo Nº 05: Fichas de recolección de los tiempos de la actividad
antihelmíntica 76
Anexo N° 06: Resultados experimentales de la actividad antihelmíntica 78
Anexo N° 07: Resultados experimentales de la cl50-18hrs 80
Anexo N° 08: Análisis estadístico de cada extracto 81
Anexo N° 09: Análisis estadístico de los extractos al 0.25% 85
Anexo N° 10: Análisis estadístico de los extractos al 0.125% 87
Anexo N° 11: Análisis estadístico de los extractos al 0.125% 89
Anexo N° 12: Análisis estadístico de los extractos al 1% 91
Anexo N° 13: Análisis estadístico de los extractos al 0.5% 93
Anexo N° 14: Análisis estadístico de los extractos al 0.25% 95
Anexo Nº 15: Cálculo de la CL50-18 hrs método probit 97
Anexo Nº 16: Ph de los extractos ensayados frente a miracidio 103
Anexo Nº 17: Ph de los extractos ensayados frente a fasciola adulta 104
Anexo N° 18: Solubilidad de los extractos 105
Anexo N° 19: Construcción de la incubadora artesanal 106
Anexo N° 20: Fotografías 107
RESUMEN
La fasciolosis es una enfermedad parasitaria distribuida mundialmente,
causante de múltiples trastornos fisiológicos que pueden comprometer la vida
del hombre así como la de los animales. El objetivo del estudio fue determinar
la actividad antihelmíntica de los extractos (acuoso, etanólico a 70º y
clorofórmico) de las hojas de Ambrosia arobrescens Mill “Marcu” in vitro frente
a Fasciola hepatica, el estudio fue de tipo cuasi experimental; se utilizó dos
modelos experimentales in vitro, en placa Petri para fasciola adulta y placa
multipozo para miracidio de Fasciola hepatica. Los resultados fueron los
siguientes: en la determinación de la actividad antihelmíntica se tuvo que, para
el miracidio se registró el menor tiempo de muerte con el extracto seco
etanólico a 70º a las concentraciones de 0.25, 0.125 y 0.0625%, seguido del
extracto seco clorofórmico y finalmente el extracto acuoso el cual no presentó
actividad antihelmíntica; para la fasciola adulta se registró el menor tiempo de
muerte con el extracto seco clorofórmico a las concentraciones de 1, 0.5 y
0.25%, seguido del extracto seco etanólico a 70º y finalmente el extracto
acuoso; en la determinación de la Concentración Letal Media a las 18 horas
para la fasciola adulta, se tuvo, para el extracto clorofórmico de 346.219 ppm,
seguido del extracto seco etanólico a 70º de 398.216 ppm y finalmente el
extracto acuoso de 456.503 ppm. Se concluye que los extractos (acuoso,
etanólico a 70º y clorofórmico) de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu” presentan actividad antihelmíntica frente a Fasciola hepatica, siendo el
de mayor actividad frente a fasciola adulta el extracto clorofórmico, y para el
miracidio el extracto etanólico a 70°.
Palabras clave: Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, actividad antihelmíntica,
Fasciola hepatica, concentración letal media.
ABSTRACT
Fascioliasis is distributed worldwide by a parasite, which causes multiple
physiological disorders that can compromise the life of man and animals. The
aim of this study was to determine the anthelmintic activity of the extracts
(aqueous, ethanolic 70º and chloroform) from the leaves of Ambrosia
arobrescens Mill "Marcu" in vitro against Fasciola hepatica, the study was quasi
experimental; we used two experimental models in vitro, in Petri dishes for adult
fluke and plate multiwell for miracidium of Fasciola hepatica. The results were
as follows: in the determination of the anthelmintic activity had to be, for
miracidium the lowest time of death with dry ethanol 70° at 0.25, 0.125 and
0.0625%, followed by dry chloroform and finally the aqueous extract in which no
activity anthelmintic; for fluke adult has the lowest time of death with dry
chloroform to 1, 0.5 and 0.25%, followed by dry ethanol 70° and finally the
aqueous extract; in determining the Median Lethal Concentration at 18 hours for
the adult fluke, it had, for the chloroform extract of 346.219 ppm, followed by dry
ethanol 70 º of 398.216 ppm and finally the aqueous extract of 456.503 ppm.
We conclude that the extracts (aqueous, ethanolic 70 º and chloroform) from
the leaves of Ambrosia arborescens Mill "Marcu" against Fasciola hepatica has
anthelmintic activity, being the most active anthelmintic the chloroform extract to
fasciola adult and the busiest anthelmintic for the ethanol extract to miracidium.
Keywords: Ambrosia arborescens Mill "Marcu" anthelmintic activity, Fasciola
hepatica, median lethal concentration.
GLOSARIO DE TÉRMINOS
Antihelmíntica: Capacidad inherente de una sustancia de origen natural o
sintético que provoca la expulsión de los helmintos ya sea matándolos e
incitando en ellos una conducta de huida. (18)
Anemia: Trastorno que se produce por la disminución de hemoglobina o del
número de glóbulos rojos en la sangre. (18)
Cercaría: Larva caudada de los digeneos, se originan por reproducción
asexual a partir de un esporocisto o redia. (17)
Concentración Letal Media (CL50): Es aquella que causa la muerte del 50 %
de animales expuestos experimentalmente a ella, durante un tiempo específico
y bajo condiciones controladas. (17)
Fasciolasis: Infección ampliamente distribuida, causada por Fasciola
hepatica, parásito de numerosos mamíferos (ovinos y bovinos) y humanos. (17)
Helmintiasis: Infección producida por helmintos, gusanos que residen o
migran a los tejidos, órganos o cavidades del hospedador, en estadio juvenil o
adulto. (17)
Hepatomegalia: Aumento de volumen del hígado. (17)
Hospedero: Es un animal vivo (hombre, otros mamíferos, aves, artrópodos,
etc.) que en circunstancias naturales permite la subsistencia o el alojamiento de
un agente infeccioso. (17)
Hospedero definitivo: Es aquel donde el parásito llega a la madures o pasa
por su fase sexual. (17)
Hospedero intermediario: Es aquel donde el parásito se encuentra en su
forma larvaria o asexual. (17)
In vitro: Investigación que se realiza fuera del organismo, en el vidrio de un
tubo de ensayo. (17)
Metacercaria: Último estadio entre cercaría y adulto en el ciclo de vida de la
mayoría de los digeneos. (17)
Miracidio: Larva ciliada de algunos digeneos, es de vida libre por corto tiempo
hasta que penetra en el hospedador intermediario apropiado, un molusco
(gastrópodo o bivalvo). (17)
Opérculo: Cubierta en forma de tapón en uno de los extremos del huevo de
trematodos. (17)
Parálisis flácida: Estado en el cual los músculos presentan una disminución
del tono muscular. (18)
Parálisis espástica: Estado en cual los músculos están rígidos y es muy difícil
movilizarlos. (18)
Redia: Estadio larvario de trematodos digeneos que se desarrolla entre los
estadios de miracidio o esporocisto, según sea la especie. (17)
Zoonosis: Infecciones e infestaciones que se transmiten en forma natural entre
humanos y animales domésticos o silvestres. (17)
ABREVIATURAS
SHFM: Solución Hedon Fleig modificado
HM: Hojas molidas
mL: Mililitro
g: Gramo
ppm: Partes por millón (mg/ L)
CL50: Concentración letal media
QP: Químicamente puro
INTRODUCCIÓN
El uso de plantas medicinales en el Perú es tan antiguo como nuestra cultura
andina, muchos conocimientos se encuentran arraigados en el saber popular,
sin embargo, la excesiva modernización de la Medicina Occidental ha hecho
que estos conocimientos sean relegados, y en ciertos aspectos, hasta
olvidados. (43)
Las enfermedades parasitarias constituyen una de las problemáticas
fundamentales que presentan la mayoría de los países del Tercer Mundo;
dentro de estas se tiene a la distomatosis hepática o fasciolosis, que es una
zoonosis parasitaria causada por el tremátodo denominado Fasciola hepatica,
la misma que se encuentra extendida por todo el mundo y es la causante tanto
en el hombre como en los animales, de múltiples trastornos fisiológicos y de
grandes pérdidas económicas que van desde el decomiso de los hígados de
los animales infectados hasta disminución del peso, retraso del crecimiento,
reducción de la producción de carne, leche o lana, descenso de la resistencia a
otras enfermedades, inhibición de la reproducción, abortos e incluso la muerte.
Todo esto unido a los altos costos derivados del tratamiento antihelmíntico, la
convierte en una de las parasitosis más costosas de la ganadería mundial.
Por otra parte el uso incrementado de compuestos antihelmínticos ha generado
resistencia a los tratamientos y favorecido la parasitosis, por lo que se hace
indispensable la utilización de medicamentos de origen natural, como una vía
de sustituir aquellos medicamentos sintéticos de elevados costos en el
mercado.
El diagnóstico clínico de esta infección en humanos es en ocasiones muy difícil
de hacer por la complejidad de sus síntomas y la multiplicidad de los síndromes
que es capaz de producir, lo cual hace pasar como asintomático o mostrar
cuadros graves e incluso localizaciones aberrantes. (42)
Con todo lo expuesto se ve por conveniente realizar un estudio que contribuya
a la validación del uso terapéutico tradicional de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu” como antihelmíntico ya que existen reportes sobre su uso como tal.
CAPÍTULO I
GENERALIDADES
1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los helmintos al ingresar al organismo humano pueden localizarse en la luz del
tubo digestivo las formas adultas o en los órganos profundos invadidos ya sea
por las formas adultas o larvarias, provocando en el hospedero una
enfermedad parasitaria que se manifiesta con los siguientes síntomas anorexia,
nauseas, cansancio, dolor abdominal, diarrea, fiebre, prurito perianal, rash
cutáneo, anemia, etc. (1) (6)
Una de las infecciones parasitarias por helmintos que se da a nivel mundial es
la fasciolosis producida por Fasciola hepatica, según estimaciones se sabe
que hay entre 2,6 y 17 millones de personas infectadas en el mundo (46) y
además se ha demostrado que las más importantes regiones endémicas de
fasciolosis humana están localizadas en América del Sur. (8) (14) (20) (45) (65)
El Perú no escapa a esta realidad ya que se tiene un significativo incremento
de casos reportados en las últimas cuatro décadas por fasciolosis humana (14)
(46) (65); así mismo la droga de elección para tratar esta infección es el
triclabendazol (29), el cual no se encuentra disponible en Perú,
administrándose otros medicamentos que no son específicos para dicha
infección o utilizándose el triclabendazol para uso veterinario. (60)
Por otro lado las grandes pérdidas económicas que causa en el sector
ganadero ya que se ve reducida la ganancia en peso, en la producción de
leche, lana, y reducción en la vida útil del animal por mortalidad o al ser
tempranamente llevado al camal. (48)
Todo esto aunado a la resistencia de Fasciola hepatica al triclabendazol en
animales (58), hace que sea considerado como una problemática de salud
pública a nivel mundial.
1
Según la Organización Mundial de la Salud, actualmente, el 80% de la
población mundial recurre a la medicina tradicional para atender sus
necesidades primarias de asistencia médica, por lo que recomienda el estudio
de los recursos vegetales de uso medicinal a fin de incorporales a la política
nacional de salud de cada país miembro. (52)
A la especie Ambrosia arborescens Mill “Marcu” dentro de la medicina
tradicional se le atribuye muchas propiedades terapéuticas, una de ella como
antihelmíntico, al realizarse la revisión bibliográfica solo se ha encontrado los
usos que se le da con esta propiedad a nivel tradicional (43) (19), además de
algunas investigaciones sobre su composición fitoquímica. (12) (36) (3)
Con este marco, se plantea el presente estudio cuyo propósito es el de
comprobar la actividad antihelmíntica de los extractos (acuoso, etanólico 70º y
clorofórmico) y determinar la concentración letal media in vitro de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente a Fasciola hepatica, de modo que
sirva de base para posteriores investigaciones y tal vez como una sustancia
alternativa para tratar la fasciolosis.
2
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
¿Los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
presentarán actividad antihelmíntica in vitro frente a Fasciola hepatica?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 OBJETIVOS GENERALES
Determinar la actividad antihelmíntica de los extractos de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente a Fasciola hepatica.
1.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obtener los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a partir de
las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”.
Evaluar in vitro la actividad antihelmíntica de los extractos (acuoso,
etanólico 70º y clorofórmico) frente a miracidio y fasciola adulta.
Determinar el tiempo de muerte del miracidio y fasciola adulta al ser
expuestos a los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico).
Determinar la Concentración Letal Media de los extractos (acuoso,
etanólico 70º y clorofórmico) que presenten actividad antihelmíntica
frente a miracidio y fasciola adulta.
1.4 LIMITACIONES DE LA INVESTIGACIÓN
No se determinó la concentración letal media frente a miracidio, porque
debido a su tamaño y dificultad de manipularlo no se ajusta para el ensayo
toxicológico.
1.5 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA
Desde tiempos antiguos las plantas han constituido una fuente de remedios al
alcance del ser humano para la curación de sus enfermedades, en la
3
actualidad las plantas siguen siendo utilizadas en la medicina tradicional, por lo
cual es necesario tener un conocimiento integral de los recursos vegetales por
ende mejorar su aprovechamiento.
En el Perú, la fasciolosis humana es una enfermedad infecciosa parasitaria
emergente, según el estudio realizado por un equipo multidisciplinario de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia, se tiene un total de 1701 personas (1-
71 años) infectadas que fueron reportadas en el Perú entre 1963 y 2005. Del
total de casos, 191 eran casos agudos (11%); 1313 en fase crónica (77.1%); y
167 crónicos asintomáticos (9.8%); el número de sujetos infectados se
presentan por décadas apreciándose un paulatino aumento alcanzando a 54.1
casos por año en la última década analizada. Así mismo menciona para el
Cusco una morbilidad de 13% y a nivel nacional el 71% del territorio andino
peruano estaría afectado por esta zoonosis. (44)
Según el reporte obtenido de la Dirección Regional de Salud del Cusco, se tuvo
una morbilidad de 21 pacientes entre el 2005 y 2008; en cuanto a la fasciolosis
animal, se tiene una morbilidad de 53030 bovinos beneficiados entre 2005 y
2009, reporte obtenido del Servicio Nacional de Sanidad Agraria del Cusco.
(ANEXO N° 03, 04)
En la población humana, la fasciolosis causa múltiples trastornos fisiológicos
como fiebre, dolor abdominal, cólico biliar, ictericia, anemia, cirrosis hepática,
hepatomegalia e incluso puede conducir a la muerte; la carencia de
fasciolicidas de uso humano como el triclabendazol, ya que existe sólo el de
uso veterinario, hace que la necesidad de contar con un tratamiento eficaz,
inocuo y oportuno para prevenir las secuelas irreversibles que ocasiona el
parásito en el hígado de los seres humanos, en especial entre los niños, sea
urgente. (44) (60)
En la población pecuaria, este parásito, causa grandes pérdidas económicas
que van desde el decomiso de los hígados de los animales infectados,
reducción de la producción de carne, leche o lana, inhibición de la
reproducción, abortos e incluso la muerte; los altos costos derivados del
4
tratamiento antihelmíntico así como la resistencia de Fasciola hepatica al
triclabendazol en animales. (58)
Con estas referencias, se plantea la realización del presente estudio con el fin
de encontrar fuentes alternativas de agentes de origen natural con actividad
antihelmíntica, los cuales podrían sustituir aquellos medicamentos sintéticos de
elevados costos en el mercado.
1.6 HIPÓTESIS
Los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, presentan
actividad antihelmíntica in vitro frente a Fasciola hepatica
5
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO CONCEPTUAL
2.1 ANTECEDENTES
2.1.1 ANTECEDENTES ETNOFARMACOLÓGICOS
Esta especie vegetal está distribuida desde América Central hasta
Bolivia, en el Perú en la Costa, Sierra y Selva Alta entre 500 y 4000
msnm, arbusto silvestre y cultivado al cual se le atribuye muchas
propiedades terapéuticas como antirreumática, antihelmíntica (tomar
infusión de las hojas) (43) (19), contra las hemorroides (aplicación tópica
de la hojas), analgésico (la infusión de las hojas), ginecológico (infusión
de las hojas estimula el flujo menstrual), e insecticida (colocar la planta
bajo la cama para ahuyentar las pulgas). (9)
2.1.2 ANTECEDENTES FITOQUÍMICOS
Alvarado Chávez Britt “Plantas medicinales de la Cordillera Negra”
Rev Acad Perú Salud 14(2), 2007.
El estudio se realizó en el distrito de Cotaparaco ubicado en la Cordillera
Negra de la provincia de Recuay, departamento de Ancash; se colectó
35 especies vegetales para inventario, identificación botánica y base
para estudios fitoquímicos de plantas medicinales usados por los
habitantes de la zona. Se utilizó Screening fitoquímico: Identificación con
reacciones químicas, cromatografía en capa fina (cromatofolios Al de
silicagel F254) y cromatografía en papel (papel Watman Nº 2, relación
entre fluorescencia UV visible y la estructura del flavonoide). El resultado
que se tiene señala que el 100% de las especies contienen flavonoides,
para Ambrosia arborescens Mill “Marcu” (hojas y tallos) se identificó
antraquinonas, azúcares reductores, flavonoides, taninos, alcaloides y
aminoácidos libres.
6
Se concluye que en la zona de la Cordillera Negra la mayor
biodiversidad vegetal se encuentra en el piso bioclimático mesoandino
(2.500-4.000 m.s.n.m); considerando a los alcaloides, glucósidos
sapónicos, antraquinonas, lactonas sesquiterpénicas y flavonoides,
como los de mayor responsabilidad de las propiedades medicinales, su
presencia en las especies estudiadas representan 91,42%, 40%,
77,14%, 80% y 100%, respectivamente; las especies estudiadas están
distribuidas en 18 familias, donde las Asteráceas
(Ambrosia arborescens Mill “Marcu”) representan el 28,6%, las
Solanáceas y Lamiáceas el 8,6%.
Lezama Melchor; Susana Marina: “Aislamiento y elucidación
estructural de lactonas sesquiterpenicas de Ambrosia arborescens
Mill.”. Universidad Nacional de Mayor de San Marcos, Facultad de
Farmacia y Bioquímica, Lima, 1993.
En el estudio se determinó que Ambrosia arborescens Mill contiene
cuatro lactonas sesquiterpénicas; fueron identificadas dos lactonas
damsina comprobada mediante cromatografía en capa fina y punto de
fusión, y que la coronopulínea cuya estructura fue determinada mediante
sus constantes físicas, espectroscópicas, UV, IR y formación de
derivados, una tercera lactona sesquiterpénica cristalizable y una cuarta,
que sólo se llegó a aislar; no pudieron ser identificadas por la proporción
en que se encontraban presentes en la muestra.
2.1.3 ANTECEDENTES FARMACOLÓGICOS
Lema N.; Castro G.; Arias G.; Lozano N.: “Determinación de la
Actividad Antimicrobiana de Plantas Medicinales de Huarochiri y
Huancayo”. Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima Perú,
1994.
El estudio se realizó en Huancayo y Huarochiri, se colectó 17 plantas
medicinales. Se utilizó el método disco-placa-cultivo, los diversos
extractos obtenidos fueron ensayados frente a bacterias gran positivas y
gran negativas y frente a levadura (Candida albicans).
7
Se tiene como resultado de las 17 plantas estudiadas, el 76% presentó
actividad antimicrobiana, de las cuales 13 plantas medicinales tienen
actividad frente a bacterias gran positivas dentro de la cual se tiene a
Ambrosia arborescens Mill “Marcu”; de los ensayos biocromatográficos
se observa que las fracciones responsables de la actividad podrían ser
los tripterpenos y/o esteroides.
Concluyéndose que existe una gran correlación entre el uso medicinal
tradicional y la actividad farmacológica.
Guauque Maria del Pilar; Castaño Jhon; Gomez Milton: “Detección
de metabolitos secundarios en Ambrosia peruviana Willd,
determinación de la actividad antibacteriana y actividad
antihelmíntica”. Universidad del Quindio, Armenia. Colombia, 2010.
En el estudio se realizó una tamización fitoquímica por desengrase en
extractor soxhlet; para la concentración letal media se analizó por el
método Probit; para el efecto antibacteriano se utilizó el método de
concentración inhibitoria mínima en caldo nutritivo LB y para el efecto
antihelmíntico se utilizo un modelo experimental in vitro, en placa de
Petri. Se identificó la presencia de alcaloides, glucósidos cardiotónicos,
quinonas, flavonoides, carbohidratos, taninos y saponinas. La
concentración letal media (Artemia salina) para el extracto etanólico seco
fue 64,2 mg/ml, mientras que para el extracto acuoso fue de 840,4
mg/ml; los extractos no presentaron actividad antibacteriana; los
ejemplares adultos de T. canis presentaron disminución de la motilidad
frente a extractos secos, mientras que en la fracción de alcaloides
murieron luego de 4 horas de exposición; los extractos de A. peruviana
sobre huevos de T. canis permitieron una disminución en el porcentaje
de huevos con embrión que no dependía del extracto observado sino de
la concentración empleada. Se concluyó que Ambrosia peruviana
Willd, tiene actividad antihelmíntica frente a Toxocara canis, y que no
presenta actividad antibacteriana.
8
Romero J. Marialina; Olazabal M. Ervelio; Martinez Yusnel; Serrano
Hector; Monteagudo Alcides: “Actividad fasciolicida in vitro de
Portulaca oleracea L”. Universidad Central de las Villas, Cuba, 2002.
Se evaluó la actividad fasciolicida in vitro del extracto seco de Portulaca
oleracea L, obtenido a partir de la liofilización del extracto acuoso al
10% de la planta completa y se emplearon varias concentraciones del
mismo. Se utilizaron dos modelos experimentales in vitro, en placa de
Petri frente a fasciola adulta y en placas multipozos frente al miracidio de
Fasciola hepática. Los resultados fueron, para el miracidio con el
extracto al 1%, 0.5%, 0.25% y 0.125%, se produce la muerte en una
hora del 100% de los parásitos; para fasciola adulta el extracto al 1%
produce la muerte en 24 horas del 100% de los parásitos. Se concluyó
que Portulaca oleracea L tiene actividad fasciolicida, dicha actividad
podría deberse a metabolitos con características polares como los
alcaloides, aminoácidos y saponinas.
9
2.2 BASES TEÓRICO CIENTÍFICAS
2.2.1 ASPECTOS BOTÁNICOS DE LA ESPECIE EN ESTUDIO
Fotografía N° 01 Ambrosia arborescens Mill “Marcu”Fuente: APC
2.2.1.1 IDENTIFICACIÓN BOTÁNICA
Reino : Vegetal
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Asteridae
Orden : Asterales
10
Familia : Asteraceae
Género : Ambrosia
Especie : Ambrosia arborescens Mill
Sinónimos : Ambrosia artemisioides Willd.,
Franseria artemisioides Willd.,
Artemisia artemisiodes (10) (19)
N. vulgar : Marcju, Marcu, artemisa
Fuente : Herbario Vargas (Anexo Nº 1)
2.2.1.2 DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
Arbusto perenne, silvestre con 1,5 m de altura. Tallos y hojas puberulentos a
pilosos. Hojas basales opuestas, superiores alternas profundamente pinnadas,
nervadura pinnada, haz y envés con glándulas resinosas.
Inflorescencias monoicas; estaminadas terminales, en elongados racimos;
pistiladas axilares, en cabezuelas fasciculadas o solitarias en hojas superiores.
Cabezuelas masculinas con pedicelos; brácteas involucrales en una serie,
connadas, herbáceas, esparcido pubescente; receptáculo, subconvexo, con
páleas filiformes. Flores campanuladas, lobadas, amarillas, anteras obtusas en
la base, con apéndices apicales. Cabezuelas femeninas subsésiles; brácteas
involucrales biseriadas, externas libres, las internas fusionadas al único ovario
presente, corola y androceo ausente, estilo bífido, obtuso en la parte distal.
Aquenio ovoide, rostrado en el ápice, envuelto por un involucro espinuloso y
esparcido pubescente; vilano ausente. (30) (10)
2.2.1.3 HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN
Arbusto silvestre y cultivado, está distribuida desde América Central hasta
Bolivia. En el Perú, en la costa, sierra y selva Alta entre 500-4000 msnm. (9)
2.2.1.4 FITOQUÍMICA
11
La planta contiene aceites esenciales; contonina; damsina; franserina (10-
hidroxitetrahidroxi ambrosina); dos alcaloides en las flores; absintina, proteínas
y aceites etéreos. (9)
2.2.1.5 USOS MEDICINALES POPULARES
En el libro “Las Plantas Medicinales de nuestra Madre Tierra Valle Sagrado de
los Inkas-Cusco”, menciona que las semillas maceradas en vino o tomar la
infusión de las hojas de Marcu como antihelmíntico, para el reumatismo la
hojas soasadas se frotan en la parte afectada o también se puede realizar una
tintura con la cual se friccionan, para el dolor de dientes se mastican las yemas
y como diurético tomar la infusión de las hojas. (43)
En el libro “Las plantas en la medicina indígena y la dieta: enfoque
bioconductual” (1986), menciona que la especies Ambrosia artemissifolia
contiene psilostachyn y Ambrosia marítima ambrosin y damsin, las cuales
tienen propiedades anticancerígenas. (23)
En la Enciclopedia de las Plantas Útiles del Ecuador “Plantas Tóxicas” (2008),
menciona el uso de Ambrosia arborescens Mill “Marcu” para eliminar pulgas
con 23 registros de uso, todos provenientes de ocho de las diez provincias de
la Sierra (de donde esta especie es nativa). (22)
En el libro “Plantas medicinales de America Latina”, menciona la infusión de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill como antihelmíntico, analgésico,
dismenorrea y oliguria. (19)
En el “Diccionario Enciclopédico de Plantas Útiles del Perú”, menciona el uso
de Ambrosia artemisioides como antirreumática, antihelmíntica (infusión de
las hojas), hemorroides, analgésico e insecticida. (9)
En otros estudios realizados se menciona que Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, se usa para afecciones como cefalea, sarna reumas limpiados de
baño caliente, baño vaginal, insecticida, circulación, sarpullido, abortivo y
12
retraso de la menstruación, y que produce efectos tóxicos debido a la presencia
de principios amargos, aceite esencial y glucósidos cianogénicos (12) (50)
(66); Ambrosia cumanensis, se usa en casos de diarrea. (35)
2.2.2 Fasciola hepatica
Fotografía N° 02 Fasciola hepatica “Alicuya”Fuente: APC
2.2.2.1 POSICIÓN SISTEMÁTICA DE Fasciola hepatica
Reyno : Animalia Linneo, 1758
Subreino : Metazoa Linneo, 1758
Phylum : Platyhelminthes Schneider, 1873
Clase : Trematoda Rudolphi, 1859
Subclase : Digenea Van Beneden, 1858
Orden : Echinostomida Erasmus, 1972
Familia : Fasciolidae Railliet, 1895
Género : Fasciola Linneo, 1758
Especie : Fasciola hepatica Linneo, 1758
13
Nombre vulgar: Alicuya, Duela del hígado, Palomilla, Qallutaca,
Saguaipé, Ojuela, Conchuela (27) (54)
2.2.2.2 ASPECTOS MORFOLÓGICOS Y FISIOLOGÍA
ESTADIO ADULTO
Fasciola hepatica, es un tremátode hermafrodita pudiendo alcanzar un
tamaño de 3,5 cm de largo por 1 cm de ancho. (64)
Posee un cono cefálico, dos ventosas de sujeción y una cubierta cuticular
espinosa, presenta el extremo anterior más ancho que se va adelgazando
hacia el extremo posterior que es obtuso a manera de una pequeña
prolongación cónica (característico de la especie), se desplaza a través de
movimientos reptantes. (34) (37)
La parte externa del tegumento está formada por una cutícula de naturaleza
plasmática, con espinas voluminosas que llegan hasta la membrana basal,
vesículas pinocíticas básales, mitocondrias y retículo endoplásmico tubular.
La parte interna está formada por tubos protoplásmicos, músculos circulares y
longitudinales, responsables de los movimientos de las espinas que causan
acción irritativa sobre el epitelio de los conductos biliares, abundantes células
parenquimatosas, cuerpos de golgi y vacuolas citoplásmicas (32), entre las
funciones del tegumento esta la absorción de sustancias nutritivas, la
respiración y otras funciones sensoriales. (59)
Principalmente se ha comprobado que los nutrientes que Fasciola hepatica
necesita, son una mezcla de tejidos o detritos tisulares epiteliales, sangre,
contenido intestinal, bilis y moco (fundamental en la fase juvenil). (59) (63)
HUEVO
14
Son elipsoidales, operculados de color amarillo, miden de 130-150 X 63-90 µm;
de superficie lisa con estriaciones o dentículos en el opérculo y la abertura.
La primera división del huevo origina dos células desiguales (micro y
macrómero); posteriores divisiones originan la mórula, cuya posición es
inconstante; la gastrulación es de tipo epibólico. La temperatura es un factor
importante para el desarrollo del miracidio, después de dos a tres semanas (16
días a 22 ºC) a mayor temperatura disminuye el periodo de incubación (13 días
a 28 ºC), pero a una temperatura mayor de 30 ºC los huevos no llegan a
embrionar. Los huevos al momento de la puesta no están segmentados y su
evolución requiere de la separación de la masa fecal y condiciones
termohigrométricas adecuadas siendo indispensable que también estén
recubiertas de una fina película de agua, en estas condiciones se forma el
miracidio lo cual se lleva a cabo dentro de la membrana vitelina que presenta
una estructura que actúa como amortiguador viscoso y coloidal en el extremo
operculado. (15) (53)
La eclosión del huevo para la salida del miracidio depende de la luz, la banda
de 650 nm del espectro estimula la producción de una enzima proteolítica
fotoactiva que debilita la unión del opérculo con la cáscara del huevo. La
actividad del miracidio y la hipertonía del medio interno del huevo presionan el
opérculo que se abre y permite su salida al exterior. (4)
MIRACIDIO
Tiene forma ovalada, más ancha en su parte anterior donde presenta una
papila apical mide aproximadamente 130 a 180 µm. El ectodermo presenta
pestañas vibrátiles cuyo extremo anterior presenta una especie de rostro o
papila cefálica, corta, retráctil y desprovista de pestañas, algo por detrás
presenta una doble mancha ocular pigmentada con función fotorreceptora. La
cavidad del cuerpo está constituida por grupos de células germinativas, células
del miracidio que serán transmitidas a los estadios larvarios siguientes y que
forman numerosos elementos de estos estadios evolutivos. (29) (34)
Al salir del huevo nada con geotropismo negativo y con fototropismo positivo,
presentan cuatro tipos de agrupamientos celulares (33) (34):
El primero corresponde a las células de la superficie del cuerpo donde se
encuentran los cilios.
15
El segundo grupo de células se encuentra en el polo posterior, constituyendo el
primordio de células germinales.
El tercer grupo lo forman las células excretoras y el cuarto grupo constituye el
primordio del aparato digestivo.
Debajo del epitelio existen dos capas de fibras musculares una circular y otra
longitudinal; la musculatura está compuesta por fibras musculares que están
exactamente debajo de las placas epidérmicas y de la papila apical, algunas de
estas fibras sirven como retractores de la papila. (33) (34)
ESPOROCISTO
Es de forma oval alargada con un extremo redondeado y el otro cónico, el
miracidio al momento de penetrar el caracol pierde sus cilios y se convierte en
esporocisto joven, pasando a ubicarse en el manto del caracol hospedero.
Su tamaño es aproximadamente de 500 a 600 µm. La membrana o pared que
forma el esporocisto es de tipo citoplasmático y sin espinas. (13) (63)
El desarrollo del esporocisto involucra la transformación de células germinales
en la cavidad del esporocisto maduro, para formar masas germinales de
células que posteriormente se diferenciarán en los sucesivos estadios larvarios.
(4) (34)
REDIA
Son larvas a manera de sacos alargados miden 1 a 3 mm de largo presentan
movimientos activos migratorios y se localizan en la parte distal del caracol
principalmente en la glándula digestiva tienen abundantes células germinales
que originan posteriormente redias hijas y cercarías. Si las condiciones
ambientales y nutritivas para los caracoles son desfavorables pueden formarse
una segunda generación de redias aunque lo normal es que la primera
generación de redias da lugar a las cercarías, en el último tercio del cuerpo
presenta dos proyecciones laterales en forma de dos pequeñas aletas, en el
extremo anterior presenta una ventosa conectada internamente con una faringe
esférica la cual se continúa con tubo recto y ciego que se extiende hasta la
mitad de la longitud del cuerpo. Las redias se alimentan de las células de los
tejidos del hepatopáncreas del caracol hospedero a través de la boca y del
16
aparato digestivo simple, como también a través de la pared del tegumento.
(13)
CERCARÍA
La cercaría sale de la redia a través del poro de nacimiento, es de tipo
gimnocéfala de cuerpo alargado cuando esta activa y redondeado al estar en
reposo; mide entre 250 a 330 µ de ancho máximo, la cola mide 700 µm de
largo. Presenta típicas glándulas citógenas distribuidas principalmente en los
márgenes del cuerpo, con vesícula excretora en forma de “Y” invertida presenta
una ventosa oral, una ventosa ventral, una faringe y un primordio genital. El
número de cercarías formadas en cada caracol es muy variable y no depende
del número de miracidios que lo infectaron; se han evidenciado emisiones
desde 10 a 4000 cercarias siendo la media de 100 cercarias por Lymnea su
liberación se da después de 38 a 45 días de que el miracidio penetró en el
caracol. (34)
Una vez liberada del hospedero intermediario la cercaría presenta tendencia a
enquistarse sobre cualquier superficie que esté en contacto con ella,
incluyendo el agua. El tiempo aproximado que requiere el proceso de
transformación en metacercaría es de 20 a 30 minutos. (4) (7)
METACERCARIA
Estadio infectante par los hospederos vertebrados mide de 180 a 120 µm de
diámetro, se forma después que las cercarías pierden la cola, son de forma
redondeada, estas pueden fijarse en las plantas acuáticas o en plantas que se
hallan en las riveras de los riachuelos o acequias. Eliminan una secreción que
rápidamente se solidifica formando una especie de quiste de doble pared, la
parte externa de esta pared está constituida de una capa de proteína tánica
que cubre los lados dorsal y lateral y una capa interna fina que rodea a toda la
metacercaria, estas capas sirven de protección por lo que pueden tolerar de 4 a
6 ºC lo que posibilitaría su supervivencia durante el invierno, llegando a ser
infectiva a las 24 horas después del enquistamiento. (15)
Después de la ingestión de metacercarias por parte del hospedero definitivo en
el proceso de desenquistamiento ocurren dos etapas: activación de la joven
duela, que comienza en el rúmen a temperatura de 38 ºC y emergencia, que
17
tiene lugar en el duodeno, donde son activados las enzimas de las
metacercarias, provocando apertura de los orificios de emergencia del quiste,
alimentándose posteriormente de la mucosa intestinal, para luego perforar
rápidamente la pared intestinal y ubicarse en los conductos biliares del hígado,
después de 2 a 6 días, y a los 30 días aproximadamente se convierten en
fasciolas adultas después de la infestación. (1) (54)
CICLO DE VIDA
Consta de seis etapas bien definidas (42):
1. Salida de los huevos desde el hospedero definitivo al medio.
2. Desarrollo embrionario de los huevos.
3. Ruptura de los huevos en el agua y salida del miracidium en busca del
hospedero intermediario.
4. Desarrollo y multiplicación de los parásitos dentro del hospedero
intermediario.
5. Emisión cercariana y formación de las metacercarias o cercarías
enquistadas (estadio infectante) sobre plantas acuáticas.
6. Ingestión de las plantas acuáticas por el hospedero definitivo y desarrollo del
parásito hasta su forma adulta.
RESPIRACIÓN Y CIRCULACIÓN
No existen órganos especiales para la respiración de Fasciola hepatica, la
ventilación y la absorción ocurren utilizando el cilio epidérmico. (49)
La respiración es principalmente anaerobia pudiendo ser facultativa porque el
oxigeno es raras veces disponible, la respiración por lo general implica la
degradación de glucosa y el dióxido de carbono, siendo el consumo de oxigeno
dependiente de factores que incluyen temperatura, tamaño del cuerpo etc. (59)
Existe un sistema linfático para el sistema de circulación a manera de senos
apareados muy delgados que son longitudinales y horizontales, con sincitio
epitelial cuya función es el transporte de aminoácidos y lípidos así como
contribución al sistema excretor. (59)
SISTEMA NERVIOSO
18
En Fasciola hepatica, este sistema está formado por un par de ganglios
cerebrales y un plexo submuscular, los cuales se comunican por medio de
cordones transversos y longitudinales generalmente son tres pares de
cordones longitudinales, dorsal, ventral y lateral. (2) (4) (32)
Existe un anillo nervioso alrededor de la faringe y es considerado como un
sistema autónomo y tiene inervaciones hacia el intestino y el sistema excretor
equivalente a un sistema nervioso simpático; se ha descrito abundantes células
neurosensoriales y motoras localizadas en las ventosas. (38) (32)
ENERGÉTICA Y CRECIMIENTO (59) (67) (61)
Fasciola hepatica, obtiene energía por la degradación de carbohidratos tanto
del glicógeno como de glucosa, son anaerobios facultativos pero pueden
utilizar el oxigeno cuando esté presente para la respiración aerobia, llegando a
excretar incluso grandes cantidades de ácidos de cadena corta como producto
final lo que indica que ellos no consumen toda la energía posible que pudieran
conseguir de la glucosa, debido a que tienen un suministro inagotable del
hospedero, lo que hace que la glucosa no catabolice completamente.
Para conseguir la energía se produce el piruvato para convertirlo en acetil CoA,
que entonces pasa al ciclo de Krebs generando energía ; cuando el oxigeno
está presente, este será el aceptor final de electrones y cuando está ausente el
aceptor final de electrones será el piruvato cuyo producto final será lactato.
Otra forma de conseguir la energía adicional es mediante enzimas
catabolizadoras intermedias del ciclo de Krebs. En etapas larvales y libres que
presentan durante el ciclo de vida, utilizan una cadena clásica de electrones de
transporte a través de la citocromo C oxidasa.
En adultos de Fasciola hepatica, bombean hacia el exterior los ácidos de
cadena corta para crear un gradiente de protones a través de sus membranas
celulares la energía de gradientes es utilizada para generar ATP; los estadios
larvarios como miracido y cercaría son aerobios obligados y tienen que
conseguir la energía a través del metabolismo de la glucosa debido a que no se
alimentan; tanto el miracidio como la cercaría tienen un ciclo principal de Krebs,
19
una vez que la cercaría sale del hospedero sufre un cambio principal
metabólico, los lípidos son utilizados para realizar el reemplazo de tegumento.
2.2.3 FASCIOLOSIS
La fasciolosis es una zoonosis parasitaria causada por Fasciola hepatica,
interviniendo en su ciclo de vida como hospedadores definitivos animales
herbívoros y el hombre, y como hospedero intermediario un pequeño caracol
de agua dulce. (1) (42)
La fasciolosis podemos clasificarla en fasciolosis animal y humana.
2.2.3.1 FASCIOLOSIS ANIMAL
PATOGENIA Y FISIOLOGÍA
La patogenia depende del número de vermes que invaden el hígado, con las
formas parasitarias inmaduras migrantes en el parénquima hepático y con la
actividad hematófaga de las fasciolas adultas en los conductos biliares. (13)
La fasciolosis cursa con anemia, hipoalbuminemia e hiperglobulinemia y
dependiendo de la intensidad y duración de la infección, con hiper o
hipoproteinemia, la anorexia y la pérdida de peso o el retraso del crecimiento.
(64)
En la fasciolosis ovina subclínica durante el período de prepatencia existe una
reducción del flujo biliar y secreción biliar de ácidos biliares, como resultado de
la hepatopatía ocasionada por la migración de las fasciolas inmaduras; también
se incrementa la bilirrubina sérica y se observa un descenso significativo de la
bilirrubina biliar; en cambio se han detectado fenómenos hipercoleréticos
durante la fase de patencia en el ganado vacuno. La alimentación hematófaga
es propia de las fasciolas adultas, siendo los vermes inmaduros histiófagos.
(13) (57)
En el curso de la fasciolosis, el hígado se encuentra en un estado hipercinético
respecto a las proteínas plasmáticas con un marcado incremento de las
síntesis de hemoglobina, albúmina e inmunoglobulinas; también la médula
ósea aumenta notablemente su actividad eritropoyética. En cambio, en los
20
estados terminales la capacidad del hospedador para incrementar la síntesis de
hemoglobina en respuesta a la hemorragia está comprometida por la falta de
hierro y de proteínas. El crecimiento corporal, como las proteínas plasmáticas y
los glóbulos rojos, se mantiene hasta la madurez sexual de las fasciolas en los
conductos biliares (a las 8-12 semanas post infección); a partir de entonces, el
descenso de peso y la eliminación consecuente van parejos al incremento de
las pérdidas sanguíneas. (7) (13) (64)
La anorexia que acompaña a la fasciolosis es en parte responsable de la
hipoalbuminemia y de la pérdida de peso; la ingestión voluntaria de alimento
desciende progresivamente después de la infección y alcanza su mayor
intensidad al final de la fase de prepatencia, momento en el que la hepatopatía
originada por las fasciolas inmaduras es máxima. En procesos más graves la
depresión del apetito continúa e incluso aumenta con la patencia y el deterioro
físico del animal; existe cierta correlación entre la aparición e intensidad de la
inapetencia con el descenso de la capacidad metabólica hepática; y con el
desarrollo de la anemia y pérdida de proteínas plasmáticas asociadas a las
fasciolas adultas. Quizás la anemia, la hipoalbuminemia y el deterioro de las
reservas proteicas extravasculares determinen de algún modo la ingestión. El
desarrollo de todas estas alteraciones depende fundamentalmente de la fase,
la duración y la intensidad de la infección y del estado nutritivo e inmunitario del
hospedador. (13) (64)
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Se presenta tres formas clínicas aguda, subaguda y crónica, esta clasificación
se basa en los hallazgos de necropsia y del número de parásitos que se
encuentran en el hígado y de su estado de desarrollo. (13)
FASE AGUDA
La fasciolosis ovina se origina por la ingestión, casi simultánea de un millar de
metacercarias y afecta a corderos expuestos por primera vez al parasito.
En esta fase se tiene dos tipos de fasciolosis aguda, el primero se caracteriza
por la existencia de 1000-2500 vermes en el hígado, de los cuales el 60% se
encuentran migrando por el parénquima hepático; en el segundo se encuentran
21
700-1000 vermes inmaduros, albergando los conductos biliares un porcentaje
de duelas mayor que en el tipo anterior. (34) (64)
Los animales afectados muestran un cuadro de anemia hemorrágica aguda tipo
normocítico y normocrómico, la evolución de la anemia puede ser tan rápida
que es posible observar muertes repentinas durante el periodo de prepatencia,
debidas a la enorme pérdida de sangre y el fallo de la función hepática. Otras
características son marcada eosinofilia, elevada actividad plasmática de la
aspartato aminotransferasa, hiperglobulinemia y en los casos terminales, los
animales muestran un valor hematócrito de 7-10%. (34)
La sintomatología se caracteriza por debilidad, palidez de las mucosas,
taquipnea o evidente disnea cuando se obliga al animal a moverse y en
algunos casos hepatomegalia palpable con dolor abdominal y ascitis; el curso
de la enfermedad es corta muriendo los animales después de 12 días tras la
aparición de los síntomas. Es frecuente la complicación de la fasciolosis aguda
con hepatitis necrótica infecciosa. (13)
FASE SUB AGUDA
Se debe a la ingestión de un número elevado de metacercarias durante un
período de tiempo suficientemente largo como para no provocar un proceso
agudo. En el hígado se hallan por término medio de 1000 vermes (500-1500)
existiendo un equilibrio entre las formas adultas y las inmaduras. Las ovejas
afectadas pierden peso durante 1-2 semanas antes de la aparición de los
síntomas y se muestran letárgicas e incapaces de mantenerse con el resto del
rebaño. (13)
En este estado la palidez de las mucosas es patente y las ovejas afectadas se
resienten a la palpación de la parte anterior del abdomen, aunque sólo un
pequeño número tiene hepatomegalia palpable, algunos pueden mostrar
edema submandibular y ascitis. (13) (64)
Gradualmente se desarrolla anemia hipocrómica y macrocítica; existe también
reticulocitosis marcada (8-30%) que sólo se observa en animales con el valor
hematocrito menor de 25%. Las modificaciones de los valores sanguíneos se
acompañan con alteraciones de las proteínas séricas, inicialmente se produce
hiperproteinemia, debida principalmente al incremento de la fracción
globulínica, fundamentalmente inmunoglobulinas como respuesta a los
22
antígenos parasitarios. A continuación evoluciona a hipoproteinemia, debido a
la marcada disminución de los valores plasmáticos de albúmina; las ovejas
generalmente sobreviven durante 1-2 semanas desde la aparición de los
síntomas. (7) (13)
FASE CRÓNICA
La más frecuente en la oveja, la población parasitaria está formada por vermes
adultos (250-300) y los síntomas se originan por la presencia de duelas en los
conductos biliares. El síntoma más aparente es la pérdida de peso,
acompañada por una anemia hemorrágica crónica e hipoalbuminemia. Los
afectados están delgados, muestran palidez de las mucosas y suelen presentar
ascitis y edema submandibular, el valor hematócrito puede llegar a ser 11-19%;
los animales enfermos pueden sobrevivir durante varias semanas e incluso,
meses. (13) (34)
En los bovinos la fasciolosis aguda y subaguda puede presentarse también, el
síndrome clínico más frecuente es la forma crónica, la cual se puede
observarse principalmente en los animales jóvenes, los síntomas que presenta
son pérdida de peso, anorexia y palidez de las mucosas la anemia es
hemorrágica y de tipo macrocítico y normocrómico. Los animales se muestran
poco vivaces e incluso letárgicos, el edema submandibular y la ascitis no son
características constantes y en ningún momento se palpa el hígado ni existe
dolor a la palpación o percusión en la región hepática, la constipación intestinal
es intensa. Al comienzo de la infección existe un incremento de las proteínas
plasmáticas totales por el aumento de las inmunoglobulinas, principalmente de
la función gamma, que desciende posteriormente por la pérdida de albúmina a
las 10-11 semanas post infección, existe también eosinofilia periférica muy
marcada. Los animales infectados muestran diarrea acompañada con pérdida
de peso y anemia, en la necropsia se pueden encontrar 200-500 fasciolas en
los conductos biliares. (7) (34) (64)
DIAGNÓSTICO
CLÍNICO (13) (24) (42) (51)
23
Consiste en determinar la actividad plasmática de algunas enzimas de origen
hepático. El incremento de la glutamato deshidrogenasa enzima mitocondrial
hepatocitaria, indica un proceso agudo reciente, descendiendo su actividad
cuando las fasciolas alcanzan la madurez sexual y se localizan en los
conductos biliares.
La actividad plásmatica de la aspartato aminotransferasa y la sorbitol
deshidrogenasa también aumentan durante la migración de los vermes por el
parénquima hepático aunque son enzimas menos hepatoespecíficas.
La gamma-glutamil transferasa, procedente del epitelio de los conductos
biliares, alcanza valores más elevados cuando los trematodos se encuentran
en los conductos biliares.
En ausencia de otros datos, el incremento de la actividad plásmatica de la
glutamato deshidrogenasa o la gamma glutamil transferasa indican fasciolosis
aguda y subaguda o crónica, respectivamente pudiendo utilizarse también para
comprobar la eliminación de los parásitos tras el tratamiento terapéutico.
PARASTIOLÓGICO
Se realiza mediante la detección de huevos de Fasciola hepatica en las heces
de los animales sospechosos es útil para diagnosticar fasciolosis crónica. Se
tiene mediante métodos de flotación o sedimentación, consiste en utilizar
sustancias de alta densidad como el sulfato de zinc o el yodo mercuriato
potásico, el inconveniente de las técnicas de flotación es la deformación y
colapso de los huevos por fenómenos osmóticos, debido a las soluciones
utilizadas. La flotación con sulfato de zinc es una técnica muy difundida pero
ineficaz ante escasas eliminaciones de huevos, recomendándose entonces los
métodos de sedimentación. (13) (64)
Los métodos de sedimentación se basan en la mayor densidad de los huevos
de los trematodos que el detritus que se hallan en las heces, lo que permite
concentrarlos en el sedimento tras repetidos lavados. La adición de un
colorante de contraste al sedimento permite destacar el color amarillo dorado
de los huevos. (34) (64)
INUMODIAGNOSTICO
24
Se han descrito varias técnicas, la técnica más difundida es el ELISA con
diferentes modificaciones, consiste en utilizar antígenos somáticos o de
excreción-secreción del parásito. La mejora de los métodos de purificación
antigénica ha incrementado la sensibilidad y especificidad de esta prueba. (40)
En la actualidad, se trata, mediante técnicas de biología molecular, consiste en
caracterizar genes de Fasciola hepatica que codifiquen antígenos específicos,
cuya expresión en un sistema heterólogo permitiría su obtención en cantidad
suficiente y aumentaría la especificidad y sensibilidad de estas pruebas. Las
técnicas de inmunodiagnotstico permite detectar la infección por F. hepática
durante el período de prepatencia y para la realización de estudios
epidemiológicos. (13)
HALLAZGOS DE NECROPSIA
Se le practica en animales recientemente muertos o se sacrifica al animal que
presente signos graves de la enfermedad. Mediante esta se evidencia un
hígado hipertrofiado y hemorrágico, con numerosas fasciolas en el parénquima
hepático e incluso en el peritoneo, bazo, páncreas y pulmones, también se
aprecia colangitis crónica, oclusión biliar, fibrosis hepática, engrosamiento y
calcificación de los conductos biliares. (13) (52)
TRATAMIENTO
La terapéutica de la fasciolosis debe ir dirigida tanto contra las fasciolas adultas
como contra las formas inmaduras en migración por el parénquima hepático,
con el fin de restaurar la función hepática. (13) (48)
En la fasciolosis aguda el fármaco de elección es el triclabendazol por su alta
eficacia sobre fasciolas inmaduras. En la fasciolosis subaguda, el
triclabendazol también es el de elección, también se puede utilizar el clorsulón,
netobimín, nitroxinil y la brotianida. En la fasciolosis crónica se pueden utilizar
todos los antihelmínticos eficaces contra fasciolas adultas (triclabendazol,
clorsulón, closantel, netobimin, nitroxinil brotianida, oxiclozanida, albendazol y
sulfoxido de bitionol). La oxiclozanida es el único fasciolicida utilizable durante
la lactación ya que no es necesario el período de supresión. (13) (48)
25
Cuadro N° 01 Fármacos usados contra Fasciola hepatica
FÁRMACO DOSIS (mg/Kg)
7.5 (oveja)10 (vaca)60 (vaca)60 (vaca)
Brotianida 6 (oveja)Clorsulón 7 (vaca)
3 (vaca)5 (oveja)20 (vaca)20 (oveja)10 (vaca)10 (oveja)10 (vaca)15 (oveja)10 (vaca)15 (oveja)
Oxiclozanida
Triclabendazol
Albendazol
Bitionol
Closantel
Neotibimín
Nitroxinil
Fuente: Elaboración propia según bibliografía (13) (48)
2.2.3.2 FASCIOLOSIS HUMANA
PATOGENIA Y FISIOLOGÍA
Fasciola hepatica realiza tres acciones en su mecanismo patógeno (42):
1. Acción expoliadora: esta acción tiene importancia debido a que el parasito es
hematófago.
2. Acción mecánica: el parasito oblitera los pequeños y gruesos conductos
biliares, con lo que interrumpe las secreciones del coléodoco.
3. Acciones tóxicas e irritativas: son las más importantes en la determinación
de las lesiones del hígado y la causa de los síntomas de la fasciolosis hepática.
La anatomía patológica de la fasciolosis en humanos no se ha estudiado
debidamente, pero se considera que la enfermedad provocada en los hígados
animales sea similar a la que ocurre en el hombre. (42)
El hígado se encuentra hipertrofiado y presenta gruesos cordones fibrosos de
color blanco, que contrasta con el color pardo normal de este órgano; estos
cordones ocupan con preferencia la cara inferior del hígado y la recorren
superficialmente bajo la cápsula fibrosa, durante una parte de su trayecto, para
luego profundizar en el parénquima hepático. Dichos cordones son conductos
biliares hipertrofiados y esclerosados; al corte la luz de estos conductos se
encuentra estrechada a veces muy reducida y dejan salir una materia oscura
26
mucopurulenta de huevos, a veces de una arenilla oscura, de excretas del
parásito y de dístomas en número variable. En las infecciones antiguas e
intensas, la arenilla (concreciones arenosas) forma tubos calcáreos de color
negro, que tapizan interiormente los conductos biliares hipertrofiados. (42) (48)
MANIFESTACIONES CLÍNICAS
FASE AGUDA O INVASIVA
Esta fase coincide con el período durante el cual los parásitos inmaduros
migran a través de la cavidad peritoneal, penetran la cápsula de Glisson y
alcanzan el parénquima hepático. Los síntomas se deben al mecanismo
destructivo que sufre el peritoneo y el tejido hepático por el paso de estas
formas inmaduras, que causan reacciones tóxicas y alérgicas, esta fase puede
durar 2 a 4 meses; sin embargo, en áreas endémicas la reinfección con
Fasciola hepatica suele ser frecuente, entonces las lesiones aguda pueden
superponerse a la enfermedad crónica. El paciente presenta un elevada
eosinofilia sanguínea, fiebre, dolor abdominal, trastornos gastrointestinales,
urticaria y hepatoesplenomegalia. (27) (42)
FASE LATENTE
Cuando el parásito llega a los conductos biliares, alcanza la madurez sexual e
inicia la oviposición, comienza el período conocido como fase patente o latente,
que puede durar mese o años. El paciente presenta una inexplicable y elevada
eosinofilia sanguínea, podría sugerir una infección helmíntica y además los
pacientes suelen referir trastornos gastrointestinales u otro de los síntomas
mencionados en la fase aguda. (27) (42)
FASE OBSTRUCTIVA
En esta la presencia del parásito adulto dentro del conducto biliar causa
inflamación e hiperplasia del epitelio del mismo, así como engrosamiento y
dilatación, lo que trae como resultado colangitis y colecistitis, lo cual constituye
junto con el cuerpo del parásito la causa de una obstrucción mecánica del
conducto biliar. (27) (42)
27
DIAGNÓSTICO
DIRECTO
El diagnóstico de certeza de fasciolosis está basado en el hallazgo de los
huevos del parásito en heces o en el fluido duodenal del individuo parasitado.
Sin embargo, este diagnóstico nunca podría realizarse durante la fase aguda
de la enfermedad, debido a que el parásito se encuentra migrando en el
parénquima hepático sin llegar a la madurez sexual. Una vez iniciada la
oviposición aún es difícil el diagnóstico puesto que la excreción de huevos es
intermitente y muchos casos no son diagnosticados mediante un simple
examen parasitológico. Por estas razones, en estos casos el hallazgo de los
huevos del parásito requiere del empleo de técnicas coproparasitológicas de
concentración. La realización de varios exámenes seriados o de la intubación
dudodenal que provoca molestias y es traumática para el paciente. Las
técnicas parasitológicas empleadas en la fase crónica de la infección van
desde un simple examen directo de las heces, hasta la aplicación de varias
técnicas de concentración como la copa cónica, el método de Ritchie y técnicas
de cuantificación como la de Kato Katz; pero en general todas estas técnicas
poseen baja sensibilidad, por lo que son utilizadas en el diagnóstico individual.
(1) (42) (5)
INDIRECTO
INMUNODIAGNÓSTICO
TÉCNICAS PARA MEDIR LA RESPUESTA CELULAR
La evaluación de la respuesta celular específica requiere generalmente del
empleo de técnicas complejas, caras y de difícil uso como diagnóstico de rutina
por lo que no son utilizadas; la intradermorreacción o reacción cutánea se
emplea ocasionalmente porque es simple y sensible, pero debido a su elevada
inespecificidad ya no se usa actualmente. (42)
TÉCNICAS DE DETECCIÓN DE ANTICUERPOS
28
Los métodos de inmunodiagnóstico basados en la detección de anticuerpos
son mucho más rápidos y factibles para el diagnóstico diario, dentro de estas
se tiene las de precipitación en gel, de aglutinación, fluorescencia, ensayos
inmunoenzimáticos, etc., la desventaja de estas técnicas es la incapacidad de
diferenciar una infección pasada de una reciente y el elevado número de
reacciones cruzadas que se presentan con otras entidades parasitarias. Una
de las de mejores resultados ha sido el ELISA indirecto en la cual se utilizan
antígenos de excreción-secreción de parásitos adultos de Fasciola hepatica.
(40) (42)
DETECCIÓN DE ANTÍGENOS
Mediante la cual es capaz de detectar la infección activa. Se tiene ELISA tipo
“sandwich”, que utiliza para la captura de los antígenos un anticuerpo
monoclonal antiantígenos de excreción-secreción de gusanos adultos de
Fasciola hepatica de la clase IgG2, (AcM ES78). Mediante este método es
posible detectar la infección activa en todas sus etapas, mediante la detección
de antígenos en suero o antígenos circulantes en las primeras 5 semanas de
infección, a partir de la sexta semana posinfección y durante toda su evolución,
antígenos en heces o coproantígenos. (42) (62)
TRATAMIENTO
La emetina fue una de las primeras de gran eficacia utilizadas en el tratamiento
de fasciolosis hepática; hoy en día aún se sigue utilizando, así como la
dihidroemetina pero la aplicación debe ser muy cuidadosa, con el paciente
hospitalizado. Otra droga de gran eficacia es el bithionol, que aunque menos
que la emetina, produce severos efectos secundarios, además de requerir
muchos días de tratamiento. Tanto la emetina como el bithionol no poseen gran
eficacia cuando se trata de las formas migratorias del parásito. (42)
La droga de elección sería el triclabendazol, la cual es segura por los efectos
secundarios son mínimos y se utiliza en dosis únicas o repetirse una segunda
dosis a las 24 horas, se han obtenido grandes éxitos en el tratamiento de
fasciolosis aguda y crónica, además de ser la única con eficiencia en la
eliminación de los parásitos inmaduros, tanto en el hombre como en los
animales. (28) (42) (48)
29
En el cuadro N° 02, se tiene los diferentes fármacos que se usan tanto para
fasciolosis aguda y crónica.
Cuadro N° 02 Fármacos usados contra la Fasciola hepatica
FÁRMACO DOSIS
Emetina 60 mg/día (por 10 días IM)
Dihidroemetina 90 mg/día (por 10 días IM)
40 mg/Kg/día (por 40 días fasciolosis aguda)
25 mg/Kg/día (por 40 días fasciolosis crónica)
Nitazoxanida 500 mg/día (por 7 días VO)
Triclabendazol 10 mg/Kg (una dosis, fasciolosis aguda y crónica)
Bithionol
Bithionol
Fuente: Elaboración propia según bibliografía (42) (28)
2.2.4 PRINCIPIOS DE LOS ENSAYOS BIOLÓGICOS DE TOXICIDAD
2.2.4.1 PRINCIPOS GENERALES (41)
La toxicología ha sido definida como el estudio de los efectos de los agentes
químicos sobre los materiales biológicos, con especial énfasis en las acciones
perjudiciales. En esencia abarca la comprensión de todos los efectos de
prácticamente todas las sustancias químicas sobre todos los tipos de materia
viva; es evidente que toda sustancia química es capaz, en algunas
condiciones, de producir algún tipo de efecto sobre cualquier tejido biológico.
2.2.4.2 PRINCIPIOS DE METODOLOGÍA TOXICOLÓGICA EXPERIMENTAL
Los principios de metodología toxicológica están basados en la premisa de que
todos los efectos de las sustancias químicas en los tejidos vivos son el
resultado de una reacción con o interacción entre cualquier entidad química
dada y algún componente del sistema biológico vivo, esta reacción inicial
puede no ser evidente. El resultado de esta reacción se manifiesta como un
efecto en una función y en muchos casos en la estructura del sistema biológico.
30
El efecto en la función puede ir no necesariamente acompañado por un cambio
detectable en la estructura del sistema biológico, es decir sólo una lesión
bioquímica. Este efecto puede se reversible a falta de una exposición
continuada a la sustancia química, o bien puede ocasionar la muerte de la
célula. (41)
Como resultado del desarrollo de esta metodología toxicológica, han llegado a
ser evidentes ciertos principios generales. Estos principios se aplican a muchos
o quizás a todos los procedimientos de ensayo toxicológico
Son los siguientes (41):
Para que un agente químico produzca un efecto biológico, debe entrar en
contacto inmediato con las células en consideración.
1. Para cada sustancia química existe una cantidad por debajo de la cual no
produce efecto detectable en ningún sistema biológico y una cantidad con la
cual produce un efecto significativo en todos los sistemas biológicos. Entre
estos extremos se encuentra el intervalo de cantidades en el que toda
sustancia química ocasionará un efecto significativo en algunos tipos de
sistemas biológicos.
2. Las células que tienen funciones parecidas y vías metabólicas similares en
varias especies por lo general se verán afectadas de forma parecida por una
entidad química dada.
3. Pequeños cambios en la estructura de un agente químico pueden influir en
gran manera en su acción biológica.
2.2.4.3 CONCENTRACIÓN RESPUESTA EN LOS ENSAYOS
TOXICOLÓGICOS
Siempre que se determinan el efecto de una sustancia química en un único
animal de experimentación, se pueden obtener dos tipos de datos. Uno es el
dato de tipo “todo o nada”, en el que un efecto se da o no se da (el animal vive
o muere). El segundo tipo de datos son las respuestas graduales en las que se
da un efecto que puede ser de una intensidad específica, como un efecto en
algún tipo de función, una disminución del ritmo cardiaco o incluso un aumento
en el número de tumores. Este último tipo de efecto debe ser siempre
cuantificado. Esto frecuentemente se hace, para un efecto dado en forma de
31
porcentaje con respecto a la normalidad o como incidencia del efecto en un
grupo determinado de animales de experimentación. (41)
2.2.4.4 CURVA DOSIS-RESPUESTA
Si se obtiene una respuesta de una magnitud definida para cada dosis, dentro
de un rango de dosis, se dice que la respuesta es gradual. Es decir que a
diferentes dosis se observan los efectos que varían en forma continua y tienen
un valor único para cada dosis. En algunas ocasiones la relación dosis-efecto
no es tan definida y dentro de una población se observa una distribución de
respuestas para cada dosis. En este caso el efecto que se mide no es la
magnitud, se mide el porcentaje de la población en estudio que presenta una
determinada respuesta para cada dosis suministrada. Este tipo de efecto se le
denomina cuantal. En estos casos se acostumbra graficar, en la ordenada, el
por ciento de la población que presenta un determinado valor de la respuesta y
en la abscisa, el logaritmo de la dosis suministrada. (55)
2.2.4.5 PARÁMETROS FÁRMACO-TOXICOLÓGICOS (55)
DE50: Si se trata de la curva dosis-efectos terapéuticos se le llama DE50
(Dosis Efectiva, nivel 50%). Cuando se midieron efectos graduales la DE50 es
la dosis que produce una respuesta igual a la mitad de la respuesta máxima. Si
se midieron efectos cuantales, entonces la DE50 es la dosis que produce una
respuesta deseable determinada en el 50 % de la población. Este parámetro se
obtiene trazando una line horizontal del punto del 50% de respuesta en la
región lineal de la curva de dosis-efectos deseables; en el punto de
intersección con la curva se traza una línea vertical. El punto en el cual la línea
intercepta la abscisa es la DE50.
DL50: Dosis Letal 50, dosis individual de una sustancia que provoca la muerte
del 50% de la población animal debido a la exposición a la sustancia por
cualquier vía distinta a la inhalación. Normalmente expresada como miligramos
o gramos de material por kilogramo de peso del animal.
CL50: Concentración letal 50, es la concentración, obtenida por estadística, de
una sustancia de la que puede esperarse que produzca la muerte, durante la
32
exposición o en un plazo definido después de ésta, del 50% de los animales
expuestos a dicha sustancia durante un periodo determinado. El valor de la
CL50 se expresa en peso de sustancia por unidad de volumen de aire normal
(miligramos por litro, mg/L).
INDICE TERAPÉUTICO (IT) Y MARGEN DE SEGURIDAD (MS): Son
números útiles en estudios farmacológicos. El índice terapéutico (Ec. 01) es el
cociente que resulta de dividir la dosis requerida para producir un efecto letal
por la dosis requerida para producir un efecto deseado, usualmente se hace la
comparación de las dosis medias.
¿=DL50DE 50
(Ec .01)
El margen de seguridad (Ec. 02) se calcula dividiendo la DL1 (efectos letales
en el 1% de la población) por la DE99 (efectos deseables en el 99% de la
población)
MS= DL1DE 99
(Ec .02)
2.2.4.6 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (41)
La concentración letal media conocida generalmente como CL50 es aquella
concentración de compuesto que produce la muerte del 50% de los animales.
La CL50 es un valor virtual obtenido estadísticamente, se trata de un valor
calculado que representa la mejor estimación de la concentración requerida
para producir la muerte en el 50 % de los animales y, por lo tanto siempre va
acompañada de algunos tipos de estimación del error del valor hallado, tal
como su intervalo de probabilidad.
Los límites del intervalo de probabilidad se escogen arbitrariamente para
indicar que se obtendrían resultados similares en un 90 o 95 por 100 de los
ensayos llevados a cabo de una forma idéntica a la descrita. Se dispone de
varios métodos para efectuar este cálculo uno de ellos el método del papel
cuadriculado logarítmico de probit de Miller y Tainter (1994).
33
La CL50 se obtiene a partir de la curva trazando una line horizontal desde el
punto correspondiente al 50 % de mortalidad del eje de ordenadas hasta su
intersección con dicha curva. A partir de dicho punto de intersección se traza
una línea vertical que corta al eje de las abscisas en el punto correspondiente a
la CL50. Es evidente que a partir de esta curva y por un procedimiento similar
se puede obtener información con respecto a la concentración letal para el 95%
o el 5% de los animales. La CL84 (concentración letal para el 84% de los
animales) representa +1 DT (desviación típica) de la CL50, y la CL16
(concentración letal para el 16 % de los animales) representa -1 DT de la CL50.
El tanto por ciento de mortalidad puede convertirse en probits, que son
números asignados a porcentajes, de manera que una mortalidad del 50 % es
igual a un probit de 5, una mortalidad del 50% ± 1 DT es igual a un probits de 6
o 4, respectivamente, una mortalidad del 50% ± 2 DT es igual a un probit de 7 o
3.
2.2.4.7 POTENCIA FRENTE A TOXICIDAD
Cuando se obtiene datos para dos compuestos, designados como A y B, las
curvas que representan la relación entre la concentración y la incidencia de la
muerte.
Si la CL50 del compuesto B es mayor que la de A, puede decirse que el
compuesto B es menos potente que el A. Además, si sólo se consideran
concentraciones y letalidad, cabe decir que el compuesto A es más toxico que
el compuesto B.
Esto indica que potencia (expresada como cantidad de sustancia química
implicada) y toxicidad (expresada como nocividad) son términos relativos que
solo pueden ser empleados con respecto a otra sustancia química. Por lo tanto
uno de los criterios que se pueden seguir para describir las toxicidades
relativas de dos compuestos es el de la relación de las concentraciones
requeridas para producir un mismo efecto. (41)
34
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO
3.1.1 MUESTRA VEGETAL
En la realización del presente estudio se utilizaron las hojas secas de la
especie vegetal Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, las cuales fueron
recolectadas en la localidad de Kasakhunka (3800 msnm), provincia de Anta,
Departamento del Cusco.
3.1.2 MUESTRA PARASITOLÓGICA
Los miracidios (huevos de fasciola adulta) y las fasciolas adultas, se
recolectaron del camal de Ka’yra, distrito de San Jerónimo, Departamento del
Cusco.
3.1.3 MEDIO DE CULTIVO
Se utilizó solución de Hedon Fleig modificado (Anexo N° 02)
35
3.2 MATERIALES E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO
3.2.1 MATERIALES DE CAMPO
Bolsa de tela
Cuchillo
Cámara fotográfica
Cuaderno de campo
3.2.2 MATERIALES DE LABORATORIO
Vasos de precipitado de 100, 200 mL
Tubos de ensayo
Embudos de vidrio
Pipetas de 1 mL a 10 mL
Micropipetas
Frascos ISO de 250 mL y 500 mL
Probeta de 100 mL y 1000 mL
Baguetas
Gradilla
Placas de Petri
Pinzas
3.2.3 INSTRUMENTOS DE LABORATORIO
Balanza analítica electrónica Sartorius, sensible a 0.01-0.0001g
Refrigeradora marca Inresa
Autoclave artesanal capacidad 14L
Cocinilla a gas
Evaporador de extractos Sirema modelo E40L
Estufa Citecil Mod 2001
36
Incubadora Memmert Tº máx.70 ºC
Ph-metro HACH EC20 Portable
Microscópio Labor Tech binocular (10x, 20x, 40x, 100x oil)
Rotavapor Buchi Mod B-491
Molino de granos artesanal
3.2.4 REACTIVOS
Agua destilada
Etanol 70º
Cloroformo QP
3.2.5 OTROS MATERIALES
Guantes
Detergente
Barbijos
Incubadora artesanal
Gorras quirúrgicas
Frascos de vidrio 130, 500 y 700 mL
Jeringas 1, 20 mL
Equipo de venoclisis
Bisturí Nro. 24
Cronómetro
Colador (Nro 16 y 60)
Mechero artesanal
3.3 RECURSOS E INFRAESTRUCTURA
Laboratorio de Microbiología Farmacéutica e Industria Farmacéutica de la
Carrera Profesional de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional
de San Antonio Abad del Cusco.
Laboratorio de Parasitología de la carrera Profesional de Biología de la
Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
37
Laboratorio de Química Orgánica de la Carrera profesional de Química de
la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco.
3.4 METODOLOGÍA
3.4.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN
La presente investigación constituye un estudio cuasi experimental ya
que tuvo como propósito determinar la actividad antihelmíntica in vitro de
los extractos de las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente
a Fasciola hepatica.
3.4.2 DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
DEL ENSAYO DE LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA DE LOS EXTRACTOS
Se realizó un diseño con post prueba y grupo control negativo
A. MIRACIDIO
5G1 X1 O1
5G2 X2 O2
5G3 X3 O3
5G4 X4 O4
5G5 X5 O5
5G6 --- O6
Donde:
5G1, 5G2, 5G3, 5G4, 5G5, 5G6: Miracidios cada grupo formado por
uno con 5 repeticiones.
X1: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
1%.
X2: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.5%.
X3: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.25%.
38
X4: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.125%.
X5: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.0625%.
------: Solución usada como blanco (agua destilada).
O1, O2, O3, O4, O5, O6: Observación de la motilidad del miracidio vivo (rápida,
lenta) y muerte durante 62 minutos.
B. FASCIOLA ADULTA
5 G1 X1 O1
5 G2 X2 O2
5 G3 X3 O3
5 G4 --- O4
Donde:
5G1, 5G2, 5G3, 5G4: Fasciolas adultas cada grupo formado por dos con
cinco repeticiones.
X1: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
1%.
X2: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.5%.
X3: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) al
0.25%.
-----: Solución usada como blanco (SHFM, Anexo Nº 02).
O1, O2, O3, O4: Observación de la motilidad de la fasciola adulta viva
(móvil, semimóvil, parálisis espástica, parálisis flácida) y muerte durante el
tiempo que dure el experimento
DE LA PRUEBA PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA
Se realizó un diseño con post prueba y un grupo control negativo
39
A. PRUEBA PRELIMINAR
3 G1 X1 O1
3 G2 X2 O2
3 G3 X3 O3
3 G4 --- O4
Donde:
3G1, 3G2, 3G3, 3G4: Fasciolas adultas cada grupo formado por diez, con
tres repeticiones.
X1: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
1000 ppm.
X2: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
100 ppm.
X3: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
10ppm.
-----: Solución usada como blanco (solución Hedon Fleig modificado).
O1, O2, O3, O4: Conteo de fasciolas adultas muertas transcurrido a las 18
horas.
B. PRUEBA DEFINITIVA
3 G1 X1 O1
3 G2 X2 O2
3 G3 X3 O3
3 G4 --- O4
Donde:
3G1, 3G2, 3G3, 3G4: Fasciolas adultas cada grupo formado por diez, con
tres repeticiones
X1: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
1000 ppm.
40
X1: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
900 ppm.
X2: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
600 ppm.
X3: Concentración de los extractos (acuoso, etanólico 70º y clorofórmico) a
300 ppm.
-----: Solución usada como blanco (solución Hedon Fleig modificado).
O1, O2, O3, O4: Conteo de fasciolas adultas muertas transcurrido a las 18
horas.
41
3.4.3 VARIABLES
3.4.3.1 DE LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA DE LOS EXTRACTOS
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIÓN NATURALEZA MEDICIÓN ESCALA INDICADOR INSTRUMENTO
Extracto acuoso: Es la cantidad de hojas (molidas) expuestas a SHFM (Droga obtenida por infusión (25))
Cuantitativa Directa Razón g/mLBalanza analíticaProbeta
Extracto seco hidroalcohólico: Es la cantidad del extracto (producto sólido obtenido por evaporación del etanol (25)) disueltas en SHFM
Cuantitativa Directa Razón g/mLBalanza analíticaProbeta
Extracto seco clorofórmico: Es la cantidad del extracto (producto sólido obtenido por evaporación del cloroformo (25) ) disueltas en SHFM
Cuantitativa Directa Razón g/mLBalanza analíticaProbeta
42
VARIABLE DEPENDIENTE
MIRACIDIODEFINICIÓN NATURALEZA MEDICIÓN ESCALA INDICADOR INSTRUMENTO
Actividad antihelmíntica: Capacidad inherente de una sustancia de origen natural o sintético que provoca la expulsión de los helmintos ya sea matándolos e incitando en ellos una conducta de huida (17)
Cuantitativa Directa RazónMiracidio muertoMiracidio vivo
Microscopio
FASCIOLA ADULTA
DEFINICIÓN NATURALEZA MEDICIÓN ESCALA INDICADOR INSTRUMENTO
Actividad antihelmíntica: Capacidad inherente de una sustancia de origen natural o sintético que provoca la expulsión de los helmintos ya sea matándolos e incitando en ellos una conducta de huida. (17)
Cuantitativa Directa RazónFasciola adulta muertaFasciola adulta viva
Vista
43
3.4.3.2 DE LA CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA DE LOS EXTRACTOS
VARIABLE INDEPENDIENTE
DEFINICIÓN NATURALEZA MEDICIÓN ESCALA INDICADOR INSTRUMENTO
Extracto acuoso: Es la cantidad de hojas (molidas) expuestas a SHFM (Droga obtenida por infusión (25))
Cuantitativa Directa Razón ppm (mg/L)Balanza analíticaProbeta
Extracto seco hidroalcohólico: Es la cantidad del extracto (producto sólido obtenido por evaporación del etanol (25)) disueltas en SHFM
Cuantitativa Directa Razón ppm (mg/L)Balanza analíticaProbeta
Extracto seco clorofórmico: Es la cantidad del extracto (producto sólido obtenido por evaporación del cloroformo (25)) disueltas en SHFM
Cuantitativa Directa Razón ppm (mg/L)Balanza analíticaProbeta
44
VARIABLE DEPENDIENTE
DEFINICIÓN NATURALEZA MEDICIÓN ESCALA INDICADOR INSTRUMENTO
Concentración letal: Es aquella que causa la muerte de un porcentaje de animales expuestos experimentalmente a ella, durante un tiempo específico y bajo condiciones controladas. (41)
Cuantitativa Directa RazónNúmero de fasciolas muertas Vista
45
3.5 PROCEDIMIENTO
FLUJOGRAMA DE LA INVESTIGACIÓN
Fuente: Elaboración propia
46
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
RECOLECCIÓN DE Ambrosia arborescens Mill “MARCU”
OBTENCIÓN DE LOS PARÁSITOS
SECADOY
MOLIENDA
PRUEBAS IN VITRO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓNLETAL MEDIA
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Y PORCENTAJE
DE RENDIMIENTO
FASCIOLAS ADULTAS
MIRACIDIOS
PRUEBAS IN VITRO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA Y EL TIEMPO DE MUERTE DE LOS PARÁSITOS
3.5.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
3.5.1.1 RECOLECCIÓN
Las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, fueron recolectadas de la
comunidad Kasakhunka, perteneciente a la provincia de Anta, departamento
del Cusco, zona situada a 3800 msnm, en el mes de enero durante horas de la
mañana en una bolsa de tela.
3.5.1.2 SECADO Y MOLIENDA
El material recolectado (hojas) fue secado a la sombra en un ambiente
ventilado durante 30 días, y la molienda se realizó con un molino de granos.
3.5.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS Y PORCENTAJE DE
RENDIMIENTO
El material seco y molido se sometió a un proceso de extracción de la siguiente
manera:
Extracto acuoso: Se obtuvo por infusión con solución Hedon Fleig modificado
a una temperatura de ebullición, luego se dejo hasta que alcance la
temperatura ambiente.
Extracto etanólico a 70º: Se obtuvo por maceración en un frasco oscuro con
etanol a 70º a temperatura ambiente por 10 días, después se procedió a
concentrar el extracto a sequedad haciendo uso de un evaporador de extractos
a 37 ºC.
Extracto clorofórmico: Se obtuvo por maceración en un frasco oscuro con
cloroformo a temperatura ambiente por 10 días, después se procedió a
concentrar el extracto a sequedad haciendo uso de un rotavapor a 37 ºC,
finalmente se dejó evaporar al medio ambiente por 7 días.
47
Seguidamente se procedió a determinar el porcentaje de rendimiento mediante
la siguiente fórmula:
%E=PfPiX 100
Donde:
%E: Porcentaje de rendimiento
Pf: Peso final (extracto seco)
Pi: Peso inicial (muestra molida)
3.5.3 OBTENCIÓN DE LOS PARÁSITOS
Miracidio: Se recolectaron del camal de San Jerónimo de los hígados de los
animales que presentaban lesiones compatibles con la fasciolosis. Las
vesículas biliares fueron separadas, luego el líquido biliar fue depositado en un
frasco con tapa rosca (capacidad 4 L) para su traslado al laboratorio.
En el laboratorio la bilis fue tamizada con un colador (Nro 60), hacia un frasco
(700 mL), aforando con agua destilada hasta 400 mL, dejando sedimentar por
30 minutos, después se eliminó el sobrenadante haciendo uso de una jeringa y
una manguera de equipo de venoclisis dejando en el recipiente 100 mL, dicho
procedimiento se repite hasta obtener una solución límpida, después al
recipiente que contiene los huevos de fasciola adulta se afora con agua
destilada hasta 600 mL, luego el frasco se introduce a una incubadora
artesanal dejando por un tiempo de 13 días y temperatura de 28 ºC, finalmente
se induce la eclosión de los huevos por cambios bruscos de temperatura frío -
calor.
Fasciola adulta: Se recolectaron del camal de San Jerónimo, para lo cual se
inspeccionaron los hígados de los animales para detectar al parásito, después
se recolectaron las fasciolas en un colador (Nro. 16) y fueron lavadas con
solución fisiológica, después se depositaron en un termo conteniendo solución
Hedon Fleig modificado (ANEXO Nº 02) a 37 ºC, finalmente fueron trasladados
al laboratorio.
48
En el laboratorio las fasciolas fueron lavadas nuevamente con solución
fisiológica.
3.5.4 PRUEBAS IN VITRO PARA DETERMINAR LA ACTIVIDAD
ANTIHELMÍNTICA (56)
ACTIVIDAD ANTIHELMINTICA FRENTE A MIRACIDIO
Se evaluaron 5 concentraciones diferentes de los extractos (acuoso, etanólico
a 70º y clorofórmico) de las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
obtenidas a partir de una solución madre al 2%. Se realizaron 5 réplicas de
cada una, se utilizaron placas multipozos (12x8 pozos) con pozos de 300 µL
de capacidad, cada pozo contenía 100 µL de agua destilada (contiene un
miracidio, que fue capturado mediante el uso de un microscopio y una
micropipeta) y 100 µL de la solución de los extractos secos (acuoso, etanólico a
70º y clorofórmico), para obtener un volumen final de 200 µL y una
concentración final de 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% y 0.0625% respectivamente.
Se mantuvo un grupo control negativo en agua destilada y para medir la
actividad antihelmíntica se evaluó la motilidad del miracidio vivo (movimiento
rápido, movimiento lento) y muerte, la cual fue observada con un microscopio
en tiempos fraccionados adecuadamente para cada extracto (duración del
experimento fue de 62 minutos). Así mismo para coadyuvar a la solubilidad del
extracto clorofórmico en la solución Hedon Fleig modificado se utilizo tween 80
(1 mL).
ACTIVIDAD ANTIHELMINTICA FRENTE A FASCIOLA ADULTA
Se utilizaron placas de Petri (9.5 X 2 cm), todos los materiales (placa de Petri,
solución Hedon Fleig y otros) fueron autoclavados por 15 minutos y la
manipulación se realizó usando un mechero. Se evaluaron 3 concentraciones
diferentes con 5 réplicas cada una de los extractos secos de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” (1%, 0.5% y 0.25%), obtenidas mediante
la disolución de 1, 0.5 y 0.25 g de los extractos secos en 100 mL de solución
Hedon Fleig modificado.
En cada placa de Petri se depositaron 25 mL de la solución a ensayar y 2
fasciolas adultas con un tamaño de 1.7-2.5 cm (11), luego se colocaron en una
49
incubadora (Memmert) a 37 ºC, las lecturas se realizaron cada 10 minutos (se
observo a cada fasciola por 10 segundos) para medir la actividad antihelmíntica
se evaluó la motilidad en la fasciola viva (móvil, semimovil, parálisis espástica,
parálisis flácida) y muerta.
Así mismo para coadyuvar a la solubilidad del extracto clorofórmico en la
solución Hedon Fleig modificado se utilizo tween 80 (2-1 mL).
3.5.5 PRUEBAS IN VITRO PARA DETERMINAR LA CONCENTRACIÓN
LETAL MEDIA SOBRE FASCIOLA ADULTA (26) (18)
A. PRUEBA PRELIMINAR
Se utilizaron frascos de vidrio (capacidad 130 mL); todos los materiales fueron
autoclavados incluyendo la solución Hedon Fleig por 15 minutos.
Se evaluaron 3 concentraciones diferentes, con 3 réplicas cada uno de los
extractos secos (acuoso, etanólico a 70º y clorofórmico) de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” (1000 ppm, 100 ppm y 10 ppm),
obtenidas mediante la disolución de 1000 mg, 100 mg y 10 mg de los extractos
secos en 1L de solución Hedon Fleig modificado (Anexo Nº 02). En cada frasco
se depositaron 100 mL de la solución a ensayar y 10 fasciolas adultas. Luego
se colocaron en una incubadora (Memmert) a 37 ºC. Las lecturas se realizaron
a las 18 horas; para medir el efecto de los extractos secos se evaluó la
motilidad de la fasciola.
B. PRUEBA DEFINITIVA
Se utilizaron frascos de vidrio (capacidad 130 mL); todos los materiales fueron
autoclavados incluyendo la solución Hedon Fleig por 15 minutos.
Se evaluaron 3 concentraciones diferentes, con 3 réplicas cada uno de los
extractos secos (acuoso, etanólico a 70º y clorofórmico) de las hojas de
Ambrosia arborescens Mill “Marcu” (300 ppm, 600 ppm y 900 ppm),
obtenidas mediante la disolución de 300 mg, 600 mg y 900 mg de los extractos
secos en 1L de solución Hedon Fleig modificado (Anexo Nº 02). En cada frasco
se depositaron 100 mL de la solución a ensayar y 10 fasciolas adultas. Luego
se colocaron en una incubadora (Memmert) a 37 ºC. Las lecturas se realizaron
50
a las 18 horas; para medir el efecto de los extractos secos se evaluó la
motilidad de la fasciola.
3.5.6 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el análisis estadístico de los datos obtenidos en la determinación de la
actividad antihelmíntica de la especie Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, se
utilizó el paquete estadístico Statistical Package for Social Sciences (SPSS)
versión 17.0.
El procesamiento de variables cuantitativas se realizó mediante el análisis de
varianza ANOVA y la prueba de DUNCAN con el 95% de confianza. Así mismo
para hallar la concentración letal media (método Probit) se utilizó el paquete
estadístico Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versión 17.0.
51
CAPITULO IV
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
TABLA Nº 01PORCENTAJE DE EXTRACCIÓN DE LOS EXTRACTOS ACUOSO,
ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO DE LAS HOJAS DE Ambrosia arborescens Mill "Marcu”
EXTRACTOPESO INICIAL
MUESTRA MOLIDA (g)
PESO FINAL EXTRACTO SECO
(g)
PORCENTAJE DE EXTRACCIÓN
(%)
Acuoso - - -Etanólico 70º 367.8 44 11.96Clorofórmico 370.8 17.6 4.74
Fuente: Elaboración propia 2010
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN:
En la tabla Nº 01 se observan los resultados del porcentaje de extracción,
donde el extracto etanólico a 70º tiene 11.96 % y el extracto clorofórmico tiene
4.74 %; se observa que el extracto etanólico a 70º tuvo un porcentaje de
rendimiento medio y el extracto clorofórmico tuvo un porcentaje de rendimiento
bajo debido al solvente usado el cual es selectivo para sustancias apolares.
Con respecto al extracto acuoso no se determinó el porcentaje de extracción
porque la droga se obtuvo por infusión.
52
TABLA N° 02TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LOS MIRACIDIOS CON LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 0.25% DE LAS HOJAS DE
Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE Y/O VIVO
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
ETANÓLICO 5 5 5.2 0.4CLOROFÓRMICO 5 5 6.0 0.7ACUOSO 5 0 62.0 0.0BLANCO 5 0 62.0 0.0
P= 0,000Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 09)
GRÁFICO Nº 01
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 09)
5.2 6
62 62
0
10
20
30
40
50
60
70
Etanólico Clorofórmico Acuoso Blanco
Min
uto
s (p
rom
ed
io)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico precedente se observan los resultados del tiempo promedio de
muerte de las muestras obtenidas, miracidios, con sus respectivas desviaciones
estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es el etanólico
con 5.2 minutos, seguido del clorofórmico con 6 minutos y finalmente el acuoso en el
cual se mantuvieron vivos con 62 minutos. Al comparar la actividad antihelmíntica
de los extractos etanólico, clorofórmico y acuoso al 0.25%, se apreció una
efectividad superior del extracto etanólico encontrándose diferencias significativas
(p<0.05), lo que demuestra que esta última es más eficaz en la extracción de la
droga activa responsable de la actividad antihelmíntica.
53
TABLA N° 03TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LOS MIRACIDIOS CON LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 0.125% DE LAS HOJAS DE
Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE Y/O VIVO (MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
ETANÓLICO 5 5 7.2 0.4CLOROFÓRMICO 5 5 8.2 0.4ACUOSO 5 0 62.0 0.0BLANCO 5 0 62.0 0.0
P= 0,000 Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 10)
GRÁFICO Nº 02
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 10)
7.2 8.2
62 62
0
10
20
30
40
50
60
70
Etanólico Clorofórmico Acuoso Blanco
Min
uto
s (
pro
me
dio
)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico adjunto se observan los resultados del tiempo promedio de
muerte de las muestras obtenidas, miracidios, con sus respectivas desviaciones
estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es el etanólico
con 7.2 minutos, seguido del clorofórmico con 8.2 minutos y finalmente el acuoso en
el cual se mantuvieron vivos con 62 minutos. Al comparar la actividad antihelmíntica
de los extractos etanólico, clorofórmico y acuoso al 0.125%, se apreció una
efectividad superior del extracto etanólico encontrándose diferencias significativas
(p<0.05), lo que demuestra que esta última es más eficaz en la extracción de la
droga activa responsable de la actividad antihelmíntica.
54
TABLA N° 04TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LOS MIRACIDIOS CON LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 0.0625% DE LAS HOJAS DE
Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE Y/O VIVO
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
ETANÓLICO 5 5 11.4 0.5CLOROFÓRMICO 5 5 13.4 0.5ACUOSO 5 0 62.0 0.0BLANCO 5 0 62.0 0.0
P= 0,000Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 11)
GRÁFICO Nº 03
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 11)
11.4 13.4
62 62
0
10
20
30
40
50
60
70
Etanólico Clorofórmico Acuoso Blanco
Min
uto
s (
pro
me
dio
)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla Nº 04 y gráfico Nº 03 se observan los resultados del tiempo promedio de
de muerte de las muestras obtenidas, miracidios, con sus respectivas desviaciones
estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es el etanólico
con 11.2 minutos, seguido del clorofórmico con 13.4 minutos y finalmente el acuoso
en el cual se mantuvieron vivos con 62 minutos. Al comparar la actividad
antihelmíntica de los extractos etanólico, clorofórmico y acuoso al 0.0625%, se
apreció una efectividad superior del extracto etanólico encontrándose diferencias
significativas (p<0.05), lo que demuestra que esta última es más eficaz en la
extracción de la droga activa responsable de la actividad antihelmíntica.
55
TABLA N° 05TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LAS FASCIOLAS ADULTAS CON LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 1% DE LAS
HOJAS DE Ambrosia arborescen0s Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE (MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CLOROFÓRMICO 10 10 70.0 4.7ETANÓLICO 10 10 201.0 5.7ACUOSO 10 10 245.0 7.1BLANCO 10 0 510.0 10.5P= 0,000Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 12)
GRÁFICO Nº 04
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 12)
70
201
245
510
0
100
200
300
400
500
600
Clorofórmico Etanólico Acuoso Blanco
Min
uto
s (
pro
me
dio
)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico precedente se observan los resultados del tiempo promedio de
muerte de las muestras obtenidas, fasciolas adultas, con sus respectivas
desviaciones estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es
el clorofórmico con 70 minutos, seguido del etanólico con 201 minutos y finalmente
el acuoso con 245 minutos. Al comparar la actividad antihelmíntica de los extractos
clorofórmico, etanólico y acuoso al 1%, se apreció una efectividad superior del
extracto clorofórmico encontrándose diferencias significativas (p<0.05), lo que
demuestra que esta última es más eficaz en la extracción de la droga activa
responsable de la actividad antihelmíntica.
56
TABLA N° 06TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LAS FASCIOLAS ADULTAS CON LOS
EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 0.5% DE LAS HOJAS DE Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE (MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CLOROFÓRMICO 10 10 99.0 5.7ETANÓLICO 10 10 268.0 12.3ACUOSO 10 10 374.0 5.2BLANCO 10 0 510.0 10.5
P= 0,000Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 13)
GRÁFICO Nº 05
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 13)
99
268
374
510
0
100
200
300
400
500
600
Clorofórmico Etanólico Acuoso Blanco
Min
uto
s (
pro
me
dio
)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico adjunto se observan los resultados del tiempo promedio de
muerte de las muestras obtenidas, fasciolas adultas, con sus respectivas
desviaciones estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es
el clorofórmico con 99 minutos, seguido del etanólico con 268 minutos y finalmente
el acuoso con 374 minutos. Al comparar la actividad antihelmíntica de los extractos
clorofórmico, etanólico, y acuoso al 0.5%, se apreció una efectividad superior del
extracto clorofórmico encontrándose diferencias significativas (p<0.05), lo que
demuestra que esta última es más eficaz en la extracción de la droga activa
responsable de la actividad antihelmíntica.
57
TABLA N°07TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE DE LAS FASCIOLAS ADULTAS CON LOS
EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO AL 0.25% DE LAS HOJAS DE Ambrosia arborescens Mill “Marcu”
EXTRACTOS NNRO. DE
PARÁSITOS MUERTOS
TIEMPO PROMEDIO DE MUERTE (MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
CLOROFÓRMICO 10 10 147.0 6.7
ETANÓLICO 10 10 383.0 11.6
ACUOSO 10 10 510.0 10.5
BLANCO 10 0 510.0 10.5P= 0,000Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 14)
GRÁFICO Nº 06
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 14)
147
383
510
510
0
100
200
300
400
500
600
Clorofórmico Etanólico Acuoso Blanco
Pro
me
dio
(m
inu
tos
)
Extractos
Muerte Vivo
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico precedente se observan los resultados del tiempo promedio de
muerte de las muestras obtenidas, fasciolas adultas, con sus respectivas
desviaciones estándar, donde el extracto que produce el menor tiempo de muerte es
el clorofórmico con 147 minutos, seguido del etanólico con 383 minutos y finalmente
el acuoso con 510 minutos. Al comparar la actividad antihelmíntica de los extractos
clorofórmico, etanólico, y acuoso al 0.25%, se apreció una efectividad superior del
extracto clorofórmico encontrándose diferencias significativas (p<0.05), lo que
demuestra que esta última es más eficaz en la extracción de la droga activa
responsable de la actividad antihelmíntica.
58
TABLA N° 08VALORES DE LA CL50-18hrs ESTIMADAS POR EL METODO PROBIT DE LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO DE LAS HOJAS
DE Ambrosia arborescens Mill “Marcu” FRENTE A FASCIOLA ADULTA
EXTRACTOSCL50-18hrs
(ppm)
LIMITE DE CONFIANZA AL 95%
LIMITE INFERIOR
LIMITE SUPERIOR
ACUOSO 456.503 334.351 569.186ETANÓLICO 398.216 302.821 478.356CLOROFÓRMICO 346.219 273.075 406.349
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 15)
GRÁFICO Nº 07
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 15)
334.4
456.5
569.2
302.8
398.2
478.4
273.1
346.2
406.3
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
LIM INF. CL 50 LIM SUP.
pp
m ACUOSO
ETANÓLICO
CLOROFÓRMICO
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En la tabla y gráfico adjunto se muestra los resultados del análisis estadístico según
el método Probit, de la concentración letal media a las 18 hrs, de los extractos de las
hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente a fasciola adulta, con sus
respectivos limites de confianza al 95%, los cuales nos indican que la variación de
los promedios se hallen entre límite superior e inferior. Se observa que la menor
CL50-18 hrs se obtiene con el extracto seco clorofórmico con 346.219 ppm, seguido
del extracto seco etanólico con 398.216 ppm y finalmente el extracto acuoso con
456.503 ppm.
CURVA SIGMOIDEA Y RECTA DE REGRESIÓN LINEAL DE LAS CL50-18 hrs DE LOS EXTRACTOS ACUOSO, ETANÓLICO 70° Y CLOROFÓRMICO DE LAS
59
HOJAS DE Ambrosia arborescens Mill “Marcu” FRENTE A FASCIOLA ADULTA
GRÁFICO Nº 08 GRÁFICO Nº 09
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 15 )
0102030405060708090
100
0 250 500 750 1000 1250 1500
Prob
it (%
mor
talid
ad)
Concentración (ppm)
Extrac clorofórmico Extrac etanólico Extrac acuoso
Fuente: Elaboración propia 2010 (Anexo N° 15)
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
En los gráficos precedentes se observa la curva sigmoidea en relación a las
concentraciones en la abscisa y Probit en la ordenada; y la linealización de la curva
sigmoidea en relación al logaritmo de la concentración en la abscisa y Probit en la
ordenada, encontrándose que para el 50% de unidades Probit les corresponde
como CL50-18h para los extractos clorofórmico, etanólico y acuoso de 346.219,
398.2166 y 456.503 ppm respectivamente. Así mismo se observa en el gráfico Nº 08
que la curva sigmoidea del extracto clorofórmico se encuentra más cerca a la
ordenada a diferencia del extracto etanólico y acuoso; en el gráfico Nº 09 se observa
que el extracto clorofórmico presenta una mayor pendiente a diferencia del extracto
etanólico y acuoso.
DISCUSIÓN
60
Con respecto a los miracidios, según los resultados obtenidos en la tabla N° 02, 03
y 04, el extracto etanólico de 70° al 0.25, 0.125 y 0.0625% es el más eficaz
(p<0.005) con los tiempos de 5.2, 7.2 y 11.4 minutos respectivamente, seguido del
extracto clorofórmico al 0.25, 0.125 y 0.0625% con los tiempos de 6, 8.2 y 13.4
minutos respectivamente y finalmente del extracto acuoso al 0.25, 0.125 y 0.0625%
en el cual sólo se observó disminución de la motilidad, más no muerte de los
miracidios, probablemente porque el tiempo de exposición fue muy corto (62
minutos). Así mismo se tiene el estudio realizado por Romero (2002), en el que se
demuestra que el extracto acuoso liofilizado al 1% de Portulaca oleracea L
“Verdolaga”, provocó la muerte de los miracidios a los 60 minutos, en tanto que en
nuestro trabajo, el extracto acuoso al 1% (infusión) de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, provocó sólo la disminución de la motilidad de los miracidios a los 62
minutos, sin producir la muerte de los mismos.
Con respecto a la fasciola adulta, según los resultados obtenidos en la tabla N° 05,
06 y 07, el extracto clorofórmico al 1, 0.5 y 0.25% es el más eficaz (p<0.005) con los
tiempos de 70, 99, y 147 minutos respectivamente, seguido del extracto etanólico de
70° al 1, 0.5 y 0.25% con los tiempos de 201, 268 y 383 minutos respectivamente y
finalmente el extracto acuoso al 1, 0.5 y 0.25% con los tiempos de 245, 374 y 510
minutos respectivamente; además se observó, que después de la exposición a la
droga la muerte del parásito es precedida de parálisis espástica en el extracto
acuoso y etanólico de 70°, y parálisis flácida en el extracto clorofórmico. Así mismo
se tiene el estudio realizado por Romero (2002), en donde el extracto acuoso al 1%
(liofilizado) de Portulaca oleracea L “Verdolaga”, produce la muerte de todas las
fasciolas adultas a las 24 horas, a diferencia de nuestro extracto acuoso al 1%
(infusión) de Ambrosia arborescens Mill “Marcu”, en la que a las 4 horas (245
minutos) las fasciolas adultas mueren. La evidencia de la actividad antihelmíntica in
vitro determinada en el presente trabajo, se presume que se pueda deber a la
presencia de saponinas para el extracto acuoso, alcaloides para el extracto
clorofórmico y lactonas sesquiterpénicas para el extracto clorofórmico de acuerdo a
lo reportado por Lezama (1993), Alvarado (2007) y Guauque (2010). De los
resultados obtenidos en la tabla N° 08 de la CL50 a las 18hrs, se tiene que los
61
extractos acuoso, etanólico 70° y clorofórmico son tóxicos para fasciola adulta de
Fasciola hepatica, obteniéndose 456.503, 398.216 y 346.219 ppm
respectivamente.
Loomis (1982) manifiesta que uno de los criterios que debe seguirse para describir
las toxicidades relativas de dos compuestos es el de la relación de las
concentraciones requeridas para producir el mismo efecto; en el presente trabajo se
evidencia que el extracto clorofórmico es el que presenta mayor potencia tóxica,
frente a los extractos etanólico de 70° y acuoso ya que para producir el 50% de
mortalidad solo se necesita de 346.219 ppm.
62
CONCLUSIONES
Se determinó la actividad antihelmíntica de los extractos y la concentración letal
media in vitro de las hojas de Ambrosia arborescens Mill “Marcu” frente a
Fasciola hepatica.
Se obtuvieron los extractos secos de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, hallándose para el extracto etanólico 70º y extracto clorofórmico un
porcentaje de extracción de 11.96 % y 4.74 % respectivamente.
En la determinación de la actividad antihelmíntica se tuvo que, para los miracidos
se registró el menor tiempo de muerte con el extracto seco etanólico a 70º,así, a
las concentraciones de 0.25, 0.125 y 0.0625% los tiempos fueron de 5.2, 7.2 y 11
minutos respectivamente; seguido del extracto seco clorofórmico a las
concentraciones de 0.25, 0.125 y 0.0625% los tiempos fueron de 6, 8.2 y 9
minutos respectivamente y finalmente del extracto acuoso en el cual se
mantuvieron vivos hasta los 62 minutos. Para la fasciola adulta se registró el
menor tiempo de muerte con el extracto seco clorofórmico, así, a las
concentraciones de 1, 0.5 y 0.25% los tiempos fueron de 70, 99 y 147 minutos
respectivamente; seguido del extracto seco etanólico a 70º a las concentraciones
de 1, 0.5 y 0.25%, los tiempos fueron de 201, 268 y 383 minutos respectivamente
y finalmente del extracto acuoso a las concentraciones de 1, 0.5 y 0.25%, los
tiempos fueron de 245, 374 y 510 minutos respectivamente.
En la determinación de la Concentración Letal Media frente a Fasciola hepatica,
el extracto clorofórmico mostró una CL50 de 346.219 ppm a las 18 horas, seguido
del extracto seco etanólico a 70º con una CL50 de 398.216 ppm y finalmente el
extracto acuoso con una CL50 de 456.503 ppm.
SUGERENCIAS
63
Realizar nuevos ensayos de actividad antihelmíntica de Ambrosia arborescens
Mill “Marcu” frente a Fasciola hepatica en otros estadios (metacercaria).
Realizar nuevos ensayos de actividad antihelmíntica de Ambrosia arborescens
Mill “Marcu” frente a otros parásitos (Ascaris lumbricoides, Giardia lamblia,
Toxocara canis).
Determinar los metabolitos secundarios del extracto clorofórmico, responsables
de la actividad antihelmíntica.
Continuar con los estudios farmacológicos para evaluar otras propiedades
atribuidas a Ambrosia arborescens Mill “Marcu”.
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71
ANEXOS
ANEXO Nº 01
CERTIFICADO DE LA PLANTA
72
ANEXO Nº 02
MEDIO DE CULTIVO
73
Solución de Hedon Fleig (Romero, 2002)
10 g glucosa
7 g NaCl
0.3 g KCl
0.1 g CaCl
1.5 g bicarbonato de sodio
0.3 g MgSO4
Se diluye en un 1L agua destilada
Solución de Hedon Fleig modificado (por el autor de esta tesis)
17.5 g glucosa
7 g NaCl
0.3 g KCl
0.1 g CaCl
2 g bicarbonato de sodio
0.3 g MgSO4
Se diluye en un 1L agua destilada
74
ANEXO Nº 03
REPORTE DE MORBILIDAD DE FASCIOLOSISDIRECCIÓN REGIONAL DE SALUD CUSCO
75
ANEXO Nº 04
REPORTE DE MORBILIDAD DE FASCIOLOSISSERVICIO NACIONAL DE SANIDAD AGRARIA CUSCO
76
ANEXO Nº 05
FICHAS DE RECOLECCIÓN DE LOS TIEMPOS DE LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA
MIRACIDIO
2 15 15 15 151 1 MR MR ML ML ML2 1 MR MR ML ML ML3 1 MR MR ML ML ML4 1 MR MR ML ML ML5 1 MR MR ML ML ML1 1 MR MR MR MR ML2 1 MR MR MR MR ML3 1 MR MR MR MR ML4 1 MR MR MR MR ML5 1 MR MR MR MR ML1 1 MR MR MR MR MR2 1 MR MR MR MR MR3 1 MR MR MR MR MR4 1 MR MR MR MR MR5 1 MR MR MR MR MR1 1 MR MR MR MR MR2 1 MR MR MR MR MR3 1 MR MR MR MR MR4 1 MR MR MR MR MR5 1 MR MR MR MR MR1 1 MR MR MR MR MR2 1 MR MR MR MR MR3 1 MR MR MR MR MR4 1 MR MR MR MR MR5 1 MR MR MR MR MR1 1 MR MR MR MR MR2 1 MR MR MR MR MR3 1 MR MR MR MR MR4 1 MR MR MR MR MR5 1 MR MR MR MR MR
Leyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento X: Muerte
Blanco
1
0.5
0.25
0.125
0.0625
Extracto Acuoso
MinutosParásito
Placa multipozos
Concentración (%)
Concentración (%) Placa multipozos
Parásito Tiempo (minutos)
Observación Tiempo (minutos)
Observación1 1 0.33 ML 0.67 X2 1 0.33 ML 0.67 X3 1 0.33 ML 0.67 X4 1 0.33 ML 0.67 X5 1 0.33 ML 0.67 X1 1 1 ML 1 X2 1 1 ML 1 X3 1 1 ML 2 X4 1 1 ML 1 X5 1 1 ML 2 X1 1 2 ML 3 X2 1 2 ML 4 X3 1 2 ML 3 X4 1 2 ML 3 X5 1 2 ML 3 X1 1 2 ML 6 X2 1 2 ML 5 X3 1 2 ML 5 X4 1 2 ML 5 X5 1 2 ML 6 X1 1 2 ML 9 X2 1 2 ML 10 X3 1 2 ML 9 X4 1 2 ML 10 X5 1 2 ML 9 X1 1 2 MR 9 MR2 1 2 MR 10 MR3 1 2 MR 9 MR4 1 2 MR 10 MR5 1 2 MR 9 MR
Extracto Etanólico 70°
1
Leyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento X: Muerte
0.5
0.25
0.125
0.0625
Blanco
Concentración (%) Placa multipozos
Parásito Tiempo (minutos)
Observación Tiempo (minutos)
Observación1 1 No se observa No se observa2 1 No se observa No se observa3 1 No se observa No se observa4 1 No se observa No se observa5 1 No se observa No se observa1 1 No se observa No se observa2 1 No se observa No se observa3 1 No se observa No se observa4 1 No se observa No se observa5 1 No se observa No se observa1 1 2 ML 4 X2 1 2 ML 4 X3 1 2 ML 3 X4 1 2 ML 4 X5 1 2 ML 5 X1 1 2 ML 6 X2 1 2 ML 6 X3 1 2 ML 6 X4 1 2 ML 6 X5 1 2 ML 7 X1 1 2 ML 11 X2 1 2 ML 12 X3 1 2 ML 12 X4 1 2 ML 11 X5 1 2 ML 11 X1 1 2 MR 11 MR2 1 2 MR 12 MR3 1 2 MR 12 MR4 1 2 MR 11 MR5 1 2 MR 11 MR
Leyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento X: Muerte
Blanco
Extracto Clorofórmico
1
0.5
0.25
0.125
0.0625
77
FASCIOLA ADULTA
Minutos Placa Parásito
A M S S E E E E E M S S S S E E E E E E E X M M M M M M M M S S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M M M M M M
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B M S S E E E E E M S S S S E E E E E E E M M M M M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M M
C S S S E E E E X M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M M M M M
D S S S E E E E X M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M M M M M
E M S E E E E E E M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S S E E E E X M M M M M M M M M M M M M M M M M
F S S E E E E E X M S S S E E E E E E E E M M M M M M M S S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M M
G S S S E E E E X M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M
H S S E E E E E E M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S S E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M
I M S E E E E E E M S S S E E E E E E E E M M M M M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M
J S S E E E E E X M S S S S E E E E E E E M M M M M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M M M M M
1 0.5 0.25 0
Extracto Acuoso (%)
10
1
2
3
4
5
Leyenda:
HM: Hipermotilidad M: Movil S: Semimovil E: Parálisis espástica F: Parálisis flacida X: Muerte
10
1
2
3
4
5
10
1
2
3
4
5
Minutos Placa Parásito
A M S S E E E E M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
B M S S E E E E M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M M
C M S S E E E E M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
D M S S E E E E M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
E M S S E E E E M M M S S S E E E X M M M M S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
F M S S E E E E M M M S S S E E E E M M M M S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
G M S S E E E E M M M S S E E E E X M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
H M S S E E E E M M M S S E E E X M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
I M S S E E E E M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
J M S S E E E X M M M S S E E E E M M M M S S S E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
A M S S E E E X M M M S S E E E E M M M S S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
B M S S E E E E M M M S S E E E X M M M S S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
C M S S E E E X M M S S S E E E X M M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
D M S S E E E X M M M S S E E E X M M M S S S E E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
E M S S E E E E M M M S S E E E E M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M
F M S S E E E X M M M S S S E E E X M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M
G M S S E E E X M M M S S E E E E M M M S S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
H M S S E E E X M M M S E E E E M M M S S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
I M S S E E E X M M M S S E E E E M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M
J M S S E E E M M M S S E E E X M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M
A S S E E E E M M S S E E E E X M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
B S S E E E E X M M S S S E E E M M M S S S E E E E E E E M M M M M M M M M M M M M
C M S E E E E M M S S S E E E M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
D S S E E E E M M S S E E E E M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
E M S S E E E X M M S S S E E E E M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M
F S S E E E E M M S S S E E E E M M M S S S S E E E E E M M M M M M M M M M M M
G S S E E E E M M S S S E E E E M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
H S S E E E E M M S S E E E E M M M S S S E E E E E E X M M M M M M M M M M M M M
I S S E E E E M M S S S E E E X M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M
J M S E E E E M M S S E E E E M M M S S S E E E E E E M M M M M M M M M M M M
Leyenda:
HM: Hipermotilidad M: Movil S: Semimovil E: Parálisis espástica F: Parálisis flacida X: Muerte
10
1
2
3
4
5
10
1
2
3
4
Extracto Etanólico 70° (%)1 0.5 0.25 0
5
10
1
2
3
4
5
Minutos Placa Parásito
A HM F HM S F HM S S F F M M M M M
B HM S X HM S F HM S S F F M M M M M
C HM S X HM S F X HM S S F X M M M M M
D HM S X HM S F X HM S S F X M M M M M
E HM S F HM S F X HM S S F F M M M M M
F HM S X HM S F X HM S S F F M M M M M
G HM S X HM S F X HM HM S F X M M M M M
H HM S X HM S F X HM HM S S X M M M M M
I HM S X HM S F X HM S S S F M M M M M
J HM F X HM S F F HM S S F F M M M M M
A HM F HM S F HM S S F F M M M M M
B HM F HM S F HM S S F F M M M M M
C HM F HM F F HM S S F M M M M
D HM F HM F F HM S S F M M M M
E HM S X HM S F HM S S F X M M M M M
F HM S HM S F HM S S F X M M M M M
G HM F HM S F HM S S F M M M M
H HM F HM F F HM S S F M M M M
I HM F HM S F HM S S F X M M M M M
J HM F HM S F X HM S S F X M M M M M
A S X HM S X HM S F F X M M M M M
B S F HM F X HM S S F X M M M M M
C S F S F F HM S S F M M M M
D S F S F F HM S F F M M M M
E HM F HM F F HM S F F M M M M
F HM F HM S F HM S F F M M M M
G S F S F F HM S S F M M M M
H S F S F F HM S S F M M M M
I S F HM S F HM S S F M M M M
J S F HM S F HM S F F M M M M
Leyenda:
HM: Hipermotilidad M: Movil S: Semimovil E: Parálisis espástica F: Parálisis flacida
X: Muerte
2
3
4
10
1
2
3
4
5
Extracto Clorofórmico (%)
1 0.5 0.25 0
5
10
1
2
3
4
5
10
1
78
ANEXO N° 06
RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LA ACTIVIDAD ANTIHELMÍNTICA
MIRACIDIOEXTRACTO ACUOSO
TABLA N° 01
BLANCO
MR MR ML V MR MR ML V MR MR V MR MR V MR MR V V
2 15 45 62 2 45 15 62 2 60 62 2 60 62 2 60 62 62
62 62
PROMEDIO
62 2 60 62 2 602 45 15 62 2 605 1 2 15 45 62
62 2 60 62 6215 62 2 60 62 2
62
4 1 2 15 45 62 2 45
62 2 60 62 2 602 45 15 62 2 603 1
60
2 15 45 62
60 62 2 60 62
62
6215 62 2 60 62 2
62 622 60 62 2 60
2 1 2 15 45 62 2 45
622 45 15 62 2 601 1 2 15 45 62
TIEMPO DE MUERTE Y/O VIVO (MINUTOS)
PLACA MULTIPOZO
PARÁSITO1% 0.5% 0.25% 0.125% 0.0625%
Leyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento
EXTRACTO ETANÓLICO A 70ºTABLA N° 02
BLANCO
ML ML X ML ML X ML ML X ML ML X ML ML X V
0.33 0.67 1 1 1.4 2.4 2 3.2 5.2 2 5.2 7.2 2 9.4 11.4 11.4
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
PLACA MULTIPOZO
PARÁSITO1% 0.5% 0.25% 0.125% 0.0625%
6 8 2 9 113 5 21 0.33 0.67 1 1 1 2 2 11
2 1 0.33 0.67 1 1 1 2 2 4 6 2 5 7 2 10 12 12
1
7 2 9 11 113 1 0.33 0.67 1 1 2 3 2
4 1 0.33 0.67 1 1 1 2 2
5 1 0.33 0.67 1 1 2 3 2 3 5 2 5 7 2 9 11 11
3 5 2 5 7 2 10 12 12
3 5 2 5
PROMEDIOLeyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento X: Muerte
EXTRACTO CLOROFÓRMICOTABLA N° 03
BLANCO
ML ML X ML ML X ML ML X ML ML X ML ML X V
2 4 6 2 6.2 8.2 2 11.4 13.4 13.4PROMEDIO
11 13 13
5 1 2 5 7 2 7 9 2 11 13 13
4 1 2 4 6 2 6 8 2
14 14
3 1 2 3 5 2 6 8 2 12 14 14
1 2 4 6 2 6 8 2 12
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
PLACA MULTIPOZO
PARÁSITO1% 0.5% 0.25% 0.125% 0.0625%
1 1
NO SE OBSERVA
NO SE OBSERVA
2 4 6 2 6 8 2 11 13 13
2
Leyenda: MR: Movimiento rápido V: Vivo ML: Movimiento lento X: Muerte
79
FASCIOLA ADULTAEXTRACTO ACUOSO
TABLA N° 04
BLANCOM S E X M S E X M S E X M
1 20 60 160 240 30 120 220 370 230 120 170 520 5201 30 70 150 250 30 140 210 380 240 110 180 530 5301 20 80 140 240 30 120 220 370 230 120 160 510 5101 20 70 150 240 30 130 210 370 230 120 160 510 5101 30 50 180 260 30 120 220 370 230 140 140 510 5101 20 60 160 240 30 100 250 380 230 140 150 520 5201 20 70 150 240 50 120 200 370 230 120 150 500 5001 20 60 170 250 50 110 210 370 230 130 140 500 5001 30 50 170 250 30 110 240 380 230 120 150 500 5001 20 60 160 240 30 120 230 380 230 120 150 500 500
23 63 159 245 34 119 221 374 231 124 155 510 510PROMEDIO
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
PLACA PARÁSITO1% 0.5% 0.25%
1
2
3
4
5
Leyenda:S: Semimóvil M: Movil E: Parálisis espástica X: Muerte
EXTRACTO ETANÓLICO A 70ºTABLA N° 05
BLANCOM S E X M S E X M S E X M
1 20 60 120 200 80 60 130 270 100 100 190 390 3901 20 60 130 210 80 70 110 260 100 100 200 400 4001 30 50 120 200 70 80 110 260 110 90 190 390 3901 20 60 120 200 80 60 120 260 100 90 200 390 3901 30 60 120 210 80 80 120 280 100 100 170 370 3701 20 60 120 200 80 90 120 290 100 110 160 370 3701 20 60 120 200 80 70 130 280 100 100 190 390 3901 20 60 120 200 80 50 120 250 100 100 190 390 3901 20 60 120 200 80 70 120 270 100 90 180 370 3701 30 50 110 190 80 60 120 260 100 90 180 370 370
23 58 120 201 79 69 120 268 101 97 185 383 383PROMEDIO
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
PLACA PARÁSITO1% 0.5% 0.25%
1
2
3
4
5
Leyenda:S: Semimóvil M: Movil E: Parálisis espástica X: Muerte
EXTRACTO CLOROFÓRMICOTABLA N° 06
BLANCOHM S F X HM S F X HM S F X M
1 20 10 30 60 30 30 30 90 30 50 70 150 1501 20 20 30 70 30 20 40 90 30 60 70 160 1601 20 20 30 70 20 20 60 100 30 60 50 140 1401 20 20 30 70 20 20 60 100 30 50 60 140 1401 30 20 30 80 30 20 50 100 30 50 70 150 1501 30 20 20 70 30 30 40 100 30 60 60 150 1501 20 20 30 70 20 30 50 100 40 50 50 140 1401 20 20 30 70 20 20 60 100 40 60 40 140 1401 20 20 30 70 30 30 40 100 30 70 50 150 1501 20 10 40 70 30 30 50 110 30 60 60 150 150
22 18 30 70 26 25 48 99 32 57 58 147 147PROMEDIO
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
PLACA PARÁSITO1% 0.5% 0.25%
1
2
3
4
5
Leyenda:S: Semimóvil M: Movil E: Parálisis espástica X: Muerte
80
ANEXO N° 07
RESULTADOS EXPERIMENTALES DE LA CL50-18hrs
PRUEBA PRELIMINAR PRUEBA DEFINITIVA
EXTRACTO ACUOSO
CONCENTRACIÓN (ppm)
1 2 3CONCENTRACIÓN
(ppm) 1 2 3
BLANCO 0/10 1/10 1/10 BLANCO 1/10 0/10 0/10
10 1/10 0/10 1/10 300 4/10 3/10 3/10
100 3/10 2/10 2/10 600 5/10 6/10 5/10
1000 8/10 9/10 10/10 900 8/10 9/10 9/10
N° DE ENSAYO N° DE ENSAYO
EXTRACTO ETANÓLICO 70°
CONCENTRACIÓN (ppm) 1 2 3
CONCENTRACIÓN (ppm) 1 2 3
BLANCO 1/0 0/10 0/10 BLANCO 1/10 0/10 1/10
10 0/10 0/10 3/10 300 3/10 4/10 4/10
100 2/10 2/10 3/10 600 7/10 6/10 6/10
1000 10/10 10/10 10/10 900 9/10 10/10 10/10
N° DE ENSAYO N° DE ENSAYO
EXTRACTO CLOROFÓRMICO
CONCENTRACIÓN (ppm) 1 2 3
CONCENTRACIÓN (ppm) 1 2 3
BLANCO 1/10 1/10 0/10 BLANCO 0/10 0/10 1/10
10 3/10 0/10 2/10 300 4/10 3/10 5/10
100 3/10 2/10 3/10 600 9/10 7/10 9/10
1000 10/10 10/10 10/10 900 10/10 10/10 10/10
N° DE ENSAYO N° DE ENSAYO
81
ANEXO N° 08
ANÁLISIS ESTADISTICO DE CADA EXTRACTO MIRACIDIO
EXTRACTO ACUOSO
CONCENTRACIÓN (%)
NTIEMPO DE VIVO MEDIA (MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTANDAR
0.25 5 62.0 0.00.125 5 62.0 0.0
0.0625 5 62.0 0.0
EXTRACTO ETANÓLICO 70°
CONCENTRACIÓN (%)
N
TIEMPO DE MUERTE MEDIA
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTANDAR
0.25 5 5.2 0.40.125 5 7.2 0.4
0.0625 5 11.4 0.5
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRATICA
F Sig.
INTER GRUPOS 100.133 2 50.067 214.571 0.000
INTRA GRUPOS 2.800 12 .233
TOTAL 102.933 14
PRUEBA DE DUNCAN
CONCENTRACIÓN (%)
NSUBCONJUNTO PARA ALFA=0.05
1 2 3
0.25 5 5.2
0.125 5 7.2
0.0625 5 11.4
Sig. 1.0 1.0 1.0
82
EXTRACTO CLOROFÓRMICO
CONCENTRACIÓN (%)
N
TIEMPO DE MUERTE MEDIA
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTANDAR
0.25 5 6.0 0.70.125 5 8.2 0.4
0.0625 5 13.4 0.5
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRATICA
F Sig.
INTER GRUPOS 144.400 2 72.200 216.600 0.000
INTRA GRUPOS 4.000 12 .333
TOTAL 148.400 14
PRUEBA DE DUNCAN
CONCENTRACIÓN (%)
NSUBCONJUNTO PARA ALFA=0.05
1 2 3
0.25 5 6.00.125 5 8.2
0.0625 5 13.4Sig. 1.0 1.0 1.0
83
FASCIOLA ADULTA
EXTRACTO ACUOSO
CONCENTRACIÓN (%)
N
TIEMPO DE MUERTE MEDIA
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
1 10 245.0 7.10.5 10 374.0 5.2
0.25 10 510.0 10.5
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRATICA
F Sig.
INTER GRUPOS 351206.667 2 175603.333 2805.497 0.000
INTRA GRUPOS 1690.000 27 62.593
TOTAL 352896.667 29
PRUEBA DE DUNCAN
CONCENTRACIÓN (%) NSUBCONJUNTO PARA ALFA=0.05
1 2 3
1 10 245.0 0.5 10 374.0
0.25 10 510.0Sig. 1.0 1.0 1.0
EXTRACTO ETANÓLICO 70°
CONCENTRACIÓN (%)
N
TIEMPO DE MUERTE MEDIA
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTÁNDAR
1 10 201.0 5.70.5 10 268.0 12.3
0.25 10 383.0 11.6
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRATICA
F Sig.
INTER GRUPOS 169460.000 2 84730.000 799.899 0.000
INTRA GRUPOS 2860.000 27 105.926
TOTAL 172320.000 29
84
PRUEBA DE DUNCAN
CONCENTRACIÓN (%)
NSUBCONJUNTO PARA ALFA=0.05
1 2 3
1 10 201.00.5 10 268.0
0.25 10 383.0Sig. 1.0 1.0 1.0
EXTRACTO CLOROFÓRMICO
CONCENTRACIÓN (%)
N
TIEMPO DE MUERTE MEDIA
(MINUTOS)
DESVIACIÓN ESTANDAR
1 10 70.0 4.70.5 10 99.0 5.7
0.25 10 147.0 6.7
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRATICA
F Sig.
INTER GRUPOS 30246.667 2 15123.333 453.700 .000
INTRA GRUPOS 900.000 27 33.333
TOTAL 31146.667 29
PRUEBA DE DUNCAN
CONCENTRACIÓN (%) NSUBCONJUNTO PARA ALFA=0.05
1 2 3
1 10 70.0
0.5 10 99.0
0.25 10 147.0
Sig. 1.0 1.0 1.0
85
ANEXO N° 09
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 0.25%
MIRACIDIO
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE Y/O VIVO (MINUTOS)ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
V M M V
1 62 5 6 622 62 6 6 623 62 5 5 624 62 5 6 625 62 5 7 62
PROMEDIO 62 5.2 6 62Leyenda:V: Miracidios vivosM: Miracidios muertos
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRÁTICA
F Sig.
INTER GRUPOS 10604.800 2 5302.400 22724.571 0.000
INTRA GRUPOS 2.800 12 0.233
TOTAL 10607.600 14
Leyenda:gl: Grados de libertadF: Distribución de FisherSig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 0.25% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia igual a 0.000 frente a miracidios.
86
PRUEBA DE DUNCAN
TABLA N° 06
EXTRACTO NSUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.051 2 3
ETANÓLICO 5 5.2
CLOROFÓRMICO 5 6.0
ACUOSO 5 62.0
BLANCO 5 62.0
Sig. 1.0 1.0 1.0
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subconjuntos de los extractos al 0.25%, se concluye que la actividad
antihelmíntica del extracto etanólico es más efectiva obteniendo el menor
tiempo de muerte de 5.2 minutos, seguido del extracto clorofórmico con 6
minutos y el extracto acuoso en el cual se mantuvieron vivos, con 62 minutos.
87
ANEXO N° 10
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 0.125%
MIRACIDIO
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE Y/O VIVO (MINUTOS)ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
V M M V
1 62 5 6 622 62 6 6 623 62 5 5 624 62 5 6 625 62 5 7 62
PROMEDIO 62 5.2 6 62Leyenda:V: Miracidios vivosM: Miracidios muertos
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRÁTICA
F Sig.
INTER GRUPOS 9830.800 2 4915.400 36865.500 0.000
INTRA GRUPOS 1.600 12 0.133
TOTAL 9832.400 14
Leyenda:gl: Grados de libertadF: Distribución de FisherSig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 0.125% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia de 0.000 frente a miracidios.
PRUEBA DE DUNCAN
88
TABLA N° 06
EXTRACTO NSUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.05
1 2 3
ETANÓLICO 5 7.2
CLOROFÓRMICO 5 8.2
ACUOSO 5 62.0
BLANCO 5 62.0
Sig. 1.0 1.0 1.0
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subconjuntos de los extractos al 0.125%, se concluye que la actividad
antihelmíntica del extracto etanólico es más efectiva obteniendo el menor
tiempo de muerte de 7.2 minutos, seguido del extracto clorofórmico con 8.2
minutos y el extracto acuoso en el cual se mantuvieron vivos, con 62 minutos.
ANEXO N° 11
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 0.125%
89
MIRACIDO
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE Y/O VIVO (MINUTOS)
ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
V M M V
1 62 11 13 622 62 12 14 623 62 11 14 624 62 12 13 625 62 11 13 62
PROMEDIO 62 11.4 13.4 62Leyenda:V: Miracidios vivosM: Miracidios muertos
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRÁTICA
F Sig.
INTER GRUPOS 8210.533 2 4105.267 20526.333 0.000
INTRA GRUPOS 2.400 12 0.200
TOTAL 8212.933 14
Leyenda: gl: Grados de libertad F: Distribución de Fisher
Sig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 0.0625% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia de 0.000 frente a miracidios.
90
PRUEBA DE DUNCAN
TABLA N° 06
EXTRACTO 0.0625% NSUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.05
1 2 3
ETANÓLICO 5 11.4
CLOROFÓRMICO 5 13.4
ACUOSO 5 62.0
BLANCO 5 62.0
Sig. 1.0 1.0 1.0
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subconjuntos de los extractos al 0.0625%, se concluye que la actividad
antihelmíntica del extracto etanólico es más efectiva obteniendo el menor
tiempo de muerte de 11.4 minutos, seguido del extracto clorofórmico con 13.4
minutos y el extracto acuoso en el cual se mantuvieron vivos, con 62 minutos.
91
ANEXO N° 12
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 1%
FASCIOLA ADULTA
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
M M M V
1240 200 60 520250 210 70 530
2240 200 70 510240 200 70 510
3260 210 80 510240 200 70 520
4240 200 70 500250 200 70 500
5250 200 70 500240 190 70 500
PROMEDIO 245 201 70 510Leyenda:V: Fasciolas vivasM: Fasciolas muerto
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVA SUMA DE CUADRADOS gl
MEDIA CUADRÁTICA F Sig.
INTER GRUPOS 165740.000 2 82870.000 2380.309 0.000
INTRA GRUPOS 940.000 27 34.815
TOTAL 166680.000 29Leyenda:gl: Grados de libertadF: Distribución de FisherSig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 1% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia de 0.000 frente a fasciola adulta.
92
PRUEBA DE DUNCAN
TABLA N° 06
EXTRACTO 1% NSUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.05
1 2 3 4
CLOROFÓRMICO 10 70.0
ETANÓLICO 10 201.0
ACUOSO 10 245.0
BLANCO 10 510.0
Sig. 1.0 1.0 1.0 1.0
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subgrupos de los extractos al 1%, se concluye que la actividad antihelmíntica
del extracto clorofórmico es más efectiva obteniendo el menor tiempo de
muerte de 70 minutos, seguido del extracto etanólico con 201 minutos y el
extracto acuoso con 245minutos.
93
ANEXO N° 13
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 0.5%
FASCIOLA ADULTA
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
M M M V
1370 270 90 520380 260 90 530
2370 260 100 510370 260 100 510
3370 280 100 510380 290 100 520
4370 280 100 500370 250 100 500
5380 270 100 500380 260 110 500
PROMEDIO 374 268 99 510Leyenda:V: Fasciolas vivasM: Fasciolas muerto
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRÁTICA
F Sig.
INTER GRUPOS 384740.000 2 192370.000 2748.143 0.000
INTRA GRUPOS 1890.000 27 70.000
TOTAL 386630.000 29
Leyenda:gl: Grados de libertadF: Distribución de FisherSig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 0.5% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia de 0.000 frente a fasciola adulta.
94
PRUEBA DE DUNCAN TABLA N° 06
EXTRACTO 0.5% NSUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.05
1 2 3 4
CLOROFÓRMICO 10 99.0
ETANÓLICO 10 268.0
ACUOSO 10 374.0
BLANCO 10 510
Sig. 1.0 1.0 1.0 1.0
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subgrupos de los extractos al 0.5%, se concluye que la actividad antihelmíntica
del extracto clorofórmico es más efectiva obteniendo el menor tiempo de
muerte de 99 minutos, seguido del extracto etanólico con 268 minutos y el
extracto acuoso con 374 mintuos.
95
ANEXO N° 14
ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS EXTRACTOS AL 0.25%
FASCIOLA ADULTA
TABLA N° 06
TIEMPO DE MUERTE (MINUTOS)
ACUOSO ETANÓLICO CLOROFÓRMICO BLANCO
GRUPOS DE ESTUDIO
M M M V
1520 390 150 520530 400 160 530
2510 390 140 510510 390 140 510
3510 370 150 510520 370 150 520
4500 390 140 500500 390 140 500
5500 370 150 500500 370 150 500
PROMEDIO 510 383 147 510Leyenda:V: Fasciolas vivasM: Fasciolas muerto
ANÁLISIS DE VARIANZA
TABLA N° 06
ANOVASUMA DE
CUADRADOSgl
MEDIA CUADRÁTICA
F Sig.
INTER GRUPOS 678646.667 2 339323.333 3496.844 0.000
INTRA GRUPOS 2620.000 27 97.037
TOTAL 681266.667 29
Leyenda:gl: Grados de libertadF: Distribución de FisherSig: Nivel de significancia
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Según los resultados del Análisis de Varianza (ANOVA), se observa que
existen diferencias significativas entre la actividad antihelmíntica y los
diferentes extractos al 0.25% de las hojas de Ambrosia arborescens Mill
“Marcu”, con un nivel de significancia de 0.000 frente a fasciolas adultas.
96
PRUEBA DE DUNCAN
TABLA N° 06
EXTRACTO 0.25% N
SUBCONJUNTO PARA ALFA = 0.05
1 2 3
CLOROFÓRMICO 10 147.0
ETANÓLICO 10 383.0
ACUOSO 10 510.0
BLANCO 10 510.0
Sig. 1.000 1.000 1.000
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN
Después de aplicar la prueba de Duncan para determinar cómo se agrupan los
subgrupos de los extractos al 0.25%, se concluye que la actividad
antihelmíntica del extracto clorofórmico es más efectiva obteniendo el menor
tiempo de muerte de 147 minutos, seguido del extracto etanólico con 383
minutos y el extracto acuoso con 510 mintuos.
97
ANEXO Nº 15
CÁLCULO DE LA CL50-18 hrs METODO PROBIT
EXTRACTO ACUOSO
Información sobre los datos Nº de casos
Válidos 9
Rechazados
Perdidos 0La transformación log no se puede realizar
0
Número de respuestas > número de sujetos
0
Grupo control 3Estimaciones de los parámetros
PROBITa
Parámetro Estimación Error típico Z Sig.
Intervalo de confianza al 95%
Límite inferior
Límite superior
Concentración 2.937 .735 3.995 .000 1.496 4.378
Intersección -7.811 2.006 -3.894 .000 -9.817 -5.805a. Modelo PROBIT: PROBIT(p) = Intersección + BX (Las covariables X se transforman utilizando el logaritmo en base 10.000.)
98
Información sobre la convergancia
Número de iteraciones
Solucón optima
encontradaPROBIT 7 Sí
99
Contraste de chi-cuadrado Chi-cuadrado gl(a) Sig.
PROBIT Contraste de la bondad de ajuste de Pearson
3.301 7 ,856b
a. Los estadísticos basados en casos individuales difieren de los estadísticos basados en casos agregados.b. Como el nivel de significación es mayor que .05, no se utiliza un factor de heterogeneidad en el cálculo de los límites de confianza.
Residuos y frecuencias de casillas
Número Concentración
Número de sujetos
Respuestas observadas
Respuestas esperadas Residuos Probabilidad
PROBIT 1 2.477 10 4 2.961 1.039 .296
2 2.477 10 3 2.961 .039 .296
3 2.477 10 3 2.961 .039 .296
4 2.778 10 5 6.363 -1.363 .636
5 2.778 10 6 6.363 -.363 .636
6 2.778 10 5 6.363 -1.363 .636
7 2.954 10 9 8.067 .933 .807
8 2.954 10 9 8.067 .933 .8079 2.954 10 8 8.067 -.067 .807
Limites de confianza
Probabilidad
Límites de confianza al 95% para Concentración
Límites de confianza al 95% para Log(Concentración)(a)
Estimación
Límite inferior
Límite superior
Estimación
Límite inferior
Límite superior
PROBIT ,010 73.692 10.817 144.246 1.867 1.034 2.159
,020 91.249 16.408 166.963 1.960 1.215 2.223
,030 104.499 21.365 183.267 2.019 1.330 2.263
,040 115.720 26.051 196.622 2.063 1.416 2.294
,050 125.730 30.606 208.240 2.099 1.486 2.319
,060 134.930 35.099 218.703 2.130 1.545 2.340
,070 143.549 39.573 228.340 2.157 1.597 2.359
,080 151.732 44.056 237.358 2.181 1.644 2.375
,090 159.578 48.566 245.897 2.203 1.686 2.391
,100 167.159 53.119 254.056 2.223 1.725 2.405
,150 202.573 76.870 291.231 2.307 1.886 2.464
,200 235.997 102.881 325.362 2.373 2.012 2.512
,250 269.035 131.774 358.718 2.430 2.120 2.555
,300 302.627 164.076 392.767 2.481 2.215 2.594
,350 337.488 200.258 428.860 2.528 2.302 2.632
,400 374.274 240.685 468.606 2.573 2.381 2.671
,450 413.677 285.486 514.257 2.617 2.456 2.711
,500 456.503 334.351 569.186 2.659 2.524 2.755
,550 503.763 386.401 638.424 2.702 2.587 2.805
,600 556.798 440.459 729.037 2.746 2.644 2.863
,650 617.489 495.878 850.418 2.791 2.695 2.930
,700 688.621 553.375 1015.577 2.838 2.743 3.007
,750 774.603 615.274 1245.266 2.889 2.789 3.095
,800 883.040 685.716 1577.857 2.946 2.836 3.198
,850 1028.740 772.042 2095.445 3.012 2.888 3.321
,900 1246.689 890.149 3014.902 3.096 2.949 3.479
,910 1305.914 920.602 3294.252 3.116 2.964 3.518
,920 1373.446 954.634 3628.026 3.138 2.980 3.560
,930 1451.739 993.254 4035.222 3.162 2.997 3.606
,940 1544.468 1037.952 4545.492 3.189 3.016 3.658
,950 1657.476 1091.063 5208.240 3.219 3.038 3.717
,960 1800.855 1156.546 6113.464 3.255 3.063 3.786
,970 1994.229 1241.936 7447.831 3.300 3.094 3.872
,980 2283.805 1364.505 9688.536 3.359 3.135 3.986
,990 2827.922 1581.138 14680.026
3.451 3.199 4.167
a. Base del logaritmo = 10.
EXTRACTO ETANÓLICO 70º
Información sobre los datos Nº de casos
Válidos 9
Rechazados
Perdidos 0
La transfroamción log no se puede realizar
0
Número de respuestas > número de sujetos
0
Grupo control 3
Estimaciones de los parámetros
PROBITa
Parámetro Estimación Error típico Z Sig.Intervalo de confianza al
95%
Límite inferior
Límite superior
Concentración 3.713 .798 4.652 .000 2.149 5.278
Intersección -9.655 2.154 -4.484 .000 -11.809 -7.502
a. Modelo PROBIT: PROBIT(p) = Intersección + BX (Las covariables X se transforman utilizando el logaritmo en base 10.000.)
Residuos y frecuencias de casillas
Número Concentración
Número de sujetos
Respuestas observadas
Respuestas esperadas Residuos Probabilidad
PROBIT 1 2.477 10 3 3.239 -.239 .324
2 2.477 10 4 3.239 .761 .324
3 2.477 10 4 3.239 .761 .324
4 2.778 10 7 7.457 -.457 .746
5 2.778 10 6 7.457 -1.457 .746
6 2.778 10 6 7.457 -1.457 .746
7 2.954 10 9 9.057 -.057 .906
8 2.954 10 10 9.057 .943 .906
9 2.954 10 10 9.057 .943 .906
100
Información sobre la convergancia
Número de iteraciones
Solucón optima
encontradaPROBIT 15 Sí
Contrastes de chi-cuadrado
Chi-cuadrado gl(a) Sig.
PROBITContraste de la bondad de ajuste de Pearson
4.990 7 ,661b
a. Los estadísticos basados en casos individuales difieren de los estadísticos basados en casos agregados.
b. Como el nivel de significación es mayor que .05, no se utiliza un factor de heterogeneidad en el cálculo de los límites de confianza.
Limites de confianza
Probabilidad
Límites de confianza al 95% para Concentración
Límites de confianza al 95% para Log(Concentración)(a)
Estimación
Límite inferior
Límite superior Estimación
Límite inferior
Límite superior
PROBIT ,010 94.113 27.601 157.272 1.974 1.441 2.197
,020 111.445 36.868 177.597 2.047 1.567 2.249
,030 124.061 44.287 191.895 2.094 1.646 2.283
,040 134.484 50.826 203.445 2.129 1.706 2.308
,050 143.606 56.843 213.384 2.157 1.755 2.329
,060 151.855 62.514 222.253 2.181 1.796 2.347
,070 159.477 67.943 230.357 2.203 1.832 2.362
,080 166.626 73.195 237.886 2.222 1.864 2.376
,090 173.406 78.318 244.968 2.239 1.894 2.389
,100 179.890 83.342 251.694 2.255 1.921 2.401
,150 209.418 107.704 281.848 2.321 2.032 2.450
,200 236.307 131.846 308.851 2.373 2.120 2.490
,250 262.110 156.576 334.607 2.418 2.195 2.525
,300 287.674 182.387 360.204 2.459 2.261 2.557
,350 313.584 209.648 386.479 2.496 2.321 2.587
,400 340.325 238.658 414.249 2.532 2.378 2.617
,450 368.365 269.659 444.462 2.566 2.431 2.648
,500 398.216 302.821 478.356 2.600 2.481 2.680
,550 430.485 338.218 517.639 2.634 2.529 2.714
,600 465.954 375.834 564.729 2.668 2.575 2.752
,650 505.688 415.662 623.041 2.704 2.619 2.795
,700 551.234 457.960 697.433 2.741 2.661 2.844
,750 604.998 503.654 795.208 2.782 2.702 2.900
,800 671.059 554.872 928.673 2.827 2.744 2.968
,850 757.221 615.986 1122.158 2.879 2.790 3.050
,900 881.517 696.877 1435.423 2.945 2.843 3.157
,910 914.479 717.302 1524.761 2.961 2.856 3.183
,920 951.687 739.946 1628.622 2.978 2.869 3.212
,930 994.347 765.426 1751.566 2.998 2.884 3.243
,940 1044.257 794.650 1900.526 3.019 2.900 3.279
,950 1104.245 829.033 2086.725 3.043 2.919 3.319
,960 1179.140 870.959 2329.923 3.072 2.940 3.367
,970 1278.211 924.932 2669.485 3.107 2.966 3.426
,980 1422.912 1001.182 3200.964 3.153 3.001 3.505
,990 1684.949 1132.936 4266.726 3.227 3.054 3.630
a. Base del logaritmo = 10.
101
EXTRACTO CLOROFÓRMICO
Información sobre los datos
Nº de casosVálidos 9
Rechazados
Perdidos 0
La transfroamción log no se puede realizar
0
Número de respuestas > número de sujetos
0
Grupo control 3
Estimaciones de los parámetros
Parámetro Estimación Error típico Z Sig.
Intervalo de confianza al 95%
Límite inferior
Límite superior
PROBITa Concentración 4.872 .978 4.983 .000 2.956 6.789
Intersección -12.373 2.578 -4.799 .000 -14.951 -9.794
a. Modelo PROBIT: PROBIT(p) = Intersección + BX (Las covariables X se transforman utilizando el logaritmo en base 10.000.)
Residuos y frecuencias de casillas
Número Concentración
Número de sujetos
Respuestas observadas
Respuestas esperadas Residuos Probabilidad
PROBIT 1 2.477 10 4 3.809 .191 .381
2 2.477 10 3 3.809 -.809 .381
3 2.477 10 5 3.809 1.191 .381
4 2.778 10 9 8.777 .223 .878
5 2.778 10 7 8.777 -1.777 .878
6 2.778 10 9 8.777 .223 .878
7 2.954 10 10 9.784 .216 .978
8 2.954 10 10 9.784 .216 .978
9 2.954 10 10 9.784 .216 .978
102
Información sobre la convergancia
Número de iteraciones
Solucón optima
encontradaPROBIT 18 Sí
Contrastes de chi-cuadrado
Chi-cuadrado gl(a) Sig.PROBIT Contraste de la
bondad de ajuste de Pearson
4.591 7 ,710b
a. Los estadísticos basados en casos individuales difieren de los estadísticos basados en casos agregados.b. Como el nivel de significación es mayor que .05, no se utiliza un factor de heterogeneidad en el cálculo de los límites de confianza.
Limites de confianza
Probabilidad
Límites de confianza al 95% para Concentración
Límites de confianza al 95% para Log(Concnetración)(a)
Estimación
Límite inferior
Límite superior Estimación
Límite inferior
Límite superior
PROBIT ,010 115.316 48.138 170.986 2.062 1.682 2.233
,020 131.171 59.378 188.019 2.118 1.774 2.274
,030 142.343 67.816 199.752 2.153 1.831 2.300
,040 151.369 74.931 209.096 2.180 1.875 2.320
,050 159.133 81.254 217.046 2.202 1.910 2.337
,060 166.053 87.047 224.075 2.220 1.940 2.350
,070 172.368 92.455 230.446 2.236 1.966 2.363
,080 178.227 97.575 236.322 2.251 1.989 2.374
,090 183.727 102.469 241.815 2.264 2.011 2.383
,100 188.940 107.184 246.999 2.276 2.030 2.393
,150 212.145 129.023 269.896 2.327 2.111 2.431
,200 232.603 149.330 289.950 2.367 2.174 2.462
,250 251.720 169.079 308.704 2.401 2.228 2.490
,300 270.223 188.793 326.989 2.432 2.276 2.515
,350 288.581 208.814 345.382 2.460 2.320 2.538
,400 307.152 229.399 364.382 2.487 2.361 2.562
,450 326.257 250.758 384.504 2.514 2.399 2.585
,500 346.219 273.075 406.349 2.539 2.436 2.609
,550 367.402 296.513 430.686 2.565 2.472 2.634
,600 390.255 321.235 458.552 2.591 2.507 2.661
,650 415.369 347.431 491.397 2.618 2.541 2.691
,700 443.588 375.398 531.313 2.647 2.574 2.725
,750 476.194 405.697 581.471 2.678 2.608 2.765
,800 515.331 439.459 647.104 2.712 2.643 2.811
,850 565.028 479.041 738.117 2.752 2.680 2.868
,900 634.422 529.929 877.638 2.802 2.724 2.943
,910 652.423 542.510 915.958 2.815 2.734 2.962
,920 672.558 556.340 959.793 2.828 2.745 2.982
,930 695.415 571.759 1010.759
2.842 2.757 3.005
,940 721.863 589.269 1071.280
2.858 2.770 3.030
,950 753.256 609.644 1145.211
2.877 2.785 3.059
,960 791.888 634.182 1239.202
2.899 2.802 3.093
,970 842.107 665.318 1366.188
2.925 2.823 3.136
,980 913.829 708.520 1556.606
2.961 2.850 3.192
,990 1039.473 781.295 1914.683
3.017 2.893 3.282
a. Base del logaritmo = 10.
103
ANEXO Nº 16
Ph DE LOS EXTRACTOS ENSAYADOS FRENTE A MIRACIDIO
EXTRACTO ACUOSO EXTRACTO ETANÓLICO 70ºConcentraciones pH Concentraciones pHAgua destilada 6.238 Agua destilada 6.219
1% 6.990 1% 5.7710.50% 7.035 0.50% 5.7730.25% 7.026 0.25% 5.7950.125% 6.580 0.125% 5.871
0.0625% 6.436 0.0625% 5.951
EXTRACTO CLOROFÓRMICOConcentraciones pHAgua destilada 6.221
1% 6.1870.50% 6.2530.25% 6.2080.125% 6.034
0.0625% 6.171
104
ANEXO Nº 17
Ph DE LOS EXTRACTOS ENSAYADOS FRENTE A FASCIOLA ADULTA
EXTRACTO ACUOSO
ACTIVIDA ANTIHELMÍNTICA CL50-18h
Concentraciones pH Concentraciones pH Concentraciones pH
Solución Hedon Fleig modificado 8.008 Solución Hedon Fleig modificado 8.168 Solución Hedon Fleig modificado 8.001
1% 7.929 10 ppm 8.187 900 ppm 7.9420.5% 7.884 100 ppm 8.173 600 ppm 8.008
0.25% 8.025 1000 ppm 8.033 300 ppm 8.052
EXTRACTO ETANÓLICO 70º
Concentraciones pH Concentraciones pH Concentraciones pH
Solución Hedon Fleig modificado 8.010 Solución Hedon Fleig modificado 8.001 Solución Hedon Fleig modificado 8.102
1% 7.656 10 ppm 7.937 900 ppm 7.8680.5% 7.742 100 ppm 7.797 600 ppm 7.838
0.25% 7.828 1000 ppm 7.716 300 ppm 7.944
EXTRACTO CLOROFÓRMICO
Concentraciones pH Concentraciones pH Concentraciones pH
Solución Hedon Fleig modificado 8.030 Solución Hedon Fleig modificado 7.950 Solución Hedon Fleig modificado 8.050
1% 7.818 10 ppm 7.937 900 ppm 7.9100.5% 7.884 100 ppm 7.890 600 ppm 7.950
0.25% 7.957 1000 ppm 7.846 300 ppm 7.973
105
ANEXO N° 18
SOLUBILIDAD DE LOS EXTRACTOS
SOLVENTE
EXTRACTO
ETANÓLICO 70° CLOROFÓRMICO
AGUA DESTILADA - -
SOLUCIÓN FISIOLÓGICA + -
SHFM ++++ -
Leyenda
++++ : Altamente soluble
++ : Medianamente soluble
+ : Baja solubilidad
- : Insoluble
SHFM :Solución Hedon Fleig Modificado
106
ANEXO N° 19
CONSTRUCCIÓN DE LA INCUBADORA ARTESANAL
53.5 cm
34 cm
MATERIALES
Tripley
Tornillos
Clavos
Socket
Foco 50 watts
Enchufe
Cable mellizo 2x14 AWG.
107