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"Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY
contra Vitelogenina (Vtg), como
biomarcador esteroidogénico en
Oreochromis niloticus”
Jairo Caza Barcia
V Congreso Internacional de Acuicultura en Aguas Continentales
Sangolquí del 17 al 19 de mayo del 2016
![Page 2: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/2.jpg)
(Carrillo, 2009)
Control hormonal y vitelogénesis
![Page 3: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/3.jpg)
Biomarcadores
• Bioquímicos y moleculares
• Celulares
• Histológicos
• Individuales
• Poblacionales
• Comunidades
• Biomarcadores de exposición
• Biomarcadores de efecto
• Biomarcadores de
susceptibilidad
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Maduración asincrónica
Falta de estacionalidad en la
producción de ovocitos y afectación
de la esteroidógenesis
Evaluación de productos
esteroidógenico ofrecen
información sobre el proceso
reproductivo
Compuestos químicos pueden
actuar como disruptores
endócrinos en cuerpos de agua
Diclorodifenil-tricloroetano y
tamoxifeno, inductores e
inhibidores de la vitelogenesis
Vitelogenina (Vtg)
Biomarcador
esteroidogénico
Biomarcador
ambiental
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Ventajas del uso IgY
(Schade y col, 1991)
IgG IgY
Muestreo Invasivo No invasiva
Rendimiento 200 mg IgG por
sangramiento (40 ml)
50-100 mg IgY por
huevo
(5 a 6 por semana)
Rendimiento por mes 200 mg Aprox. 1600 mg
Rendimiento específico/proceso Aprox. 5% 2% a 10%
Interferencia con el factor
reumatoide
Si No
Activación de complemento Si No
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OBJETIVO GENERAL
Producir anticuerpos policlonales (IgY) de
gallinas contra la proteína precursora,
vitelogenina (Vtg), como posible biomarcador
esteroidogénico en hembras adultas de
Tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus)
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OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Inducir la producción y purifica de Vtg con 17-ß
estradiol en machos adultos de tilapia (Oreochromis
niloticus)
Inmunizar gallinas Isa Brown, para inducir la
producción y purificación de inmunoglobulinas IgY
contra Vtg
Determinar la avidez y especificidad de
anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia, mediante
técnicas de inmuno detección
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Metodología
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![Page 10: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/10.jpg)
Producción de IgY
(Born, 2015)
![Page 11: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/11.jpg)
Resultados
![Page 12: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/12.jpg)
Purificación de Vtg
Shi, y col. (2002) fueron capaces de separar
mediante cromatografía de intercambio aniónico
vitelogenina del pez dojo (Misgurnus
anguillicaudatus) y en el pez carpa (Cyprinus
carpio)
La elución en la que Vtg fue identificada y
validada en gradiente de 0,37 M
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Se empleó el método fluorométrico
Qubit® Protein Assay (Invitrogen,
USA), que arrojó un resultado de Vtg
total de 1,127 mg vtg/ml
Shi y col. (2002), aislaron 1,067 mg/ml
a través del mismo método.
Ortiz y col., (2016) recuperó Vtg a una
concentración de 1,8 ± 0,4 mg Vtg/ml
Concentración Cuantificación
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Identificación (SDS-PAGE)
Ortiz y col., (2016) en tilapia del
Nilo (Oreochromis niloticus) a una
altura de 210 KDa
Fukada y col., (2003) purificaron
Vtg de 150 KDa en carpa
(Cyprinus carpio)
Shimizu y col., (2002) halló Vtg en
medaka común (Oryzias latipes) a
220 KDa
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Alícuotas de 800 µl de anticuerpos a una
concentración de máxima de 5,2 mg/ml
Shimizu y col., (1988) aislaron
anticuerpos IgY a partir de cromatografía
de intercambio iónico en matrices de
DEAE celulosa
Hwee y col., (2012) utilizaron doble
precipitación con sulfato de amonio al 30
y 20 % con un rendimiento de IgY de 5
mg/ml.
Purificación de IgY
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•Nunes y col., (2014)
caracterizaron una cadena
pesada en los 68 KDa, y una
cadena liviana en los 27 Kda
•Oyarzún (2011) han reportado
utilizando SDS-PAGE al 12%
estructuras de IgY con cadena
pesada de 67 KDa y cadena
liviana de 25 KDa
Identificación de IgY por SDS-PAGE
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Deslow (1999) propuso
dosis de concentración de
100 µg/ml y 50 µg/ml como
dosis de refuerzo
Moreno (2010) propuso
dosis similares de
inmunización
Wen y col., (2012)
utilizaron dosis de
antígeno a 1 mg/ml
Curva de inmunización de gallinas
en función de IgY purificadas
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Sotiropoulou y col., (2012)
comprobaron la unión
antígeno-anticuerpo a una
concentración de 1 µg/ml
Tada y col., (2004)
utilizaron IgG anti
vitelogenina a una
concentración de 40 µg/mL
ELISA indirecto
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Muestras pre-purificadas de plasma de O. niloticus. 1: plasma inducido día 10.
2: plasma inducido día 15. 3: plasma inducido día 20. 4: plasma inducido día 25.
- : plasma macho normal.
Western Blot IgY contra Vtg
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Conclusiones
![Page 21: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/21.jpg)
Se inoculó 17-ß estradiol en individuos
machos de Oreochromis niloticus, lo cual
indujo la producción Vtg, obteniéndose 1,127
mg /ml
![Page 22: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/22.jpg)
Se obtuvieron inmunoglobulinas IgY
contra Vtg en huevos de gallinas Isa Brown,
inmunizadas a partir de 19 semanas de
nacidas. Los anticuerpos fueron purificados
mediante métodos bioquímicos.
![Page 23: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/23.jpg)
Se determinó la especificidad de
anticuerpos de IgY-anti Vtg de Tilapia,
mediante el uso de ensayos inmunométricos,
tales como ELISA y WB.
![Page 24: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/24.jpg)
Dr. Juan Ortiz Tirado, Director del Grupo de Investigaciones de Recursos
Bioacuáticos y Acuicultura de la ESPE (RAAE)
Dra. Marbel Torres del Laboratorio Inmunología-Virología-ESPE
Dr. Rodolfo Fernández-Gómez investigador-docente del Programa
Prometeo SENESCYT, de Biophysic Solurions, C.A., Caracas, Venezuela
Al personal científico-docente, técnico y administrativo de la Universidad
de las Fuerzas Armadas-ESPE, y en especial, del IASA I
Agradecimientos
![Page 25: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/25.jpg)
![Page 26: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/26.jpg)
Anticuerpos IgY
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![Page 28: Desarrollo de anticuerpos policlonales IgY contra Vitelogenina …acuacultura.espe.edu.ec/wp-content/uploads/2016/05/6... · 2016-05-19 · "Desarrollo de anticuerpos policlonales](https://reader035.vdocumento.com/reader035/viewer/2022070920/5fb8e55e54669d46e064c26f/html5/thumbnails/28.jpg)
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