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Institut de RecercaHospital Universitari Vall d’Hebron
Tecnologies d’alt rendiment
a l’ucts. Conceptes i anàlisi de dades
28/11/12 – 05/12/12
Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)
Ricardo Gonzalo Sanz
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN la ucts.conceptos y análisis de datos
DIA 1. 28 de Noviembre. 10-14:00
Microarrays. Ricardo Gonzalo Sanz
Analisis de resultados de microarrays. Alex Sanchez
RTqPCR. Paqui Gallego
Análisis de resultados de RTqPCR. Jose Luis Mosquera
DIA 2. 5 de Diciembre. 10-14:00
Ultrasecuenciación. Paqui Gallego y Rosa Prieto
Analisis de resultados de Ultrasecuenciación. Alex Sanchez
Zeptosens. Paqui Gallego
Análisis de resultados de Zeptosens. Ferran Briansó
Hoja de asistencia. Certificado asistenciaEncuesta satisfacción.
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MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)
ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos•¿cómo están hechos?
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
Esquema
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MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
Esquema
ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos•¿cómo están hechos?
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Tipos de microarrays
DNA ANALYSIS ARRAYS RNA ANALYSIS ARRAYS
•SNPs
•Resequencing
•Citogenética
•Chip on chip
•3’IVT
•Gene/Exon arrays
•miRNA
•FFPE
Según lo que interrogan:
Según el formato:
Cartucho individual
Placa de 16/24/96
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•Genome-Wide SNP Analysis GW Human SNP array 6.0
? 1.8 M marcadores genéticos (900.000 SNP + 900.000 CNV)
•Resequencing Arrays Human Mitochondrial array
“Custom” resequencing arrays
•Citogenética CytoScan HD Array
Tipos de microarrays.DNA
DNA ANALYSIS ARRAYS
Dna copy number (ganancias/pérdidas), LOH, disomia uniparental, SNPs
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DNA ANALYSIS ARRAYS
Tipos de microarrays. DNA
• ChiP-on-Chip: Estudio de interacciones entre DNA y proteínas y
modificaciones del DNA, ej.
Sitios de unión de factores de transcripción
Sitios de unión de histonas
Metilación del ADN
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Tipos de microarrays. RNA
EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS
3’5’
•3’IVT
Human U133 Plus 2.0 Prime View Array
•Detección sesgada (buena cola polyA, buen extremo 3’)
•Muchas especies representadas
•Arrays más clásicos
(Unigene database 133) (Unigene database 219)
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EXPRESSION ANALYSIS ARRAYS
Gene Arrays Human, Mouse, Rat, CHO, Porcine, Canine … Gene 1.0 ST Array
Exon Arrays Human, Mouse, Rat Exon 1.0 ST Array
3’5’
Gene Arrays
Exon Arrays
Tipos de microarrays. RNA
Human/Mouse/Rat/CHO Gene 2.0 ST Array
•Librería actualizada (RefSeq 36 51)•Incluye sondas para detección long intergenic no-coding RNA transcripts (lincRNAs)
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miRNA GeneChip miRNA 3.0 Array
•153 organisms in the array (human, mouse, rat, canine, ….)
•100% miRBase v17
•2.216 snoRNAs and scaRNAs (human small nuclear RNAs)
•Low inputs amounts (130 ng total RNA)
•2.999 probe sets unique to pre-miRNA hairpins
•Interroga de forma independiente pre-miRNAs y maduros
•También útil para muestras de FFPE
Tipos de microarrays. RNA
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Tipos de microarrays. RNA
ALMAC XCEL ARRAY
•Tipo química 3’IVT
•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)
•Diseño de kit “a medida” (Sensation Plus FFPE kit) 20 ngr
•Kits de extracción RNA (FormaPure BeckmanCoulter, RecoverAll LifeTech, Rneasy Qiagen,…)
•70% equivalente a HgU133 Plus 2.0
•8% información mejorada que no está en HgU133 plus2.0
•22% sondas derivadas de secuenciación de muestras de cáncer
•De momento es un servicio. En breve un array de catálogo.
•Especialmente diseñado para muestras de FFPE. Muy problemáticas (calidad RNA baja, modif químicas,…)
•75 ngr de DNA
•Información sobre cambios en número de copias, SNPs y LOH.
•Permite integración datos con expresión y miRNAs
OncoScan
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Tipos de microarrays.
Human Transcriptome Array (HTA)
•Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012.•Arrays todavía no en catálogo. Se pueden pedir a través de “core facilities”. Finales 2012.
•Más adecuado que Exon arrays (solamente 20% de la información está basada en datos bien
contrastados). Falsos positivos
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Tipos de microarrays.
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¿Cómo están hechos? (I). Fotolitografía
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¿Cómo están hechos?
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ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos•¿cómo están hechos?
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)
![Page 17: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/17.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
MATERIAL DE PARTIDA RNA TOTAL
Poli A mRNA
EXTRACCIÓN
Células eucariótas QIAGEN
Tejido TRIZOL
CALIDAD CANTIDADBIOANALYZER
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (I): BIOANALYZER
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (II): BIOANALYZER
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CALIDAD RNA (III): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
RNA Area: 192.0 RNA Concentration: 150 ng/µlResult Flagging Color: 255 Result Flagging Label: Bad RNA quality
RNA Area: 155.7 RNA Concentration: 122 ng/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.6 RNA Integrity Number (RIN): 8.5 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
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Not all expected ladder peaks have been found. You should try to modify peak find settings or add peaks using manual integration.
Issue with ladder peak detection. Please check ladder.
RNA Area: 1,653.2 RNA Concentration: 50,101 pg/µlrRNA Ratio [28s / 18s]: 1.3 RNA Integrity Number (RIN): 7.7 (B.02.08) Result Flagging Color: 65280 Result Flagging Label: Good RNA quality
CALIDAD RNA (IV): BIOANALYZER. Cálculo de la concentración
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
BIOANALYZER
Chips disponibles:
RNA
PROTEINAS
DNA
CÉLULAS
Agilent RNA 6000 Nano Kit Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent 2100 Small RNA Kit
Agilent DNA 1000 Kit Agilent DNA 7500 Kit Agilent DNA 12000 Kit Agilent High Sensitivity DNA Kit
Agilent Protein 80 Kit Agilent Protein 230 Kit High Sensitivity Protein 250 Kit
Agilent Cell Kit
![Page 23: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/23.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (III): RNA INTEGRITY NUMBER
0 ≤ RIN ≤ 10
![Page 24: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/24.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (IV): RNA INTEGRITY NUMBER
![Page 25: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/25.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (V): RNA INTEGRITY NUMBER
? ¿qué RIN es el más adecuado?
RIN 5.0 RIN 8.0
¿hasta que RIN se puede utilizar?
¿se pueden mezclar diferentes RIN?
![Page 26: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/26.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CALIDAD RNA (VI): TIPO DE MUESTRA
• kits especiales extracción RNA
• extracción “genes globina”
• no trabajar con sangre total
• HABLAR CON NOSOTROS ANTES
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CANTIDAD RNA
• 3’ IVT ARRAYS 200 ng / 3 µL
• Exon/Gene ARRAYS 200 ng / 3 µL
• NUGEN 500 pg / 5 µL
• miRNA 130ng / 8 µL
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MATERIAL DE PARTIDA: RNA
•Calidad (Bioanalyzer/RIN)•Cantidad (Kits amplificación)
ARRAYS AFFYMETRIX
•Tipos•¿cómo están hechos?
EXPERIMENTO DE MICROARRAYS
•Procedimiento de amplificación / detección•GeneTitan•Controles de calidad
![Page 29: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/29.jpg)
RNA (150 ng)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
3’IVT EXPRESS
AAAAAAAAAAAA
TTTTTTT
TTTTT
RNA (150 ng) RNA-cDNA dscDNA cRNA (≈ 40 µg)
IVT
O/N
PROCEDIMIENTO (I)
EXON/GENE
NNNNN
RNA-cDNA dscDNA
IVT
O/NcRNA
NNNNN
ssDNA (7 µg)
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
NUGEN
PROCEDIMIENTO (II)
NNNNN
RNA (500 pg) RNA-cDNA dscDNA
SPIA
ssDNA (8 µg)TTTTT
miRNA
ATPAAAAAA
RNA (130 ng) AAAAAA
Biotin-labeled 3DNA
Biotin-labeled RNA
![Page 31: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/31.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
PROCEDIMIENTO (III)
Fragmentación
O/N
3’IVT EXPRESS EXON/GENE NUGEN miRNA Resequencing
![Page 32: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/32.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
![Page 33: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/33.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
Y ESTO SOLO ACABA DE EMPEZAR…
.CEL
UEB
![Page 34: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/34.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIFERENCIAS ENTRE LOS KITS
3’ IVT Exon/Gene NUGEN
O oligo dT NNN oligo dT + NNN
cRNA ssDNA ssDNA
15 µg 5.5 µg 5 µg
NO MEZCLAR DIFERENTES PROTOCOLOS DE AMPLIFICACIÓN
EN UN MISMO PROYECTO…
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TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN (I)
![Page 36: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/36.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(II)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
![Page 37: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/37.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
GENETITAN(III)
• Formato placa: 16, 24, 96 arrays
mayor high throughtput
reducción del tiempo de procesado
disminución de costes
mayor reproducibilidad (disminución de efecto batch)
Formato cerrado (16, 24, 96)
No todos los tipos de especies, tipo de array representados
![Page 38: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/38.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (I)
![Page 39: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/39.jpg)
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
CONTROL DE CALIDAD (II)
![Page 40: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/40.jpg)
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Puricado
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
![Page 41: Curso de Genómica - UAT (VHIR) 2012 - Microarrays](https://reader034.vdocumento.com/reader034/viewer/2022052600/557d2646d8b42a90748b46f2/html5/thumbnails/41.jpg)
CONTROL DE CALIDAD (III). cRNA Fragmentado
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA