Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de
Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
CONTENIDO
Seleccione con una X la modalidad en que va a participar:
_X __ Modalidad 1.
_____ Modalidad 2.
1. Información general
Título del proyecto1: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la
congelabilidad del semen porcino
Nombre de la convocatoria en la cual presenta el proyecto: “Convocatoria general para la financiación de proyectos de Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”
Nombre de los Grupos de Investigación: (registre la información de los grupos que participan)
Nombre del Grupo: Biología de la producción pecuaria
Facultad/Instituto/Departamento: Departamento de Producción Agropecuaria
Clasificación
__A___
Tipo de proyecto de I&D: Investigación Básica2: Investigación Aplicable
3:
Aplicación en curso4: Creación: Innovación Tecnológica
5:
Tipo de innovación:
Innovación tecnológica de producto Innovación tecnológica de proceso
Innovación organizacional
Área Estrátegica del Plan de Desarrollo
Biotecnología
Artes, Cultura y Humanidades Problemática Social
Salud
Ambiental
No corresponde a ninguna de las
áreas estratégicas
INTEGRANTES DEL EQUIPO DE INVESTIGACIÓN
(indicar el investigador responsable con un asterisco) NOMBRE/TIPO DE VINCULACIÓN EN LA
UNIVERSIDAD DE CALDAS
DEPARTAMENTO o
PROGRAMA
ÁREA DE CONOCIMIENTO
(según COLCIENCIAS)
*Francisco Javier Henao Uribe/profesor
titular
Departamento de Producción
Agropecuaria
Agronomía, veterinaria y
afines
1 Se recomienda que no exceda 15 palabras
2 Son estudios que tienen como propósito el trabajo experimental o teórico realizado principalmente con el objeto de
generar nuevos conocimientos sobre los fundamentos de fenómenos y hechos observables, sin prever ninguna
aplicación específica inmediata 3 Son proyectos de investigación original realizada para la adquisición de nuevos conocimientos, contextualizada
dentro de fines con potencialidad de ofrecer alguna contribución práctica 4 Son proyectos de investigación original, dirigida principalmente y de manera inminente hacia un fin u objetivo
práctico, determinado y específico 5 Se refiere a aquellos proyectos que tienen como objetivo el desarrollo de nuevos productos o procesos, así como las
modificaciones tecnológicas importantes en productos o procesos
x
x
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ESTUDIANTES DE POSTGRADO PROGRAMA ÁREA DE CONOCIMIENTO
(según COLCIENCIAS)
Julian Alonso Valencia Giraldo
Doctorado en Ciencias
Agrarias
Agronomía, veterinaria y
afines
Lugar de Ejecución del Proyecto: (Municipio/Departamento)
Ciudad: Manizales Departamento: Caldas
Presupuesto
Valor total del proyecto:
$ 103.457.480
Fuentes de financiación: Universidad de Caldas
Valor solicitado en efectivo en esta convocatoria:
$ 27.880.000
Duración total (meses):24
2. Resumen ejecutivo
El uso de semen congelado-descongelado de verraco en los programas de
inseminación en la especie porcina es mínimo, debido a la reducción de la fertilidad
de las granjas. Actualmente existen estudios prometedores en los cuales se ha
mejorado la calidad seminal después de la criopreservación, con resultados
aceptables pero poco consistentes, debido principalmente, a la alta diferencia en la
congelabilidad entre machos, lo que genera el desaprovechamiento de la mayoría
del material seminal con alta calidad genética y baja congelabilidad. En esta materia
hay diferentes enfoques como la evaluación del efecto del plasma seminal (PS) y de
proteínas contenidas en este sobre la congelabilidad de los verracos, para
esclarecer el efecto biológico de estas sobre los espermatozoides en la congelación
y para su uso como predictores moleculares de congelabilidad.
El semen obtenido de 8 verracos será congelado en tres momentos diferentes con
intervalo de 4 a 8 días entre congelación para identificar los verracos con alta y baja
congelabilidad según la prueba de espermatozoides funcionalmente competentes
(EFC).
En una segunda fase, será colectada la fracción rica de los ocho verracos, e
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inmediatamente terminada la colección se tomarán tres alícuotas de 5 ml, la primera
será centrifugada a 800 g x 10 minutos para separar el PS de los espermatozoides
que serán utilizados para medición de proteínas y colesterol; y las otras dos serán
diluidas 1:1,5 con Androhep plus® y enfriadas hasta 17°C por tres horas. Luego de
este enfriamiento se realizarán dos procedimientos distintos de separación de los
espermatozoides, una alícuota será centrifugará a 800 g por 20 minutos y la otra se
dejará sedimentar; los espermatozoides obtenidos de cada procedimiento serán
congelados y se les evaluará post-congelación la población de EFC, la integridad
estructural de la membrana (IEM), la integridad funcional de la membrana (IFM), la
integridad acrosómica (IAC), la morfología y movilidad espermáticas, la
fragmentación del ADN y la fecundación in vitro según los protocolos del Laboratorio
de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas.
A su vez serán identificadas y cuantificadas, las proteínas Nieman-pick disease type
C2 (NPC2) y AQN-1 en PS por Western Blot y ELISA indirecta, y unidas al
espermatozoide por inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos ligados a FITC.
También se medirá la proporción de colesterol en la membrana espermática y
colesterol libre en el PS por cromatografía de gases-masas. Las mediciones de las
proteínas y del colesterol serán realizadas inmediatamente terminada la colección, y
después del enfriamiento hasta 17°C en el semen centrifugado y en el semen
sedimentado.
Con esta metodología se pretende determinar la dinámica de las proteínas del
plasma seminal NPC2 y AQN-1 y el efecto sobre la congelabilidad del semen
porcino.
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3. Conformación y trayectoria del equipo de investigadores
El grupo de Biología de la producción pecuaria COL0029577, categoría A, se integró en
enero de 2002, es liderado por el Dr. Francisco Javier Henao Uribe, cuenta con 13
integrantes, entre ellos, tres estudiantes de maestría y cuatro de doctorado. El grupo se
articula con otros afines para dar soporte científico a los Programas de Maestría en
Sistemas de producción Agropecuaria y de Doctorado en Ciencias Agrarias. Las líneas
de investigación del grupo son: Mejoramiento Genético y Biología de Reproducción,
Nutrición y Alimentación, Medicina Preventiva y Gestión Ambiental.
La presente investigación pertenece a la línea de Mejoramiento Genético y Biología de
la Reproducción, liderada por Francisco Javier Henao U, PhD; en esta línea, como
producto de los resultados de las investigaciones realizadas, se han publicado 14
artículos científicos en revistas nacionales y extranjeras de diferentes categorías, y un
libro. De los artículos en mención guardan relación con el proyecto los siguientes:
Marín R., C. Escobar, H. Mesa, G. Gómez, F. J. Henao. Evaluación de
semen diluido de verraco mediante la prueba de endósmosis. Porcicultura
Colombiana, 107: 33-40. 2007.
Henao U. F. J., O. Diaz, J. G. Valencia, L. Perez. Evaluación de la calidad
seminal en los porcinos. Porcicultura Colombiana, 109: 20-25. 2007.
Osorio S. R. E., Giraldo J. F., Mesa H. Germán Gómez L. G., Henao U. F. J.
Evaluación de la integridad acrosómica en semen de verraco. vet.zootec.
1(1): 41-47, 2007.
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Díaz F. O., Mesa H., Gómez G., Henao U. F. J. Evaluación in vitro de la
viabilidad del semen porcino hasta 120 horas de almacenamiento en
refrigeración. vet.zootec. 1(4), 2008.
Díaz F. O., Mesa H., Valencia J. G., Gómez G., Henao U. F. J. Acrosomal
integrity and biochemical functionality assessment of the sperm plasmalemma
in boars with persistent cytoplasmic droplets. Revista Científica, FCV-LUZ,
XIX (5): 500-505, 2009.
Henao U. F. J., Valencia G. J. A., Diaz F. O., Rangel S. M. Y. Efecto de la
adición de plasma seminal sobre la eliminación de gotas citoplásmicas en
semen de sus Scrofa linnaeus, 1758. bol.cient.mus.hist.nat. 15 (2): 94-104,
2011.
Gómez G., Vélez C., Ceballos A., Henao U. F. J. Revisión sistemática de los
factores asociados a la presentación de gotas citoplásmicas en porcinos. Rev.
salud pública. 16 (6): 779-788, 2014.
En labores relacionadas con la misma línea de investigación trabajan en la
actualidad dos estudiantes de maestría; igualmente, en los últimos dos años, han
terminado trabajo de grado un estudiante de doctorado, tres estudiantes de maestría
y tres de Medicina Veterinaria y Zootecnia.
Las actividades más recientes han sido en: mejoramiento genético bovino,
inseminación artificial en bovinos y porcinos, calidad seminal en bovinos y porcinos,
y conservación seminal en bovinos y porcinos.
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4. Descripción del proyecto
4.1 Planteamiento de la pregunta o problema de investigación y su
justificación
La criopreservación de semen porcino es una biotecnología de gran utilidad para la
comercialización de genética de alta calidad y conservación a largo plazo. Esta
biotecnología junto con la inseminación artificial, se pueden utilizar para ampliar la
distribución de material genético a gran cantidad de hembras, obtener animales de
mejor calidad y rendimiento a más bajo costo. Sin embargo, en la especie porcina su
implementación a nivel comercial aún no es viable, debido a que la membrana de
los espermatozoides presenta alta sensibilidad al frío, lo que resulta en pérdida de
más del 50% de la viabilidad espermática y en reducción de la vida útil de los
espermatozoides en el tracto reproductor de la cerda debido a capacitación
prematura o criocapacitación. Además la alta diferencia de la congelabilidad de los
verracos conlleva a resultados poco consistentes, ya que alrededor del 26 % de los
verracos de alta calidad genética son de baja congelabilidad, por lo cual,
actualmente algunos grupos de investigación se han orientado a la búsqueda de
predictores moleculares de congelabilidad y a entender el efecto del PS y de las
proteínas presentes en el sobre la resistencia de los espermatozoides a la
congelación. Estos problemas no se presentan con semen fresco o diluido utilizado
normalmente en las granjas. Por tanto, la prevención de los efectos negativos en la
calidad seminal que ocasiona la criopreservación, es de crucial importancia para la
implementación de ésta biotecnología en las granjas.
Lo anterior hace necesario implementar técnicas moleculares y químicas de alta
resolución y especificidad, como la electroforesis en gel de poliacrilamida para
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separación por peso molecular, el Western Blot para detección de proteínas
específicas, la inmunofluorescencia indirecta para detectar proteínas de membrana
y la técnica de ELISA indirecta para cuantificar concentración de proteínas
especificas en el PS y la cromatografía de gases para medición de colesterol; con el
objeto de indagar con más profundidad sobre la función de proteínas en la
congelabilidad de los espermatozoides, determinar la diferencias en
concentraciones de estas en PS procedente machos de diferente congelabilidad y
establecer si existe diferencia en la capacidad de recepción de las proteínas por
parte de los espermatozoides de machos de alta y baja congelabilidad. Esto
mostrará un panorama más amplio de la biología de este proceso y mayor
entendimiento para realizar innovaciones biotecnológicas al respecto.
4.2 Marco Teórico
La membrana plasmática del espermatozoide del cerdo es más sensible al frío en
comparación a las otras especies, debido a que su membrana celular tiene menor
cantidad de colesterol, con una relación molar colesterol a fosfolípidos de 0.26, a
diferencia de la membrana del espermatozoide del toro que posee una relación de 0.45
(Parks y Lynch, 2004); lo que produce una menor estabilidad de la membrana (Johnson
et al., 2000). Este último factor hace más sensible al espermatozoide a iniciar el
proceso de capacitación y de reacción acrosómica (Belmonte et al., 2005; Hossain et
al., 2011). La capacitación espermática, es una vía bioquímica que debe desarrollar el
espermatozoide durante el paso por el tracto reproductor de la hembra, antes de
fecundar un ovocito (Rodríguez-Martínez et al., 2005; Visconti y Kopf, 1998). Como
consecuencia la congelación de semen porcino reduce más de la mitad de la
supervivencia espermática, y la mayoría de las células que sobreviven, desarrollan
prematuramente un fenómeno parecido a la capacitación, llamado criocapacitación
(Kaneto et al., 2002; Vadnais y Althouse, 2011). Actualmente, se han desarrollado
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múltiples ensayos con PS, con el fin de prevenir este fenómeno (García et al., 2010;
Rodríguez-Martínez et al., 2008; Saravia et al., 2009).
El PS es una mezcla de secreciones provenientes de la red testicular, el epidídimo y las
glándulas sexuales accesorias (Caballero et al., 2004; Centurión et al., 2003); funciona
como vehículo y medio de inmersión de los espermatozoides después de la eyaculación
(García, 2007), participa en la regulación de procesos relacionados con nutrición,
protección, maduración, movilidad (Waberski et al., 1995), y capacitación del
espermatozoide (Calvete et al., 1997).
Los componentes del PS varían entre machos (Caballero, 2007), y entre las fracciones
del eyaculado en razón de su origen (Rodríguez-Martínez et al., 2005). El PS de la
fracción pre-espermática es proveniente de las glándulas uretrales y bulbouretrales; el
plasma seminal de la fracción rica en espermatozoides es de origen prostático, contiene
secreciones del epidídimo y de las vesículas seminales; y el plasma seminal de la
fracción pobre en espermatozoides, contiene secreciones de la próstata, y de las
vesículas seminales (Rodríguez-Martínez et al., 2005; Rodríguez-Martínez et al., 2009;
Saravia et al., 2009). Los componentes del PS que mayor efecto tienen sobre la función
del espermatozoide son las proteínas (Caballero, 2007).
Existen reportes sobre el efecto crioprotector de las proteínas contenidas en el PS,
debido a su participación en los procesos de capacitación y supervivencia de los
espermatozoides (Calvete et al., 1997).
Las familias de proteínas del plasma seminal porcino que producen cambios en la
función espermática asociados a los procesos de congelación como la capacitación,
son las proteínas que contienen el dominio fibronectina tipo 1 y 2, las lipocalinas, las
espermadhesinas y los trasportadores de colesterol. La fibronectina tipo 1 es
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considerada un marcador molecular de la congelabilidad de los machos ya que
presenta diferente concentración en machos de alta y baja congelabilidad (Vilagran et
al., 2015), está relacionada con defectos de tracto intermedio y cola del
espermatozoide, se une a la membrana plasmática mediante integrinas y es una
proteína protectora del espermatozoide; además interactúa con la albumina, lo que
reduce el estrés oxidativo (González-Cadavid et al., 2014). La fibronectina tipo 2 Se une
a la fosforilcolina de la membrana del espermatozoide lo que posiblemente evita el
movimiento de fosfolípidos y mantiene la estabilidad de la membrana, también se une a
la heparina y puede causar la salida del colesterol durante la capacitación espermática
(Caballero, 2007). Dentro de las enzimas mas importantes relacionadas con la
congelabilidad del semen porcino se reportan la lipocalina PGDS (de su nominativo en
ingles Prostaglandin D Synthase) y la ß-HEX (del inglés ß subunit of N-acetyl-b-
hexosaminidase. La PGDS fue reportada por (Flowers, 1999) como una proteína
marcadora de fertilidad, esta se une con alta afinidad al ácido retinoico (Tanaka et al.,
1997) y al ácido docosahexoico el cual interactúa con otros lípidos de la membrana
como el colesterol y puede jugar un rol importante en la estructura local y en la función
de la membrana y el ácido retinoico afecta la permeabilidad de las membranas
celulares (Stillwell y Wassall, 1990). En un estudio realizado en toros se encontró que la
adición de PGDS incrementa la unión espermatozoide-ovocito in vitro e inhibe la
fecundación in vitro (Gonçalves et al., 2008). La ß-HEX indicador fiable de la
criotolerancia del espermatozoide, se une al acrosoma y es liberado durante la reacción
acrosómica; también se ha encontrado correlación negativa de esta enzima con
movilidad e integridad de membrana plasmática post-ongelación (Wysocki et al., 2015).
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La familia de proteínas con mayor presencia en el PS porcino son las espermadhesinas
que constituyen un 90% del total (Caballero, 2007) y se clasifican como AQN-1, AQN-3
y AWN que tienen capacidad de unión a la heparina y las PSP-I y PSP-II que no tienen
esta propiedad (Sanz et al., 1992). Una proteína de igual importancia, con diferente
estructura pero que interactúa con las espermadhesinas es la proteína DQH, que forma
un complejo proteico con las proteínas AQN y AWN que afecta a función del
espermatozoide (González-Cadavid et al., 2014).
Las espermadhesinas AQN I, II y III están relacionadas con la unión del espermatozoide
con el epitelio del útero en el reservorio ubicado en la unión utero-tubal (Ekhlasi-
Hundrieser et al., 2005), se unen a la membrana del acrosoma y del 50 al 75% se
desprenden durante la capacitación lo que hace pensar en un efecto decapacitante;
luego las que permanecen adheridas participan en la formación del reservorio
espermático (Dostátlová et al., 1994), en la unión de gametos, principalmente ala AQN I
que tiene capacidad de unión a diferentes ligandos entre ellos la manosa (Caballero,
2007). Esta proteína también tiene alta afinidad por el colesterol y en el momento en
que esta se desprende, funciona como liberadora y aceptora de esta molécula
(Jonáková et al., 2000).
La proteína NPC2 (de su nombre en inglés Nieman-pick disease type C2) es una de las
proteínas con mayor afinidad al colesterol y esta involucrada en la regulación de la
composición lipídica de la membrana plasmática, principalmente como acarreadora de
colesterol (Dacheux et al., 2006; Okamura et al., 1999); al parecer alta presencia de
colesterol en la membrana plasmática de espermatozoides de humano corresponde con
alta concentración de esta proteína en le PS (Légaré et al., 2006), debido a que tiene la
función de mantener altos niveles de colesterol en la membrana plasmática y en el
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acrosoma (Kirchhoff et al., 1996) por lo que se considera un factor decapacitante
(Lasserre et al., 2001). Como es mencionado anteriormente las proteínas NPC2 y AQN-
1 presentan interacción con el colesterol (Okamura et al., 1999, Jonáková et al., 2000)
lo que sugiere un rol en el mantenimiento o en la liberación de esta molécula, hechos
que son determinantes para el inicio de la capacitación o para la prevención de la
criocapacitación, por lo cual el enfoque de adición de PS se debe centrar en este punto
(Lehay y Gadella, 2011).
4.3 Objetivos
Objetivo general:
Determinar la dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la
congelabilidad del semen porcino.
Objetivos específicos:
Determinar la congelabilidad de los machos porcinos mediante la prueba de
espermatozoides funcionalmente competentes en semen congelado-
descongelado.
Evaluar el efecto de las proteínas NPC2 y AQN-1 del plasma seminal sobre la
población de espermatozoides funcionalmente competentes, la capacidad
fecundante, la fragmentación del ADN y la calidad seminal según los protocolos
del Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas en
semen congelado-descongelado de verracos de alta y baja congelabilidad.
Evaluar el efecto de la proporción de colesterol en la membrana espermática
sobre la población de espermatozoides funcionalmente competentes, la
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capacidad fecundante, la fragmentación del ADN y la calidad seminal según los
protocolos del Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de
Caldas en semen congelado-descongelado de verracos de alta y baja
congelabilidad.
Establecer la asociación entre las proteínas NPC2 y AQN-1 con la proporción de
colesterol en la membrana espermática en semen de verracos de alta y baja
congelabilidad.
4.4 Metodología propuesta
Serán utilizados ocho verracos, alojados en corrales individuales, alimentados con
2kg/animal/día de un balanceado comercial, agua a disposición, eyaculados con una
frecuencia de cuatro a ocho días y con fertilidad por encima del 85% monitoreada 6
meses previos al estudio.
El semen de los ocho machos será colectado y congelado en tres momentos diferentes
con intervalo de 4 a 8 días, para determinar congelabilidad mediante la prueba de
espermatozoides funcionalmente competentes (EFC) y el análisis seminal de rutina del
Laboratorio de Biología de la Reproducción de la Universidad de Caldas.
En una segunda fase, se colectará la fracción rica de cada macho, e inmediatamente
terminada la colección se tomarán tres alícuotas de 5 ml, la primera será centrifugada a
800 g x 10 minutos para separar el PS de los espermatozoides y realizar medición de
concentración de colesterol y cuantificación de proteínas; y las otras dos serán diluidas
1:1,5 con Androhep plus® y enfriadas hasta 17°C por tres horas.
Luego del enfriamiento se realizarán dos procedimientos distintos de separación de los
espermatozoides, una alícuota será centrifugará a 800 g por 20 minutos y la otra se
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dejará sedimentar; los espermatozoides obtenidos de cada procedimiento serán
congelados y evaluados post-congelación mediante la prueba de EFC, el análisis
seminal de rutina, el test de fragmentación del ADN y una prueba de fecundación in
vitro.
A su vez serán medidas la concentración en PS de dos proteínas: la NPC2 y la AQN-1
y la concentración de colesterol en espermatozoides y en PS. Estas mediciones se
realizarán inmediatamente terminada la colección (utilizando la primera alícuota de 5
ml), en el semen centrifugado y en el semen sedimentado.
La congelación se realizará según protocolo comercial de minitub® con Androstar
Cryoplus®.
Evaluación seminal
- La prueba de EFC mediante prueba combinada sHOST con viabilidad (Perez-Llano et
al., 2009), fijación con glutaraldehido al 2% en BTS (Pursel y Johnson, 1974) y
evaluación en microscopio Nikon Eclipse-80i de contraste de interferencia con
epifluorescencia (filtro B-2A) a 1000 X. El resultado de la prueba consistirá en expresar
el porcentaje de células vivas, morfológicamente normales, HOST+ y con acrosoma
íntegro; ajustado por los valores previos de aglutinación y formas redondas de cola.
- IEM con el Kit LIVE/DEAD® (Garner y Johnson, 1995).
- IFM (Perez-Llano et al., 2001).
- IAC (Pursel et al., 1974).
- Morfología espermática.
- Movilidad espermática en sistema CASA (computer assisted semen analysis).
- Integridad del ADN con el Kit Halotech® (Enciso et al., 2006).
- fecundación in vitro ( Abeydeera y Day, 1997).
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Electroforesis vertical y Western Blot
El PS obtenido será transportado al laboratorio en una cava con hielo, filtrado a través
de 1 y 0,22 micras y almacenado a -20°C.
La concentración de proteína total será medida con el método de Bradford a 595 nm en
espectrofotómetro. Se usará SDS-PAGE discontinua, resolución al 16% y apilamiento al
7% (12-21 KDa). El PS será diluido 1:3 en solución desnaturalizante (62.5 mM de Tris-
HCl, pH 6.8, 25% de glicerol, 2% de SDS y 0.01%de azul bromofenol).
El corrido se realizará a 50 V por 20 minutos y luego a 100 V por 3 horas en buffer
TRIS-Glicina y la transferencia toda la noche a corriente constante de 25 mA en
membranas de PVDF previamente tratadas con metanol. Las membranas transferidas
serán lavadas una vez con tween-20 al 0,1 % en PBS (PBST) por 20 minutos y dos
veces con PBS por 10 minutos cada una y bloqueadas con ASB al 3% en PBST
durante 12 horas a 4°C. Después de lavarlas será agregado el anticuerpo primario
contra cada proteína (producido en conejo) diluido según recomendación de fábrica,
para incubar durante 12 horas a 4°C; se lavará nuevamente para adicionar el
anticuerpo secundario conjugado a enzima peroxidasa de rábano (cabra anti-conejo) a
1:50000, e incubar por 2 horas a temperatura ambiente.
La reacción enzima-sustrato será realizada con el Kit Opti-4CN de BIO-RAD® por 20
minutos a temperatura ambiente y se visualizará con documentador de geles y el
software Image Lab-4 de BIO-RAD®.
Inmunofluorescencia indirecta
Esta técnica será realizada según por Ekhlasi-Hundrieser et al.,(2005) y Manásková y
Jonáková (2008). Los espermatozoides serán incubados por separado con los
anticuerpos primarios para las dos proteínas. Serán probadas diferentes diluciones del
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anticuerpo en PBS tomando como base un rango entre 1:50 y 1:500. Luego se realizará
un lavado de tres centrifugaciones a 150 g de tres minutos cada una, para incubar por 1
hora a 37°C con anticuerpo secundario (anti-conejo) ligado a FITC (SIGMA-ALDRICH,
Cat. F9887), diluido 1:160 en PBS. Después de lavar por centrifugación será realizado
un extendido en portaobjetos que se cubrirá con 1,5 µg/ml de VectaShield por 15
minutos. La visualización será realizada en microscopio Eclipse 80i Nikon con
epifluorescencia (filtro B-2A).a 40 X.
ELISA indirecta
El PS será diluido en buffer NaHCO3 a 0.05M (pH 9.6) a 2 µg/µl y se incubarán 100
µl/poso por 2 horas a 37°C para fijar el antígeno; también serán incubados 100 µl con
20 µg por poso del antígeno sintético como control positivo. Después de remover la
muestra no fijada se realizará un lavado con 200 µl/poso de PBST para bloquear con
200 µl/poso de ASB al 2,5% en PBS durante la noche a 4°C. Serán ensayadas
diferentes diluciones del anticuerpo primario contra cada proteína (producido en
conejos) con base en las recomendaciones de la casa comercial (dilución 1:10.000),
para incubar por 2 horas a 37°C. Después de lavar con PBST serán agregados 200
µl/poso del anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa (anti-conejo) (Sigma, Cat.
A0545) diluido 1:500 en PBS para incubar por 1 hora a 37°C. La reacción enzimática
será realizada según las especificaciones del Kit HRP-Substrate Kit (Cat. 1721064 de
BIO-RAD®).
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La medición de colesterol será realizada por cromatografía de gases con detector
selectivo de masas, la preparación de las muestras de PS y espermatozoides se
realizará por microextracción en fase líquida. Será usada una columna Rxi®-1ms (30m,
0,25mm ID, 0,25µm), temperatura inj. 250°C y gas helio con flujo de 1 ml/min.
4.5 Resultados esperados
- Conocimiento de la dinámica y función de las proteínas NPC2 y AQN-1 y el efecto
sobre el movimiento de colesterol en la membrana espermática y la congelabilidad
del semen porcino.
- Claridad sobre el efecto del plasma seminal en la congelabilidad del semen y sobre
que proteínas en específico están involucradas.
- Definición de criterios prácticos para la evaluación de la congelabilidad del semen
porcino para Colombia.
- Identificación de proteínas específicas relacionadas con la congelabilidad de los
machos, para una selección más acertada de estos con propósitos de congelación.
4.6 Impactos esperados a partir del uso de los resultados
El conocimiento de la participación de proteínas específicas en la incorporación de
colesterol a la membrana y en la función espermática, aportará información relevante
en cuanto a la prevención de la criocapacitación y de los daños en la calidad seminal
ocasionados por la congelación, además suministrará información para posteriores
ensayos de congelabilidad del semen porcino y para la clasificación de machos
mediante marcadores moleculares de congelabilidad.
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La relación entre proteínas plasmáticas y el semen de alta congelabilidad ciertos
machos, puede abrir nuevos caminos para establecer los marcadores biológicos de la
eficiencia en la conservación de gametas porcinas, y aporta fundamentos para realizar
innovación biotecnológica en el campo de la criopreservación, la inseminación artificial y
el control de la reproducción animal.
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4.7 Cronograma de actividades:
Actividades 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Revisión de literatura x x x x x x x x x x x x
Seguimiento de la fertilidad de los machos
x x x x x x x x
Compra e importación de reactivos x x x x x x x
Validación de las pruebas de EFC y FIV para congelabilidad
x x x
Adaptación de un protocolo de ELISA indirecta para cuantificación de proteínas
x x x x x
Adaptación de un protocolo de inmunofluorescencia indirecta para identificación de proteínas
x x x x x
Adaptación de un protocolo para medición de colesterol por cromatografía
x x x x x x
Realización de pruebas de congelabilidad
x x x
Identificación y cuantificación de proteínas
x x x
Medición de colesterol en membrana espermática y en PS
x x x
Análisis de resultados y preparación de informe final
x x x x x x
Preparación de artículos para publicación
x x x x
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5. Compromisos
Los resultados de esta investigación generarán mínimo una publicación en una
revista A1 indexada u homologada por COLCIENCIAS. Se presentará un informe
técnico al final del proyecto, al igual que el acta de sustentación de trabajo de grado.
6. Bibliografía
Abeydeera, L. R., and B. N. Day. 1997. Fertilization and Subsequent Development In
Vitro of Pig Oocytes Inseminated in a Modified Tris-Buffered Medium with Frozen-Thawed Ejaculated Spermatozoa. BIOLOGY OF REPRODUCTION 57: 729-734.
Belmonte, S. A., C. I. López, C. M. Roggero, G. A. De blas, C. N. Tomes, and L. S. Mayorga. 2005. Cholesterol content regulates acrosomal exocytosis by enhancing Rab3A plasma membrane association. Developmental Biology 285: 393 - 408.
Caballero, I. 2007. Estudio del plasma seminal y la espermadhesina PSP-I/PSP-II sobre la funcionalidad de los espermatozoides de verraco, Universidad de Murcia, Murcia.
Caballero, I., J. M. Vásquez, M. A. Gil, J. J. Calvete, J. Roca, L. Sanz, I. Parrilla, E. M. García, H. Rodríguez-Martínez, and E. A. Martínez. 2004. Does seminal plasma psp-i/psp-ii spermadhesin modulate the ability of boar spermatozoa to penetrate homologous oocytes in vitro? J. journal of Andrology 25: 1004-1012.
Calvete, J. J., M. Ensslin, J. Mburu, A. Iborra, A. Martínez, K. Adermann, D. Waberski, L. Sanz, E. Töpfer-Petersen, K. F. Weitze, S. Einarsson, and E. Rodríguez-Martínez. 1997. Monoclonal antibodies against boar sperm zonapellucida-binding protein awn-1. Characterization of a continuous antigenic determinant and immunolocalization of awn epitopes in inseminated sows. Biol Reprod 57: 735-742.
Centurión, F., J. M. Vásquez, J. J. Calvete, J. Roca, L. Sanz, I. Parrilla, E. M. García, and E. A. Martínez. 2003. Influence of porcine spermadhesins on the susceptibility of boar spermatozoa to high dilution. Biol Reprod 69: 640-646.
Dacheux, J. L., M. Belghazi, Y. Lanson, and F. Dacheux. 2006. Human epididymal secretome and proteome. Molecular and Cellular Endocrinology 250: 36-42.
Ekhlasi-Hundrieser, M., K. Gohr, A. Wagner, M. Tsolova, A. Petrunkina, and E. Töpfer-Petersen. 2005. Spermadhesin AQN1 Is a Candidate Receptor Molecule Involved in the Formation of the Oviductal Sperm Reservoir in the Pig. BIOLOGY OF REPRODUCTION 73: 536-545.
Enciso, M., C. López-Fernandez, J. L. Fernández, P. García, A. Gosálbez, and J. Gosálvez. 2006. A new method to analyze boar sperm DNA fragmentation under bright-field or fluorescence microscopy. Theriogenology 65: 308-316.
Flowers, W. L. 1999. Relationships between Seminal Plasma Proteins and Boar Fertility: Development of a Proactive Semen Fertility Test. Animal Science.
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García, E. M. 2007. Análisis, función y aplicaciones biotecnológicas de las proteínas del plasma seminal de porcino PSP I y PSP II, Universidad de Murcia, Murcia.
García, J. C., J. C. Domínguez, F. J. Peña, B. Alegre, R. González, M. J. Castro, G. G. Habing, and R. N. Kirkwood. 2010. Thawing boar semen in the presence of seminal plasma: Effects on sperm quality and fertility. Animal Reproduction Science 119: 160-165.
Garner, D. L., and L. A. Johnson. 1995. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide. Biology of reproduction 53: 276-284.
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González-Cadavid, V., J.-A. M. Martins, F.-B. Moreno, A. Tiago-S, A.-C. L. Santos, A.-C. Monteiro-Moreira, R.-A. Moreira, and A.-A. Moura. 2014. Seminal plasma proteins of adult boars and correlations with sperm parameters. Theriogenology 82: 697-707.
Hossain, M. S., A. Johannisson, A. P. Siqueira, M. Wallgren, and H. Rodríguez-Martínez. 2011. Spermatozoa in the sperm-peak-fraction of the boar ejaculate show a lower flow of Ca (2+) under capacitation conditions post-thaw which might account for their higher membrane stability after cryopreservation. Animal Reproduction Science 128: 37-44.
Johnson, L. A., K. F. Weitze, P. Fiser, and W. M. C. Maxwell. 2000. Storage of boar semen. Animal Reproduction Science 62: 143-172.
Jonáková, V., P. Manásková, M. Kraus, J. Liberda, and M. Tichá. 2000. Sperm Surface Proteins in Mammalian Fertilization. Molecular reproduction and development 56: 275-277.
Kaneto, M., H. Harayama, M. Miyake, and S. Kato. 2002. Capacitation-like alterations in cooled boar spermatozoa: assessment by thechlortetracycline staining assay and immunodetection of tyrosine-phosphorylated sperm proteins. Animal Reproduction Science 73: 197-209.
Kirchhoff, C., C. Osterhoff, and L. Young. 1996. Molecular Cloning and Characterization of HE1, a Major Secretory Protein of the Human Epididymis. BIOLOGY OF REPRODUCTION 54: 847-856.
Lasserre, A., R. Barrozo, J.-G. tezón, P.-V. Miranda, and M.-H. Vazquez-Levin. 2001. Human epididymal proteins and sperm function during fertilization: un update. Biological Research 34.
Légaré, C., M. Thabet, J.-L. Gatti, and R. Sullivan. 2006. HE1/NPC2 status in human reproductive tract and ejaculated spermatozoa: consequence of vasectomy. Molecular Human Reproduction 12: 461-468.
Manásková, P., and V. Jonáková. 2008. Localization of porcine seminal plasma (PSP) proteins in the boar reproductive tract and spermatozoa. Journal of Reproductive Immunology 78: 40-48.
Okamura, N., S. Kiuchi, M. Tamba, T. Kashima, S. Hiramoto, T. Baba, F. Dacheux, J.-L. Dacheux, Y. Sugita, and Y.-Z. Jin. 1999. A porcine homolog of the major secretory protein of human epididymis, HE1, specifically binds cholesterol. Biochimica et Biophysica Acta 1438: 377-387.
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Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
Perez-Llano, B., J. L. Lorenzo, P. Yenes, A. Trejo, and P. Garcia-Casado. 2001. A short hypoosmotic swelling test for the prediction of boar sperm fertility. Theriogenology 56: 387-398.
Perez-Llano, B., R. Sala, G. Reguera, and P. Garcia-Casado. 2009. Changes in subpopulations of boar sperm defined according to viability and plasma and acrosome membrane status observed during storage at 15 degrees C. Theriogenology 71: 311-317.
Pérez-Llano, B., R. Sala, G. Reguera, and P. García-Casado. 2009. Changes in subpopulations of boar sperm defined according to viability and plasma and acrosome membrane status observed during storage at 15 °C. Theriogenology 71: 311-317.
Pursel, V. G., and L. A. Johnson. 1974. Glutaraldehyde fixation of boar spermatozoa for acrosome evaluation. Theriogenology 1: 63-68.
Rodríguez-Martínez, H., F. Saravia, M. Wallgren, J. Roca, and F. J. Peña. 2008. Influence of seminal plasma on the kinematics of boar spermatozoa during freezing. Theriogenology 70: 1242-1250.
Rodríguez-Martínez, H., F. Saravia, M. Wallgren, P. Tienthai, A. Johannisson, J. M. Vázquez, E. Martínez, J. Roca, L. Sanz, and J. J. Calvete. 2005. Boar spermatozoa in the oviduct. Theriogenology 63: 514-535.
Rodríguez-Martínez, H., J. L. Vallet, and A. J. Ziecik. 2009. The physiological roles of the boar ejaculate. In: Eighth International Conference on Pig Reproduction, Control of Pig Reproduction VIII
Sanz, L., J. J. Calvete, K. Mann, W. Schafer, E. R. Schmid, W. Amselgruber, F. Sinowatz, M. Ehrhard, and E. Tapfer-Petersena. 1992. The complete primary structure of the spermadhesin AWN, a zona pellucida-binding protein isolated from boar spermatozoa. FEBS 300: 213-218.
Saravia, F., M. Wallgren, A. Johannisson, J. J. Calvete, L. Sanz, F. J. Peña, J. Roca, and H. Rodríguez-Martínez. 2009. Exposure to the seminal plasma of different portions of the boar ejaculate modulates the survival of spermatozoa cryopreserved in MiniFlatPacks. Theriogenology 71: 662-675.
Stillwell, W., and S.-R. Wassall. 1990. Interactions of Retinoids with Phospholipid Membranes: Optical Spectroscopy. METHODS IN ENZYMOLOGY 189: 373-382.
Tanaka, T., Y. Urade, H. Kimura, N. Eguchi, A. Nishikawa, and O. Hayaishi. 1997. Lipocalin-type Prostaglandin D Synthase (b-Trace) Is a Newly Recognized Type of Retinoid Transporter. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 272: 15789-15795.
Vadnais, M. L., and G. C. Althouse. 2011. Characterization of capacitation,cryoinjury, and the role of seminal plasma inporcine sperm. Theriogenology 76: 1508-1516.
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Visconti, P. E., and G. S. Kopf. 1998. Regulation of Protein Phosphorylation during Sperm Capacitation. Biol Reprod 59: 1-6.
Waberski, D., H. Südhoff, T. Hahn, P. W. Jungblut, E. Kallweit, J. J. Calvete, M. Ensslin, H. O. Hoppen, N. Wintergalen, and K. F. Weitze. 1995. Advanced ovulation in gilts by the intrauterine application of a low molecular mass pronase-sensitive fraction of boar seminal plasma. Journal Reproduction Fertility 105: 247-252.
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Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
Wysocki, P., A. Orzolek, J. Strzézek, M. Koziorowska-Gilun, L. Zasiadczyk, and W. Kordan. 2015. The activity of N-acetyl-b-hexosaminidase in boar seminal plasma is linked with semen quality and its suitability for cryopreservation. Theriogenology: 1-9.
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7. Presupuesto
PRESUPUESTO TOTAL *
Nombre del proyecto: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la
congelabilidad del semen porcino
RUBROS
FUENTES
TOTAL
UNIVERSIDAD DE
CALDAS
FINANCIACIÓN
EXTERNA
RECURRENTE
[1]
Solicitado a
V.I.P RECURRENTE
RECURSOS
FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES 75.577.480 0 0 0 75.577.480
1.1. Investigadores 75.577.480 0 0 0 75.577.480
1.2. Auxiliares 0 0 0 0 0
1.3. Consultores 0 0 0 0 0
1.4. Asesores 0 0 0 0 0
2. GASTOS GENERALES 0 27.880.000 0 0 27.880.000
2.1. Servicios técnicos 0 7.200.000 0 0 7.200.000
2.1.1. Exámenes 0 0 0 0 0
2.1.2. Pruebas técnicas 0 7.200.000 0 0 7.200.000
2.1.3. Servicios de encuestas 0 0 0 0 0
2.2. Materiales e insumos 0 20.680.000 0 0 20.680.000
2.2.1. De campo 0 0 0 0 0
2.2.2. De oficina (papel, tinta,
fotocopias) 0 0 0 0 0
2.2.3. De laboratorio 0 20.680.000 0 0 20.680.000
2.3. Apoyo económico para gastos de
viaje 0 0 0 0 0
2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0 0 0 0
2.3.2. Pasajes terrestres 0 0 0 0 0
2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y
peajes) 0 0 0 0 0
2.3.4. Auxilio para viaje 0 0 0 0 0
2.3.5. Apoyo económico para
alojamiento y alimentación [2] 0 0 0 0 0
2.4. Gastos para uso de equipos 0 0 0 0 0
2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0 0 0 0
3. INVERSIÓN 0 0 0 0 0
3.1. En equipos 0 0 0 0 0
3.1.1. Para compra de equipos 0 0 0 0 0
3.1.2. Equipos propios 0 0 0 0 0
3.2. En planta física 0 0 0 0 0
3.2.1. Adecuaciones 0 0 0 0 0
3.2.2. Alquiler de planta física 0 0 0 0 0
3.3. En material bibliográfico
necesario para esta investigación 0 0 0 0 0
Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de
Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
3.3.1. Para comprar 0 0 0 0 0
3.4. En software necesario para esta
investigación 0 0 0 0 0
3.4.1. Para comprar 0 0 0 0 0
3.4.2. Propio 0 0 0 0 0
SUB-TOTAL 75.577.480 27.880.000 0 0 103.457.480
ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 0 0
TOTAL 75.577.480 27.880.000 0 0 103.457.480
PORCENTAJE DE FUENTES 73,1% 26,9% 0,0% 0,0% 100,0%
PRESUPUESTO *
AÑO 1
Nombre del proyecto: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la
congelabilidad del semen porcino
RUBROS
FUENTES
TOTAL
UNIVERSIDAD DE
CALDAS
FINANCIACIÓN
EXTERNA
RECURRENTE
[1]
Solicitado a
V.I.P RECURRENTE
RECURSOS
FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES 37.788.740 0 0 0 37.788.740
1.1. Investigadores 37.788.740 0 37.788.740
1.2. Auxiliares 0 0
1.3. Consultores 0
2. GASTOS GENERALES 0 27.880.000 0 0 27.880.000
2.1. Servicios técnicos 0 7.200.000 0 0 7.200.000
2.1.1. Exámenes 0
2.1.2. Pruebas técnicas 7.200.000 7.200.000
2.1.3. Servicios de encuestas 0
2.2. Materiales e insumos 0 20.680.000 0 0 20.680.000
2.2.1. De campo 0
2.2.2. De oficina (papel, tinta,
fotocopias) 0
2.2.3. De laboratorio 20.680.000 20.680.000
2.3. Apoyo económico para gastos de
viaje 0 0 0 0 0
2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0
2.3.2. Pasajes terrestres 0 0
2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y
peajes) 0 0
2.3.4. Auxilio para viaje 0 0
2.3.5. Apoyo económico para
alojamiento y alimentación [2] 0 0
2.4. Gastos para uso de equipos 0 0 0 0 0
2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0
Guía para la presentación de proyectos en el marco de la “Convocatoria general para la financiación de proyectos de
Investigación, Innovación y Creación de la Universidad de Caldas 2015”
Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
3. INVERSIÓN 0 0 0 0 0
3.1. En equipos 0 0 0 0 0
3.1.1. Para compra de equipos 0 0
3.1.2. Equipos propios 0 0
3.2. En planta física 0 0 0 0 0
3.2.1. Adecuaciones 0 0
3.2.2. Alquiler de planta física 0 0
3.3. En material bibliográfico
necesario para esta investigación 0 0 0 0 0
3.3.1. Para comprar 0 0
3.4. En software necesario para esta
investigación 0 0 0 0 0
3.4.1. Para comprar 0 0
3.4.2. Propio 0 0
SUB-TOTAL 37.788.740 27.880.000 0 0 65.668.740
ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 0 0
TOTAL 37.788.740 27.880.000 0 0 65.668.740
PORCENTAJE DE FUENTES 57,5% 42,5% 0,0% 0,0% 100,0%
PRESUPUESTO * AÑO 2
Nombre del proyecto: Dinámica de las proteínas del plasma seminal NPC2 y AQN-1 sobre la
congelabilidad del semen porcino
RUBROS
FUENTES
TOTAL
UNIVERSIDAD DE
CALDAS
FINANCIACIÓN
EXTERNA
RECURRENTE
[1]
Solicitado a
V.I.P RECURRENTE
RECURSOS
FRESCOS
1. SERVICIOS PERSONALES 37.788.740 0 0 0 37.788.740
1.1. Investigadores 37.788.740 0 37.788.740
1.2. Auxiliares 0 0
1.3. Consultores 0
2. GASTOS GENERALES 0 0 0 0 0
2.1. Servicios técnicos 0 0 0 0 0
2.1.1. Exámenes 0
2.1.2. Pruebas técnicas 0
2.1.3. Servicios de encuestas 0
2.2. Materiales e insumos 0 0 0 0 0
2.2.1. De campo 0
2.2.2. De oficina (papel, tinta,
fotocopias) 0
2.2.3. De laboratorio 0
2.3. Apoyo económico para gastos de
viaje 0 0 0 0 0
2.3.1. Tiquetes aéreos 0 0
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Vicerrectoría de Investigaciones y Postgrados
2.3.2. Pasajes terrestres 0 0
2.3.3. Gastos de viaje (gasolina y
peajes) 0 0
2.3.4. Auxilio para viaje 0 0
2.3.5. Apoyo económico para
alojamiento y alimentación [2] 0 0
2.4. Gastos para uso de equipos 0 0 0 0 0
2.4.1. Pago de alquiler de equipos 0 0
3. INVERSIÓN 0 0 0 0 0
3.1. En equipos 0 0 0 0 0
3.1.1. Para compra de equipos 0 0
3.1.2. Equipos propios 0 0
3.2. En planta física 0 0 0 0 0
3.2.1. Adecuaciones 0 0
3.2.2. Alquiler de planta física 0 0
3.3. En material bibliográfico
necesario para esta investigación 0 0 0 0 0
3.3.1. Para comprar 0 0
3.4. En software necesario para esta
investigación 0 0 0 0 0
3.4.1. Para comprar 0 0
3.4.2. Propio 0 0
SUB-TOTAL 37.788.740 0 0 0 37.788.740
ADMINISTRACIÓN, 20% 0 0 0 0 0
TOTAL 37.788.740 0 0 0 37.788.740
PORCENTAJE DE FUENTES 100,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0%
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TABLAS DE ANEXO AL PRESUPUESTO
Descripción de los gastos de personal Nombre de los
investigadores
Formación
Académica
Función dentro
del proyecto
Institución o
Empresa
Tipo de
vinculación
Dedicación
(horas/sem)
Fuentes Total
Efectivo Recurrente
Francisco Javier
Henao Uribe PhD Director
Universidad
de Caldas Profesor titular 5 x 42.577.480
Julian Alonso
Valencia Giraldo
Profesional
universitario
Estudiante de
doctorado
Universidad
de Caldas Estudiante 20
33.000.000
Totales 75.577.480