COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR
CONGELACIÓN A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS
GILMA JANNETH CANARIA PULIDO DIANA ROCIO MARTINEZ CIFUENTES
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
para optar al título de
BACTERIOLOGA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA Bogotá D.C
7 de noviembre del 2000
NOTA DE ADVERTENCIA Artículo 23 de la resolución Nº13 de julio de 1946: “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por los alumnos en sus tesis de grado”.
COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR
CONGELACIÓN A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS
GILMA JANNETH CANARIA PULIDO DIANA ROCIO MARTINEZ CIFUENTES
__________________________ _________________________ MARCELA GOMEZ HUGO DIEZ DIRECTORA CODIRECTOR
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE BACTERIOLOGIA Bogotá D.C
7 de noviembre del 2000
COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR
CONGELACION A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS
GILMA JANNETH CANARIA PULIDO DIANA ROCIO MARTINEZ CIFUENTES
_____________________________ CARLOS CORREDOR PhD Decano académico facultad de ciencias
______________________________ AURA ROSA MANASCERO Directora de las carrera de bacteriología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BACTERIOLOGIA
Bogotá D.C 7 de noviembre del 2000
DEDICATORIA
A DIOS POR PERMITIRNOS LOGRAR CADA META PROPUESTA
Y COLABORARNOS EN TODOS LOS ASPECTOS DE NUESTRAS
VIDAS.
A NUESTROS PADRES POR APOYARNOS EN TODOS LOS
MOMENTOS.
A LOS AMIGOS QUE CON GRAN ALEGRIA NOS HAN
ALENTADO A LO LARGO DE LA CARRERA.
A MARCELA GOMEZ Y HUGO DIEZ POR SU FORMACION Y
AYUDA EN EL CICLO PROFESIONAL Y DURANTE ESTE
TRABAJO DE GRADO.
A NOSOTRAS MISMAS POR HACERNOS VER QUE NO EXISTEN
METAS INALCANZABLES CUANDO SE CUENTA CON
VERDADEROS AMIGOS Y LA AYUDA DE DIOS.
TABLA DE CONTENIDO
OBJETIVOS ¡Error! Marcador no definido.
INTRODUCCION 2
JUSTIFICACION 3
1. MARCO TEORICO 4
1.1 Preservación 4
1.1.1 Métodos de preservación a largo plazo 8
1.1.1.1 Liofilización 8
1.1.1.2 Ultracongelación 12
1.1.1.3 Mantenimiento sobre perlas de vidrio 12
1.1.2 Métodos de preservación a corto plazo 13
1.1.2.1 Subcultivo 13
1.1.2.2 Inmersión en aceite mineral 14
1.1.2.3 Desecación 15
1.1.2.3.1 Desecación en tiras o discos de papel 15
1.1.2.3.2 Desecación en discos de gelatina 15
1.1.2.3.3 Desecación con silica gel 16
1.1.2.3.4 Desecación en vidrio poroso y perlas de porcelana 16
1.1.2.4 Congelación 17
1.1.2.4.1 Congelación ordinaria 18
1.1.2.4.2 Congelación profunda 18
1.2 Generalidades de las cepas bacterianas en estudio 19
1.2.1 Bacterias grampositivas 19
1.2.2 Bacterias gramnegativas 20
1.2.3 Bacilos esporulados 21
2. MATERIALES Y METODOS 24
2.1 Tipo de estudio 24
2.2 Variables 24
2.3 Bacterias evaluadas 24
2.4 Hipótesis 25
2.5 Congelación a -20ºC en leche descremada al 10% 25
2.6 Congelación a -20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% 26
2.7 Congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en dicos de gelatina 26
2.8 Recuperación de la cepa 27
2.9 Pureza 28
2.10 Análisis de resultados 28
3. Resultados 29
3.1 Identificación de cepas 29
3.2 Viabilidad bacteriana posterior a cada técnica de mantenimiento 32
3.2.1 Conservación en leche descremada al 10% 32
3.2.2 Conservación en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% 34
3.2.3 Corservación por congelación posterior a la desecación con silica gel sobre discos de gelatina 35
3.3 Evaluación de cada técnica de mantenimiento en los gruposde bacterias evaluadas 37
3.4 Porcentajes de mortalidad obtenidos en cada método de preservación por cepa estudiada 38
3.5 Análisis estadístico 39
4. DISCUSIÓN 40
5. CONCLUSIONES 44
6. RECOMENDACIONES 45
BIBLIOGRAFIA 46
ANEXOS
INDICE DE TABLAS
pág
TABLA 1 EXPECTATIVA DE VIDA DE 33 GENEROS BACTERIANOS PRESERVADOS POR DIFERENTES METODOS DE CONSERVACIÓN 9 TABLA 2 METODOS DE PRESERVACION PARA DIFERENTES GENEROS BACTERIANOS 11 TABLA 3 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS 29 TABLA 4 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS 30 TABLA 5 RESULTADOS EN LAS PRUEBAS DE IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS 31 TABLA 6 VALORES SIGNIFICATIVOS OBTENIDOS EN EL ANALISIS ESTADISTICO POR EL TEST DE ESFERICIDAD DE BARTLETT’S 39
INDICE DE FIGURAS
pág FIGURA 1 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMNEGATIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN
LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).
32
FIGURA 2 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
COCOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).
33
FIGURA 3 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN LECHE DESCREMADA AL 10% (P/V).
33
FIGURA 4 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMNEGATIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN
LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON
ADICIÓN DE GLICEROL AL 3%. 34
FIGURA 5 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
COCOS GRAM POSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A-20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN
DE GLICEROL AL 3%. 34
FIGURA 6 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN
DE GLICEROL AL 3%. 35
FIGURA 7 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMNEGATIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN
LA TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON
SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA. 35
FIGURA 8 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
COCOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON SILICA
GEL EN DISCOS DE GELATINA. 36
FIGURA 9 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS DEL GRUPO DE
BACILOS GRAMPOSITIVOS, A LOS DIFERENTES INTERVALOS DE TIEMPO EN LA
TÉCNICA DE CONGELACIÓN A -20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN CON SILICA
GEL EN DISCOS DE GELATINA. 36
FIGURA 10 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS EN LOS GRUPOS
DE ESTUDIO MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC CON LECHE DESCREMADA AL
10% (P/V). 37
FIGURA 11 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS EN LOS GRUPOS
DE ESTUDIO, MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC EN CALDO TRIPTONA SOYA
CON ADICIÓN DE GLICEROL AL 3%. 37
FIGURA 12 CONCENTRACIÓN DE BACTERIAS RECUPERADAS EN LOS GRUPOS
DE ESTUDIO MEDIANTE CONGELACIÓN A –20ºC POSTERIOR A LA DESECACIÓN
CON SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA. 38
FIGURA 13 PORCENTAJES DE MORTALIDAD FINALES EN CADA
MICROORGANISMO, DEACUERDO AL SISTEMA DE CONSERVACIÓN
EMPLEADO. 38
COMPARACION DE TRES TECNICAS DE PRESERVACION POR
CONGELACIÓN A –20ºC PARA EL MANTENIMIENTO DE BACTERIAS
GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS
OBJETIVO GENERAL
Comparar las técnicas de preservación, para así determinar el método de
mantenimiento más adecuado en las especies Staphylococcus aureus, St epidermidis,
St. saprophyticus, Streptococcus mutans, Enterococcus faecalis, Enterococcus
faecium y Listeria monocitogenes, Salmonella spp, Shigella spp, Escherichia coli,
Bacillus subtilis y Bacillus cereus.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
• Aplicar tres métodos de conservación: : Desecación de discos de gelatina
sobre silica gel, congelación en leche descremada y congelación en medio
triptona soya con adición del crioprotector glicerol en las cepas bacterianas.
• Evaluar la viabilidad bacteriana antes y después del empleo de cada técnica.
• Establecer la técnica de preservación más apropiada para cada cepa bacteriana
estudiada.
• Confrontar las tres técnicas de mantenimiento y determinar el mejor sistema
en los grupos bacterianos
RESUMEN
Los microorganismos cuentan con amplia variedad de aplicaciones, entre ellas la
investigación, la educación y control de calidad en industrias y laboratorios; por tal
motivo, es necesaria la implementación de técnicas adecuadas para la preservación de
estos; para lo cual cada laboratorio debe estandarizar sus técnicas de preservación de
acuerdo a sus necesidades y recursos.
En el presente estudio se evaluaron y compararon las siguientes técnicas de
preservación por congelación a –20ºC: en leche descremada al 10%, en medio
triptona soya con adición de glicerol al 3% y posterior a la desecación con silica gel
en discos de gelatina; aplicadas a bacterias representativas de los grupos
grampositivos y gramnegativos, evaluando viabilidad y pureza posteriores a la
congelación, a intervalos de 3 días, 1,2,3 y 4 semanas.
Los microorganismos grampositivos y gramnegativos se recuperaron viables y puros,
a todos los períodos evaluados en cada técnica de conservación; aunque la
concentración de bacterias recuperadas decreció en todas las cepas de ensayo a
medida que aumentaba el tiempo de preservación; se observo la mayor recuperación
en el grupo de cocos grampositivos por los tres métodos de preservación; finalmente
se obtuvieron grandes porcentajes de mortalidad en B. subtillis (67%) por silica gel y
en Salmonella spp un 48.5% independientemente del sistema usado.
Al comparar los tres sistemas de mantenimiento se estableció que los
microorganismos mejor preservados de acuerdo a cada técnica son: Shigella spp, St.
aureus y B. subtillis por el método de congelación a –20ºC en leche descremada al
10%; E. coli, St. saprophyticus, E. faecalis, Listeria monocytogenes y Bacillus cereus
en la técnica de congelación a –20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al
3%; por último Salmonella spp, St. epidermidis, St mutans, y E. faecium en la técnica
de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina.
INTRODUCCION
Algunos avances de la industria y la investigación en microbiología dependen del
mantenimiento de microorganismos para proveer cultivos bacterianos puros, viables y
estables haciendo necesaria la preservación de cepas bacterianas como una gran
prioridad (Kirsop and Snell, 1984). El objetivo primario de la preservación de los
cultivos es mantener el microorganismo vivo, libre de contaminación y sin variación
o mutación en su ADN (Gerhardt, 1994); ya que los cultivos microbianos son
extremadamente vulnerables a la contaminación, cambios ocasionados por su hábitat
o muerte por lo cual es de gran importancia la adopción de técnicas apropiadas para
mantener los microorganismos de acuerdo al período de tiempo requerido, costos, y
recursos de cada laboratorio. Se han empleado diferentes métodos para preservación
de bacterias, como congelación a -20°C, -70°C y –80°C, subcultivo, liofilización,
inmersión en aceite mineral y desecación (Gerhardt, 1994); produciendo resultados
variados dependiendo de las especies bacterianas, por lo cual es aconsejable que cada
laboratorio evalúe la mayor cantidad de técnicas de preservación para así al momento
de escoger una de ellas, sea la que más se ajuste a sus necesidades teniendo en cuenta
el balance de ventajas y desventajas de la misma. Además la preservación de un
cultivo también depende de variables propias de cada cepa del laboratorio como el
tiempo transcurrido desde la adquisición del cultivo, las especies y las condiciones de
almacenamiento (Tsvetkowt et al, 1983).
El mantenimiento de las cepas bacterianas en el laboratorio de Microbiología
Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana se lleva a cabo con fines
pedagógicos y científicos, por lo cual en este trabajo se evaluaron tres técnicas de
congelación a –20ºC en la preservación de cultivos a corto plazo; en leche
descremada al 10%, en medio triptona soya con adición de glicerol al 3% y por
último posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina, para así
determinar el método de preservación más adecuado en las especies más
representativas de los grupos evaluados.
JUSTIFICACION
Muchos laboratorios bacteriológicos mantienen cultivos de stock o colecciones
bacterianas de referencia con múltiples propósitos; entre ellos investigación,
bioensayos, industria y educación (Gibson, et al 1986); los métodos para el
mantenimiento de dichos cultivos, se dividen básicamente en dos categorías: Métodos
a corto plazo, como subcultivo, inmersión en aceite mineral, congelación y
desecación; y métodos a largo plazo, entre los que se encuentran, la liofilización,
ultracongelación, criofijación y deshidratación (Gherna, 1994). El propósito de la
preservación de cultivos es mantener microorganismos, viables, libres de
contaminación y sin mutaciones ni variación de sus características, por lo cuál es
importante la estandarización y evaluación de cada método por el laboratorio,
deacuerdo a los equipos, cepas y reactivos con que se cuente, para así lograr
seleccionar la técnica mas apropiada que mantenga el mayor número de especies de
varios de microorganismos incluyendo los de más relevancia en cada área de trabajo.
Debido al déficit de estudios sobre preservación bacteriana en Colombia y
observando que en el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia
Universidad Javeriana, solo se ha implementado el mantenimiento de cepas por el
método de subcultivos, el cual posee varias desventajas como el alto riesgo de
contaminación, pérdida de la cepa original y mutaciones; debido a la propensión de
estos cultivos a perder la estabilidad de sus caracteres creando un mutante que puede
seguir siendo seleccionado para subcultivos posteriores; se propuso evaluar en este
laboratorio tres técnicas de preservación por congelacion a –20ºC a corto plazo para
la preservación: la primera en leche descremada al 10%, la segunda en medio triptona
soya con adición del glicerol al 3% y por último, posterior a la desecación con silica
gel en discos de gelatina; para así determinar el método de preservación más
adecuado en las especies más representativas en los grupos de bacterias grampositivas
y gramnegativas estudiados. Estas técnicas al ser empleadas han arrojado excelentes
resultados en estudios anteriores en otros países (CECIL, P et al, 1955), (GRIVELL,
Et al, 1969).
1. MARCO TEORICO
Muchos laboratorios de bacteriología mantienen un stock de cultivo bacterianos, para
educación, investigaciones, bioensayos, o industria, por medio de diferentes sistemas
de preservación; con diversos resultados entre géneros y entre las mismas especies
bacterianas. La preservación de cultivos es extremadamente importante y debe
dársele la misma atención que a la estandarización de equipos y la selección de
compuestos químicos, ya que numerosos estudios en biología molecular, bioquímica
y genética, han sido estropeados por la pérdida o variación del stock de cultivos como
resultado de una preservación inadecuada (Gerhardt, 1994). Distintos autores han
empleado métodos de preservación en bacterias grampositivas y gramnegativas como
congelación -20ºC, -70ºC y –80ºC, subcultivos en medios apropiados dependiendo
del microorganismo, desecación y liofilización (Juven, 1979; Kirsop and Snell, 1984;
Demain and Solomon, 1986; Gibson and Khoury, 1986; Mills and Gherna, 1988;
Myonsun et al, 1991; Gerhardt, 1994; Lou and Youses, 1999).
1.1 PRESERVACION
El objetivo de la preservación de cultivos es mantener al organismo viable no
contaminado, sin variación o mutación en su ADN, conservando características
biológicas y sus propiedades morfológicas y bioquímicas; esto significa poseer las
condiciones adecuadas para que el microorganismo aislado sea igual al original. Se
han empleado muchos métodos de preservación pero no todas las especies responden
de manera similar, de hecho algunas cepas de la misma especie, responden diferente
frente al mismo procedimiento; es así como la preservación de un cultivo depende del
medio que se emplea, la técnica, la antigüedad de la cepa, la concentración del
inoculo y el tiempo de preservación (Villalobos, 1995; Gibson and Khoury, 1986;
Tsvetkov and Brankova, 1982). Por tal motivo todos los microorganismos utilizados
rutinariamente en el laboratorio deben ser conservados por la mejor técnica posible.
La información de métodos de preservación es limitada en la literatura y a menudo no
esta disponib le, ya que no existe un protocolo universal para todas las bacterias, sin
embargo algunos procedimientos usados en otros sistemas biológicos como células
eucariotas resultan aplicables. Todas las técnicas tienen ventajas y desventajas y la
elegida para un uso particular debe ser determinada por la relación de características
de cada método de acuerdo a las necesidades de su uso en el laboratorio (Kirsop et al,
1984).
Las características a ser consideradas cuando se elige una técnica de preservación
son:
♦ Mantenimiento de la viabilidad
La muerte celular puede ocurrir durante el proceso de preservación y puede aumentar
durante el almacenamiento, por causas como la contaminación, inestabilidad de los
caracteres bacterianos por mutaciones, o daño celular por la formación de cristales en
la preservación por congelación; resultando eventualmente en un bajo nivel de
viabilidad inaceptable. Para mantener la viabilidad de los cultivos, el método a
escoger debe minimizar la perdida de esta durante el procesamiento y
almacenamiento ya que una vez preservado el cultivo debe sobrevivir por largos
periodos (Kirsop et al, 1984).
♦ Cambio de población a través de selección
Una proporción de células en una población puede morir durante el proceso inicial de
preservación y este puede parecer poco significativo al usar altas concentraciones
celulares iniciales. Sin embargo la reducción en el número de células viables puede
resultar en selección de poblaciones resistentes de células sobrevivientes (mutantes) e
introducir la posibilidad de un cambio en las características del cultivo preservado.
Los sistemas de preservación deben tratar de recuperar el mayor numero de células
vivas para que las poblaciones sobrevivientes sean lo mas parecidas a la original
(Ellis, 1975).
♦ Cambio genético
Algunos microorganismos son usualmente preservados porque ciertos caracteres de
las cepas son de significancia científica o industrial. Por esto es importante que las
cepas preservadas no pierdan las características importantes o ganen otras. Los
cambios pueden ocurrir durante la preservación mediante mutaciones o perdida de
plásmidos, así que la técnica de preservación debe minimizar la ocurrencia de estos
eventos. Generalmente se recomiendan soluciones con bajas concentraciones de
agentes selectivos (mutagénicos) para mantener la presión selectiva uniforme en
estado preservado (Demain et al, 1986 and Snyder et al, 1997).
♦ Pureza
Los cultivos preservados deben permanecer puros y el procedimiento de preservación
debe minimizar la oportunidad de contaminación (Kirsop et al, 1984). Para esto es
necesario que las instalaciones, el material, y la manipulación durante el proceso
cumplan con todas las normas de esterilidad en el laboratorio, especialmente cuando
se trabaja con un amplio stock de microorganismos (bacterias, hongos, protozoos,
virus y células eucarióticas).
♦ Gastos
Los costos de mantenimiento de cultivos incluyen el gasto en personal, equipos,
materiales y facilidades generales tales como espacio para el almacenamiento y
capacidad de copias. El alto costo de capital en equipos para algunos métodos como
el liofilizador puede estar compensado con los costos de personal reducidos, dado que
la estabilidad por largo tiempo de los cultivos reduce la necesidad de intervención
manual frecuente (Kir sop et al, 1984).
♦ Tamaño del stock de cultivos preservados
El principal factor a ser considerado en relación con el número de cultivos para
escoger el método es el tiempo requerido por el operador en la preservación inicial y
la subsecuente manipulación, si se requieren una o más copias. Encontrar un método
apropiado para la preservación de pequeñas colecciones puede ser una labor extensiva
cuando el número de cepas aumenta. Escoger un método para un gran stock de
cultivos puede estar afectado por la cantidad de espacio de almacenamiento
disponible (Gerhardt, 1994).
♦ Importancia de los cultivos
Las consecuencias de la perdida de cultivos deben ser consideradas en la elección del
sistema de conservación. Los cultivos de mayor importancia económica, de difícil
aislamiento o consecución, y de uso en la investigación, deben ser preservados por
técnicas que minimicen el riesgo de pérdida y para mayor seguridad utilizar más de
un método de preservación, además, de poseer numerosas copias. (Ellis, 1975).
♦ Suministro y transporte de cultivos
Para la distribución de los cultivos son necesarias replicas de estos. Estas pueden ser
preparadas según sea requerido o prepararse en un volumen stock para la posterior
distribución. La ventaja de mantener la igualdad entre las copias de una misma
especie, depende del método de preservación usado y el número de cultivos a ser
distribuidos. Si los cultivos son distribuidos por correo deben estar empacados en
forma apropiada y sobrevivir al retraso y condiciones adversas encontradas; debe
tenerse estricto seguimiento de las regulaciones nacionales e internacionales del
correo, los duplicados de estas regulaciones se obtienen con las autoridades
nacionales postales (Kirsop et al, 1984).
♦ Frecuencia del uso de los cultivos
Algunos cultivos tales como cepas de ensayo, cepas de producción industrial o
aquellas empleadas para control de calidad son usadas frecuentemente en un
laboratorio. En estos casos, la facilidad de resucitación y el riesgo de contaminación
de los cultivos stock deben ser considerados al elegir la técnica de mantenimiento; en
cultivos usados irregularmente otros factores pueden ser de mayor importancia
(Demain et al, 1986).
Ningún método de preservación cumple todos estos criterios y su selección es un
proceso dispendioso. Esto es importante para reconocer que los microorganismos
difieren en su tolerancia a varios métodos de preservación y, a menos que una
colección sea muy especializada, es improbable que un solo método pueda proveer
óptimas condiciones para todas las cepas; en general la vida media de las cepas
bacterianas conservadas por distintos métodos se resume en la tabla 1.
En conclusión, la escogencia de un método depende del balance de ventajas y
desventajas de este. Los métodos de preservación se clasifican dependiendo del
tiempo en el cual se pueda tener una buena recuperación celular en métodos a corto
plazo que incluyen subcultivo, inmersión en aceite mineral, congelación y
desecación; y métodos a largo plazo como liofilización, ultracongelación y
mantenimiento sobre perlas de vidrio; los cuales se muestran en la tabla 2.
1.1.1 METODOS DE PRESERVACION A LARGO PLAZO
1.1.1.1 LIOFILIZACION
La liofilización implica la remoción de agua de suspensiones de células
congeladas por sublimación bajo presión reducida. Este es un buen método
de preservación a largo plazo para muchos microorganismos, aunque
algunos reportes demuestran que el proceso de liofilización puede inducir a
mutaciones en la bacteria (Ashwood et al, 1976). Para un óptimo resultado en
la preservación por liofilización se requiere el uso de agentes crioprotectores
como leche descremada al 10% (p/v), sucrosa al 12% (p/v), dimetil sulfoxido
(DMSO), o glicerol; estos compuestos químicos son adicionados a la
suspensión bacteriana para ayudar a reducir el daño causado durante la
congelación por la formación de cristales (Tsvetkov and Brankova, 1982;
Demain et al, 1986; Gerard et al, 1993).
TABLA 1. Expectativa de vida de 33 géneros bacterianos preservados por diferentes
métodos de conservación. GENERO SUBCULTIVO
(meses)
INMERSIÓN
EN ACEITE
MINERAL
(años)
CONGELACIÓN
PROFUNDA
(años)
LIOFILIZACION
(años) ULTRA
CONGELACION
EN NITRÓGENO
LIQUIDO
(años)
Acetobacter 1-2 1 1-3 >40 >40
Achromobacter 1 1-2 1-3 >40 >40
Acinetobacter 1 sem >40 >40
Actinobacillus 1 sem 2-3 >40 >40
Actinomyes 1 2-3 >40 >40
Agrobacterium 1-2 1-2 >40 >40
Arthobacter 1-2 1-2 >40 >40
Bacillus 2-12 2-3 >40 >40
Bacteroides 1 sem 1 >40 >40
Bifidobacterium 1 sem >40 >40
Chromatium 1 >5 >40
Clostridium 6-12 1-2 2-3 >40 >40
Corinebacterium 1-2 1 1-2 >40 >40
Enterobacter 1-4 1-2 >40 >40
Erwinia 1-4 1-2 >40 >40
Escherichia 1-4 1-2 >40 >40
Flavobacterium 1 2 >40 >40
Gluconobacter 1 >40 >40
Haemofilus 1 sem 1 mes
(37°C)
>40 >40
Klebsiella 1-4 1 1-2 >40 >40
Lactobacillus 1 sem >40 >40
Methanobacterium 1 >5 >40
Methanomonas 1 >5 >40
Micromonospora 1 1 1 >30 >40
Neisseria 1 >30 >40
Nocardia 1-4 1 1-2 >30 >40
Proteus 1-2 1 1-2 >40 >40
Pseudomonas 1-3 >40 >40
Spirillum 1 sem >40
Staphylococcus 1-2 1 >40 >40
Streptococcus 1-2 1 >40 >40
Streptomyces 1-8 1-2 1-3 >40 >40
Xantomonas 1-2 >40 >40
Tomado de Gerhardt, P et al, 1994 in methods for general and molecular bacteriology.
TABLA 2. Métodos de preservación para diferentes géneros bacterianos
METODOS A CORTO PLAZO METODOS A LARGO PLAZO
♦ Subcultivo
♦ Desecación
♦ Congelación
♦ Inmersión en aceite mineral
♦ Liofilización
♦ Ultracongelación
♦ Mantenimiento de bacterias sobre perlas de vidrio
Muchas cepas pueden preservarse liofilizadas por periodos de diez años o
más. La liofilización es particularmente útil cuando los cultivos preservados
son transportados constantemente, ya que los cultivos liofilizados no
requieren descongelamiento, así como para su transporte y almacenamiento
no es necesario refrigerar (Gerhardt, 1994).
1.1.1.2 ULTRACONGELACION
La preservación por largo tiempo de especies bacterianas no sensibles a la
liofilización ha sido alcanzada a través del almacenamiento en estado de congelación
a la temperatura del nitrógeno líquido (-196ºC) o encima (fase de vapor, -150 ºC,
aislado debidamente en tanques) este sistema requiere la adición de crioprotectores
como el glicerol y DMSO en la preparación de los cultivos. La colección Americana
de cultivos tipo o de fuentes comerciales (ATCC) ha aislado satisfactoriamente
muchas bacterias exigentes en nitrógeno líquido por cerca de 30 años sin pérdida de
las propiedades fenotípicas (Gibson and Koury, 1986).
La preservación por largo tiempo de cultivos bacterianos puede ser también alcanzada
usando temperaturas ultra-bajas en congeladores mecánicos (Revco, Inc.) Con una
temperatura de –70ºC, con adición de criopreservantes; aunque se deben tomar
precauciones para los inconvenientes de fluido eléctrico como alarmas o generadores
eléctricos para prevenir la pérdida de una colección de valor, usando esta técnica
(Gerhardt, 1994; Gerard et al, 1993).
1.1.1.3 MANTENIMIENTO DE BACTERIAS SOBRE PERLAS DE VIDRIO
El mantenimiento de cultivos en el rango de –60ºC a –80ºC es posible en algunos
laboratorios por la disponibilidad de congeladores comerciales con este rango de
temperatura, la desventaja del almacenamiento de la bacteria de este modo, es el daño
causado por la congelación y descongelación repetida cuando se requieren
subcultivos. Para superar este problema un método basado en el uso de suspensiones
bacterianas con adición de glicerol unido a perlas de vidrio fue desarrollado (Feltham
et al, 1978). La técnica permite remover perlas individuales sin descongelar la
muestra entera, y ha probado ser confiable por periodos hasta de 7 años, en el
almacenamiento de un amplio rango de microorganismos usando suspensiones
bacterianas mayores de 1 x 108 organismos por ml, y almacenadas en un rango de
–60ºC a –80ºC; lo cual es una gran desventaja, ya que la disponibilidad de estos
congeladores en los laboratorios es limitada dado su elevado costo (Kirsop et al,
1984).
1.1.2 METODOS DE PRESERVACION A CORTO PLAZO
1.1.2.1 SUBCULTIVO
El método tradicional de preservación bacteriana es por transferencias periódicas
seriadas a medio fresco; el intervalo entre cada transferencia varia de acuerdo al
microorganismo, el medio usado y las condiciones externas como temperatura,
humedad y riesgo de contaminación (Gibson and Khoury, 1986), así algunas bacterias
deben ser transferidas siempre a los pocos días como Neisseria spp y Listeria spp, en
cambio otras hasta semanas o meses después, tal es el caso de los Staphylococus y
coliformes. Las mayores desventajas de la técnica de transferencias seriadas son: el
riesgo de contaminación, la errada designación de cepas, la selección de varios
mutantes y la posible pérdida del cultivo, también el espacio de almacenamiento
requerido por lo cual el subcultivo no es recomendable como sistema de preservación
en laboratorios donde se manejen grandes volúmenes, ni como técnica de
preservación a largo plazo. Tres condiciones deben ser determinadas cuando se usa
este método de preservación de cultivos: medio apropiado de mantenimiento,
temperatura ideal de almacenamiento y frecuencia entre transferencias.
Los medios mínimos son preferidos para el subcultivo ya que bajan la taza metabólica
del organismo y prolongan el período entre transferencias. Sin embargo algunas
bacterias requieren medios complejos para el crecimiento, o para la conservación de
sus propiedades fisiológicas especificas y necesitan la presencia de compuestos
complejos en el medio. Cuando un medio complejo se usa, son necesarios más
repiques como resultado del crecimiento acelerado o la acumulación de metabolitos
(Gerhardt, 1994).
El almacenamiento en un contenedor cerrado en refrigerador de 5ºC a 8ºC es el
preferido para subcultivos, ya que reduce la tasa metabólica del organismo y la
desecación; muchas bacterias pueden ser conservadas por periodos de 3 a 5 meses
tomando las precauciones necesarias, los cultivos deben examinarse para pureza
después de cada subcultivo y realizar una caracterización periódica para monitorear
algún cambio en las características fenotípicas; además siempre se debe mantener un
duplicado en tubos como una precaución contra la perdida. Nunca se debe seleccionar
una sola colonia en la transferencia de cultivos, ya que las posibilidades de la
selección de un mutante aumentan cuando esta técnica es usada (Demain and
Solomon, 1986).
1.1.2.2 INMERSION EN ACEITE MINERAL
Un procedimiento simple para preservar una cepa bacteriana, sin necesidad de
refrigeración, es la inmersión en aceite mineral del cultivo en la fase logarítmica de
crecimiento o ocurrida la esporulación sobre agar inclinado o caldo de cultivo,
colocado en una posición vertical a 25ºC, para prevenir la deshidratación y reducir la
actividad metabólica y de crecimiento del cultivo. El aceite debe ser esterilizado en
un horno a 170ºC por una o dos horas y seguidamente realizársele una prueba de
esterilidad sobre un medio apropiado como agar nutritivo o agar triptona soya, se
recomienda no exceder la temperatura de esterilización puesto que el aceite podría
ahumarse y encenderse. La siembra sumergida dentro del aceite puede ser fácilmente
subcultivada en medio fresco, con un inoculo por picadura. Este procedimiento
tampoco es recomendado para el almacenamiento por largo tiempo de
microorganismos ya que posee las mismas desventajas del subcultivo y la adición del
aceite aumenta aun más la probabilidad de contaminación (Hartsell, 1956).
1.1.2.3 DESECACION
La desecación es el método de preservación más extensivamente usado. Existe una
gran variedad de métodos pero todos consisten esencialmente en remover el agua y
prevenir la rehidratación. Es tos métodos han sido ampliamente aplicados a hongos,
los cuales presentan mayor resistencia a la desecación que otros grupos de
microorganismos. Algunas levaduras y bacterias selectas como Campilobacter spp,
Neisseria gonorrhoeae y Vibrio cholerae han sido exitosamente preservadas por
desecación (Kirsop et al, 1984); pero en cambio cepas de Staphylococcus, Listeria
monocytogenes y Salmonella tiphymurium han presentado muerte (Walsh et al, 1974;
Juven et al, 1984; Beard et al, 1988; Palumbo and Williams, 1990; Janning et al,
1994).
1.1.2.3.1 Desecación en tiras o discos de papel
Es un método simple y económico de preservación para bacterias suspendidas en
caldo nutritivo apropiado (1x108 bacterias por ml), las cuales son posteriormente
impregnadas en tiras o discos de papel filtro estéril (Whatman No. 4) sin añadir
ningún agente crioprotector, colocadas en un desecador y almacenadas a temperatura
ambiente o en refrigeración. Muchos discos que contienen la misma bacteria pueden
ser colocados en un mismo tubo de ensayo o vial de tapa rosca refrigerados para
aumentar la vida media del cultivo desecado. Un único disco puede ser removido
asépticamente con pinzas estériles y ser inoculado en el caldo apropiado para la
recuperación (Demain and Solomon, 1986). Es idealmente usada en el mantenimiento
de cultivos de control de calidad y para envíos postales de un gran número de cepas
1.1.2.3.2 Desecación en discos de gelatina
Muchas bacterias heterotrópicas pueden ser preservadas por varios años en discos
desecados (Heckly, 1978). En este método, originalmente descrito por Stamp (1947),
los organismos son suspendidos en un medio nutritivo de gelatina, solidificados en
cajas de petri, y con la ayuda de una espátula pequeña se obtienen discos de
aproximadamente 1cm de diámetro; Los cua les son desecados posteriormente sobre
pentóxido de fósforo o silica gel, previamente activados y esterilizados en tubos tapa
rosca, para finalmente ser almacenados en refrigerador (Kirsop and Snell, 1984;
Gerhardt, 1994).
1.1.2.3.3 Desecación con silica gel
Hunt, Gourevitch and Lein (1958) y Perkins (1962) describieron los métodos para
preservación de cepas microbianas por deshidratación con silica gel y desde allí una
gran variedad de bacterias ha sido exitosamente preservada por desecamiento en
gránulos de silica gel estéril; el procedimiento es simple, rápido y económico. Tubos
de vidrio con silica gel son esterilizados a 180ºC, allí es también activada la silica, se
agrega la suspensión bacteriana en leche descremada al 10% (v/v) o los discos de
gelatina con una concentración bacteriana conocida se cubren y llevan a
refrigeración. Esta técnica es efectiva hasta por años (Grivell and Jackson, 1969;
Janning et al, 1994). La silica gel es un absorbente granular compuesto de cuarzo,
tridimita, cristobalita y otros minerales (cuya base estructural es la molécula de
SiO2), que le confieren la capacidad de resistir altas o bajas temperaturas y controlar
la humedad sin alterar su estructura (Grivell and Jackson; 1969; Kirsop and Snell,
1984)
1.1.2.3.4 Desecación en vidrio poroso y perlas de porcelana
Una amplia gama de bacterias han sido preservadas eficazmente por desecación bajo
el vacío sobre esferas perforadas de vidrio (Miller y Simmons, 1962), o esferas de
porcelana porosa (Hunt, 1958). Se usa 1ml de suspención de aproximadamente 1x108
células por ml en leche descremada al 10% (v/v) a las cuales se transfieren
asépticamente 20 a 40 esferas de vidrio, previamente tratadas para que cumplan las
condiciones necesarias de esterilidad y pH, se mezcla bien y remueve el exceso. Las
esferas son transferidas a un tubo de ensayo estéril con silica gel y algodón, tapados,
almacenados a temperatura ambiente por una semana y posteriormente en
refrigerador a 4ºC (Hunt et al, 1969; Gerhardt, 1994).
1.1.2.4 CONGELACION
La congelación es el método más simple y cómodo usado para la preservación de
microorganismos, no requiere un equipo especial; sin embargo para obtener
resultados satisfactorios, deben ser agregados agentes preservativos como el glicerol,
DMSO, leche descremada o sucrosa al medio cultivo (Laskin and Lechevalier, 1977;
Demain and Solomon, 1986; Gerhardt, 1994); las temperaturas de almacenamiento
deben ser constantes e inferiores de –20ºC (Kirsop and Snell al, 1984).
En la preservación por congelación el agua no es disponible para los
microorganismos y las células deshidratadas son almacenadas a bajas temperaturas.
Cuando la temperatura de la suspensión celular baja a 0°C el liquido extracelular
comienza a congelarse y forma cristales externos; La temperatura a la cual ocurre este
suceso depende de las propiedades de congelamiento de la suspensión y puede ser
evitado con la adición de agentes crioprotectores (Demain and Solomon, 1986),
adicionalmente, la concentración de solutos aumenta y el agua celular interna
comienza a migrar fuera de la célula por diferencia en la presión osmótica, la
remoción de esta también puede resultar en daño celular; eventualmente todos los
cristales de agua congelados se convierten en hielo puro dejando únicamente los
solutos concentrados y el agua de hidratación, los cuales se congelan y a esto se le
denomina temperatura eutéctica. Una congelación muy rápida puede contribuir a los
daños celulares por la formación de cristales internos, además, se puede causar daño
celular en las étapas subsecuentes de congelación y descongelación; por factores
como la concentración de electrolitos por remoción del agua en forma de hielo o por
la formación de cristales los cuales dañan la integridad celular (Reusser, 1963;
Manzur, 1970; Kirsop and Snell, 1984; Gerhardt, 1994). Un balance entre el daño
causado por la concentración de solutos y la formación interna de cristales puede ser
alcanzado con el control de la tasa de congelación. Una taza de 1-10°C por minuto es
satisfactoria para todas las bacterias. Anexo a esto, la concentración de solutos
durante la congelación puede alterar los componentes del medio por la formación de
complejos o bajas de pH en medios bufferados pobremente (Reusser, 1963; Gerhardt,
1994).
El uso de agentes crioprotectores ha sido ampliamente estudiado, comenzando por el
efecto protector del glicerol el cual fue descubierto por Pollee, Smith, and Parkes en
1949, y demostró ser el aditivo más efectivo hasta el descubrimiento de las virtudes
del DMSO en 1959 por Lovelock and Bishop. El glicerol es otro compuesto químico
crioprotector, de bajo peso molecular, no tóxico, capaz de penetrar la membrana
celular fácilmente, y hábil para unirse a cualquiera de los electrolitos que aumentan
su concentración durante la congelación, o a las moléculas de agua que demoran la
misma (Gerhardt, 1994).La protección por glicerol es explicable sobre las bases de
molaridad y solubilidad; actuando por reducción de la concentración de electrólitos
en los residuos no congelados de la solución y alrededor de la célula a una
temperatura dada (Manzur, 1970).
1.1.2.4.1 Congelación ordinaria
Cultivos en caldo o células cultivadas en medio inclinado son dispensados en tubos o
viales y almacenados en el compartimento de congelación en una nevera ordinaria
con temperaturas en el rango de -5ºC a –20ºC. La viabilidad de muchos
microorganismos depende de la especie, pero en general es de seis meses a dos años.
Sin embargo este método no es recomendable para un almacenamiento a largo plazo
ya que produce los daños mencionados anteriormente (Tsvetkov and Brancova, 1983;
Delgado et al, 1994).
1.1.2.4.2 Congelación profunda
La preservación de bacterias por este sistema a –70ºC en un congelador mecánico es
superior a la anterior a –20ºC. El procedimiento envuelve el congelamiento de viales
con la suspensión bacteriana en el medio adecuado y adición obligatoria de un
crioprotector para prevenir el daño celular durante el proceso de congelación, lo cual
significa una ventaja frente al sistema de congelación ordinaria; posteriormente las
células son recuperadas en el medio apropiado para cada especie, por descongelación
rápida de la suspensión celular en un baño de agua a 37ºC (Gerhardt, 1994).
1.2 GENERALIDADES DE LAS CEPAS BACTERIANAS EN ESTUDIO
Las bacterias se usan con múltiples propósitos, como pedagogía, investigación,
industria y control de calidad en los hospitales. Por las inconsistencias en diferentes
reportes en su conservación debido a: su metabolismo, ciclo de vida, propiedades
morfológicas y bioquímicas; es importante evaluar el mayor numero posib le de
cepas representativas por genero teniendo en cuenta sus características. En el presente
trabajo se evaluaron las especies más representativas de tres grupos de bacterias, los
cuales son:
1.1.2 BACTERIAS GRAM POSITIVAS
Las bacterias grampositivas poseen varias características que ayudan a diferenciarlas
de los microorganismos gramnegativos, estas son en el elevado contenido de
glucopeptidos y bajo contenido lipídico de sus paredes celulares, lo cual les permita
que retengan el colorante de cristal violeta de la tinción de Gram (desarrollada por él
medico danés Hans Christian Gram; de aquí su nombre), debido a que los alcoholes y
otros solventes orgánicos no penetran en las paredes celulares deficientes en lípidos.
Son en general más resistentes a los efectos de la desecación, el calor y la luz solar,
así como a la acción de sustancias químicas (Mattar y Melo, 1998).
Las paredes celulares son las capas más externas de estos microorganismos
(excluyendo las cápsulas), esencialmente gruesas (20-80nm) y consisten en un 50 a
60% de péptidoglucano, extensivamente entrecruzado en tres dimensiones para
formar una red polimérica gruesa; el restante esta compuesto de ácidos teicoicos,
ácidos teicuronicos y lipopolisacáridos (LPS) en bajas proporciones. Todas las células
grampositivas poseen un polímero lineal de ácido N-acetilmurámico y
N-acetilglucosamina, pero existe una variación en longitud y composición del
puente peptídico y el tetrapéptido de un ácido N-acetilmurámico que cruza hacia el
polímero adyacente. Los ácidos teicoicos, están unidos al ácido murámico de la capa
de peptidoglucano y se presentan en dos formas principales, ácido ribitol teicoico y
ácido glicerol teicoico. En general hay polímeros largos ya sea de ribitol (un alcohol
azúcar de cinco carbonos) o un glicerol (alcohol azúcar de tres carbonos) unidos entre
sí a través de puentes fosfodiéster. Sin embargo, todos los grupos hidroxil de ribitol o
subunidades de glicerol están unidos a diferentes azucares o aminoácidos. Debido a
que estos ácidos teicoicos son altamente antigénicos (inducen en un huésped la
producción de anticuerpos específicos que reaccionan contra estos) parece que se
extienden a través de la capa de péptidoglucano, y por lo tanto, brindan determinantes
antigénicos utilizados en la identificación serológica de muchos grupos y especies de
bacterias grampositivas (Howard, 1983; Wesley, 1993). Para la mayor parte las
proteínas no se encuentran como constituyentes de la pared celular de este grupo. Una
excepción es la proteína M del grupo A de Streptococcus.
1.2.2 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
La pared celular de las bacterias gramnegativas es más compleja desde el punto de
vista químico, estructuralmente poseen una membrana citoplasmática fosfolipídica,
rodeada por una capa de peptidoglicanos que delimitan el espacio periplasmático, así
como una pared externa que contiene elementos intercalados como lipopolisacaridos
(LPS), moléculas construidas sobre la región core y una cadena lateral. El LPS es un
complejo lipídico en el que intervienen, un lípido A (disacárido de glucosamina) y un
polisacárido, de extrema importancia por su toxicidad para los animales, recibiendo el
nombre de endotoxina ; aunque esta se encuentra asociada principalmente con el
lípido A, mientras que el polisacárido constituye el antígeno O somático. Otros
elementos de la membrana son lipoproteínas, porinas y otras proteínas, las cuales son
bastante complejas, e irradian los flagelos, las fimbrias o pilis. Al microscopio con la
tinción de Gram estos microorganismos se observan rosados por tomar el colorante
fucsina de la técnica. En estos más que en los grampositivos, hay un espacio entre la
membrana citoplasmática y la membrana externa, denominado espacio
periplasmático; el cual ha demostrado contener proteínas, enzimas hidrolíticas como
fosfatasa, DNAsa I, RNAsa I y penicilasas controladas por plásmidos (Brock, 1991;
Krieg, 1994; Mattar y Melo1998).
Es interesante observar que todos los LPS de la pared celular existen de
manera aislada en la capa exterior de la membrana externa, haciendo que esta
sea considerablemente más rígida que las membranas de las células normales.
Además, la membrana externa de los gramnegativos no esta del todo
penetrada por componentes hidrofóbicos (insolubles en agua) y es, por tanto,
resistente a la disolución por detergentes, otorgando a las bacterias la
posibilidad de crecer en presencia de detergentes que son letales para las
células grampositivas (Wesley, 1993).
1.2.3 BACILOS ESPORULADOS
Muchos miembros bacterianos de los géneros Bacillus y Clostridium entre otros
tienen la propiedad de formar un cuerpo refringente intracelular llamado
endoesporas, cuya función primaria es la sobrevivencia y diseminación de las
especies. Estas poseen una mayor resistencia que las células vegetativas a las
condiciones ambientales adversas, impenetrabilidad a las sustancias químicas,
resistencia al calor y a otros factores ambientales, además, pueden sobrevivir a los
procesos empleados en la preservación de comidas o a la esterilización de materiales
para uso en procedimientos médicos a menos que las condiciones de desinfección o
esterilización estén perfectamente mantenidas, ya que solo muy pocas especies
manifiestan una resistencia extrema (Moat and Foster, 1988; Divo, 1990)
La diseminación de esporas en la fase vegetativa puede resultar en contaminación de
las comidas y la producción de toxinas que pueden ocasionar riesgos serios de
enfermedad o muerte. Por estas razones los aspectos fisiológicos de la esporulación y
la resistencia de esporas a las condiciones ambientales han sido estudiados
extensivamente (Moat and Foster, 1988; Wesley, 1993).
Cuando una célula vegetativa forma una endospora fabrica una pared celular
totalmente diferente, cambia de forma y produce enzima nuevas, las cuales no se han
podido asociar específicamente, ya que las esporas y células tienen mucho en común
con respecto a las especies de proteínas. Por ejemplo cerca del 97% del mRNA
sintetizado durante la esporulación, es mRNA celular. Algunas actividades
enzimáticas encontradas en el desarrollo de las esporas no están presentes en el
citoplasma de la célula madre (aspartato-amino-transferasa y alanino-amino-
transferasa), y La L-alanino- deshidrogenasa es encontrada solamente en el
citoplasma de la célula madre (Howard, 1983; Wesley, 1993; Krieg, 1994).
La formación de endosporas es iniciada generalmente por la depleción de las fuentes
de carbono y nitrógeno en el medio de crecimiento y comprende los siguientes pasos:
Etapa del filamento axial, formación del septum y engolfamiento de la espora,
formación de cortex, formación de cubierta y por último la maduración (Krieg,
1994). Pueden permanecer viables por muchos años, tal vez siglos, en condiciones
normales en el suelo. Además mientras que la mayor parte de las células vegetativas
mueren a temperaturas de 60ºC a 70ºC, las endosporas pueden sobrevivir en agua en
ebullición por una hora o más. No hay una explicación simple para esta resistencia
pero el hecho de que las endosporas posean muy poca agua libre indudablemente es
una razón importante para su estabilidad térmica; por otra parte, las endosporas
contienen grandes cantidades de dipicolinato cálcico, una sustancia que no se
encuentra en las células vegetativas, y se ha postulado que este compuesto podría
desempeñar un papel importante en la resistencia al calor de la endospora, pero
cualquier mecanismo por el cual podría ocurrir es aún desconocido. Se ha mostrado
que las endosporas contienen aproximadamente cinco veces mas aminoácido cisteína
por miligramo del nitrógeno total, que su correspondiente célula vegetativa, y se ha
postulado que como resultado, el alto contenido de grupos de disulfuro podría
tomarse en cuenta para la marcada resistencia de la endospora a la radiación
ultravioleta, además, su resistencia ante las sustancias químicas que destruyen a las
células vegetativas podría explicarse por su impermeabilidad al grueso abrigo de la
espora.
La formación de esporas envuelve muchos loci genéticos por ejemplo en B. subtillis
50 o más de estos se encuentran implicados. Existen muchos genes implicados en la
formación de esporas, los genes ger y out están implicados en la maduración de las
esporas y la diseminación en B. subtillis, otros genes designados cot, codifican para
los polipéptidos de la cubierta de la espora y por ultimo los genes spo que
intervienen en todas las etapas de la esporulación (Howard, 1983; Moat and Foster,
1988 Krieg, 1994).
En miembros del género Bacillus una pequeña familia de proteínas esporas ácido-
solubles (SASPs), son sintetizadas solo durante la esporulación bajo control
transcripcional. Estas SASPs son los productos de una familia de multigenes a las
cuales se les han dado las siguientes designaciones, sspA, sspB, sspC y sspD. Durante
la germinación de las esporas las SASPs son degradadas rápidamente en
aminoácidos libres, los cuales proveen la síntesis de proteínas durante las etapas
tempranas de la germinación, además, las proteínas SASPs comprenden del 25 al
50% del núcleo proteico o protoplasto de la espora. Se han encontrado evidencias de
la implicación de este tipo de proteínas en la resistencia de las esporas inactivas a la
luz ultravioleta (Moat and Foster, 1988).
2. MATERIALES Y METODOS
2.1 TIPO DE ESTUDIO: Se realizo un trabajo experimental descriptivo estadístico,
en el que se determinan concentraciones de cada bacteria para evaluar cada una
de las técnicas de preservación tanto para bacterias grampositivas como
gramnegativas en el Laboratorio de Microbiología Especializada de la Pontificia
Universidad Javeriana.
2.2 VARIABLES: se evaluaron tres técnicas de preservación a corto plazo
(congelación a –20°C en leche descremada al 10%, congelación a –20°C en
caldo triptona soya con adición de glicerol y desecación con silica gel en discos
de gelatina), considerando las siguientes variables:
o Concentración de bacterias recuperadas.
o Técnica empleada.
o Intervalo de tiempo de preservación; los cuales fueron: 3 días; 1, 2, 3 y 4
semanas.
o Especie bacteriana preservada.
2.3 BACTERIAS EVALUADAS: se tomaron las especies más representativas de
los grupos de bacterias grampositivas, gramnegativas y esporulados; las cuales
se listan a continuación:
v Bacterias grampositivas:
o Cocos: Staphylococcus aureus, St. epidermidis y St. saprophyticus;
Streptococcus mutans y Enterococcus faecalis y E. faecium.
o Bacilos: Listeria monocytogenes.
v Bacterias gramnegativas:
o Bacilos: Escherichia coli, Salmonella spp y Shigella spp.
v Esporulados:
o Bacilos: Bacillus cereus y B. subtillis.
Las cepas de ensayo fueron obtenidas de la colección de cepas del laboratorio de
Microbiología Especializada de la Pontificia Universidad Javeriana que se mantienen
actualmente por subcultivos en refrigeración.
2.4 HIPOTESIS:
♦ Hipótesis nula (Hn): No hay relación entre las variables concentración de bacteria
recuperada, el tipo de sistema de preservación empleado y el tiempo dependiendo
de la cepa bacteriana, es decir, el resultado se debe al azar.
♦ Hipótesis alterna (Ha): Plantea que hay una relación entre las tres variables
anteriormente citadas, dependiendo de la cepa bacteriana y por consiguiente la
concentración de bacterias recuperadas esta relacionada con la técnica usada, el
tiempo de preservación y la especie bacteriana.
2.5 CONGELACIÓN A –20°C EN LECHE DESCREMADA AL 10% (SKIM
MILK):
El polvo de leche desnatada se utiliza como aditivo, ya que mejora las condiciones
de crecimiento de los microorganismos presentes; y el uso de este ofrece un soporte
sólido para la congelación (Gibson and Khoury, 1986), por la presencia de sustancias
conocidas como osmoprotectores, osmolitos, o solutos compatibles. Los osmolitos
son acumulados usualmente en las células durante periodos de estrés osmótico y
pueden estabilizar funciones fisiológicas inestables de proteínas citoplasmáticas u
otras estructuras bajo estas condiciones (Ryser and Marth, 1999). El medio fue
basado en la fórmula descrita por Gibson and Khoury (1986) y Gherna (1994) con
las siguientes modificaciones:
♦ El ensayo se monto por triplicado en cada cepa, dispensando 9ml de leche
descremada al 10% (p/v) (Anexo No.1) en tubos tapa rosca de 16x150mm.
♦ Seguidamente los tubos a temperatura ambiente se inoculan con un mililitro de
caldo Eugon (anexo No.2) con la suspensión bacteriana correspondiente, a una
concentración de 1,5x108 UFC/ml, correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland
(anexo No.3).
♦ La suspensión bacteriana es alicuotada en viales estériles de a 1ml y
posteriormente almacenados a -20°C.
2.6 CONGELACIÓN A –20°C EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN
DE GLICEROL AL 3%:
El método fue basado en la fórmula descrita por Gherna (1994) con varias
modificaciones, descritas a continuación:
♦ El glicerol (15ml) es adicionado a un medio soporte que contiene caldo triptona
soya (50ml) con suero fetal bovino al 2%, extracto de levadura (100mg), y un
porcentaje final del 30% de glicerol al 3% (anexo No.4).
♦ El ensayo se monta por triplicado en cada cepa, tomando un tubo tapa rosca de
16x150mm con 9ml del medio soporte con glicerol, y seguidamente los tubos a
temperatura ambiente se inoculan con un mililitro de caldo Eugon con la
suspensión bacteriana, correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland.
♦ La suspensión resultante es alicuotada en viales estériles de a 1ml y
posteriormente almacenados a -20°C.
2.7 DESECACIÓN CON SILICA GEL EN DISCOS DE GELATINA:
Se utilizo la técnica descrita por Kirsop and Snell (1984), Demain et al. (1986), y
Janning et al. (1994); con los cambios descritos a continuación:
♦ Se dispensan 0.5g de silica gel en tubos Khan, cubiertos con una capa delgada de
algodón, se lleva a 180°C en horno por 2 horas cubiertos con papel aluminio para
esterilizar y activar la silica; posteriormente todo el conjunto se cubre con vinilpel
y es almacenado a 4°C hasta su uso.
♦ Por otra parte, medio gelatina nutritivo (anexo No.5), dispensado de a 9ml en
tubos de 16x150mm; se esteriliza a 121ºC por 15 minutos.
♦ Seguidamente los tubos a 37ºC se inoculan con un mililitro de caldo Eugon con la
suspensión bacteriana correspondiente, a una concentración de 1,5x108UFC/ml,
correspondiente al patrón 0.5 de Mc Farland; para obtener una concentración final
de 1.5x107UFC/ml en la mezcla.
♦ La mezcla de la bacteria con la gelatina, es servida en cajas de petri pequeñas y
llevada a refrigerar (4ºC) para su solidificación.
♦ Posteriormente, se extraen discos de 1cm de diámetro, con una concentración de
bacterias de 7.1x105UFC/cm3, para ser colocados sobre el algodón en los tubos
con silica y sellados con parafilm.
♦ Por último todo el conjunto es llevado a congelar a –20°C.
2.8 RECUPERACIÓN DE LA CEPA:
♦ Después de ser sometidas a cada una de las técnicas de preservación, las cepas
dispuestas en los viales a –20°C, fueron resuspendidas en 9ml de caldo nutritivo
Eugon, pasados los siguientes intervalos de tiempo de evaluación: 3 días,
1, 2, 3 y 4 semanas.
♦ Los caldos con las cepas son preincubadas a 37°C por 25 minutos, pasado este
tiempo se realiza la primera lectura de las absorbancias “tiempo 0”, tomando
2.5ml de la suspensión en una celda especto fotométrica, para ser leída en un
espectrofotómetro a 540nm; nuevamente a las 24 horas de incubación se realiza
la segunda lectura de misma manera descrita anteriormente, para poder establecer
la viabilidad posterior a la aplicación de cada técnica.
Nota: Las lecturas se realizan contra blancos preparados paralelamente a cada técnica
pero sin adición de bacterias, que son resuspendidos en 9ml de caldo Eugon.
2.9 PUREZA:
♦ Previamente a la ejecución de cada una de las técnicas de preservación se realizo
la identificación de cada una de las cepas con las siguientes reacciones para cada
grupo:
o Bacterias grampositivas: Catalasa (Anexo No.6), Producción de
Coagulasa (Anexo No.7), Resistencia a la Novobiocina (Anexo No.8),
DNAsa (Anexo No.9), Hemólisis en Agar Sangre de Cordero (Anexo
No.10), Resistencia a la Optoquina (Anexo No.11), Bilis Esculina
(Anexo No.12), y Crecimiento en NaCl (Anexo No.13).
o Bacterias gramnegativas: Triple Azúcar Hierro (TSI) (Anexo No.14),
Lisina Hierro Agar (LIA) (Anexo No.15), Citrato (Anexo No.16),
Sulfuros-Indol-Motilidad (Agar SIM) (Anexo No.17), Urea (Anexo
No.18), Rojo de metilo-Voges Proskawer (Anexo No. 19).
♦ Pasadas las 24 horas de incubación de cada recuperación, se sembró cada especie
bacteriana recuperada de las tres técnicas, por el método de única estría; los
microorganismos gramnegativos en el agar eosina azul de metileno modificado
(EMB) (anexo No.20), y los grampositivos se siembran en Agar Columbia
(anexo No.21), se llevaron a encubar a 37°C por un día.
♦ Seguidamente se observaron las colonias características y la morfología de cada
cultivo se verifico por tinción de Gram (Anexo No.22).
2.10 ANÁLISIS DE RESULTADOS:
Los datos obtenidos se procesaron en el programa estadístico Start view 4.0, para
obtener las diferencias significativas entre los sistemas usados, tiempo de
almacenamiento, concentración de bacterias recuperadas y especie bacteriana;
graficados posteriormente en el programa Microsoft Excel.
3. RESULTADOS
3.1 IDENTIFICACION DE CEPAS: se siguieron los protocolos de identificación de
Koneman (1999); los resultados obtenidos (tabla 3, 4, 5), fueron constantes a lo
largo del estudio, demostrando así la pureza de cada una de las especies en los
diferentes procesos de conservación aplicados.
TABLA 3. Resultados en las pruebas de identificación de bacilos gramnegativos
E. coli Salmonella spp Shigella spp
Colonias
características en
medio EMB
Colonias circulares,
convexas, de borde
continuo o
ligeramente
ondulado, con brillo
verde metálico.
Colonias mucosas
circulares, planas,
convexas de borde
continuo, color
púrpura claro o
semitranslúcidas.
Colonias redondas
brillantes de borde
continuo, mucosas de
color púrpura claro o
semitranslúcidas
Morfología en tinción
de Gram
Bacilo gramnegativo Bacilo gramnegativo Bacilo gramnegativo
TSI A(K)/A K/A K/A
H2S/GAS Negativo/positivo Positivo/positivo Negativo/negativo
LIA K/K K/K K/A
CITRATO Negativo Positivo Negativo
UREA Negativo Negativo Negativo
INDOL Positivo Negativo Negativo
MOTILIDAD Positivo/negativo Positivo Negativo
RM Positivo Positivo Positivo
VP Negativo Negativo Negativo
LACTOSA Positivo Negativo Negativo
TABLA 4. Resultados en las pruebas de identificación de cocos grampositivos
St. aureus St.
saprophyticus
St.
epidermidis
St. mutans E. faecalis E. faecium
Colonias
características
en Agar
Triptona soya
Colonias
elevadas,
redondas con
borde
continuo,
lisas
brillantes con
pigmento
beis.
Colonias
elevadas,
levemente
convexas de
borde
continuo lisas
y opacas.
Colonias
redondas de
borde
continuo,
lisas,
mucoides,
brillantes.
Colonias
redondas de
borde
continuo,
lisas,
mucoides
con
superficie
granulosa.
Colonias
redondas,
lisas,
cremosas y
de color
blanco en su
totalidad.
Colonias
redondas,
lisas,
cremosas
Y de color
blanco.
Morfología
en tinción de
Gram
Coco
gampositivo
Coco
grampositivo
Coco
grampositivo
Coco
grampositivo
Coco
grampositivo
Coco
grampositivo
Coagulasa Positiva Negativa Negativa
Catalasa Positiva Positiva Positiva Negativa Negativa Negativa
Sensibilidad
a la
Novobiocina
Resistente
Sensible
Dnasa Positiva Negativa Negativa
Hemolísis en
Agar Sangre
de Cordero
Gamma
δ
Gamma
δ
Gamma
δ
Alfa/Gamma
α/δ
Gamma
δ
Gamma
δ
Sensibilidad
a la
optoquina
Resistente
Solubilidad
en bilis
Negativa
Bilis
esculina
Positiva Positiva
Crecimiento
en NaCl al
Positivo
Positivo
Positivo
6.5%
TABLA 5. Resultados en las pruebas de identificación de bacilos grampositivos
Listeria
monocytogenes
B. subtillis B. cereus
Colonias
características en
Agar Triptona soya
Colonias pequeñas
redondas, elevadas,
levemente convexas.
Colonias altamente
irregulares, cremosas,
brillantes.
Colonias irregulares,
cremosas opacas.
Morfología en tinción
de Gram
Bacilo corto delgado
grampositivo.
Bacilo grampositivo
esporulado.
Bacilo grampositivo
esporulado.
Catalasa positiva positiva Positiva
Hemolísis en Agar
Sangre de Cordero
Beta
β
Gamma
δ
Gamma
δ
Crecimiento en NaCl
al 6.5%
Negativo Positivo Débilmente positivo
3.2 VIABILIDAD BACTERIANA POSTERIOR A CADA TECNICA DE
MANTENIMIENTO: se evaluó la recuperación de las bacterias en intervalos de
3 días, 1-2-3 y 4 semanas después de aplicados los métodos de preservación por
congelación a –20ºC, en los bacilos gramnegativos E. coli, Salmonella spp,
Shigella spp; los cocos grampositivos St. aureus, St. epidermidis, St
saprophyticus, St. mutans, E. faecium, E. faecalis; y los bacilos grampositivos
listeria monocytogenes, B. cereus y B. subtillis. Los resultados obtenidos en cada
sistema se presentan a continuación:
3.2.1 CONSERVACION EN LECHE DESCREMADA AL 10%(p/v) (fig. 1, 2 y3)
FIGURA 1. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos gramnegativos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CON
CEN
TRA
CIÓ
N D
E B
ACT
ERIA
S R
ECU
PERA
DA
S
(1
x10^
8 U
FC/cc
)
E. coli Salmonella Shigella
FIGURA 2. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos gramposit ivos, a los diferentes
intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).
FIGURA 3. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos grampositivos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en leche descremada al 10% (p/v).
0
0,51
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
St. aureus St. epidermidis St. saprophyticus
St. mutans E. faecium E. faecalis
0
0,51
1,5
2
2,53
3,54
4,5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanasTIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
ION
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
Listeria monocytogenes B. cereus B. subtillis
3.2.2 CONSERVACIÓN EN CALDO TRIPTONA SOYA CON ADICIÓN DE
GLICEROL AL 3% (fig. 4, 5, y 6).
FIGURA 4. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos gramnegativos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a –20ºC en caldo Triptona soya con
adición de glicerol al 3%.
FIGURA 5. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos gram positivos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a-20ºC en caldo triptona soya con adición
de glicerol al 3%.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
E. coli Salmonella Shigella
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CON
CEN
TRA
CIÓ
N D
E BA
CTER
IAS
REC
UPE
RA
DA
S (1
x10̂
8 U
FC/cc
)
St. aureus
St. epidermidis
St. saprophyticus
St. mutans
E. faecium
E. faecalis
FIGURA 6. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos grampositivos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC en caldo triptona soya con adición
de glicerol al 3%.
3.2.3 CONSERVACIÓN POR CONGELACIÓN POSTERIOR A LA
DESECACION CON SILICA GEL SOBRE DISCOS DE GELATINA (fig.
7, 8 y 9)
FIGURA 7. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos gramnegativos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica
gel en discos de gelatina.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
T I E M P O D E P R E S E R V A C I Ó N
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
Lister ia monocytogenes B. cereus B. subtillis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
E. coli Salmonella Shigella
FIGURA 8. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de cocos grampositivos, a los diferentes
intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica gel en
discos de gelatina.
FIGURA 9. Concentración de bacterias recuperadas del grupo de bacilos grampositivos, a los
diferentes intervalos de tiempo en la técnica de congelación a -20ºC posterior a la desecación con silica
gel en discos de gelatina.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CON
CEN
TRA
CIÓ
N D
E BA
CTER
IAS
REC
UPE
RA
DA
S (1
x10̂
8)
St. aureus
St. epidermidis
St. saprophyticus
St. mutans
E. faecium
E. faecalis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
Listeria monocytogenes B. cereus B. subtillis
3.3 EVALUACIÓN DE CADA TECNICA DE MANTENIMIENTO EN LOS
GRUPOS DE BACTERIAS EVALUADOS: se realizo comparación en los
grupos de bacilos gramnegativos, cocos grampositivos y bacilos grampositivos
para cada una de las técnicas utilizadas (fig. 10, 11, 12).
Figura 10. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio mediante congelación a –
20ºC con leche descremada al 10% (p/v).
Figura 11. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio, mediante congelación a
–20ºC en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3%.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanasTIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PER
AD
AS
(1x1
0^8
UFC
/cc)
BACILOS GRAM NEGATIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS COCOS GRAM POSITIVOS
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanas
TIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PE
RA
DA
S (
1x10
^8)
BACILOS GRAM NEGATIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS COCOS GRAM POSITIVOS
Figura 12. Concentración de bacterias recuperadas en los grupos de estudio mediante congelación a
–20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina.
3.4 PERDIDAS DE VIABILIDAD OBTENIDAS EN CADA MÉTODO DE
PRESERVACIÓN: se evaluaron las perdidas de viabilidad en porcentaje (%), a
medida que transcurrían los intervalos de tiempo, para obtener la mortalidad
final a las cuatro semanas, por cepa de estudio, en cada técnica de preservación;
estableciendo una comparación, los datos se muestran en la figura 12.
Figura 13. Porcentajes de mortalidad finales en cada microorganismo, deacuerdo al sistema de
conservación empleado.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3 días 1 semana 2 semanas 3 semanas 4 semanasTIEMPO DE PRESERVACIÓN
CO
NC
EN
TR
AC
IÓN
DE
BA
CT
ER
IAS
RE
CU
PE
RA
DA
S (
1x10
^8 U
FC
/cc)
BACILOS GRAM NEGATIVOS BACILOS GRAM POSITIVOS COCOS GRAM POSITIVOS
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
100
PO
RC
EN
TA
JE D
E M
OR
TA
LID
AD
(%
)
E. coli
Salmon
ella
Shige
llaSt.
aureu
s
St. ep
iderm
idis
St. sa
prop
hytic
usSt.
mutan
sE. f
aeciu
mE. f
aeca
lis
Listeri
a mon
ocyto
gene
s
B. cere
usB. s
ubtil
lis
T I E M P O D E P R E S E R V A C I Ó NL e c h e S i l i c a G l i c e r o l
3.5 ANALISIS ESTADISTICO: los datos obtenidos se analizaron por el test de
esfericidad de Bartlett’s en el programa Start View 4.0 para establecer la
correlación de los diferentes sistemas de mantenimiento aplicados; los valores
significativos obtenidos se muestran en la tabla 6.
LECHE GLICEROL SILICA
DF 14 14 14
DETERMINANTE 0.00 0.01 0.01
Chi Square 67.34 61.08 61.77
VALOR-P <.0001 <.0001 <.0001
4. DISCUSION
La preservación de cultivos bacterianos se realiza con diversos propósitos entre ellos,
la educación, investigación y control de calidad en la industria, por lo cual es
importante evaluar técnicas de preservación a corto y largo plazo para poder
determinar el método más adecuado de acuerdo a la especie bacteriana, los recursos y
necesidades de cada laboratorio. Esta área de estudio ha sido pobremente explorada
en los últimos años, especialmente en países en vía de desarrollo como Colombia; por
lo cual es posible plantear varias hipótesis sobre las causas de pérdida de los cultivos
bacterianos preservados; difiriendo del objetivo inicial de la conservación que es
mantener microorganismos vivos, viables, libres de contaminación y sin variación o
mutación de sus características.
La conservación de microorganismos por congelación a –20ºC, es un sistema que ha
tenido óptimos resultados en bacterias grampositivas y gramnegativas; aunque se
pueden producir algunos daños en las células durante el proceso de remoción del agua
en forma de hielo, por la formación de cristales que afectan la pared bacteriana;
adicionalmente el aumento en la concentración de electrólitos puede resultar tóxico
para la célula y la etapa de subsecuente descongelación aumenta los daños por
cambios bruscos en la temperatura. Para evitar la perdida de viabilidad ocasionada
por la congelación se adiciona a la suspensión bacteriana sustancias crioprotectoras
complementarias que evitan la formación de los cristales, como el glicerol y la leche
descremada al 10%, según Tsvetkov and Brankova (1983).
Uno de los posibles riesgos al llevar a cabo cualquiera de los procesos de
preservación es la contaminación de las cepas bacterianas; lo cual puede terminar en
perdida de la cepa original por selección de colonias contaminantes; en nuestro
estudio la pureza de los microorganismos recuperados por cada técnica, se verifico
mediante los protocolos de identificación de Koneman, los resultados obtenidos
fueron satisfactorios y se muestran en las tablas No. 3, 4 y 5.
La viabilidad obtenida en las distintas especies bacterianas por la técnica de
congelación a –20ºC en leche descremada al 10% se muestra para cada grupo en las
figuras 1, 2 y 3. Del grupo de bacilos gramnegativos, la especie que presentó la mejor
recuperación al término de los intervalos de preservación evaluados en esta técnica
fue la E. coli; mientras que la Salmonella spp mostró la más alta recuperación en los
primeros intervalos de tiempo (3.79x108 UFC/cc, 3 días; 3.58x108 UFC/cc, 1 semana;
3.58x108 UFC/cc, 2 semanas), pero esta decrece casi a la mitad a las cuatro semanas
(1.95x108 UFC/cc). En el grupo de cocos grampositivos se obtuvo la mejor
recuperación por este método en la especie de E. faecalis (4.63x108 UFC/cc, 3 días;
3.76x108 UFC/cc, 1 semana; 3.37x108 UFC/cc, 2 semanas; 3.17x108 UFC/cc, 3
semanas; 3.14x108 UFC/cc, 4 semanas); y la menor recuperación se observo en St.
epidermidis a todos los intervalos evaluados. Por último en el grupo de los bacilos
grampositivos se alcanzó un comportamiento similar en las concentraciones de
bacterias recuperadas para las especies: Listeria monocytoges, B. subtillis y B. cereus.
En la técnica de congelación a -20ºC en caldo triptona con adición de glicerol al 3%,
se valoró igualmente la recuperación de las bacterias en los tres grupos anteriormente
mencionados, y los períodos establecidos; los resultados se exponen en las figuras 4,
5 y 6. Para los bacilos gramnegativos se consiguió la más alta recuperación en
Salmonella spp, contrario a lo observado en la técnica de leche descremada; la
especie de cocos grampositivos con la máxima recuperación fue St. saprophyticus y
la menor St. epidermidis al igual que en la técnica anterior; finalmente en el grupo de
bacilos grampositivos se obtuvo la viabilidad más alta en B subtillis, aunque a la
cuarta semana de mantenimiento las concentraciones de las bacterias recuperadas son
parecidas en las tres especies.
Los valores obtenidos en la recuperación de cada bacteria subsiguiente a la
preservación en congelación a –20ºC posterior a la desecación con silica gel en discos
de gelatina se presentan en las figuras 7, 8 y 9. En el grupo de bacilos gramnegativos,
al período de tres días se alcanzó la mayor concentración de microorganismos
recuperados en la cepa de Salmonella spp; mientras a las cuatro semanas de
mantenimiento fue para E. coli. En los cocos grampositivos se consiguió una
viabilidad óptima para St. aureus en los primeros intervalos de tiempo, sin embargo
en la última recuperación la concentración decreció por debajo de la recuperación de
las otras especies; finalmente en el grupo de bacilos grampositivos B. subtillis tiene la
recuperación más alta hasta las tres semanas; ya que en el último período su
recuperación es inferior a la obtenida en B. cereus.
Al comparar los tres grupos bacterianos en cada una de las técnicas (fig. 10, 11 y 12)
se observa una recuperación mayor en el grupo de cocos grampositivos por los tres
sistemas de conservación, probablemente por la resistencia que les otorga su pared
gruesa compuesta por peptidoglicano (60%), ácidos teicoicos, teicurónicos y
lipopolisacárido, frente a los cristales formados durante el proceso de congelación
que pueden afectar la integridad celular.
Enfrentando los porcentajes de mortalidad obtenidos a las cuatro semanas de
preservación (fig. No 12), entre los datos más relevantes se observa un alto porcentaje
de mortalidad (67%) por la técnica de silica gel en B. subtillis, y pérdidas
significativas en Salmonella spp de 49%, 47% y 49% en las técnicas de congelación a
–20ºC en leche descremada al 10%, posterior a la desecación con silica gel en discos
de gelatina y en caldo triptona soya con adición de glicerol al 3% respectivamente;
por lo cual se proponen evaluar otros métodos de conservación para esta especie.
Se puede establecer una relación entre las variables planteadas en este trabajo dados
los valores p<.0001 obtenidos en el análisis estadístico por el test de esfericidad de
Bartlett’s (tabla No. 6), permitiendo aceptar la hipótesis alterna, es decir, existe un
vínculo entre el tiempo de preservación, técnica usada y concentración de bacterias
recuperadas en cada especie.
Al reunir los diferentes valores obtenidos (fig. No 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10) se
puede establecer que los microorganismos mejor preservados por el método de
congelación a –20ºC en leche descremada al 10% son: Shigella spp, St. aureus y B.
subtillis; en la técnica de congelación a –20ºC en caldo triptona soya con adición de
glicerol al 3% se obtuvieron los menores porcentajes de mortalidad para un buen
número de cepas, comprobándose así el papel crioprotector del glicerol de acuerdo a
otros estudios realizados por Calcott and Macleod (1974), las cepas mejor
preservadas por este sistema fueron: E. coli, St. saprophyticus, E. faecalis, Listeria
monocytogenes y Bacillus cereus; por último en la técnica de congelación a –20ºC
posterior a la desecación con silica gel en discos de gelatina las cepas mayor
preservadas son Salmonella spp, St. epidermidis, St mutans,E. faecium.
El efecto crioprotector del glicerol comprobado en el presente estudio, fue
descubierto por Pollee, Smith y Parkes en 1949; este compuesto químico de bajo peso
molecular, no tóxico, es capaz de penetrar la membrana celular fácilmente y unirse a
cualquiera de los electrólitos que aumentan su concentración durante la congelación,
y a las moléculas de agua que demoran esta misma; atribuyéndosele de esta manera
algunos de los porcentajes más bajos en la mortalidad de varias cepas estudiadas (fig.
No. 12).
Contrario a lo esperado en los bacilos grampositivos esporulados, en donde se
pensaba conseguir un mayor crecimiento o no tener pérdidas de viabilidad en el
proceso debido a la formación de endoesporas que surgen en condiciones ambientales
adversas, como la congelación, los resultados obtenidos pueden ser explicados por la
fase exponencial de crecimiento en la que se encontraban los microorganismos al
momento de ser preservados y el poco tiempo que existe entre esta y la congelación
de la suspención, ya que no se alcanzan a formar las esporas.
5. CONCLUSIONES
§ La pureza de cada bacteria en los diferente métodos de conservación se alcanzo
cumpliendo con uno de los objetivos de la preservación de cepas.
§ La viabilidad bacteriana decrece a medida que transcurre el tiempo de
preservación por lo cual es importante trabajar altas concentraciones iniciales de
las cepas.
§ El daño celular causado por la formación de cristales y el aumento en la
concentración de electrólitos, durante la congelación puede ser evitado mediante
la adición de sustancias criprotectoras como el glicerol y la leche descremada,
pero sus efectos están sujetos a otras variables como las características de los
grupos de microorganismos, la temperatura de almacenamiento y el tiempo de
preservación.
§ Los cocos grampositivos presentan las mayores concentraciones de recuperación
en los tres sistemas evaluados; probablemente por la composición de su pared
bacteriana.
§ No se puede establecer un protocolo universal de conservación para todas las
bacterias, debido a las diferencias entre sus características estructurales y
bioquímicas por lo cual, es necesario evaluar cada especie bacteriana en
diferentes sistemas de preservación.
§ Todos los microorganismos se mantuvieron viables en las tres técnicas de
preservación hasta el final de los intervalos evaluados
BIBLIOGRAFÍA § BBL. Manual of BBl . 1992. Products and laboratory procedures. Editorial
Becton Dickinson.
• BEARD, P., STUBBS, E. AND VIKERY, A. Observations on the resistance
to drying of Staphylococcal strains. Journal of medical microbiology. 1988. 26:251-255.
• BERGER, M. AND URBAN, J. Methods for increasing survivability during
storage of exponentially growing bacteria. Current Microbiology. 1996. 33(5):312-316.
• BIRGIT, J. NOTERMANS, S. AND KRAMER, J. . Resistance of
bacterial strains to dry conditions: use of anhydrous silica gel in a desiccation model system. Journal of applied Bacteriology. 1994 77: 319 –324.
• BROCK, T. AND MADIGAN, M. Microbiología. 6ta Edición. Nucalpan de
Juárez- Mexico. Editorial prentice hall hispanoamericana. 1991. P 38-91.
• CALCOTT, H AND MACLEOD,R. Survival of Escherichia coli from
freze-thaw damage: a theorical and practical study. Canadian journal of microbiology. 1971. 20(5): 671-680.
• CECIL, P. MAYOR, J. AND ARTHUR, P The effect of the initial cell
concentration upon survival of bacteria at –22°C. Journal of bacteriology. 1955. 69: 244-149.
• DELGADO, A. PRIETO, S. AMICH, S Y SALVE, M. Laboratorio de
microbiología. España. Interamericana. Mc Graw Hill. 1994. p 20-22. • DEMAIN, A AND SOLOMON, N. 1986. Manual of industrial
microbiology and biotecnology. Washinton D.C. American Society for microbiology.
• DIVO, A. Microbiología médica. 4ta Edición. Mexico. Interamericana
Mc Graw-Hill. 1990. p109-263.
• ELLIS, J. Manual de procedimientos de control de calidad para los laboratorios de microbilogía. Caracas Venezuela. Editorial-Instituto nacional de higiene. 1975.
• FARLEY, R. THINDIJATI, S. REJEKI, S. KARYADI, A. AND
NURHAYATI, S. Silica gel as transport medium for Corynebacterium diphtheriae under tropical conditions (Indonesia). Journal of clinical microbiology. 1987. 25(5): 964-965.
• GERHARDT, P. AND WILLIS, M 1994. Methods for general and
molecular Bacteriology. Washigton. Noel R. Krieg Editors. Chap 12: 278 – 292.
• GIBSON, L. AND KTHOURY, J. Storage and survival of bacteria by
ultra – freeze. Letters in applied microbiology. 1986 3: 127 – 129. • GRIVELL, A. AND JACKSON, J. Microbial culture preservation whith
silica gel. Journal genetical. Microbiology. 1969 58:423 – 425.
• HARTSELL, S. Maintenance of cultures under parafin oil. Applied
microbiology. 1956. 4: 350-355. • HUNT, G. GOUREVITCH, A. LEIN. J. Preservation of cultures by drying
on porcelain beads. Journal of bacteriology. 1969. 76: 343-344.
• JUVEN, B. A simple method for long- term preservation of stock cultures of
lactic acid bacteria. Journal. of applied Bacteriology. 1979. 47: 379 –381. • JUVEN, B., COX, N., BARLEY, J., THOMSON, J., CHARLES, O.AND
SHUTZE, J Survival of Salmonella in dry food and feed. Journal of food protection. 1984. 47:445-448.
• KIRSOP, B. AND SNELL,S. Manteinance of microorganisms. London.
Editorial academic press . 1984 pp 1-41. • KONEMAN, E., ALLENS,D., DOWELL,R. Diagnóstico microbiologico.
3ra Edición. Editorial médica Panamericana. 1999. P 56-103.
• KREST, S AND MARTH,E. Injury and death of frozen Listeria monocytogenes as affected by glicerol and milk components. Journal Dairy Science. 1991. 74(4): 1201-1208.
• KRIEG, N. Bergei’s Manual of microbiology. 1984 Vol. 1 y 2: 1080 p.
• LASKIN, A. AND LECHEVALIER. Handbook of microbiology.
2nd edition. Editorial CRC-Press, InC. 1977. pp 37- 41. • MANZUR, P. Criobiology: The freezing of biological systems. Science.
1970. 168: 939 – 949.
• MATTAR, S Y MELO,A. Bacteriología clínica: Estudio etiológico de las
enfermedades infecciosas de origen bacteriano. Santa fé de Bogotá-Colombia. Editorial CEJA. 1998. Tomo 1. p 278-322.
• MERCK. Manual de medios de cultivo. Darmstadt, Alemania. Editorial
Merck.1994.
• MILLER, R AND SIMMONS, A. Survival of bacteria after tweenty-one
years in the dried state. Journal bacteriology. 1962. 84: 1111-1113. • MILLS, CH. AND GHERNA, L. Criopreservation studies of
Campylobacter. Criobilogy. 1988. 25: 148-152.
• MOAT, A AND FOSTER, J. Microbial physiology. 2nd edition. United
States of America. Editorial John Wiley and Sons. 1988. Chap 1. pp 1-50. • OWEN, S. AND COSTAS, M.. The effect of cooling rate, freeze – drying
suspending fluid and culture on the preservation of Campilobacter pylori. Journal. of applied .Bacteriolology. 1989. 66:331 – 337.
• OXOID. Manual OXOID. Unipath España S.A. 1995. • PETER, H AND ROBERT, A.. Survival of Escherichia coli from freeze
thaw damage: a theoretical and practical study. Journal. Microbiology. 1973. 20 (5): 671 –680.
• REAWAY, R AND LAPAGE, J. Effect of carbohydrates and related compounds on the long-term preservation of freeze-dried bacteria. Criobiology. 1974. 11: 73-75.
• REUSSER, F. Prevention on circumvention of culture degeneration.
Advances in applied microbiology. 1963. 5: 210-213.
• ROBERT, U. KIM, CH. SCHMINK, S AND AJELLO, G. Silica gel as
transport medium for Corynebacterium diphtheriae under tropical conditions (Indonesia). Journal Clinical Microbiology. 1987. 25 (5): 964 – 965.
• ROGERS, H. Bacterial cell structure. Washington- United States of America.
American Society for Microbiology. 1984. pp. 1-53. • RYSER, E. AND MARTH, E. Listeria, listeriosis and food safeta.
2nd Edition. Editorial Board. 1999. Capitulo 6. p 131-141.
• SANCHES, M. 1998. Manual de procedimientos en bacteriología clínica.
Santa fé de Bogota-Colombia. p.35-87. • SCHUKKEN, Y., GROMMERS, F., SMITH, J., VANDEGEER, D. AND
BRAND, A. Effect of freezing on bacteriologic culturing of matitis milk samples. Journal Dairy Science. 1989. 12(7): 1900-1906.
• SMITH, A. AND GRANT,E. Mutation induction in bacteria by freeze-
drying. Criobiology. 1976. 13: 206-213. • SNEIDER, L. AND CHAMPNESS, W. Molecular genetics of bacteria.
2nd edition. Washington. D.C. ASM Press. 1997.
• TAGE, J. ANDERS, M AND HOFFMAN, S. The survival of anaerobic
bacteria at 4°C and 22°C on swabs in three transport systems. Acta pathology microbiology inmunology sacndinabian. 1983. 91:17-22.
• TANJA, P. CHUNG, K AND AJELLO, G. Evaluation of Silica Gel
Packages for transport of Neisseria meningitidis. Journal Clinical Microbiology. 1998. 36(6) : 1765 –1766.
• TORTORA, G. FUNKE, B. AND CASE, CH. Introducción a la microbiología. Zaragoza-España. Editorial Acribia S.A. 1993.
• TSVETKOW , TS. AND BRANKOVA, R.. Viability of Micrococci and
Lactobacilli upon freezing and freeze-Drying in the presence of different cryoprotectants. Criobiology. 1983. 20 (3): 318 – 323.
• VILLALOBOS, M.. Valoración y comparación de tres métodos para la
preservación y conservación del género Micobacterium. Santa fé de Bogota. Tesis pregrado. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Básicas. Depto de Microbiología. Bacteriología. 1995.
• WELLS, J. AND RUSELL, J. Why do many ruminal bacteria die and lise
so quickly. Journal Dairy Science. 1996. 79(8): 1487-1495.
• WESLEY, A. Microbilogía básica. 7ma Edición. Mexico. Editorial Harla S.A.
1996. p.35-87 • YOU, M. NARITA, I. HONDA, T. MIWATANI, T. AND NISHIBUCHI,
M. Comparison of preservation methods for enterotoxigenic Escherichia coli producing heat- labile enterotoxin. Journal of clinical microbiology. 1991. 29(10): 2326-2328.
ANEXO No1.
MEDIO LECHE EN POLVO DESNATADA 10% p/v
(SKIM MILK POWDER OXOID)
El polvo de leche desnatada se utiliza como aditivo porque me jora las condiciones de
crecimiento de los microorganismos presentes. Este producto se puede utilizar solo o
como constituyente de medios de cultivo complejos (Oxoid, 1995).
Composición:
Humedad 5.0%
Cenizas 8.0%
Nitrógeno total 5.3%
Azucares reductores (lactosa monohidrato) 48.0%
Extracto soluble en éter 0.25%
Ingredientes Por litro
Medio leche desnatada al 10% 100g
Agua destilada 1000ml
Preparación
En un erlemeyer de 1000ml, mezclar el polvo de leche desnatada y el agua destilada.
Calentar hasta punto de ebullición para que se disuelva completamente, servir de a
9ml en tubos tapa rosca (16x150mm). Esterilizar en autoclave durante 5 minutos a
121ºC. Hay que tener cuidado de no sobrecalentar en la esterilización para evitar la
caramelización (Oxoid, 1995), guardar en nevera hasta su uso.
ANEXO No.2
CALDO EUGON (EUGONBROTH BBL)
El propósito general del caldo es el cultivo de especies microbianas exigentes. El
caldo Eugon fue designado por Vera para obtener cultivos de bacterias exigentes
incluyendo muchos microorganismos difíciles de cultivar como: Haemophilus,
Neisseria, Brucella y Lactobacillus. El caldo Eugon contiene peptonas, L-cisteina,
dextrosa y sales, todas estos componentes contribuyen al crecimiento bacteriano
(BBL, 1992).
Composición de la formula clásica por litro de agua destilada:
Caseína pancreática asimilada 15.0g
Papaina digerida 5.0g
Cloruro de sodio 4.0g
L- cisteina 0.3g
Sulfito de sodio 0.2g
Dextrosa 5.5g
Ingredientes Por litro
Polvo Eugonbroth 30g
Agua Destilada 1000ml
Preparación
En un erlemeyer de 1000ml mezclar el polvo Eugonbroth con el agua destilada.
Calentar mezclando frecuentemente por un minuto para disolver completamente el
polvo y después hasta punto de ebullición, servir de a 9ml en tubos tapa rosca de
16x150mm. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos (BBL, 1992), guardar en
nevera hasta su uso.
ANEXO No.3
ESCALA Mc FARLAND (Patrón 0.5)
Estos son patrones de turbidez requeridos para curvas de crecimiento y pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana.
Ingredientes Por 10ml (Patrón 0.5)
Solución de Cloruro de Bario al 1% (BaCl2) 0.05ml
Solución de ácido sulfúrico al 1% (H2SO4) 9.95ml
Procedimiento
Se miden y sirven los volúmenes anteriormente mencionados en tubos tapa rosca de
16x150m, se almacenan a temperatura ambiente hasta su uso; teniendo la precaución
de cerrar bien el tubo para evitar contaminación.
La concentración bacteriana equivalente al tubo patrón 0.5 de Mc farland es de
1.5x106 bacterias por ml (Mattar y Melo, 1998)
ANEXO No.4
CALDO TRIPTONA SOYA-GLICEROL (10% v/v)
El caldo triptona soya es un medio versátil altamente nutritivo que se recomienda
para uso general del laboratorio en el desarrollo de bacterias y hongos. Debido a la
inclusión tanto de la triptona como de la peptona de soya, el medio favorece un
crecimiento exuberante sin la adición de suero, etc. (Oxoid, 1995). La adición de
agente crioprotector glicerol evita la formación de cristales durante el proceso de
congelación que pueden afectar la integridad celular (Kirsop and Snell, 1984)
Ingredientes Por 50ml
Polvo caldo triptona soya (OXOID) 2.9g
Suero fetal bovino (SFB) (BBL) 1ml
Extracto de levadura (MERCK) 100mg
Glicerol 3% (MERCK) 15ml
Agua destilada 50ml
Preparación
Los ingredientes son mezclados en un erlenmeyer de 100ml sin adición del SFB, se
llevan a punto de ebullición y a esterilizar a 121ºC por 15 minutos. Por otra parte el
SFB es inactivado a 56ºC por media hora previamente; cuando la mezcla se encuentre
a 37ºC después de esterilizar se añade el SFB pasándolo por un filtro de 0.5um para
evitar la contaminación del medio. Posteriormente es dispensado de a 9ml en tubos
tapa rosca de 16x150mm y almacenado a 4ºC hasta su uso.
ANEXO No. 5
MEDIO GELATINA NUTRITIVO
La gelatina es una proteína del colágeno utilizada para solidificar medios de cultivo,
que se obtiene por hidrólisis ácida a partir de materias primas de origen animal
(Merck, 1994; Oxoid 1995).
Ingredientes Por 100ml
Polvo gelatina (BBL) 10g
Caldo nutritivo No2 (OXOID) 2.5g
Glucosa (MERCK) 5g
Agua destilada 100ml
Preparación
Se mezclan los sólidos en un recipiente, se disuelven suavemente calentando hasta
punto de ebullición, después se dispensan de a 9ml en tubos tapa rosca 16x150mm y
se esterilizan en autoclave por 15 minutos a 121ºC.
ANEXO No. 6
CATALASA (MERCK)
Fundamento
La catalasa es una enzima que se encuentra en todas las células con metabolismo
aerobico. Contiene hemina como grupo activo. La catalasa transforma el peróxido de
hidrógeno tóxico, formado durante el proceso metabólico en agua y oxígeno. La
presencia o ausencia de actividad de la catalasa es una característica taxonómica de
los microorganismos y se utiliza en este sentido para su diferenciación o
identificación.
Composición:
Solución acuosa al 3% de peróxido de hidrógeno.
Empleo e interpretación:
Utilizando un asa de platino se toma una porción de la colonia a investigar y se
coloca sobre un portaobjetos seco. Sobre la masa de bacterias se deposita una gota de
reactivo de catalasa.
Reacción positiva: Desprendimiento inmediato de gas oxígeno sobre la masa de
bacterias.
Reacción negativa: No hay desprendimiento de gas.
Reacción Microorganismos
Catalasa-negativa Anaerobios, Anaerobios aerotolerantes,
lactobacteriáceas, estreptococos y otros.
Catalasa-positiva Aerobios, Propionibacterias, estafilococos
enterobacteriaceas y otros.
ANEXO No. 7
PRODUCCION DE COAGULASA
Esta prueba es usada universalmente desde hace muchísimos años y es aceptada
como el mejor criterio para la identificación de Staphylococcus patógenos más
comunes como el St. aureus en humanos(Sánchez, 1994)
Procedimiento:
Esta prueba debe realizarse en tubo utilizando plasma humano o de conejo estériles,
se prepara una suspensión de varias colonias de un cultivo que tenga 18 a 24 horas de
incubación, en 0.5ml de caldo nutritivo (OXOID), agregar 1ml de plasma fresco e
encubar a 37 grados centígrados.
Interpretación:
Observar a partir de las cuatro horas siguientes para ver la formación de coágulos.
Generalmente el St. aureus puede coagular el plasma en este periodo de tiempo; en
ocasiones puede demorar de 8 a 16 horas. Si el tiempo de incubación se prolonga de
un día para otro debe tenerse en cuenta que la producción de estafiloquinasa por
algunas cepas de St. aureus puede lisar el coágulo formado dando resultados falsos
negativos (Sánchez,1994).
ANEXO No. 8
RESISTENCIA A LA NOVOBIOCINA
Dentro de las especies clínicamente importantes de Staphylococcus: aureus,
epydermidis y saprophyticus, la prueba de resistencia a la novobiocina a una
concentración mayor de 1.6µg/ml, resulta util para identificar al St. saprophyticus,
pues es el único que presenta resistencia (Brock, 1991).
Procedimiento:
Se utilizan discos de sensibilidad antibiótica de 5µg/ml. Se prepara una suspensión de
la colonia que tenga turbidez 0.5 en la escala de Mac-Farland, esta suspensión se
siembra con un hisopo de algodón sobre una caja de agar Mueller Hinton y se coloca
un disco de novobiocina sobre la superficie de la caja ya sembrada. Se encuba por 18
a 24 horas a 37°C y se lee la zona de inhibición (Sánchez, 1994).
Interpretación:
Si la zona de inhibición tiene un halo de inhibición menor o igual a 16mm se
considera resistencia positiva a la novobiocina (Sánchez, 1994).
ANEXO No. 9
PRUEBA DE LA DNasa (MERCK)
Según el método de Jeffries et al.(1957), este medio se usa en la identificación de
microorganismos sobre todo de Staphylococcus DNasa positivo.
Fundamento:
Las colonias formadoras de DNasa hidrolizan a su alrededor, el ácido (DNA)
contenido en el medio de cultivo. Posteriormente se acidifica el conjunto con HCl 1N
con lo cual precipita el DNA (turbidez), en tanto que las colonias DNasa positiva
presentan a su alrededor los correspondientes halos de aclaración.
Composición (g/litro):
Triptosa 20,0
Cloruro sódico 5.0
Acido desoxirribonicleico 2.0
Agar-agar 15.0
Preparación:
Disolver 42g en un litro se agua destilada, esterilizar en autoclave (15 minutos a
121°C) y verter en placas. Almacenar en refrigeración hasta su uso.
Empleo e interpretación:
Sembrar en superficie, por estría, el agar de ensayo con un cultivo puro de material
sometido a investigación. Sobre la misma placa se siembran varias cepas en forma de
bandas paralelas., posteriormente se encuban de 18 a 24 horas a 37°C en el caso de
los Staphylococcus.
Microorganismos Dnasa-positivos: Halos de aclaración perfectamente delimitados,
constrando con el medio de cultivo.
Microorganismos Dnasa-negativos: Sin formación de halo.
ANEXO No. 10
HEMOLISIS EN AGAR SANGRE DE CORDERO
Fundamento:
El agar sangre es un medio con propiedades nutritivas que permite el crecimiento de
la mayoría de microorganismos; es adecuado para el crecimiento de microorganismos
patógenos muy exigentes y especialmente diseñado para mejorar las reacciones
hemolíticas de estos (Mattar y Melo, 1998).
Composición (g/litro):
Triptona 14
Peptona 4.5
Extracto de levadura 4.5
Cloruro de sodio 5.0
Agar- agar 12.5
Preparación:
Suspender 40g en un litro de agua destilada y llevar a ebullición hasta su completa
disolución. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos, enfriar a 50°C y
agregar asépticamente 7% (v/v) de sangre de cordero estéril. Servir encajas de petri y
almacenar en refrigeración hasta su uso.
Empleo e interpretación:
La colonia a investigar se sembró por el método de aislamiento sobre una caja de agar
sangre de cordero y se lleva a incubar a 37°C por 24 horas.
La hemólisis producida en glóbulos rojos de cordero puede ser:
Alfa: cuando se presenta una destrucción parcial de eritrocitos alrededor de la
colonia, produciendo coloración a verde-marrón del medio de agar sangre
(St.pneumoniae, o St. viridans).
Beta hemólisis: una zona clara decolorada alrededor de la colonia, por destrucción
total de los eritrocitos puede observarse perfectamente (St pyogenes grupo B o St.
agalactiae).
Gamma hemólisis: no hay actividad hemolítica aparente (St. viridans o
Enterococcus).
ANEXO No. 11
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A OPTOQUINA (OXOID)
Bowers y Jeffries demostraron que existe una correlación completa entre la
solubilidad en bilis y la sensibilidad total a la “Optoquina” para la diferenciación de
St. pneumoniae de St. viridans. Los discos de optoquina oxoid están impregnados con
clorhidrato de etilhidrocupreína proporcionando un sistema sustitutivo cómodo y
fiable a la prueba de solubilidad en bilis (Oxoid, 1995).
Empleo e interpretación:
Se sembró en estría masiva un cultivo puro del organismo a probar a través de la
mitad de una placa de agar sangre y se aplica un disco de optoquina, inmediatamente
antes de la incubación. Al mismo tiempo, se aplico un segundo disco de optoquina a
la otra mitad de la placa con un neumococo conocido, para proporcionar un control
positivo; y se llevo a incubación por 24 horas a 37ªC., transcurrido este tiempo se
observo deacuerdo a los siguientes parámetros:
◊ Sensible: zona de inhibición de al menos 5mm a partir del borde del disco
(neumococos).
◊ Resistente: sin halo de inhibición o con una pequeña zona que no se extiende mas
allá de 5mm a partir del borde del disco (St. Viridans).
ANEXO No. 12
PRUEBA DE BILIS ESCULINA EN AGAR (OXOID)
Fundamento:
Esta medio evalúa la capacidad de las bacterias para hidrolizar esculina a esculetina y
formar glucosa en presencia de bilis, este producto final de mezcla con iones hierro
III, dando un color verde oliva a negro (Oxoid, 1995). Se utiliza corrientemente para
diferenciar especies de Enterococcus (reacción positiva), Enterobacteriaceae, Listeria
monocytogenes y organismos anaerobios(Oxoid, 1995).
Composición (g/L)
Extracto de carne 3
Peptona de carne 5
Bilis de buey 5
Esculina 40
Citrato férrico 0.5
Agar 14.5
pH 6.6+- 0.1
Preparación:
Se suspenden 64gr en un litro de agua destilada; se lleva a esterilizar en autoclave a
121ºC por 15 minutos; y es servido en cajas de petri almacenadas en refrigeración a
5ºC hasta su uso.
Empleo e interpretación:
Se siembra la caja por el método de aislamiento, tomando de 1-2 colonias del
microorganismo en estudio y se lleva a incubación a 37ºC durante 24 horas;
Considerando como reacción positiva un cambio de color del medio a verde
oliva/negro; o como reacción negativa si no hay cambios en el color original del
medio (Oxoid, 1995).
ANEXO No. 13
CRECIMIENTO EN NaCl
Fundamento:
La prueba de tolerancia a la sal (NaCl 6.5%) puede diferenciar fácilmente entre los
grupos D enterococo y grupo D no enterococo. El grupo D enterococo (E. faecalis, E.
faecium y E durans) resisten una concentración de 6.5% de NaCl adicionado a un
caldo nutritivo desarrollándose allí, enturbiamiento del caldo de cultivo (Sánchez,
1998).
Preparación:
A 100ml de caldo nutritivo (Oxoid) se añaden 6.5g de NaCl (Merck), se mezcla y es
llevado a punto de ebullición para posteriormente ser dispensado de a 2.5ml en tubos
de ensayo y llevados a esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos; Los cuales
son almacenados a 5ºC hasta su uso.
Empleo e Interpretación:
Se toma una colonia del microorganismo a estudiar en cultivo puro, con un asa
estéril para ser mezclada en el tubo de caldo con NaCl al 6.5%; el conjunto es
llevado a incubación por 24-48 horas considerándose como positivo un
enturbiamiento del caldo (Sánchez,1998).
ANEXO No.14
TRIPLE AZUCAR HIERRO (TSI)(OXOID)
Fundamento:
El medio tiene como objetivo identificar si los microorganismos realizan o no 4
procesos bioquímicos a saber:
o Fermentación de azucares (lactosa, sacarosa, Glucosa) – Cuando se fermenta un
azúcar este da productos de carácter ácido lo cual hace que de acuerdo al
indicador el medio vire a ácido (Amarillo).
o Formación de H2S - Algunos microorganismos transforman el tiosulfato de sodio
en sulfuro de hidrógeno (H2S) el cual reacciona con las sales de hierro que tiene el
medio y forma un precipitado negro insoluble (sulfuro ferroso). Para que un
microorganismo produzca H2S necesariamente necesita un medio ácido, ya que en
este medio se proporcionan los hidrogeniones (H2) que forman el H2S, razón por
la cual esta formación solo se da cuando el medio esta amarillo (ácido por la
fermentación).
o Producción de CO2 (gas) – Algunos microorganismos no solo tienen la capacidad
de fermentar los azucares sino también de decarboxilarlos hasta CO2, fenómeno
que se observa por desplazamiento del medio o formación de burbujas.
o Degradación aeróbica de aminoácidos – En la parte superior o pico del medio hay
microorganismos que en presencia de oxigeno son capaces de desdoblar péptidos
en aminoácidos, los cuales ricos en sus grupos amina (grupo básico) viran el color
del medio a púrpura o rojizo.
Composición (g/l):
Lab-lemco en polvo 3.0
Extracto de levadura 3.0
Peptona 20.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Dextrosa 1.0
Citrato férrico 0.3
Tiosulfato de sodio 0.3
Agar 12.0
Preparación:
Se suspenden 65g en 1 litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por
completo. Se mezcla bien y es distribuido en tubos de ensayo. Se esteriliza en el
autoclave a 121°C durante 15 minutos, para seguidamente solidificar el medio en
posición inclinada para formar un fondo de aproximadamente una longitud de 2.5cm.
Empleo e interpretación:
Con una colonia aislada en un medio selectivo por picadura, se inocula el tubo de TSI
y lisina hierro Agar (LIA) y es llevado a incubación por 24 horas para la posterior
lectura de los siguientes parámetros:
Fermentación de azúcares: Positivo = ácido (color amarillo), Negativo = alcalino o no
cambio (color púrpura para alcalino o naranja para no cambio).
Formación de H2S: Positivo = color negro, negativo = no color.
Producción de CO2: Positivo = gas, Negativo = no gas.
Degradación de aminoácidos: Positivo = púrpura, Negativo = cualquier otro color.
ANEXO No.15
AGAR LISINA HIERRO (LIA) (BBL)
Fundamento:
Este medio es muy útil para la demostración simultanea de lisina decarboxilasa (LD)
y formación de ácido sulfihídrico para la identificación de la familia
Enterobacteriaceae. La lisina al ser decarboxilada por microorganismos LD-positivo,
se transforma en cadaverina, amina que en medio ácido provoca el viraje del
indicador púrpura de bromocresol, en el cual la lectura es K/K. Los microorganismos
LD-negativo fermentadores de glucosa producirán un viraje a amarillo de la totalidad
del medio, la lectura es A/A. Los géneros Proteus, Providencia y Morganella
desaminan la lisina generando ácido α-acetocarbónico, que forma compuestos rojizos
al mezclarse con sales de hierro en presencia de oxígeno; la lectura es R/A.
Composición (g/l):
Gelatina pancreática digerida 5.0
Extracto de levadura 3.0
Dextrosa 1.0
L- lisina 10.0
Citrato amonio férrico 0.5
Tiosulfato sódico 0.04
Púrpura de bromocresol 0.02
Agar 13.5
Preparación:
Se reconstituyen 33g de medio en un litro de agua destilada mezclando; seguidamente
se calienta bajo constante agitación hasta que se disuelva por completo y es
distribuido en tubos de ensayo, para ser esterilizados en autoclave a 121ºC durante 15
minutos y dejar enfriar en posición inclinada.
Empleo e Interpretación:
Este medio se inocula paralelamente al de TSI y es llevado a incubar por 24 horas
a37ºC. La lectura se realiza con estos parámetros: La decarboxilación de la lisina es
detectada en el medio por una reacción alcalina púrpura en el fondo. La deaminación
de la lisina es detectada por el color rojo en el medio en la parte superior. Producción
de sulfuro de hidrógeno es evidenciada por la presencia de un precipitado negro. Una
reacción negativa (púrpura en la superficie y amarilla en el fondo) indica la
fermentación de la lactosa solamente. (BBL, 1992)
ANEXO No. 16
AGAR CITRATO SIMONS (BBL)
Este agar es usado para la diferenciación de bacterias gram negativas sobre la base la
utilización del citrato. Koser en 1923, desarrollo un medio liquido consistente de
sales inorgánicas en las cuales la sal de amonio fue la única fuente de nitrógeno y el
citrato la única fuente de carbono para diferenciar especialmente las cepas de E. coli y
Enterobacter aerogenes como parte de las reacciones IMViC (Indol-Rojo de metilo-
Voges Proskauer-Citrato). Simmons en 1926 modifico la formulación de Koser con la
adición de 1.5%de agar y azul de bromotimol (BBL, 1992).
Fundamento:
Los organismos hábiles para utilizar el amonio dihidrógeno fosfato y el citrato de
sodio como las únicas fuentes de nitrógeno y carbono respectivamente pueden crecer
sobre este medio y producir una reacción alkalina evidenciada por una cambio de
color del indicador azul de bromotimol de verde (neutro) a azul (alkalino) (BBL,
1992)
Composición (g/l):
Amonio dihidrógeno fosfato 1.0
Fosfato dipotásico 1.0
Citrato de sodio 2.0
Cloruro de sodio 5.0
Sulfato de magnesio 0.2
Agar 15.0
Azul de bromotimol 0.08
Preparación:
Se suspenden 24.2g del medio en 1 litro de agua destilada y se mezcla, a continuación
es disuelto totalmente bajo constante agitación por calor, dispensado en tubos de
ensayo esterilizado a 121°C por 15 minutos, que posteriormente se dejan solidificar
inclinados y se almacenan en refrigeración hasta su uso.
Empleo e interpretación:
El agar es inoculado con una colonia de cultivo bacteriano pura de la bacteria a
investigar, y el conjunto llevado a incubación por 24-48 horas a 37ºC.
Si hay solo crecimiento, la prueba debe interpretarse como positiva porque indica que
la bacteria utilizó como única fuente para su subsistencia el carbono contenido en el
citrato sódico. Si el crecimiento esta acompañado por un color azul indicará la
presencia de productos alcalinos, originados por la acción de la bacteria sobre el
fosfato de amonio extrayendo su nitrógeno y convirtiéndolo en un producto
fuertemente básico que es el amoniaco, producto que vira el pH del medio
manifestado por el cambio de color del indicador de pH a este color azul.
Se informa como positivo ya sea por el crecimiento o cambio de color a azul y como
negativo el no crecimiento y permanencia del color verde original.
ANEXO No.17
AGAR SULFURO INDOL MOTILIDAD (SIM) (BBL)
Es un medio para la diferenciación de Enterobacteriaceae sobre la base de producción
de ácido sulfhídrico evidenciable por coloración negra debido a la unión de sales
ferrosas; por la producción de indol a partir de triptófano visualizable al adicionar el
reactivo de Kovacs y por la motilidad de las bacterias gracias a la baja concentración
de agar que se emplea (BBL,1992).
Fundamento:
Los ingredientes del medio SIM permiten la determinación de tres actividades por las
cuales las bacterias entéricas pueden ser diferenciadas. El tiosulfato de sodio y el
sulfato de amonio ferroso son indicadores de la producción de sulfuro de hidrogeno.
El sulfato de amonio ferroso reacciona con el gas H2S par producir sulfuro ferroso,
un precipitado negro. La peptona de caseina es rica en triptofano, la cual es atacada
por ciertos microorganismos resultando la producción de indol; el cual es detectado
por la adición de reactivos químicos después del periodo de incubación . La detección
de motilidad es posible debido al naturaleza semisólida del medio, un crecimiento
irradiado hacia fuera de la línea central de inoculación indica que el organismo es
motil (BBL, 1992).
Composición (g/l):
Digerido pancreático de caseina 20
Digerido péptico de tejido animal 6.1
Sulfato amonio ferroso 0.2
Tiosulfato sódico 0.2
Agar 3.5
Preparación:
Suspender 30g en un litro de agua destilada, llevar a ebullición hasta su completa
disolución y distribuir en tubos. Esterilizar en autoclave a 121ºC por 15 minutos y
dejar enfriar el tubo en posición vertical.
Empleo e interpretación:
Se emplea una pequeña colonia de la cepa pura en estudio, la cual es inoculada por
picadura con aguja a dos tercios de distancia del botom en el centro del tubo, y
posteriormente se llevan a incubar por 18-24 horas a 37ºC. Pasado este tiempo se
puede verificar la motilidad por el crecimiento difuso sobre la línea recta sembrada
por profundidad en el medio; sobre la misma zona se detecta la producción de H2S
por la presencia de color negro y por último la reacción indol positiva se evidencia
por la presencia de color rojo sobre la superficie del agar después de agregar 3 a 4
gotas de reactivo de Kovacs (BBL, 1992).
ANEXO No.18
AGAR UREA (OXOID)
Fundamento:
Es un medio útil para la diferenciación de Entero-bacteriaceae productoras de ureasa.
La urea al ser hidrolizada produce amonio que reacciona en solución formándose
carbonato de amonio, compuesto que vira el indicador rojo de fenol (Oxoid, 1995).
Composición (g/litro):
Peptona 1
Dextrosa 1
Cloruro de sodio 5
Fosfato disódico 1.2
Fosfato de potasio 0.8
Mezcla de sales biliares 1.5
Rojo de fenol 0.012
Agar 15
PH 6.8 +-0.1
Preparación:
Se pesan 50g de agar base urea para ser mezclados con un litro de agua destilada y
llevados a ebullición hasta su completa disolución: esterilizado por 20 minutos en
autoclave a 121ºC. Se enfría hasta 50ºC y se la adiciona 5ml de solución urea estéril
al 40% en condiciones asépticas. Servir en tubos y dejar enfriar en posición inclinada,
almacenar en refrigeración hasta su uso.
Empleo e interpretación:
Se siembra inóculo abundante sobre la superficie del Agar Urea inclinado con un
cultivo puro del microorganismo a ensayar. Una reacción positiva se observa en los
organismos que hidrolizan la urea para formar amoniaco cambiando el medio por el
viraje del indicador a un color rojo púrpura, una reacción negativa se evidencia por el
no cambio del medio (Oxoid, 1995).
ANEXO No. 19
ROJO DE METILO – VOGES PROSKAWER (DIFCO)
fundamento:
Este medio de cultivo sirve primordialmente para la diferenciación bioquímica del
grupo Coli-Enterobacter. El principio de la prueba es determinar el tipo de
fermentación (Acido mixta o Butielenglicolica) que siguen los microorganismos a
partir de la glucosa.
Composición Caldo RM-VP (g/litro)
Peptona de carne 7.0
Glucosa 5.0
Tampón de fosfato 5.0
Preparación:
Se disuelven 18g en un litro de agua destilada, se distribuye de 5ml en cada tubo de
ensayo y se lleva a esterilizar a 121ºC por 15 minutos.
Empleo e interpretación:
Los microorganismos inicialmente se siembran en un medio que contenga una fuente
primaria (glucosa) (Caldo RM-VP de Merck) y son incubados de 24 a 48 horas a
37ºC, posteriormente se dividen en dos tubos: Uno marcado como RM y otro como
VP. Al tubo marcado como RM se le adiciona de 1 a 2 gotas de rojo de metilo y al
marcado como VP se le agrega primero una gota de KOH y luego una de α-naftol-
creatina.
Interpretación (Rojo de metilo): Los microorganismos son capaces de desdoblar la
glucosa hasta ácido pirúvico (glucólisis) y a partir del ácido pirúvico pueden tomar
varias vías: unas originan ácidos fuertes como el ácido acético, ácido butírico, ácido
fórmico, ácido succínico, ácido propiónico, otras originan otros compuestos
orgánicos como alcoholes (Etilico y butírico), productos que en conjunto se llaman
ácidos mixtos (ácidos + alcoholes) y que tienen la particularidad de acidificar el
medio, razón por la cual cuando se agrega el rojo de metilo este vira hacia el lado
ácido dando un color rojizo al medio. Cuando la prueba da positiva se concluye que
el microorganismo tiene fermentación ácido mixta (colores rojos). El color rojo
indica positividad de la prueba y el no cambio de color indica que esta es negativa.
Interpretación Voges Proskawer: Algunos microorganismos no toman la vía
anteriormente descrita sino que el ácido pirúvico lo desdoblan en acetoína y butilén
glicol (colores azules). Al alcalinizar el medio con KOH y O2 atmosférico convierten
la acetoína (acetil metil-carbinol) en diacetilo y este diacetilo queda libre para que al
agregar el α-naftol-creatina esta lo convierte en un producto coloreado rojizo.
Aquellos microorganismos que son capaces de seguir esta vía y reaccionan con estos
reactivos se les ubica dentro de una fermentación Bultilen glicolítica ya que este es el
producto final de esta vía. El colo r rojo indica positividad de la prueba y el no cambio
de color indica que esta es negativa.
ANEXO No. 20
AGAR EOSINA AZUL DE METILENO (MODIFICADO) (EMB)(OXOID)
Fundamento:
Es un medio para el aislamiento y diferenciación de organismos del tipo coliforme
como: E. coli y Enterobacter, según Levine (1818-1820). Los colorantes contenidos
en su fórmula inhiben a muchos gérmenes Gram positivos de acompañamiento.
Gracias a los dos indicadores que contiene el medio, eosina y azul de metileno se
evidencia la fermentación de la lactosa (Oxoid 1995).
Composición (g/l):
Peptona 10.0
Lactosa 10.0
Fosfato dipotásico 2.0
Eosina amarillenta 0.4
Azul de metileno 0.065
Agar 15.0
Preparación
Se disuelven 37.4g/L, y son llevados a ebullición hasta su completa disolución y
esterilizados en autoclave a 121ºC durante 15 minutos posteriormente se vierte en
cajas de petri, y son almacenadas en refrigeración a 4ºC hasta su uso. Las placas con
medio de cultivo son claras y de color rojo pardusco.
Empleo e interpretación
Este medio de cultivo se sembró finamente, por el método de estría única con las
cepas E, coli, Salmonella spp y Shigella spp, se incuba 24 horas a 37ºC para obtener
las siguientes colonias características
♦ E.coli: Colonias de 2 a 3mm de diámetro, con brillo metálico verdoso a la luz
reflejada, con centro oscuro hasta negro en luz transmitida (Oxoid, 1995).
♦ Salmonella-Shigella: Colonias transparentes, de color ámbar (Oxoid, 1995).
ANEXO No. 21
AGAR BASE COLUMBIA (MERCK)
Fundamento:
Este medio completo de gran calidad, es utilizable, tanto para el cultivo de
microorganismos, incluso exigentes, como también como base para la preparación de
diversos medios de cultivos especiales (Ellner et al, 1966).
Composición (g/l):
Sustrato nutritivo especial 23.0
Almidón 1.0
Cloruro sódico 5.0
Agar-agar 13.0
Preparación
Los ingredientes se mezclan en un erlemeyer de 1000ml, se calienta hasta punto de
ebullición, y se esteriliza en autoclave por 15 minutos a 121ºC, luego se vierte en las
cajas de petri y se almacena en refrigeración a 4ºC hasta su uso. Las placas con el
medio base son claras e incoloras (Merck, 1994).
Empleo e interpretación:
Este medio de cultivo se sembró finamente, por el método de estría única con las
cepas de grampositivas y esporulados del trabajo para ser llevados a incubar por 24
horas a 37ºC y después observar sus la morfología de sus colonias características y
pureza.
ANEXO No. 22
TINCION DE GRAM (MERCK)
La coloración de Gram fue desarrollada por Christian Gram en 1823. En el proceso
de tinción los colorantes anilinicos se fijan, bajo la acción posterior al yodo, en la
pared celular de las bacterias, formando un complejo de yodo. Con este
procedimiento de tinción, las bacterias pueden clasificarse en gram-negativas y gram-
positivas. En las bacterias gram positivas el complejo de colorante-yodo no se puede
eliminar de las células utilizando decolorantes como alcohol o acetona. Las células
permanecen teñidas de color azul-violeta. En las bacterias gram-negativas, el
complejo colorante-yodo puede eliminarse y las células se tiñen de color rosa a rojo
con una contratinción con Fucsina o de color anaranjado con Safranina (Merck,
1994).
Reactivos y preparación:
CRISTAL VIOLETA
◊ Solución A: se prepara triturando 2 g de cristal violeta en mortero, agregando
poco a poco 20ml de etanol al 95%, y se lleva a frasco ámbar.
◊ Solución B: disolver 0.8g de oxalato de amonio en 80ml de agua destilada.
◊ Solución de trabajo: en frasco ámbar, diluir la solución A en proporción 1:3 y
adicionar 4 partes de solución B. conservar durante 24 horas antes de su uso y
seguidamente filtrar para su empleo.
LUGOL DE GRAM
Se colocan en un mortero 1g de yodo y 2g de yoduro de potasio y se agregan 300ml
de agua destilada poco a poco y almacenar en frasco ámbar.
DECOLORANTE
Alcohol etílico de 95º.
SAFRANINA
◊ Solución madre: se trituran 2.5g de Safranina en mortero, agregando poco a poco
100ml de etanol de 95º y se llevan a frasco ámbar.
◊ Solución de trabajo: en otro frasco ámbar se agrega 10ml de solución madre
filtrada, con 90ml de agua destilada.
Técnica:
Se toma una lamina porta-objetos limpia en la cual se realiza una emulsión de la
bacteria pura con una pequeña gota de agua, posteriormente la lamina se deja secar y
es fijada al calor en un mechero de gas. Se inicia el proceso de tinción de acuerdo a
los tiempos establecidos en cada laboratorio para este caso son los siguientes:
◊ Se cubre la lamina con cristal violeta por 1 minuto.
◊ Lavar con abundante agua destilada y escurrir.
◊ Aplicar el lugol de gram por 1 minuto.
◊ Lavar con abundante agua destilada y escurrir.
◊ Agregar solución decolorante por 15 segundos.
◊ Lavar con abundante agua destilada y escurrir.
◊ Cubrir con Safranina por 4 segundos.
◊ Lavar con abundante agua destilada y escurrir.
◊ Dejar secar al aire libre y observar al microscopio en lente de 100x con aceite de
inmersión.