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CURSO DE BIOQUMICA APLICADA
GENERALIDADES DE MTODOS ENZIMTICOS
Escuela de Tecnologa Mdica Universidad de Chile Primera Versin 2007
Propiedades de Enzimas en Solucin Acuosa
Conocer las caractersticas de los enzimas como reactivos analticos y la cintica de las reacciones enzimticas. Tener una visin general de los diferentes mtodos enzimticos de anlisis que utilizan enzimas en disolucin. Reconocer los problemas que se pueden resolver mediante mtodos enzimticos e Interpretar los resultados obtenidos en los mismos.
Uso de los ENZIMAS en diagnstico clnico: 1. Unidades enzimticas: Ul (SI). 2. Muestras biolgicas. 3. Importancia clnica. Alteracin de la actividad enzimtica asociada a un proceso patolgico: sangre Dao tisular: Necrosis del tejido. Incremento de la permeabilidad. Induccin enzimtica. sangre: deficiencia del tejido
CPK creatina Quinasa LDH Lactato deshidrogenasa HBDH - -hidroxibutrico deshidrogenasa
Enzima
Sustrato
ENZIMA
Catalizador de origen biolgico y naturaleza proteica, de alto peso molecular y conformacin tridimensional caracterstica.Estructura y conformacin: Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno apolar. La actividad cataltica requiere que dicho centro adopte una conformacin determinada, mantenida por el resto de la molcula proteica.
Reactividad: Interaccin de complementariedad LLAVE- CERRADURA. La actividad cataltica requiere en general la presencia de cofactores para llevar a cabo la conversin del sustrato.
Protena no activa
Iones metlicos y/o molculas
APOENZIMA
+
Cofactores
FMN Complejo catalticamente activo Glucosa oxidasa
Sustancia orgnica, no proteica fuertemente enlazada (GRUPO PROSTTICO) Dbilmente enlazados (no estequiomtricos) Productos Sustrato (COENZIMA) (estequiomtrico)
Fosfato de tiamina descarboxilasas
HOLOENZIMA
NAD+, deshidrogenasa
Sustrato
Caractersticas de las enzimasElevada especificidad Respecto del sustrato convertido Respecto de la reaccin catalizada Elevada eficacia cataltica Actividad a bajas concentraciones de enzima y de sustrato Actividad in vitroReactivos Analticos
O H+ HO C O O C O + O H
H
Anhidrasa Carbnica knon = 0.14 s-1t1/2 = 5 segundos
kcat = 106 s-1t1/2 = 700 nanosegundos
kcat /knon = 7.1 x 106
Reaccin
Catalizador
Temperatura (C)
Energa Activacin (Kcal/mol)
Descomposicin de H2O2
Ninguno Fe2+ Catalasa
20 22 22
18 10 1,7
Clasificacin de las Enzimaswww.biochem.ucl.ac.uk/bsm/enzymes (E.C. w.x.y.z) E.C.1.-.-.- xido-reductasas Reacciones redox E.C.2.-.-.- Transferasas Nombre sistemticoTransferencia de grupos Donor-aceptor funcionales oxidoreductasa Reacciones de hidrlisis Grupo transferasa Adiciones a dobles enlaces 1.1. >CH-OH 1.2. >C=O 1.3. >C=CH2.1. Grupos de un tomo de C 1.4. >CH-NH2 2.2. Grupos carbonilo 1.5. >CH-NH2.3. Grupos acilo 1.6. NADH, NADPH 2.4. Grupos glucosilo 3.1. Esteres 2.6. Grupos con N 3.2. Enlaces glucosidicos 2.7. Grupos con fosfato 3.4. Enlaces peptdicos 2.8. Grupos con S 4.1. >C=C< 3.5. Otros enlaces C-N 4.2. >C=O 3.6. Anhdridos de cidos 4.3. >C=N5.1. Racemasas 5.2. Cis-trans isomerasas 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. C-O C-S C-N C-C
Nombre sistemtico E.C.3.-.-.- Hidrolasas
Donor-aceptor
E.C.4.-.-.- Liasas
E.C.5.-.-.- IsomerasasIsomerizaciones
E.C.6.-.-.- Ligasas
Formacin de enlaces con ruptura de un Pirofosfato en el ATP
Unidades de Concentracin de Enzima: Actividad EnzimticaUnidad internacional (I.U.): Cantidad de enzima que cataliza la formacin de un mol de producto por minuto en las condiciones (pH, T) especificadas. Katal (Kat): Cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de sustrato por segundo en unas condiciones definidas.
1 I.U. = 16,67 nkat; 1 kat = 60 I.U.Actividad especfica de un preparado: Unidades/mg protena Concentracin de enzima en disolucin: mU o U por L o mL Actividad Molecular= Nmero de cambio (turnover) kcat [s-1] Nmero de moles de sustrato transformados por minuto por mol de centro activo bajo condiciones ptimas
Es una medida basada en datos experimentales Todas las condiciones que pueden afectar la actividad Enzimtica deben ser estipuladas 1.0 IU = La cantidad de enzima capaz de convertir 1.0 mol de sustrato en producto en 1 minuto dado que la [sustrato] inicial >> [enzima] bajo condiciones de ensayo definidas 1.0 katal = La cantidad de enzima capaz de convertir S.I 1.0 mol de sustrato en producto en 1 segundo dado que la [sustrato] inicial >> [enzima] bajo condiciones de ensayo definidas
Cada una de estas enzimas incrementa la velocidad de reaccin pero con diferente actividad
enzima D [Producto] enzima A
Enzima Q Espontneo 0 Adicin Tiempo --->
Qu caractersticas de las enzimas debo conocer antes de poner a punto un Mtodo enzimtico de anlisis?
Caractersticas cinticas de las reacciones enzimticas. Km y vmax, su significado. Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimticas y por tanto a la actividad enzimtica.
Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas.
Reacciones Monosustratov
E+S
k1 k2
ES
k3
E+P
[S]
Enzima (invertasa)
Sustrato (sacarosa)
Centro activo fructosa Enzima disponible Los productos se liberan Complejo enzima-sustrato
glucosa
El sustrato se transforma en productos
El sustrato se enlaza al enzima
Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas.Reacciones Monosustratov vmax
vmax 2
Orden 0 Orden 1
E+S
k1 k2
ES
k3
E+P
Ecuacin de Michaelis-Menten [S]KM = k2 + k3 k1v max = k 3 [E ] t
KM
v max [S] v= K M + [S]Orden 1 [S] > KMv = v max
Cintica Enzimtica
Entonces......Km Pequea [sustrato] se necesita para conseguir la mitad de la Vmxima Afinidad de la enzima por el sustrato Gran [sustrato] se necesita para alcanzar la mitad de la Vmxima
Km
Afinidad de la enzima por el sustrato
Cintica Enzimtica Importancia de conocer las Kms Hexoquinasa Presente en todas las clulas Km=30M(>0,1mM) Saturada Glucoquinasa Presente slo en hgado Km=10mMCapaz de metabolizar glucosa prandial
[glucosa] en vena portaheptica del orden de mM
Vmx y Km
Vmax depende de la cantidad de enzima.
Influencia de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimticaprimer orden Proporcional a la concentracin de sustrato orden cero Independiente de la concentracin de sustrato
Velocidad de reaccin
[S]
Caractersticas Cinticas de las Reacciones EnzimticasDeterminacin Experimental de los Parmetros de Michaelis-MentenPara desarrollar un nuevo ensayo enzimtico o adaptar uno ya descrito es importante conocer los valores de Km y vmax de la enzima utilizada.
Representacin de Lineweaver-Burk
1/v
= KM/vmax
1 KM 1 1 = + v v max [S] v max
1 / vmax -1/ KM1/[S]
Caractersticas Cinticas de las Reacciones Enzimticas. Determinacin Experimental de los Parmetros de Michaelis-Menten
Representacin de Hanes
[S]/v
= 1/vmax
[S] 1 KM [S] + = v v max v max
-KM KM / vmax[S]
v
vmax tg = -KMv/[S]
Representacin de Eadie-Hofstee
v v = K M + v max [S]
Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimticasAdems para desarrollar un ensayo enzimtico deben controlarse Todas aquellas variables experimentales que puedan afectar a la velocidad de la reaccin enzimtica.
Concentraciones de: Sustrato Enzima (Actividad enzimtica) Activadores Inhibidores Temperatura pH Fuerza inica, naturaleza de los iones presentes en el medio, etc.
Factores que afectan a la actividad enzimtica Presencia de Activadores (A)Sustancias que producen un aumento de la velocidad de la reaccin enzimtica sin resultar alterados en ella.
1. Interaccin con la enzima E+A EA EA + S EAS EA + P
2. Interaccin con el sustrato S+A SA SA + E ESA E + PA Mg2+ para A + P las PA(fosfato) kinasas
Cationes metlicos, principalmente de elementos de nmero atmico comprendido entre 19 y 30 Aniones inorgnicos, de efecto inespecfico Compuestos orgnicos (cisteina, -mercaptoetanol)Cl-
Verdadero sustrato de la enzima
Factores que afectan a la actividad enzimtica Presencia de InhibidoresSustancias que producen una disminucin de la velocidad de la reaccin enzimtica.
Inhibidores irreversiblesLa inhibicin aumenta con la [I] y puede llegar a ser total Unin enzima-inhibidor covalente La inhibicin no revierte al retirar el inhibidor de la mezcla de reaccin La velocidad de reaccin disminuye linealmente con [I] a bajas [I]
Inhibidores reversiblesLa enzima recobra su actividad cuando se elimina al inhibidor del medio Unin enzima-inhibidor y/o complejo ES-inhibidor no covalente La inhibicin puede ser revertida por dilisis o simple dilucin La inhibicin es altamente especfica
Factores que afectan a la actividad enzimtica: TemperaturaEfecto final Cada enzima posee una temperatura ptimaReaccin no enzimticaT ptima para enzimas humanas
50
v (u.a.)
Ejemplos
Fraccin de enzima activa
25Velocidad de reaccin
T ptima para Tptimaenzimas 1,0 termoflicas
Enzima activa0,5
Reaccin enzimtica10 20 30 Temperatura (C) 40
0
T (C)
0,0
Factores que afectan a la actividad enzimtica: pHpH ptimo para la pepsina pH ptimo para la tripsina
pH y medio inico afectan a la conformacin tridimensional de la protena La actividad de la enzima depende de la extensin de la reaccin de disociacin de ciertos aminocidos en la estructura proteica. Si el sustrato tiene propiedades cido-base es probable que la enzima slo pueda catalizar la transformacin de su forma disociada o de su forma no disociada.
Velocidad de reaccin
Mtodos de equilibrio o de cambio total
Mtodos cinticos
sustrato La reaccin enzimtica transcurre Se mide la velocidad de la hasta alcanzar el equilibrio. reaccin enzimtica Se mide algn cambio fsico Final Mtodos de Punto o qumico producido en el mediofavorable Con equilibrio de reaccin medida de Producto medida de Sustrato Basados en cintica Sustrato medida de Cofactor de orden uno sustrato Mtodos con reacciones Enzima Basados en cintica acopladas Activadores de orden cero Con reaccin indicadora Inhibidores subsiguiente
Mtodos Enzimticos de Equilibrio de PUNTO FINALAnalito: S
S
E
PEspecie medida Producto Cofactor SustratoPeroxidasa
A. Con equilibrio favorable
1. Medida del Producto H2O2 + DH2POD
2 H2O + D( = 440 nm )
2. Medida del Cofactor
NADH, m= 340 nm EspectrofotomtricaOx
SH2 +
NAD+
NADH + H+ + SRed
Fluorimtrica Amperomtrica
S + NADH +
H+
NAD+ + SH2
Mtodos Enzimticos de Equilibrio de Punto Final2. Medida del CofactorO C NH2
H
H
O C NH2
A0,4
+ N O O P OH O OH P O O-
N R
O H OH N NH2 N N
(forma reducida) Nicotinamida adenina dinucletido (NAD+) o su forma fosforilada (NADP+)
NADH
0,2
O
N O H H OH(PO32-)
NAD+ m= 259 nm200 250
NADH m= 340 nm
0,0
300
350
/nm
OH
Aldehdo deshidrogenasa
Acetaldehido +
NAD+
AlDH Nitrato reductasa
cido actico + NADH + H+ NO2- + NAD+ + H2O
NO3- + NADH + H+
Mtodos Enzimticos de Equilibrio de UN SOLO PASO Analito: S
S
E
PEspecie medida Producto Cofactor SustratoPeroxidasa
A. Con equilibrio favorable
1. Medida del Producto H2O2 + DH2POD
2 H2O + D( = 440 nm )
2. Medida del Cofactor 3. Medida del Sustrato
NADH, = 340 nm
El mtodo enzimtico aporta selectividad a la medida
3. Medida del SustratoO HN O H N O N H N H
Ejemplo: Determinacin de cido ricoO H N O O N H N H
+ O2 + H2O
NH2
+ CO2 + H2O2
cido rico ( = 292 nm)
Alantoina Inyeccin de enzima
A29290 M1,0
1,1 50 M0,5
30 M
0,61 0,37
0,0
1
3
5
7
t/min
Si no se pueden medir fcilmente los sustratos o productos de la reaccin enzimtica en la que se transforma el analito debe optarse por un esquema de reacciones acopladas Reaccin auxiliar (Eaux): Reaccin en la que se transforma la sustancia a determinar Reaccin indicadora (Eind): Reaccin utilizada para realizar la medida = Analito, compuesto a determinar = Especies medibles A. Mtodos con reaccin indicadora subsiguienteEaux. Eind.
S1 + S2 P1 + S3
P1 + P2 P3 + P4
A. Sistema de reacciones acopladas con reaccin indicadora subsiguiente Determinacin de glucosa, sistema HK-G6PDHHK (Hexoquinasa); G6PDH (Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa)
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + NADP+
HK
Reaccin Auxiliar
Glucosa-6-P + ADP
G-6PDH
6-fosfogluconato + NADPH + H+ A34020,5
Reaccin indicadora1. Incubacin de la mezcla de ensayo con G-6PDH en ausencia de HK 2. Adicin de HK y reduccin de NADP+ 3. A [Glucosa]
HK10,0 2 4 6 8
A
10
t/min
Reaccin auxiliar: Reaccin en la que se transforma la sustancia a determinar Reaccin indicadora: Reaccin utilizada para realizar la medida
Mtodos Enzimticos Cinticos A. Basados en reacciones de orden ceroDeterminacin de enzimas, activadores e inhibidores
Condiciones: Concentraciones saturantes de de sustrato y coenzimas (v = vmax)
v = k 3 [E ]
Mtodos Enzimticos Cinticos B. Basados en reacciones de orden unoDeterminacin de sustratos
v v = max [S] K M A
Ley lmite de orden 1 de la ecuacin de Michaelis-Menten [S] < 0,05 KMPendiente inicial
Comienzo de la reaccin t t1 t2
A = A2 - A1
tiempo
Aplicaciones AnalticasA. Anlisis Clnico Determinacin de metabolitos Glucosa, colesterol, triglicridos, cido rico.... B. Industria Alimentaria Determinacin de actividades enzimticas GOT, para distinguir carne fresca de congelada C. Otros campos marcadores hepticos: Transaminasas, fosfatasa Determinacin de etanol, lactato, glicerol Control de calidad en la industria farmacutica alcalina. Marcadores cardiacos: LDH, HBDH... carbohidratos en alimentos y de cosmticos Qumica Agrcola Botnica Microbiologa