Citotoxicidad Celular y
Fagocitosis
Dra. Sabrina Andara. Profesora invitada
Cátedra de Inmunología
Escuela de Medicina José María Vargas
Facultad de Medicina
Universidad Central de Venezuela
2016
1.- Describir los mecanismos de citotoxicidad mediada por células,
precisando mediadores solubles, de membrana y celulares
implicados
2.- Describir las características morfológicas y funcionales de los
fagocitos
3.- Describir el proceso de fagocitosis y destrucción intracelular
de patógenos
4.- Explicar el fundamento de las diversas pruebas de la función
fagocítica
5.- Enumerar los trastornos de la función fagocítica en humanos
Objetivos específicos
CITOTOXICIDAD CELULAR
Mecanismo efector esencial de la respuesta inmunitaria
Rama celular
Defensa contra: Patógenos intracelulares (Virus, algunas bacterias y parásitos)
Células tumorales
Células propias alteradas sometidas a estrés térmico o traumático.
Importante en el rechazo de tejidos alógenicos(Trasplantes)
Citotoxicidad Celular
Células Citotóxicas
Linfocitos T citotóxicos
Específicos de antígeno
CTL
Células Asesinas Naturales
Inespecíficas de antígeno
Linfocitos NK
Linfocitos NKT
Cada tipo de linfocito T efector expresa un conjunto particularde moléculas efectoras
IFN-TNF-β
IFN-IL-2 IL-4, IL-5
GRÁNULOSTÓXICOS:
FAS-L CD40L CD40L
CITOCINAS:
MOLÉCULASDE MEMBRANA:
Perforinasy Granzymas
FAS
CD40CD40
• CD45 RO
Mayor
sensibilidad a la
activación por
PP/MHC –TCR
• No requieren
coestimulación
• Alta expresión
moléculas de
adhesión
Células T Citotóxicas CTL
Marcadores: CD3 y CD8
Maduran en timo
Pre-CTL: Ly T CD8 que todavía no tienen actividad citotóxica
Generación de CTL efectores:
1.- Señal específica de Ag transmitida por el complejo
TCR (reconocimiento péptido-MHC clase I)
2.- Señal co-estimuladora (CD28-B7)
3.- Interacción IL-2 con receptor IL-2:
Proliferación y diferenciación de CTL-P
activado por Ag hacia CTL efector
Después de
5 días del
encuentro
con el Ag
Proliferación de CTL memoria no requiere de TH1
Mecanismos de Citotoxicidad
1. Interacciones Celulares
Directas
2. Interacciones Celulares
Indirectas: Citoquinas,
Fas-Fas L soluble
1. Reconocimiento TCR-
PP/MHC 1
2. Adherencia firme. Mayor
afinidad LFA-1 por ICAM-
1(5-10min) luego disminuye
afinidad y se disocian.
1. Formación de conjugado CTL-Célula Blanco. (aumento de Ca 2+ intracelular)
2. Orientación de gránulos (Aparato de Golgi) hacia membrana y fusión con esta
(exocitosis)
3. Liberación perforina monomérica
4. Cambio de conformación monomeros de perforina (inducido por Ca2+) Se
insertan en membrana célula blanco
5. Se polimerizan dentro de la membrana
6. Formación de poros Entrada de granzimas
Proteína de los gránulos
de las células T citotóxicas
Acción sobre la célula
diana
Perforina Se polimeriza para formar un
poro en la membrana
Granzimas Serin-proteasas
Activan la apoptosis (Vía
apoptósica) al llegar al
citoplasma de la célula diana.
Fragmentación del DNA.
Granulisina Media la despolarización de la
membrana mitocondrial en
células diana y liberación de
citocromo C, promoviendo
apoptosis
5 Granzimas en humanosGranzimas A, B y C
Fas - Fas L
Muerte celular mediada por
Receptores
Citotoxicidad indirecta mediada por
Citoquinas
Muerte celular mediada por
Receptores
Entrecruzamiento de CD95 o TNFR1
Trimerización del receptor
Unión de proteínas adaptadoras a dominios de
muerte
Reclutamiento y activación de caspasas
Apoptosis.
Apoptosis
Proceso de autodestrucción activo
Requiere expresión de genes y síntesis proteica activa
Culmina en desnaturalización del genoma por endonucleasas
Formación de cuerpos apoptóticos
Encogimiento celular
Degradación de la cromatina
Los eventos son ordenados
No hay inflamación
Necrosis
Daño tisular masivo por noxas
como: Trauma, calor, hipoxia,
tóxicos, etc.
Asociada a lesiones de
membrana (lisis osmótica).
Se pierde organización celular.
Conduce a inflamación del
tejido circundante
No ocurre bajo condiciones
fisiológicas
Tipos de Muerte Celular
NECROSIS APOPTOSIS
Fragmentación del núcleo
Integridad de lamembrana
Cuerpos apoptóticos
Fagocitosis sinINFLAMACION
Diseminación del contenido intracelular
Fagocitosis conINFLAMACION
Son linfocitos grandes granulares
No tienen TCR, no expresan Ig de membrana
Se activan por IFN- y TNF
Su mecanismo de destrucción no es específico,pero no es al azar (células infectadas y algunaslíneas tumorales pero no células normales)
No tienen restricción por MHC
Defensa contra virus y tumores
Citotóxicas de manera constitutiva. Siempretienen gránulos en su citoplasma.
No genera memoria inmunitaria
Celulas NK
Natural Killer o Citotóxicas Naturales
Activación Ly NK
Balance entre señales activadoras e inhibidoras de receptores en células NK
Las células modificadas pueden expresar bajos niveles de MHC I.
Los virus pueden inhibir la síntesis de proteínas entre ellas la mayor producción de MHC I inducida por IFN.
Proteína virales pueden bloquear el ensamblaje y transporte de las moléculas clase I.
Los virus pueden alterar la glicosilación de proteínas celulares del hospedador.
La unión de Receptores Activadores (como NKR-P1) junto con una baja expresión o unión a Receptores KIR activa a las células NK para que maten a las células blanco por Apoptosis.
Las señales inhibitorias tienden a superar a las activadoras
Activación Ly NK
Receptores:
1. Activadores
- Tipo Lectina:
CD94/NKG2D o C
(dominios ITAM)
ligando MIC A y B
- Tipo
Inmunoglobulina:
NKp30,44,46
- CD16 (R de Ac)
2. Inhibidores
- Tipo Lectina:
CD94/NKG2A
(dominios ITIM)
ligando HLA-E
- Tipo
Inmunoglobulina:
KIR. Ligando
móleculas HLA B o
C
ADCC. Citotoxicidad Celular
Dependiente de Anticuerpos
Actividad efectora anti-viral de linfocitos NK y linfocitos T citotóxicos
IL-12
Poseen TCR (invariante)
Ligando Glicolipidos por CD1d
No forman células memoria
Marcadores de células NK
Secretan Il-4 INF- Il-2
Ly NKT
FAGOCITOSIS
Fagocitosis
Fagocitosis se define como el acto de engullir,
con el propósito de destruir, un objeto, tal
como un microorganismoLiu H, Pope RM. Phagocytes: mechanisms of inflammation and tissue destruction. Rheum Dis Clin N Am 30 (2004) 19-39
Células Fagocíticas
Neutrófilos Macrófagos
Localización Sangre
periférica
Tejidos
Vida Media Horas Prolongada
Blanco Bacterias
Piógenas
Bacterias,Virus
y Protozoarios
intracelulares
Otras funciones:
Presentación Antigénica
y Citotoxicidad.
Gránulos Específicos
Gránulos Azurófilos
Gránulos Azurófilos0,5 μM1.500/ célula
LisozimaMieloperoxidasaElastasaCatepsina GH+ Hidrolasas
DefensinasBPI
Gránulos Específicos0,2 μM3.000/ célula
LisozimaCitocromo b558
OH- fosfatasa
Lactoferrina
Proteína Fijadora de Vitamina B12
- Depósitos de Glucógeno Les permite actuar
de forma eficiente en Anaerobiosis.
- Estallido respiratorio mayor que MO
generan mayor cantidad de reactivos de O2 y
Nitrógeno.
Monocitos y Macrofagos
- Tamaño 5-10 veces
- Complejidad estructural y
organelas
- Capacidad fagocítica
- Enzimas líticas
Macrófagos
ACTIVADOS:
Aumento de su
eficacia por mayor:
- Capacidad
fagocítica
- Potencial para
destruir patógenos
- Secreción
mediadores
inflamatorios
- Actividad
citotóxica
- Expresión MHC II
Fases de la Fagocitosis
1.Movilidad
2.Reconocimiento y
Adhesión
3. Ingestión
4.Desgranulación
5.Muerte intracelular
Fases de la Fagocitosis
Moléculas de Adhesión
Quimiocinas
Complemento
Sistema de la Coagulación
Interacción PAMP-PRR
Opsonización
Complemento
IgG
Patrones Moleculares Asociados a Patógenos
PAMPs
Receptores de ReconocimientoDe Patrones
PRR
También receptores para
moléculas opsonizantes:
- Inmunoglobulinas
- Complemento
Moléculas de Reconocimiento
Infecciones Extracelulares
Lipopolisacárido Bacterias Gamnegativas
Ácido lipoteicoico Bacterias Grampositivas
Mananos Pared celular de levaduras
Glicolípidos Micobacterias
Infecciones Intracelulares
Secuencias no metiladas CpG DNA Bacteriano
RNA bicatenario Virus RNA
PAMPs
Fagocitosis en ausencia de señal de
Peligro
Fagocitosis de células
apoptóticas
Señales de “cómeme”
No desencadena eventos
inflamatorios
Molécula Candidata: C1q
Fases de la Fagocitosis
Activación del Citoesqueleto
Emisión de Pseudópodos
Englobamiento
Formación del Fagosoma
Fases de la Fagocitosis
En minutos
Formación del fagolisosoma
Clase de Mecanismo Productos específicos
AcidificaciónpH = ~ 3.5-4.0, bacteriostático o
bactericida
Productos tóxicos derivados de
Oxígeno
Superóxido, Peróxido de Hidrógeno, radical
hidroxilo, hipoclorito
Productos tóxicos derivados de
NitrógenoNO
Péptidos Antimicrobianos Defensinas y proteínas catiónicas
Enzimas
Lisozima (disuelve la pared celular de
ciertas bacterias grampositivas)
Hidrolasas ácidas (digestión de la bacteria)
CompetidoresLactoferrina (une Fe) y proteína fijadora de
vitamina B12
Fases de la Fagocitosis
Destrucción mediante intermediarios
reactivos de Oxígeno
Citosol
Gránulo
Proceso fagocítico
Desencadenante
Membrana
Flavo-citocromo
b558
12
3
4
Proceso oxidativo
1. Anión
superóxido (para
pasar a 2 enzima:
superoxido
dismutasa)
2. Peróxido de
Hidrogeno
3. Radicales
hidroxilo
4. Hipoclorito (Por
enzima
Mieloperoxidasa)
Destrucción mediante intermediarios
reactivos de Nitrógeno
NO Sintetasa
L-NMMA
L-ARGININA CITRULINA
1
23
1. Óxido Nítrico
2. Superóxido
3. Dióxido de Nitrógeno
Destrucción mediante mecanismos
independientes de Oxígeno
Catepsina G
Defensinas de bajo PM
Proteínas catiónicas de alto PM
Proteína incrementadora de la
permeabilidad bacteriana (BPI)
Daño a las Membranas microbianas
LisozimaEscinde los mucopéptidos de la pared
celular bacteriana
Lactoferrina Forma complejos con el hierro
Enzimas proteolíticas
Otras enzimas hidrolíticas diversas
Digestión de microorganismos
digeridos
Factores secretados por Macrófagos
Activados
Interleukina 1 (IL-1)Promueve respuestas inflamatorias y fiebre
Interleukina 6 (IL-6)
Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α)
Promueven la inmunidad Innata y la eliminación de Patógenos
Proteínas del ComplementoPromueven la respuesta Inflamatoria y la eliminación de patógenos
Enzimas hidrolíticas Promueven la respuesta Inflamatoria
Interferón α (IFN-α)Activa genes celulares, dando lugar a la producción de proteínas que confieren un estado antiviral a la célula
Factor de Necrosis Tumoral α (TNF-α) Destruye algunas células tumorales
GM-CSF
G-CSF
M-CSF
Promueve la hematopoyesis inducible
Métodos de Estudio de la Fagocitosis
Conteo de PMN – Conteo de monocitos y
Macrófagos
Pruebas de Movilidad de PMN
Prueba de Movilidad al azar: Método del tubo
capilar
Prueba de la membrana para quimiotaxia
Pruebas de reconocimiento y adherencia
CD18 (Subunidad β de LFA-1, Mac-1 y CR4)
Receptores para CC e IG – FcR y CR
Cámara de Boyden
Two chambers are separated by a filter through which cells migrate. Chemotactic gradients can be set up by placing different concentrations of theputative chemo-attractant in the upper and lower chambers. The advantage of the Boyden chamber is that is can discriminate between chemo-kinetic and chemotactic influences. The use of this chamber requires that the cells undertest have to move in three dimensions (most do) and to squeeze between thepore size of the particular filter. Filters are available in different average poresizes, so this latter point is seldom a problem. The Boyden chamber isreproducible and the chemokinetic, chemotactic response easy to quantify.
Prueba para quimiotaxia de PMN
PMN
Sust. Quimiotáctica
Sust. No
Quimiotáctica
Prueba para quimiotaxia de PMN
Métodos para el Estudio de la
Fagocitosis
Pruebas de Ingestión
Cuenta Directa al Microscopio de Luz
Estimación de la radioactividad emitida por
fagocitos que han ingerido partículas marcadas
Medición de la tinción de lípidos
Análisis mediante citometría de flujo
Métodos para el Estudio de la
Fagocitosis
Pruebas de Desgranulación
Fagocitosis Frustrada
Pruebas de Muerte Intracelular
Prueba de Reducción del Azul de Tetrazolio
Nitrado
Quimioluminiscencia
Citometría de Flujo (Estallido Oxidativo)
Análisis Microbicida de Neutrófilos
Fagocitosis Frustrada
IgG agregada
PMN
Enzimas Lisosómicas
Prueba Cuantitativa del NBTazul de tetrazolio nitrado
LátexNBT
Formazán Piridina
Quimioluminiscencia
O2H2 O2
O2-
O2
O2
O2
H2 O2
H2 O2
H2 O2
O2-
O2-
O2-
Quimioluminiscencia
O2H2 O2
O2-
O2
O2
O2
H2 O2
H2 O2
H2 O2
O2-
O2-
O2-
Quimioluminiscencia
O2H2 O2
O2-
O2
O2
O2
H2 O2
H2 O2
H2 O2
O2-
O2-
O2-
Quimioluminiscencia
O2
H2 O2
O2-
O2O2
O2
H2 O2H2 O2
H2 O2
O2-
O2-
O2-
COO-
Inestable
Quimioluminiscencia
O2
H2 O2
O2-
O2O2
O2
H2 O2H2 O2
H2 O2
O2-
O2-
O2-
COOH
Edo. Basal
Citometría de Flujo
Análisis Microbicida de Neutrófilos
Alteraciones de la Función Fagocitaria
Neutropenia congénita o adquirida
Síndrome de Job
Deficiencia de Mieloperoxidasa
Deficiencia de Glucosa-6-P Deshidrogenasa
Leucemia aguda
Disfunción Transitoria del Neutrófilo Infecciones agudas
Ataxia-Telangiectasia
Crioglobulinemia
Enfermedad Granulomatosa Crónica
Síndrome de Chédiak-Higashi
Déficit de Adhesión leucocitaria
Prematuridad
Síndrome de Down
Susceptibilidad a infección por micobacterias
Modelo de Enfermedades autoinmunes
Bibliografía
Roitt: Inmunología Fundamentos
Kuby: 5ta. Edición
Stites (Sección de métodos de estudio)
Muchas Gracias!