CINÉTICA ENZIMÁTICA
E + S SE E + P
• Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.• Unidades del Metabolismo• Regulan la vel. de las reac. quím. espontáneas (G-).• No promueven reacciones no-espontáneas (G +).• Incrementan la Vel. De reacción 103 a 1012 veces sin
afectar el sentido de la reacción.• No forman parte del producto de la reacción.
PROPIEDADES GENERALES• AUMENTAN LA VELOCIDAD DE REACCIÓN
– De 106 to 1012 veces vs sin enzima.– Aún más rápido que los catalizadores químicos.
• CONDICIONES DE REACCIÓN– Temperatura 25-40 oC (algunas hasta 75 oC)– pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5– Presión atmosférica normal
• CAPACIDAD DE REGULACIÓN– Por concentración de sustrato– Por concentración de enzima– Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)– Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la enzima)– Por regulación alostérica
• ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN– Interacción estereoespecífica con el sustrato– No hay productos colaterales
ALTA ESPECIFICIDAD DE REACCIÓN
INTERACCIÓNESTEREO
ESPECÍFICA CON SU
SUSTRATO
Los Substratosse acercan a la Enzima
(sitio Activo)
Enzima
Substratos
HO-
H-
Los reactivos
interaccionan
con la enzima
(sitio activo)
Cambia la
configuración de la
enzima
La unión del sustrato produce un cambio conformacional
de la enzima hexoquinasa (cinasa), la cual es monomérica.
Substrato de glucosa
Sitio de enlace
Se realiza la reacción catalítica
Leonor Michelis y Maud Menten (1913)
Tiempo
Co
nc
ent.
ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTENECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN
Vo = V max [S]
Km + [S]
Cinética enzimática en función de la concentración de sustrato
Vmax
KM
Catalasa H2O2 25.0
Hexoquinasa ATP 0.4
D-Glucosa 0.05
D-Fructosa 1.5
Anhidrasa carbónicoa HCO3- 9.0
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina 108.0
N-Benzoiltirosinamida 2.5
-Galactosidasa D-Lactosa 4.0
Treonina deshidrogenasa L-Treonina 5.0
Km de algunas enzimas
ENZIMA SUSTRATO Km (mM)
La KM es un parámetro de Actividad Enzimática
• La KM es inversamente proporcional con la actividad de la enzima.
• Valor de KM grande, baja actividad
• Valor de KM pequeño, alta activida
ATP + Glucosa ADP + 6-fosfato de glucosa
2 Rutas
Enzimas: pueden catalizar reacciones donde hay 2 S =
HexocinasaHexocinasa
•Desplazamiento Simple, los 2 S se unen a la E
A + B + E EAB C + D
•Doble desplazamiento o ping-pong
A + B + E AE BE + C D
Determinación Cuantitativa de la Cinética Enzimática
1. La reacción global
2. Procedimeinto analítico para determinar elS que desaparece o el P que aparece
3. Sí el E requiere Cofactores (iónes o coenzimas)
4. La dependencia de la actividad enzimática con la [S] o se la KM del S.
5. El pH óptimo
6. Un intervalo de temperatura en la que la E es estable y muestra actividad elevada.
Actividad enzimática y variación del pH
1 3 7 11 14 pH
VoPepsina 1.5
Tripsina 7.7
Catalasa 7.6
Arginasa 9.7
Fumarasa 7.8
Ribonucleasa 7.8
Enzima pH óptimo
4 37 85 Temperatura oC)
Vo
10 50 100 Coenzima
Vo
10 30 50 70 100 Tiempo (min)
Vo
1.0 Unidad de Actividad Enzimática (U):
La cantidad que transforma 1.0 mol (10-6 M) de S /min, a 25 0C, en las condiciones de medida óptima.
Actividad específica:
Es el no. de U de una E / mg de proteína.Es decir: una medida de la pureza de la E.Al purificarla, el valor llega a un máximo y es estable.
Número de recambio
No. de moléculas de S transformadas /unidad de tiempo, por una molécula de E ( o por un solo sitio catalítico)
Enzima No. de Recambio
Anhidrasa carbónica 36 000 000B-Amilasa 1 000 000B-Galactosidasa 12 000Fosfoglucomutasa 1 240
¿Vmax?
¿KM?
pendiente
Transformación de los Dobles Recíprocos
(Lineweaver-Burk)
Gráfica de Eadie-Hofstee
Vo[S]
V max KM
Vo
Vmax
Cuando:
Vo= Vmax Todos los sitios activos están ocupados y no hay moléculas de E libre.
KM= [S] Sí... ½ Vmax
KM representa la cantidad de sustrato necesaria para fijarse a la mitad de la E disponible y producir la mitad de la Vmax
KM representa la concentración del sustrato en una célula
Inhibidores
Reactivos químicos específicos que pueden inhibir a la mayor parte de las enzimas.
INHIBIDORESINHIBIDORES
Irreversibles
Reversibles
Inhibidor Irreversible
• Inhibición permanente
• Unión irreversible por medio de enlaces covalentes.
• Modificaciones químicas de los gps. catalíticos.
• Modificada la enzima, está siempre inhibida.
Para distinguirlo de los reversible se someten a diálisis y si no se separan enzima e inhibidor, éste es permanente.
Inhibidor IrreversibleFluorofosfato de diisopropilo
(DFP)
Acetilcolinesterasa
Acetilcolina
Acetato + Colina
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Inhibidor Irreversible
Malatión
Acetilcolinesterasa
Tripsina
Elastasa
Fosfoglucomutasa
Cocoonasa (larvas de gusanos de seda
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP)
Fluorofosfato de diisopropilo (DFP) Serina
Iodoacetamida Cisteína
Histidina
• La unión del inhibidor y la enzima es reversible.
• Al quitar el inhibidor del medio, se recupera la actividad.
Hay 3 tipos:
Competitiva
No Competitiva
Acompetitiva (Alostérica)
Inhibidor Reversible
Antibióticos
Insecticidas
Hervicidas
Venenos
Diferentes Medicamentos
Dolor
Inflamación
Infecciones virales
Cáncer
Inhibición enzimática
Inhibición Competitiva
Vmax igualKM diferente
Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cáncer
Malonato Deshidrogenasa del ácido succínico
Sulfas Infecciones microbianas
Antihipertensores: Captopril y Enalopril
Alopurinol Controla la gota
Fluoruracilo Cáncer
Inhibidores Competitivos
El inhibidor NO se une al sitio activo
Inhibición No Competitiva
NO se puede revertir con un exceso de sustrato
Vmax diferente KM igual
Cinéticas de InhibiciónCompetitivoVmax igualKM diferente
No competitivoVmax diferenteKM igual No inhibitor
1V
1/[S]0
Inhibición acompetitiva
I
El inhibidor se une a una SUBUNIDAD reguladora
La subunidad catalítica une al sustrato y cataliza la reacción