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1
CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E11
RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN DE MACROMOLÉCULAS
Docente a cargo: Mariano GRASSELLI
CEBI_E11_4 : Filtración
FILTRACIÓN
La filtración se puede definir como una
operación unitaria capaz de separar un sólido
de un fluido (líquido o gaseoso) por acción de
un medio filtrante y una diferencia de presión.
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2
Métodos TRADICIONALES
Métodos MODERNOS
Métodos TRADICIONALES
Por motivos de estudio podemos clasificarla de diferentes maneras:
• Según la fuerza impulsora• Gravedad
• Vacío
• Fuerza centrífuga
• Según el mecanismo• Formación de una torta
• De profundidad
• Según el producto• Retentato (torta)
• Filtrado (clarificado)
• Según el modo de operación• En batch
• En continuo
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3
Equipos de filtración convencionales
Intermitentes a presión (trabajan en batch)
– Filtro Prensa
– Filtro de Cámara
Rotativos al Vacío (trabajan en continuo)
Filtro Prensa
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4
Filtro de cámara
Filtro Rotatorio al vacío
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5
Métodos MODERNOS
En los filtros modernos (de membrana)
la retención ocurre solamente en la
superficie del filtro.
Escala comparativa de tamaños
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6
Filtración tangencial(la clave del éxito)
Permeato
Retentato
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7
Parámetros importantes
• Alimentación o Feed– Producto inicial que entra en el modulo de Ultrafiltración
• Retentato– Fracción de producto que no pasa la membrana (rechazada
por la membrana)
• Permeato– Fracción de producto que atraviesa la membrana
Filtración tangencial(la clave del éxito)
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8
Esquema de un equipo de UF
bomba
Tanque
reservorio
cabezal
Manómetro
Módulo UF
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9
bomba
Tanque
reservorio
cabezal
Manómetro
Módulo UF
Técnicas de filtración
– Microfiltración
– Ultrafiltración
– Nanofiltración
– Osmosis inversa
– Electrodiálisis
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10
Microfiltración (MF)
• Rango de tamaños de partículas
– 0,1 µm a 10 µm.
• No retiene macromoléculas o sustancias disueltas.
• AplicacionesEsterilizaciones de líquidos y gases
Recuperación de biomasa
Recuperación de cuerpos de inclusión
Ultrafiltración (UF)
• Discriminan macromoléculas disueltas en solución
• Existen diferentes membranas que tienen un rango de
poros en el orden de 5 kDa a 300 kDa.
• AplicacionesConcentración,
Diafiltración y
Fraccionamiento de proteínas.
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11
Nanofiltración
• En este nivel de filtración las membranas son capaces de retener iones divalentes y pequeñas moléculas orgánicas (ej.Sacáridos).
• Se utiliza para la purificación de agua para uso farmacéutico y biotecnológico.
• En esta técnica se utilizan presiones más altas que en UF
Osmosis reversa
• En este nivel de filtración las membranas son capaces de retener iones y pequeñas moléculas orgánicas.
• Se utiliza para la purificación de agua para uso farmacéutico y biotecnológico.
• En esta técnica se utilizan presiones más altas que en los casos anteriores ya que hay que vencer la fuerza de la presión osmótica.
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12
Electrodiálisis
• Membranas especiales, el transporte es por una diferencia de potencial eléctrico (potencial electrocinético).
• Se utiliza para la eliminar amonio y lactato de cultivos celulares (nivel experimental para hidridomas).
50 A/m2
La aplicación de sistemas de membrana (MF y
UF) se esta expandiendo rápidamente en la
industria alimentaria y farmacéutica.
La principal razón para este crecimiento es
– Operación de bajo consumo energético,
– Alta recuperación de producto
– Tecnología limpia (no genera contaminantes).
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13
Composición del suero de leche
Glóbulos de caseína/lípidos
Proteínas (PM > 10 kDa)
Lactosa (PM aprox 0,34 kDa)
Sales
Agua
UF
NF
OR
MF
Suero
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14
Etapas de aplicación
Application Membrane SelectionMembrane
Material
Bacculovirus and retrovirus
concentration and washing400 kD, 500 kD, 0.05 µm PS
Clarification of cell lysates to recover
proteins0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Concentration and washing of
bacterial and/or mammalian cells500 kD, 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Continuous perfusion of cell culture 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Clarification of viral cultures 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Washing uniform latex diagnostic
particles0.1, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Washing and concentration of protein
particulates500 kD, 0.2, 0.5 µm CE -PES
Aplicaciones de la MF
(PES) Polyethersulfone
(CE) Cellulose Esters
(PS) Polysulfone
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15
Application Membrane SelectionMembrane
Material
Concentrate and/or desalt peptides
and small molecules10 kD PS
Depyrogenation 10 kD, 50 kD PS
Concentrate and/or desalt proteins,
enzymes50 kD, 100 kD, 400 kD CE -PS
Concentrate and diafilter albumin,
(~MW 67,000)50 kD PS
Concentration of monoclonal
antibodies and other macromolecules100 kD, 400 kD, 500 kD CE -PS
Aplicaciones de la UF
(PES) Polyethersulfone
(CE) Cellulose Esters
(PS) Polysulfone
Parámetros importantes
• Flujo (de filtración)– Volumen de eluato / (superficie membrana * tiempo)
• Lmh: litros metro cuadrado de membrana por hora
• Gfd: galones por pies cuadrados por día
• Flujo de recirculación (Cross-flow rate)– Caudal de alimentación del producto
• Factor de concentración (CF)– Volumen (o caudal) alimentación / volumen (o caudal)
concentrado
• % rechazo (% rejection)– 100 * (1 – [permeato] / [retentato] )
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16
Parámetros importantes
• Caída de presión (Pressure drop)– Diferencia de presión entre la entrada y salida de la
alimentación
• Presión transmembránica (TMP)– Diferencial de presión de filtración
• Presión osmótica (Π)– Depende del MW y concentración del componente
Presión transmembránica (TMP)
∆TMP = Psup – Pinf
Psup no se puede medir =>Psup= (Pin + Pout)/2
∆TMP = (Pin+Pout)/2– Pinf
En gral Pinf = 0
(Psup)
Pinf
Pin Pout
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• Test del punto burbuja (Bubble point test [BP])
– Es un procedimiento utilizado para caracterizar una membrana y monitorear la consistencia y calidad.
– Se basa en la determinación de la presión mínima en el cual el líquido que moja a la membrana es eliminado por presión formando una burbuja (también determina el tamaño max de poro).
• Taponamiento (Fouling)
– Deposición de sustancias sólidas sobre la superficie de la membrana.
– Produce la disminución del filtrado y su calidad. Los procedimiento de limpieza lo eliminan o minimizan.
Definiciones importantes
• Hidrofobicidad– las membranas hidrofóbicas repelen el agua y/o no absorben agua
• Hidrofilicidad– las membranas hidrofílicas tienen alta afinidad por el agua y se
humectan espontáneamente.
• Tamaño de poro (Pore Size)– usualmente determinado en micrones (µm) y refiere al diámetro de
las partículas que una membrana es capaz de retener con un definido grado de eficiencia.
• Through-put– Una caracterización práctica de las membranas de micro filtración.
Evalúa la capacidad de filtración durante la vida de un filtro. ej. el vol total de un líquido específico que pasa a través de la membrana antes de reemplazarla.
Definiciones importantes
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18
Flujo de filtración en diferentes las diferentes técnicas
Por que ?
Existen diferentes Resistencias a la filtración...
Flujo
R adsorción
R membrana
R taponamiento
R gelR concentración
Memb porosa
MICROFILTRACION
MICROFILTRACION
ULTRAFILTRACION
ULTRAFILTRACION
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19
Flujo de filtración en diferentes las diferentes técnicas
• Celulosa modificada
– acetatos, nitratos, etc. derivados de celulosa
• Polímeros sintéticos
– Polisulfona (PES), Polietersulfona (PS),
Polipropileno (PP) , Polietileno (PE) , PVDF, etc.
• Minerales
– óxidos de Al y/o Zr (zirconio)
• Composites
– dos o tres capas de diferentes materiales
Materiales de construcción de membranas
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20
Formato de módulos
Tubular
Fibra hueca
Plano
Espiral
Figuras de www.geafiltration.com
Módulo fibra hueca
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21
Módulo platos
Módulo espiral
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22
Comparación entre diferentes módulos
Morfología de la microestructura de la membrana
Dos tipos principales de membrana:
• asimétricas
– Monofásica
– bifásica
• simétricas
Mayor flujo
Mayor eficiencia
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23
Flujo
Poro más
pequeño
Espesor aprox.:
0,25 mm!!
Membranas asimétricas
Retro flujo (de limpieza)
Estructura
macroporosa
homogénea
Diám. Aprox. 1,5
mm
Membranas simétricas
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24
Esta técnica es la normalmente reemplaza a la diálisis en el escalado de un proceso.
Podemos definir el parámetro
MWCO (molecular weight cut off).
Las membranas de UF más comunes son – 5 kDa MWCO
– 30 kDa MWCO
– 100 kDa MWCO
– 300 kDa MWCO.
Ultrafiltración (UF)
El coeficiente de rechazo corresponde al % de moléculas de
determinado PM que son retenidas respecto de la cantidad inicial.
MWCO(rechazo de moléculas de PM determinado)
% rechazo (% rejection) = 100 * (1 – [permeato] / [retentato] )
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25
http://www.spectrapor.com
Retención de cartuchos Sartocond
descartables
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26
Flujo de filtración vs Recirculación (UF)
Concentración Diafiltración contínua
Procesos Industriales de Ultrafiltración
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27
Funcionamiento de un sistema de Fibra hueca
Concentración
Objetivos del proceso
Selección del tipo de
membrana
Selección del MWCO
Selección del área de
filtración, config y modulo
p/ estudios de lab
•Tiempo max y volúmenes de proceso
•Objetivos:
Factor de concentración
Volúmenes de diafiltración
MWCO debe ser :
•3-6 veces > MW proteína pasa al
permeato
•3-6 veces < MW proteína retenida
•De acuerdo al tiempo y vol de proceso
Estrategia de escalado de TFF
Pall USD 2390 Upscale products and services
Optimización de los
parámetros del proceso
Escalado
•Incrementar proporcionalmente el área
con el vol de muestra
•De acuerdo al tipo de muestra seleccionar el
tipo de cartucho
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28
Nuevos sistemas reducir el taponamiento
Sistema de fibras huecas helicoidales
HPTFF
(High Performance Tangencial Flow
Filtration)
• Agrega la interacción electrostática al efecto
estérico
– Modificando el pH y la fuerza iónica de la solución
se modifica el tamaño real de las proteínas.
– Membranas de UF con carga electrostática
Nuevas técnicas para mejorar la separación
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29
Membranas vibrantes
Vibratory Shear Enhanced Processing
(VSEP)
• Oscilación de la membrana para
disminuir la formación de la torta
• Frecuencia: 50- 60 Hz
• Amplitud: 2-3 cm
• Dirección: tangente a la superficie
• de la membrana
• Genera una fuerza de aprox 200 G
Nuevos sistemas reducir el taponamiento
Membranas vibrantes
Fundamento
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30
Diferencias con la centrifugación
Evitan la formación de aerosoles (manejo de
microorganismos patógenos o sustancias tóxicas)
Existe taponamiento (fouling) de las membranas
– Ciertas proteínas se adsorben a la superficie de la
membrana
– Desechos celulares forman una fina capa sobre la
membrana
– Compuestos químicos utilizados normalmente como
antiespumantes
Centrifugación vs Filtración
Tamaño de partícula a separar – A medida que aumenta el diámetro de la partícula a separar, el
costo de separación por centrifugación cae, mientras que para la filtración no se ven afectados.
– El punto de intersección están en los 1-2 µm (tamaño de la E. coli).
– La UF no tiene competencia con la centrifugación ya que esta última no permite separar componentes solubles.
Otras consideraciones– Facilidades existentes en la planta
– Compatibilidad para un proceso continuo
– Requerimientos de pureza del producto
– Nivel de impurezas o partículas permitidos
– Volumen de material a tratar
– La centrifugación requiere un mayor capital inicial y poco de mantenimiento
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31
Micro y Micro y NanoNano poros perfectosporos perfectos
Obtenidos por bombardeo con iones pesados acelerados
Colaboración con
Laboratorie des Polymeres Irradies
CEA- Saclay. Ecole Polytechnique. France
β-PVDF
112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+
Proceso de preparación de membranas
112Sn53+
β-PVDF
112Sn53+ 112Sn53+ 112Sn53+
PVDF
Irradiación con as de
partículas
Ataque químico
β-PVDF
β-PVDF 25µ
m
2.85 MeV/uma
Fuencia:
9.5 x 108 to 9.5 x 109
En vacio.
GANIL laboratory (Caen, France)
Permanganato de K 0.25 mol. L-1 en
KOH a temperatura y tiempo
establecido
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32
55 °C 65 °C
75 °C 85 °C
No-cylindricalpore entrance
55 °C 65 °C
75 °C 85 °C
No-cylindricalpore entrance