“CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE CEPAS DE TRYPANOSOMA CRUZI MEDIANTE LA TÉCNICA DE PCR EN MUESTRAS RECOLECTADAS EN CUATRO COMUNIDADES DEL CANTÓN GENERAL VILLAMIL PLAYAS, PROVINCIA DEL GUAYAS”
Silvia Fernanda Jiménez Yánez
Directora: Dra. María Augusta Chávez M.Sc.Codirector: Ing. Pedro Romero
IMPORTANCIA
Triatoma dimidiata
Rhodnius ecuadoriensis
Panstrongylus geniculatus
Autor/año Lugar Especie vector Parásito encontrado
Villacis & Grijalva, col (2008-2011)
Manabí Rodnius ecuadoriensis Trypanosoma cruzi
Abad-Franch y col (2001) Manabí Panstrongylus howardi Trypanosoma cruzi
Guevara y col (1999) Guayas Triatoma dimidiata Trypanosoma cruzi
Riesgo potencial
Vectores de importancia en Ecuador
Reino Protista Sub Reino Protozoa Orden Kinetoplastida Familia Trypanosomatidae Género Trypanosoma Especie cruzi
PARÁSITO
Protozoario Hemoflagelado
Trypanosoma cruzi
Sección Stercoraria------heces del vector
MARCO TEORICO
CICLO DE VIDA
alargado con un gran núcleo centraldeficiente capacidad de reproducción
penetra e infecta al hospedero
flagelado, alargadono tiene capacidad para dividirse,Invade otras células
sangre circulante del mamífero y en las heces del insecto
división binaria longitudinal.
parte anterior del intestino del insecto medios de cultivo
Sin movimiento;gran núcleo cerca del cinetoplasto a manera de discoreplicación,
por división binaria simple
MARCO TEORICO
Trypanosoma cruziPicadura del vectorMadre al fetoMal manejo de muestrasTransfusiones y trasplantes
Picadura ------- deyecciones del vector
Chagomas o Signo de Romaña
Triatoma dimidiata
endémico Ecuador 15 especies
VECTOR
MARCO TEORICO
RESERVORIOS DEL VECTOR
rocas apiladas, cuevas de murciélagos y agujeros en los arboles ocupados por mamíferos y aves, aéreas de mucha maleza herbácea, dentro de los domicilios que presentan imperfecciones en su construcción
ambiente favorable para su reproducción y alimentación
MARCO TEORICO
EscombrosEscombros
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Métodos directos
90% - 10%
< 60% 90% - 10%
90% - 40% - 100%
MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
98%
100%
96%100% - 36%
Caracterizar las cepas de Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, en muestras recolectadas en cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, en la provincia de Guayas.
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Colectar y extraer los triatominos infectados con el parásito Trypanosoma cruzi en las comunidades Barrio Lindo, El Morrón, Cruz Roja y Altamira dentro del cantón General Villamil Playas.
Extraer el ADN de Trypanosoma cruzi, mediante la técnica Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico de las muestras analizadas de triatominos recolectados.
Caracterizar molecularmente a Trypanosoma cruzi mediante la técnica de PCR, de las muestras de ADN obtenidas del análisis de los insectos triatominos recolectados, para obtener resultados más confiables y específicos.
Comparar la técnica microscópica con la técnica de PCR de las muestras analizadas.
Realizar un estudio complementario de la prevalencia del parásito Trypanosoma cruzi en el vector triatomino en las muestras recolectadas.
HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN
El parásito Trypanosoma cruzi tipo II está presente, de manera significativa y distinta, en todas las muestras de vectores Triatoma dimidiata recolectadas en las cuatro comunidades del cantón General Villamil Playas, provincia del Guayas.
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Cantón Playas - Guayas SNEM
Recolección
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Recolección y análisis del material fecal de triatominos
Clasificación Alimentación
Extracción del material fecal
FASE DE LABORATORIO
1,5 mL heces + suero fisiológico estéril3mL heces+ 10 mL LIT
Heces + suero fisiológicoMicroscopía de luz 40X
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Reactivos Cantidad
NaCl 7.5g
KCl 0.4g
Triptosa 5g
Sucrosa 2g
Liver infusión 5g
Hemina 20mg
Suero Fetal Bovino 70ml
Estreptomicina (10000 ug/ml) 0.1ml
Penicilina (10000 units/mg) 0.1ml
Gentamicina (10000 ug/ml) 0.1ml
H2O Destilada 1000ml
METODOLOGÍA Y PROCEDIMIENTOS
Titulo
Condiciones de Recoleccion de triatominosTabla de tesis
PORCENTAJE DE TRIATOMINOS INFECTADOS CON Trypanosoma cruzi
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Insectos vectores positivos y = 149
Triatomas total muestreados n = 206
Prevalencia global 72.33%
Nivel de confianza NDC = 95.00%
Distribución normal z = 1.95
Error E = 6.11%
Low L = 66.22%
Up U = 78.44%
Según Autor (2004)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Barrio Lindo El Morrón Altamira Cruz Roja
67 8 9 65
112 11 9 74
59.8% 72.7% 100% 87.8%
Análisis de la prevalencia de Triatominos positivos con microscopia en cada comunidad
NDC 95.00% 95.00% 95.00% 95.00%
Z 1.95 1.95 1.95 1.95
E 143.6% 4.16% 0% 1.17%
L -83.78% -343.5% 100.0% -29.9%
U 203.4% 489.0% 100.0% 205.6%
Barrio ADN prom DE Mín Max
Barrio Lindo 124.516667 93.5805197 30.9 257.3
El Morrón 95.4833333 42.38482826 30.8 155
Atamira 150.266667 55.65072027 63.9 223.1
Cruz Roja 290.057143 299.0857729 37.6 750.4Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil
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Barrio LindoEl Morrón Altamira Cruz Roja
Barrio
-5.2
192.7
390.6
588.5
786.4
AD
N
Título
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil
Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil
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Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil Versión Estudiantil
-311.85 -118.80 74.24 267.29 460.34
Cuantiles de una Normal(-6.8212E-014,25207)
-311.85
-118.80
74.24
267.29
460.34
Cuantil
es
obse
rvados(
RD
UO
_AD
N) n= 25 r= 0.960 (RDUO_ADN)
Título
Q1 = 63.9
Q2 = 122.1
Q3 = 179.9
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Barrio Identificación con primers S35 Y S36
Barrio Lindo 24% (6/25)
El Morrón 24% (6/25)
Altamira 24% (6/25)
Cruz Roja 28% (7/25)
Total 25
6 6 6
7
PCR DE MUESTRAS ANALIZADAS CON S35 Y S36
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers S35 y S36
Reactivos Concentración final Rx N°22
dNTP Mix 1MgCl2 (25mM) 1
GoTaq 5X Buffer 3Primer 1 (2.5uM) 0,4Primer 2 (2.5uM) 0,4
GoTaq Polymerasa 0,125Agua ultra pura 8,10
ADN 2Volumen final 16
Temperatura Tiempo CiclosDesnaturalización
inicial 95°C5min 1 ciclo
Desnaturalización 95°C
1min
Alineamiento 60°C
1min 30 ciclos
Extensión 72°C
1min
Extensión final 72°C
5min 1 ciclo
4°C Hasta el análisis de los productos
del gel de agarosa
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PCR
Amplificación
Muestra Barrio ng/uL
Heces Barrio Lindo 30.9
Heces Barrio Lindo 36.1
Heces Barrio Lindo 191.1
Heces Barrio Lindo 257.3
Heces Barrio Lindo 165.8
Heces Barrio Lindo 65.9
Heces El Morrón 30.8
Heces El Morrón 97.8
Heces El Morrón 83.9
Heces El Morrón 80.2
Heces El Morrón 125.2
Heces El Morrón 155
Heces Altamira 134.2
Heces Altamira 179.9
Heces Altamira 178.4
Heces Altamira 223.1
Heces Altamira 63.9
Heces Altamira 122.1
Heces Cruz Roja 750.4
Heces Cruz Roja 529
Heces Cruz Roja 516.8
Heces Cruz Roja 46.9
Heces Cruz Roja 54.8
Heces Cruz Roja 37.6
Heces Cruz Roja 94.9
CUANTIFICACIÓN DE ADN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ng/u
L
330pb
330pb330pb
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para primers TC, TC1 y TC2
Reactivos Concentración final
dNTP Mix 0,125MgCl2 (25mM) 1,25
GoTaq 5X Buffer 2,5Primer 1 (10 uM) 0,125Primer 2 (10 uM) 0,125Primer 3 (10 uM) 0,125
GoTaq Polymerasa 0,05Agua ultra pura 5,7
ADN 2,5Volumen final 12,5
Temperatura Tiempo Ciclos Desnaturalizació
n inicial 94°C5min 1 ciclo
Desnaturalización
94°C
30min
Alineamiento 55°C
30min 30 ciclos
Extensión 72°C
45min
Extensión final 72°C
5min 1 ciclo
4°C Hasta el análisis de los productos
del gel de agarosa
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
PCR
Amplificación
300pb 300pb
Trypanosoma cruzi Tipo II
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
ComunidadesMuestras amplificadas con
primers TC, TC1 y TC2Muestras no amplificadas
1. Barrio Lindo 6 0
2. El Morrón 4 2
3. Altamira 0 6
4. Cruz Roja 0 7
Barrios
Secuencia primers Nucleótidos (BLAST)
S35
1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttg gccccaaaag ttgaacgccc ctcccaaaac61 aagaatttcg taattttcgg aaccccttta tgtgtaattt ataccaccta tacctctacc121 ataccaccaa cacaacacta ccatcaagaa tacagaaact atagtatcat caatatcaag181 ataacacact caatgcaatc atacaatgcc ccacagaaca taacattttg tgttgtaaac241 tatatcatta gtatctactc tataaattat tattccggta cccctctcac ctctacatta301 caccaacccc aatcgaaccc ccacctcccc gaaaaattca caaaatcaat aaaataatgt361 acgggggaga tgcatgattt ttggccccaa aagttgaacg cccctcccaa aaccaacatt421 ttctgaaatt ccacatcttt ttcaaccatg ttataccata ccacaatcta ttacccacca481 tccaaccaaa caccaaatta taaaatgtaa ctgaatacat aactacaata acgttaacaa541 atctcatcca caaactcaca ccatgttctc ttacacaatg ttctcaacta catcattata601 attacagaaa atatactata tcctaaagac tcattataat atccaaaacc caccactcca661 cctcccttat attacaccaa ccccaatcga acc
Secuencia primers Nucleótidos (BLAST)
S36
1 ataatgtacg ggggagatgc atgatttttc cgccccaaat ttgaacgccc ctcccaaaac61 cacattttcc gaatcctcat aacccattcc taacccttac acaacattat aagatttatc121 aacaaactat agaataataa agaatatatt gtctaattta tctatacaaa catatcttat181 ctcttatatc atagttaata taatacacct ctacatacta taaacataca taacacctct 241 acaccatatt caattccaaa ttacactaca caccacccta tcctacccac cacattacca 301 cctctatatt acaccaaccc caatcgaacc
Secuencia primers Nucleótidos (BLAST)
TC2
1 acctgcaggc acacgtgtgt gtgtgtatgt atgtgtgtgt gccccaccca cctccggctc61 cttcatgttt gtgtcgtcgc tgcccttgtc tgcgcaagca cggtgtcctg tcgtgtccgt121 ctcgctgctt tgtgttctcg cactccaccg cgtgttttac ggtgttgcct gcgttttttg181 gtgtttttct gcttttttcc cgtcttttgg ctcctcgcac tgaaccgcct gcacacaccg241 ctccgcacgc attagtcgcg tgtgttccgc cccccgacac tttctgtggc gctgatcggg 301 cgactccgcc ag
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
INFECCIÓN EXPERIMENTAL
RATONES
Los ratones infectados con Trypanosoma cruzi, presentaron parasitemia visible, sin embargo la infección de los ratones no pudo ser confirmada mediante PCR, con primers específicos de Trypanosoma cruzi (300 -450pb), debido a contaminación en la muestra.
MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo líquidos LIT, no presentaron parasitemia visible debido a la falta de asepsia previa a la inoculación, o probablemente la cantidad de heces inoculadas en cada tubo con el medio liquido LIT fue demasiado alta para que los antibióticos realizaran un trabajo eficiente al momento de mantener estéril al medio.
Por lo tanto no se observaron fragmentos de bandas amplificadas para la presencia de Trypanosoma cruzi en el medio de cultivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se encontró que el 72.33% de vectores analizados tienen a Trypanosoma cruzi presente en las muestras.
El nivel socioeconómico bajo en las comunidades y su forma de vida es un riesgo potencial importante para el continuo desarrollo de la enfermedad.
Con el presente estudio, los métodos de diagnóstico podrán ser más eficientes dando un control casi personalizado a los pacientes.
El sistema de control en el vector podría ser de mayor eficiencia si se toma en cuenta el ciclo biológico del insecto dentro de los reservorios selváticos y domésticos.
Evitar la deforestación, la cual afecta los nichos ecológicos de los vectores, causando cambios en el medio en el que habitan para evitar la migración a espacios domiciliares.
Otra medida de control es la colaboración e intervención de las autoridades locales para que ayuden a crear programas de mejora habitacional en toda la zona endémica para la enfermedad de Chagas.
Control del vector con insecticidas específicos y control a los pobladores
Realizar controles dos veces al año capacitando al grupo de SNEM
Facilitar el equipo necesario para realizar los controles del vector en las distintas poblaciones
Realizar sondeos a las personas mediante técnicas de laboratorio para controlar la enfermedad de Chagas
Dar informes actualizados de estudios recientes para estableces un vinculo entre los investigadores y la enfermedad
Mantener la bioseguridad pertinente en el manejo de material infeccioso para evitar los contagios indirectos
Realizar estudios de caracterización genética para otros tipos de Trypanosomas, ya que se ha demostrado que no solo puede existir una sola clase de Trypanosoma dentro de un vector.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES