Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa (Passiflora edulis Sims.) en la
región del Sumapaz (Cundinamarca)
Donald Heberth Riascos Ortíz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería Agronómica, Escuela de Posgrados
Bogotá, Colombia
2011
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa (Passiflora edulis Sims.) en la
región del Sumapaz (Cundinamarca)
Donald Heberth Riascos Ortíz
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias Agrarias con énfasis en Fitopatología
Directora:
Ph.D. Lilliana María Hoyos-Carvajal
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ingeniería Agronómica, Escuela de Posgrados
Bogotá, Colombia
2011
Dedicado a
mis padres Janeth Ortiz y Donald Riascos,
por su apoyo incondicional, a mi hijo Daniel
Eduardo por ser la principal motivación en mi
vida, a Maritza y Carolina por su apoyo .
Contenido VI
Agradecimientos
A Lilliana Maria Hoyos Carvajal, Ph.D. y docente asociada a la Facultad de Agronomía de
la Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, por sus valiosos aportes y
participación activa como directora en esta investigación.
Al proyecto “Análisis epidemiológico y valoración económica de las principales
enfermedades de la gulupa”, por financiar y llevar a feliz término este trabajo
investigativo.
A los estudiantes de Ingeniería Agronómica Ivonne Quiroga y Rafael Gómez, por su
participación activa, además de su compromiso y dedicación en el desarrollo de la
investigación.
Al Centro de Biodiversidad Fungal en Utrecht-Holanda y en especial a los Doctores Ewal
Groenewald, Pedro Crous y Ulrike Damm, por su amable colaboración en la identificación
molecular de aislamientos del género Cladosporium asociados a Roña en gulupa.
A Ricardo Mora M.Sc., por su colaboración en la colecta de material vegetal con
síntomas de Roña en los municipios de Venecia, San Bernardo, Tibacuy.
A los laboratoristas Wadith de León y Jesús León, vinculados al laboratorio de Sanidad
Vegetal de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional, sede Bogotá, por sus
asesorías en el procesamiento y análisis histológico de material vegetal de gulupa con
síntomas de Roña.
Contenido VII
Contenido
Pág.
Resumen…………………………………………………………………………………….……..9
Lista de figuras………………………………………………………………………….……….11
Lista de tablas……………………………………………………………………………….…..13
Introducción……………………………………………………………………………….……..14
1. Capítulo 1...…………………………………………………………………………………17 Caracterización morfológica y molecular de aislamientos del género Cladosporium asociados a Roña engulupa……………………………………………………………….16 Introducción………………………………………………………………………………….16 1.1 Materiales y métodos.……………………………………….………………………….23 1.1.1Localización.…………………………………………………………………………...23 1.1.2 Aislamiento de microorganismos asociados a material vegetal enfermo..……..……………………………………………………………………..23 1.1.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Cladosporium………………...23 1.1.4 Análisis molecular de aislamientos de Cladosporium…………………………….25 1.1.5 Análisis estadístico…………………………………………………………………...25 1.2 Resultados……………………………………………………………………………….26 1.2.1 Microorganismos asociados a material vegetal enfermo…………………………26 1.2.2 Evaluación macroscópica de aislamientos de Cladosporium……………………27 1.2.3 Evaluación microscópica de aislamientos de Cladosporium…………………….32 1.2.4 Reporte de evaluación molecular de aislamientos de Cladosporium………......35 1.3 Discusión………………………………………………………………………………...36
2. Capítulo 2…………………………………………………………………………………...39 Determinación de la patogenicidad de Cladosporium en gulupa………………….…..39 Introducción………………………………………………………………………………....39 2.1 Materiales y métodos…………………………………………………………………..43 2.1.1Localización…………………………………………………………………………...43 2.1.2 Preparación de inoculo para pruebas de patogenicidad…………………..…....43 2.1.3 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio……………………...43 2.1.4 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero…………………….44 2.1.5 Análisis de microscopía de Barrido Electrónico en hojas inoculadas artificialmente………………………………………………………………………………44 2.1.6 Análisis estadístico………………………………………………………………….45 2.2 Resultados……………………………………………………………………………..45
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
VIII
2.2.1 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio……………………...45 2.2.2 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero…………………….49 2.3 Discusión……………………………………………………………………………….56
3. Capítulo 3…………………………………………………………………………………...62 Análisis de la sintomatología de la Roña en gulupa……………………………………62 3.1 Materiales y métodos..………………………………………………………………...65 3.1.1 Localización…………………………………………………………………………..65 3.1.2 Muestreo de material vegetal con síntomas de Roña…………………………...65 3.1.3 Caracterización de síntomas de Roña…………………………………………….66 3.2 Resultados……………………………………………………………………………...67 3.2.1 Caracterización de síntomas de Roña…………………………………………….67 3.3 Discusión………………………………………………………………………………..72
4. Conclusiones y Recomendaciones……………………………………………………....76 4.1 Conclusiones……………………………………………………………………………76 4.2 Recomendaciones……………………………………………………………………..77 A Anexo: Color de colonias de aislamientos de Cladosporium asociados a gulupa, de acuerdo con el manual Pantone®……………………………79
Bibliografía..…………………………………………………………………………………..….80
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
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Resumen
En la actualidad la gulupa, Passiflora edulis f. edulis, es una especie
económicamente importante dado el potencial de exportación de la fruta,
ocupando el cuarto puesto seguido del banano, plátano y uchuva. En el país, el
departamento con mayor producción de la fruta es Cundinamarca, con
importantes zonas productoras en los municipios de Venecia, San Bernardo,
Granada y Tibacuy. Sin embargo, en los últimos años los volúmenes de
producción se han venido disminuyendo en estas zonas por enfermedades
asociadas al cultivo, entre las que se incluye la Roña, la cual afecta la producción
exportable por daño estético de la fruta. En vista de que esta enfermedad se ha
encontrado asociada a Cladosporium, principalmente, en este estudio se
caracterizó por análisis morfológico y molecular aislamientos del hongo, también
se evaluó la patogenicidad de estos mismos aislamientos en hojas y frutos de
gulupa en laboratorio e invernadero y se caracterizó macro y microscópicamente
la sintomatología de la enfermedad. Los resultados sugieren a C. cladosporioides
sensu lato y C. lycoperdinum sensu estrito como la identidad de los aislamientos
del hongo, algunos de los cuales fueron patogénicos al reproducir los síntomas de
la enfermedad con la inoculación artificial. El desarrollo de los síntomas de Roña
esta correlacionado con degradación de células y tejidos, posiblemente por
liberación de toxinas, aunque repuestas de defensa en la planta toman lugar a
través de la formación de capas de absición en hojas y de corcho en frutos.
Palabras claves: Cladosporium, taxonomía, patogenicidad, sintomatología.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
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Abstract
The gulupa, Passiflora edulis f. edulis, is an species important economically given
the potential for export of fruit, occupying the fourth position after of banana,
plantain and Physalis. In Colombia, the department with the higher of production
of the fruit is Cundinamarca, with important producing areas in the municipalities
of Venecia, San Bernardo, Granada and Tibacuy. However, in recent years the
production volumes have been declining in these areas due to diseases
associated with the cultivation, among which includes the scab, which affects the
production exportable of fruit by aesthetic damage. This disease has been found
associated with Cladosporium, mainly. In this study were characterized isolates of
the Cladosporium through morphological and molecular analysis, was also
evaluated the pathogenicity of these same isolates on leaves and fruits of gulupa
in laboratory and greenhouse and characterized the symptoms of the disease
macro and microscopically. The results suggest to C. cladosporioides sensu lato
and C. lycoperdinum sensu estrito as the causal agent of the disease, some
isolates of the fungi were pathogenic to reproduce the symptoms of the disease by
artificial inoculation. The development of scab symptoms is correlated with
degradation of cells and tissues, probably due to release of toxins, although
responses of plant defense takes place through the formation of abscission layers
in leaves and cork in fruits.
Keywords: Cladosporium, taxonomy, pathogenicity, symptomatology.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
11
Lista de figuras
Pág.
Figura 1: Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AA …………………….…28
Figura 2: Crecimiento y modelamiento de aislamientos de Cladosporium……………….31
Figura 3: Características microscópicas de aislamientos de Cladosporium
asociados a gulupa……………………………………………………………………………...33
Figura 4: Tamaño promedio de estructuras microscópicas de aislamientos
de Cladosporium asociados a gulupa…………………………………………………………35
Figura 5: Árbol filogenético construido con secuencias ITS de aislamientos de
Cladosporium…………………………………………………………………………………….36
Figura 6: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados
con herida en laboratorio……………………………………………………………………….46
Figura 7: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados
sin herida en laboratorio………………………………………………………………………...46
Figura 8: Secuencia de síntomas de Roña en hojas inoculadas
artificialmente con Cladosporium en laboratorio……………………………………………..48
Figura 9: Secuencia de síntomas de Roña en hojas inoculadas
artificialmente con Cladosporium en invernadero……………………………………………50
Figura 10: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de
hoja de gulupa sana…………………………………………………………………………….51
Figura 11: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de
hoja de gulupa con síntomas intermedios de Roña………………………………………...51
Figura 12: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de
ramoconidias asociadas a hoja de gulupa con síntomas de Roña………………………..52
Figura 13: Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico de
hifas de conidióforos asociadas a hoja con síntomas de Roña……………………………52
Figura 14: Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculadas
artificialmente con Cladosporium en invernadero…………………………………………...54
Figura 15: Periodos de incubación y de latencia promedio registrados
en condiciones de invernadero para aislamientos patogénicos en frutos y hojas……….55
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
12
Figura 16: Síntomas iniciales e intermedios de Roña en frutos……………………….…..68
Figura 17: Síntomas avanzados de Roña en frutos…………………………………………69
Figura 18: Síntomas de Roña en hojas de gulupa…………………………………………..70
Figura 19: Síntomas de Roña en ramas de gulupa………………………………………....71
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
13
Lista de tablas
Pág. Tabla 1: Cultivos con registros de enfermedades por Cladosporium……………………...18
Tabla 2: Parámetros para la definición de especies dentro de Cladosporium……………19
Tabla 3: Complejos de especies sensu lato y especies sensu
estricto asociadas………………………………………………………………………………..21
Tabla 4: Origen de aislamientos de Cladosporium caracterizados
morfológicamente………………………………………………………………………………..26
Tabla 5: Tamaño de estructuras microscópicas de aislamientos de
Cladosporium caracterizados morfológicamente…………………………………………….34
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
14
Introducción
La Gulupa, Passiflora edulis f. edulis Sims., es una planta trepadora perenne, de
tallos marcadamente aristados, con flores solitarias y zarcillos que emergen de
las axilas de hojas trilobuladas, y frutos de 5-6 cm. de largo con pericarpo delgado
y duro de color púrpura. La fruta de la gulupa presenta una proyección
internacional alta, ocupando el cuarto lugar en las exportaciones de frutales
después del banano, plátano y uchuva. Su producción está dirigida en gran
medida a satisfacer las necesidades de mercados internacionales, especialmente
europeos, donde se ha incrementado la demanda de la fruta por su exquisito
sabor, pero también por sus cualidades organolépticas y nutricionales como
fuente de provitamina A, niacina, rivoflavina y ácido ascórbico, ideales en la
industria de alimentos (Wenkam, 1990; Pinzón et al., 2007).
La producción de gulupa en Colombia se concentra principalmente en los
departamentos de Cundinamarca, Antioquia y Boyacá, entre 1.800 y 2.400 msnm,
con temperatura y humedad relativa promedio diario de 17.2°C y 82.5% (Pachón
et al., 2006; Mora, 2011). Bajo estas condiciones se alcanzan producciones
adecuadas, aunque se favorece también la ocurrencia de distintos problemas
fitosanitarios, incluyendo plagas y enfermedades. Datos no oficiales reportan
pérdidas por aspectos fitosanitarios entre el 10 y el 30 % de la producción
exportable, lo cual correspondería a US$ 2.800.000 que dejarían de percibirse por
esta causa en el país.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
15
Con respecto a los patógenos asociados a pasifloras en Colombia, se cuenta con
un inventario de enfermedades asociadas a los cultivos del maracuyá Passiflora
edulis f. flavicarpa Degener, la granadilla Passiflora ligularis, y la curuba
Passiflora mollissima L., pero con respecto a los patógenos de gulupa P. edulis f.
edulis Sims. no se presenta informacion. En este inventario se reportan como
agentes causales de enfermedades en Pasifloras a diferentes especies de
Alternaria, Cladosporium, Colletothichum y Phoma (Buriticá, 1999; Castaño-
Zapata, 2009).
Gran interés en conocer los patógenos asociados al cultivo de gulupa ha
emergido en los últimos años, y especialmente aquellos que limitan severamente
la producción de la fruta. Recientemente, se ha definido como patógenos en
gulupa a los virus Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean Mosaic Virus SBMV,
Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV y Potyvirus (Camelo, 2010), a la
bacteria Xanthomonas axonopodis que causa la Mancha de aceite
(Benítez, 2010), y a los hongos Fusarium oxysporum y F. solani, agentes
causantes del Marchitamiento vascular y la Pudrición del cuello de la raíz,
respectivamente (Ortíz, 2010). Sin embargo, no se ha confirmado el agente
etiológico de la Roña de la gulupa, una de las enfermedades con mayor
importancia en el cultivo por afectar todos los órganos aéreos de la planta y en
particular los frutos, en los que se reduce la calidad estética, limitándose la
exportación de la fruta a Europa, principalmente.
Debido a la demanda creciente de gulupa en el mundo, es necesario aumentar la
producción de la fruta en Colombia a través de la optimización del manejo
integrado de enfermedades en los sistemas agrícolas, por lo que es importante
avanzar en el diagnóstico de las enfermedades para las cuales no se ha
confirmado su agente causal, incluyendo la Roña. Para contribuir al conocimiento
de las enfermedades y patógenos asociados al cultivo de gulupa, se plantea en
este estudio los siguientes objetivos general y específicos: Caracterizar la
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
16
etiología de la Roña de la gulupa P. edulis f. edulis Sims. en la región del
Sumapaz, Cundinamarca, 1) Determinar taxonómicamente el agente etiológico
asociado con la Roña de la gulupa, 2) Determinar la patogenicidad del agente
etiológico asociado con la Roña de la gulupa, y 3) Caracterizar la sintomatología
de la Roña en el cultivo de Gulupa.
El conocimiento del agente causal de la Roña en gulupa, permitirá desarrollar
métodos de evaluación de la enfermedad requeridos para la cuantificación de
pérdidas en producción y evaluación de materiales por resistencia. Igualmente, se
podrá llevar a cabo pruebas de eficacia de fungicidas y de agentes de control
biológico, como también estudios de epidemiología y de variabilidad genética de
las poblaciones del patógeno, necesarios para la formulación de programas de
manejo integrado de la enfermedad.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
17
1. Capítulo 1
Caracterización morfológica y molecular de aislamientos del
género Cladosporium asociados a Roña en gulupa
INTRODUCCIÓN
Cladosporium, es uno de los géneros más grandes de hyphomycetes, con más de
772 especies y teleomorfos en Davidiella (Braun et al., 2003; Dugan et al., 2004;
Schubert et al., 2007). Las especies de Cladosporium son comunes y
ampliamente distribuidas, incluyendo especies endófitas, patógenas en humanos,
patógenas en plantas y saprofitas. Las especies saprofitas ocurren en tallos y
hojas senescentes y muertas de plantas herbaceas y leñosas, como invasores
secundarios de manchas foliares necróticas, y son frecuentemente aisladas de
aire, suelo, productos alimenticios, pintura, textiles y otros materiales orgánicos
(Riesen y Sieber 1985, Brown et al., 1998, ElMorsy, 2000; Crous et al., 2007a).
Las enfermedades de plantas causadas por Cladosporium son comunes y
ampliamente distribuidas en vegetales, frutas y en algunos cultivos en campo a
través del mundo (Tabla 1). En gulupa, P. edulis f. edulis Sims., Cladosporium se
ha encontrado asociado a síntomas de Roña en la parte aérea de la planta, en
lesiones acuosas (ampollas) que posteriormente evolucionan a chancros y
finalmente a roñas cuando la enfermedad ocurre en frutos. En flores, las lesiones
aparecen en brácteas y sépalos como manchas húmedas, circulares de 5-10 mm.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
18
de diámetro, de color café cobrizo y esporulación gris verdoso en el centro.
Lesiones similares ocurren en hojas y ramas, observándose en este último
órgano hundimientos a manera de chancros (Mora, 2011).
Tabla 1. Cultivos con registros de enfermedades por Cladosporium.
Cultivo
Enfermedad
Especie del
patógeno
Referencia
Nuez (Carya illinoensis) Roña de la nuez C. carygenum Diehl and Graves,
1994
Lirio Alemán (Iris germánica) Mancha foliar del lirio
Alemán
C. iridis Shin y Lm, 1999
Sandía (Citrullus lanatus) Roña de la sandía C. cucumerinum Kwon et al., 1999
Frijol espada (Canavalia gladiata) Roña del frijol espada C. cucumerinum Kwon et al., 2000
Té (Thea sinensis) Roña del té C. herbarum Kwon et al., 2001a
Fresa (Fragaria ananassa) Roña de la fresa C. herbarum Kwon et al., 2001b
Tomate (Solanum lycopersicum) Moho foliar en tomate C. fulvum Agrios, 2005
Pepino (Cucumis sativus) Roña del pepino C. cucumerinum Agrios, 2005
Duraznero (Prunus persica) Roña y tizón de las ramas
del durazno
C. carpophilum Agrios, 2005
Arveja (Pisum sativum L.) Pudrición de la vaina y el
añublo de la arveja
C. cladosporioides Agrios, 2005
Bálsamo (Momordica charantia) Roña del bálsamo C. cucumerinum Kwon y Park, 2006
Espinaca (Spinacia oleraceae) Mancha foliar de
Cladosporium
C. variabile Hernandez y du
Toit, 2006.
Vid (Vitis vinifera) Pudrición de Cladosporium C. herbarum y
C. cladosporioides
Briceño y Latorre,
2008
Henbane egipcio (Hyoscyamus
muticus)
Roña del henbane egipcio C. herbarum Abdel-Motaal, 2009
Papayo (Carica papaya L.) Roña del papayo C. cladosporioides Chen et al., 2009
En los últimos años un concepto moderno de Cladosporium ha sido establecido
basado en exámenes morfológicos y análisis moleculares (Tabla 2). De esta
manera, estudios taxonómicos siguiendo una aproximación polifásica han sido
conducidos para definir distintas especies dentro de Cladosporium (Schubert y
Braun 2004; Heuchert et al., 2005; Schubert, 2005a, b; Braun et al., 2006, 2008a,
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
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b; Crous et al., 2006; Schubert et al., 2006; Braun y Schubert 2007; Crous et al.,
2007a,b; Arzanlou et al., 2007; Schubert et al., 2007; Zalar et al., 2007; Schubert
et al., 2009; Bensch et al., 2010).
Tabla 2. Parámetros para la definición de especies dentro de Cladosporium.
Tipo de
caracterización
Nivel de caracterización Procedimientos
Morfológica
Macroscópica
Evaluación del diámetro de colonias
crecidas en PDA (Papa dextrosa Agar),
AEM (Agar Extracto de Malta) y AA (Agar
Harina de Avena) a 25°C. al día 14.
Evaluación del color de las colonias
crecidas en los tres medios de cultivo al
día 14.
Microscópica
Determinación de los patrones de
ramificación de conidióforos.
Determinación del ancho y largo de 30
ramoconidias, conidias intercalar y
terminales a un aumento de 1.000x.
Estudios de microscopía de barrido
electrónico para definir la ornamentación
de pared de conidias y conidióforos.
Molecular
ITS
ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG Amplificación y alineamiento de
secuencias para definir el complejo de
especies sensu lato.
LR5: ATCCTGAGGGAAACTTC
Actina 512F: ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
Amplificación y alineamiento de
secuencias para definir especies sensu
estricto dentro de los complejos de
especies sensu lato.
783R: TACGAGTCCTTCTGGCCCAT
Factor
de
elongaci
ón 1 alfa
728F: CATCGAGAAGTTCGAGAAGG
986R: TACTTGAAGGAACCCTTACC
Calmo-
dulina
228F: GAGTTCAAGGAGGCCTTCTCCC
737R: CATCTTTCTGGCCATCATGG
Histona
H3
H3-1a: ACTAAGCAGACCGCCCGCAGG
H31b: GCGGGCGAGCTGGATGTCCTT
Los hongos del género Cladosporium producen colonias efusas u ocasionalmente
punctiformes, a menudo de color verde oliva pero también algunas veces gris,
café o marrón oscuro, de textura aterciopelada, flocosa o vellosa y con micelio
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
20
inmerso o superficial. Estroma algunas veces presente, setas e hifopodios
ausentes, conidióforos macronematosos o semimacronematosos y algunas veces
también micronematosos; los conidióforos macronematosos pueden ser rectos o
flexuosos, principalmente sin ramificar o con ramificaciones restringidas a la
región apical formando un estípite y cabeza, de color café o café oliva; con
ornamentación de pared lisa o verrucosa, ramoconidias a menudo presentes, con
células conidiógenas poliblásticas, usualmente integradas, algunas veces
discretas, simpodiales, más o menos cilíndricas, con cicatrices usualmente
prominentes. Las conidias son catenadas, pero algunas veces son solitarias,
especialmente en especies con muchas conidias, a menudo en cadenas
ramificadas, acropleurógenas, simple cilíndrica, doliforme, elipsoidal, fusiforme,
ovoide, esférica o subesférica, con una distinguible y protuberante cicatriz en
cada extremo o justo en la base, café oliva oscuro a pálido o café, liso,
verruculosa o equinulada, con 0-3 u ocasionalmente más septos (Ellis, 1971).
A nivel molecular distintos genes han sido amplificados y secuenciados en la
definición de especies dentro de Cladosporium (Tabla 3). Secuencias parciales de
las regiones ITS, y segmentos de los genes actina, calmodulina, factor de
elongación 1-α e histona H3 son considerados en la elucidación de especies
dentro del complejo C. herbarum, y ITS, actina y factor de elongación 1-α en C.
sphaerospermum y C. cladosporioides (Schubert et al., 2007; Dugan et al., 2008;
Bensch et al., 2010).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
21
Tabla 3. Complejos de especies sensu lato y especies sensu estricto asociadas.
Complejo de especies Especies sensu stricto Referencia
C. herbarum sensu lato C. antarcticum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504573
C. bruhnei Bull, 1974
C. herbaroides Schubert et al., 2007. MycoBank MB504574
C. herbarum Link, 1816
C. iridis De Vries, 1952
C. macrocarpum Preuss, 1948
C. ossifragi Braun y Schubert, 2007. MycoBank
MB504575
C. pseudiridis Schubert et al., 2007. MycoBank MB504576
C. ramotenellum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504577
C. sinuosum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504578
C. spinulosum Zalar et al., 2007
C. subinflatum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504579
C. subtilissimum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504580
C. tenellum Schubert et al., 2007. MycoBank MB504581
C. varibile De Vries, 1952
C. Sphaerospermum sensu lato C. dominicanum Zalar et al., 2007. MycoBank MB510995
C. fusiforme Zalar et al., 2007. MycoBank MB510997
C. halotolerans Zalar et al., 2007. MycoBank MB492439
C. langeronii Fonseca y Nogueira, 1931.
C. sychrotolerans Zalar et al., 2007. MycoBank MB492428
C. salinae Zalar et al., 2007. MycoBank MB492438
C. sphaerospermum Penzig, 1882.
C. spinulosum Zalar et al., 2007. MycoBank MB501099
C. velox Zalar et al., 2007. MycoBank MB492435
C. cladosporioides sensu lato C. acalyphae Bensch et al., 2010. MycoBank MB517070
C. angustiporum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517071
C. asperulatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517072
C. astraliense Bensch et al., 2010. MycoBank MB517073
C. basiinflatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517074
C. chalastosporoides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517075
C. chubutense Schubert et al., 2009.
C. cladosporioides De Vries, 1952.
C. colocasiae Sawada, 1916.
C. colombiae Schubert et al., 2009.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
22
C. cucumerinum Ellis y Arthur, 1889.
C. delicatulum Cooke, 1876.
C. exasperatum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517076
C. exile Bensch et al., 2010. MycoBank MB517077
C. flabeliforme Bensch et al., 2010. MycoBank MB517078
C. funiculosum Yamam, 1959.
C. gamsianum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517079
C. globisporum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517080
C. hillianum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517081
C. inversicolor Bensch et al., 2010. MycoBank MB517082
C. iranicum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517083
C. licheniphilum Heuchert y Braun, 2006.
C. lycoperdinum Cooke, 1883.
C. myrtacearum Schubert , 2005a.
C. oxysporum Berk y Curtis, 1869
C. paracladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517084
C. perangustum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517085
C. phyllactiniicola Bensch et al., 2010. MycoBank MB517086
C. phyllophilum McAlpine, 1896.
C. pini-ponderosae Schubert et al., 2009.
C. pseudocladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517087
C. rectoides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517088
C. scabrellum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517089
C. subuliforme Bensch et al., 2010. MycoBank MB517090
C. tenuissimum Cooke, 1878
C. uredinicola Morgan-Jones y McKemy, 1990
C. varians Braun et al., 2008b
C. verrucocladosporioides Bensch et al., 2010. MycoBank MB517091
C. vignae Gardner, 1925.
C. xylophilum Bensch et al., 2010. MycoBank MB517092
En vista de que Cladosporium se ha encontrado asociado a lesiones de Roña en
gulupa, es necesario esclarecer la identidad taxonómica del hongo, no solo por
razones de manejo de la enfermedad, sino también por la condición de fruta de
exportación, pensando en que a futuro una limitante para expandir los mercados
puede ser el no tener definidos los patógenos asociados al cultivo. Este capítulo
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
23
tiene como objetivo determinar taxonómicamente el agente etiológico asociado
con la Roña de la gulupa.
1.1 MATERIALES Y MÉTODOS
1.1.1 Localización
Esta fase del estudio se llevó a cabo en la región del Sumapaz, en los municipios
de Venecia, Tibacuy, San Bernardo y Granada, en donde se colectó material
vegetal con síntomas de Roña entre los años 2009 y 2010. Las muestras fueron
llevadas al laboratorio de Fitopatología de la Facultad de Agronomía de la
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá, para su posterior
procesamiento.
1.1.2 Aislamiento de microorganismos asociados a material vegetal enfermo
Para el aislamiento de los microorganismos se esterilizó superficialmente
explantes con lesiones de la enfermedad, pasándolos por etanol al 70% e
hipoclorito de sodio al 2% por un minuto. Posteriormente, los explantes fueron
lavados tres veces con agua destilada estéril, secados con papel toalla estéril,
sembrados sobre PDA (Agar-Papa – dextrosa) e incubados por 7 días a 25ºC, de
acuerdo con el protocolo propuesto por Rivero (2000). Las colonias de hongos
crecidas en PDA fueron purificadas e identificadas hasta nivel de género, y para
algunos aislamientos fúngicos se obtuvo cultivos monospóricos, los cuales fueron
preservados en glicerina estéril al 10% a 4°C.
1.1.3 Caracterización morfológica de aislamientos de Cladosporium
Quince (15) aislamientos monospóricos, identificados como Cladosporium fueron
caracterizados taxonómicamente de acuerdo con los siguientes parámetros
propuestos por Schubert et al. (2007): (1) Características de las colonias: Los
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
24
aislamientos se cultivaron e incubaron por 14 días en PDA, AEM (Agar extracto
de malta) y AA (Agar harina de avena) a una temperatura de 25°C. Durante este
tiempo, se registró cada 24 horas el diámetro de las colonias en tres repeticiones
por medio de cultivo. Al día 14 se evaluó el color de la superficie y el reverso de
las colonias usando el manual Pantone®, (2) Desarrollo conidial y patrones de
ramificación: Sobre colonias crecidas en SNA (Agar pobre en nutrientes) a 25ºC
durante 7 días, se realizaron improntas de conidióforos ubicados entre el margen
de la colonia y 2 Cm hacia el centro. Las improntas se montaron sobre láminas
portaobjetos con 2 gotas de ácido láctico al 85%, y seguidamente, en un
microscopio de luz a 1000x se realizó mediciones de conidias terminal, intercalar
y ramoconidias, registrando la longitud y ancho de 30 conidias por estructura.
Análisis de Microscopía de Barrido Electrónico (MEB) de los aislamientos
FABCl14 y FABCl45 fue realizado para definir el complejo de especies sensu lato
al que pertenecen, basado en la ornamentación de pared. Para tal fin, los
aislamientos fueron cultivados en SNA durante 8 días, tiempo en el cual las
conidias se desprendieron por lavado con agua destilada estéril y se dispensaron
en tubos ependorff, obteniéndose así una suspensión conidial altamente
concentrada, la cual fue posteriormente centrifugada a 2000 rpm. por 2 minutos.
El sobrenadante (agua) fue retirado y las conidias fueron fijadas por adición de
glutaraldehido al 2,5% por un periodo de 2 horas, post-fijadas con tetraoxido de
osmio por 1 hora y deshidratadas realizando diluciones seriadas por 15 minutos
en alcohol etílico al 25, 50, 70, 90 y 100%. Para el secado de punto crítico, un
volumen de la última suspensión conidial fue colocado en tubos de PCR, a los
cuales se les hizo orificios pequeños por encima del volumen de la muestra. Los
tubos de PCR con la suspensión conidial fueron centrifugados por 2 minutos a
10000 rpm a temperatura ambiente para eliminar el agua. Finalmente, las
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
25
conidias fueron secadas en punto crítico por 2 horas y orificadas con aleación
oro-paladio por 30 minutos.
1.1.4 Análisis molecular de aislamientos de Cladosporium
El Ácido Desoxirribonucleico, ADN, de cinco aislamientos de Cladosporium,
evaluados por su patogenicidad en gulupa, fue extraído y enviado al Centro de
Biodiversidad Fungal en Utrech, Holanda, para su análisis e identificación
molecular. De acuerdo con la información suministrada por el servicio de
identificación del CBS, para cada aislamiento se realizó la amplificación y
secuenciación parcial de los genes ITS (Operon rDNA nuclear, abarca el extremo
3’de 18S rRNA, 5,8S rRNA, y el extremo 5’ de 28S rRNA), Actina y Factor de
elongación 1-α, como es sugerido por Bensch et al. (2010). La identidad de los
aislamientos se definió luego de que las secuencias fueran alineadas y sometidas
a comparación con secuencias de aislamientos tipo depositadas en el GenBank.
Con las secuencias ITS obtenidas para los aislamientos de Cladosporium
asociados a gulupa y de aislamientos tipo pertenecientes a los complejos de
especies C. cladosporioides y C. herbarum sensu lato, previamente depositadas
en el GENBANK, se realizó un alineamiento y construcción de un árbol
filogenético UPGMA, utilizando el programa informático MEGA, con el propósito
de establecer las especies con las cuales se agrupan los aislamientos analizados
en este estudio, y así definir el complejo de especie sensu lato al que pertenecen.
1.1.5 Análisis estadístico
Con los datos de crecimiento diario se realizó un análisis de varianza (siguiendo
un Diseño Completamente al Azar) y pruebas de comparación de medias (Tukey)
para determinar posibles diferencias estadísticas entre aislamientos y medios de
cultivo evaluados. Estos mismos datos fueron utilizados para modelar el
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
26
crecimiento de los aislamientos de Cladosporium (línea de tendencia), basado en
el coeficiente de determinación (R2). Los registros de mediciones microscópicas
se usaron para establecer en cada aislamiento los rangos, promedios y
desviaciones estándar del ancho y largo de ramoconidias, conidias intercalar y
terminal.
1.2 RESULTADOS
1.2.1 Microorganismos asociados a material vegetal enfermo
De tejidos con síntomas de Roña se recuperó en PDA un total de 54 aislamientos,
identificados hasta nivel de género como Cladosporium (38), Colletotrichum (13) y
Botritys (3). Debido a que Cladosporium fue el género aislado con mayor
frecuencia, 15 aislamientos monospóricos del hongo fueron seleccionados y
caracterizados morfológicamente (Tabla 4).
Tabla 4. Origen de aislamientos de Cladosporium caracterizados morfológicamente
Código de aislamiento Localidad Órgano afectado
FABCl14 Tibacuy Hoja
FABCl 21 Tibacuy Hoja
FABCl 22 Tibacuy Hoja
FABCl 27 Tibacuy Fruto
FABCl 43 Pandi Hoja
FABCl 45 Venecia Fruto
FABCl 50 Venecia Hoja
FABCl 51 Venecia Hoja
FABCl 69 San Bernardo Fruto
FABCl71 San Bernardo Fruto
FABCl 73 San Bernardo Fruto
FABCl 74 San Bernardo Fruto
FABCl 78 Granada Fruto
FABCl 79 Granada Fruto
FABCl 80 Granada Fruto
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
27
1.2.2 Evaluación macroscópica de aislamientos de Cladosporium
Basado en las características de las colonias, diferencias macroscópicas fueron
observadas entre aislamientos monospóricos para los caracteres textura y color,
registrándose en PDA aislamientos con micelio algodonoso (FABCl14, FABCl21,
FABCl22, FABCl43, FABCl51, FABCl78, FABCl79, y FABCl80) y aterciopelado
(FABCl27, FABCl45, FABCl50, FABCl69, FABCl71, FABCl73 y FABCl74). En este
mismo medio de cultivo, las colonias presentaron coloración verde oliva grisáceo
con variaciones en intensidad de un aislamiento a otro, aunque micelio de color
blanco fue observado en algunos aislamientos, especialmente en los de textura
algodonosa. Igual patrón textural fue observado cuando los aislamientos
crecieron en AEM, sin embargo, estas colonias se distinguieron por presentar un
color gris-humo y pliegues con forma elipsoidal o lineal en la parte superior. En
AA, todos los aislamientos fueron de color verde oliva con micelio blanco en la
periferia y sin pliegues (Figura 1, anexo A).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
28
Figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AA a los 14 días. De izquierda a derecha aislamientos FABCl14, FABCl21, FABCl22, FABCl27 y FABCl43.
FABCl14 FABCl21 FABCl22 FABCl27 FABCl43
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
29
Continuación de la figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AO a los 14 días. De izquierda a derecha aislamientos FABCl45, FABCl50, FABCl51, FABCl69 y FABCl71.
FABCl45 FABCl50 FABCl51 FABCl69 FABCl71
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
30
Continuación de la figura 1. Colonias de Cladosporium crecidas en PDA, AEM y AO a los 14 días. De
izquierda a derecha aislamientos FABCl73, FABCl74, FABCl78, FABCl79 y FABCl80.
Para todos los aislamientos, los datos de crecimiento se ajustaron a una línea de
tendencia polinómica (cuadrática) en los tres medios de cultivo evaluados, con
coeficientes de determinación (R2) entre 0.6 – 0.99 en PDA, 0.67 – 0.99 en AEM y
FABCl73 FABCl74 FABCl78 FABCl79 FABCl80
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
31
0.89 – 0.99 en AA. De acuerdo con el análisis de varianza, diferencias
significativas entre aislamientos y medios de cultivo fueron registradas para la
variable crecimiento, con probabilidad de 0,0001 en ambos factores. Al considerar
la prueba de comparación de medias de Tukey para los dos factores, el medio de
cultivo donde mayor crecimiento se registró para todos los aislamientos fue en
AA, seguido de PDA y AEM, con valores promedio de 5.0, 4.2 y 3.4 cm. a los 14
días, respectivamente. Los aislamientos con mayor crecimiento fueron 73, 71,74,
50, 43, 27, 45, seguidos de 51, 78, 80, 69, 22, 21, 79 y 14 (Figura, 2).
Figura 2. Crecimiento y modelamiento de aislamientos de Cladosporium. A. Crecimiento de los aislamientos al día 14 en PDA (barra de color negro), AEM (barra de color blanco) y AA (barra de color gris). B-D. Modelo de crecimiento polinómico registrado en PDA, AEM y AA para todos los aislamientos evaluados.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
32
1.2.3 Evaluación microscópica de aislamientos de Cladosporium
Por análisis microscópico se determinó que los aislamientos de Cladosporium
asociados a Roña en gulupa presentan Micelio inmerso y superficial, septado, con
hifas primarias de pared delgada (2.5 – 4 μm de ancho) e hifas secundarias de
pared gruesa (micelio dimórfico). Conidióforos largos ó cortos, erectos, solitarios,
macro y micronematosos, algunas veces geniculados, con crecimiento simpodial,
con emergencia lateral y terminal. Ramoconidias primarias poco frecuentes de
2.5- 4.5 μm. de ancho x 21 – 28 μm. de largo. Ramoconidias secundarias de 2.5
– 5 μm. de ancho x 4.5 – 20 μm. de largo, con 2 -3 hilum conidial y 0-2 septos.
Conidias intercalar aseptadas y limoniformes, de 2 – 4 μm. de ancho x 3.5 - 8.5
μm. de largo, y Conidias terminal aseptadas y ovoides, de 2.3 – 4 μm. de ancho x
2.5 – 6 μm de largo. Por observaciones al microscopio de luz y de barrido
electrónico, se estableció que los aislamientos analizados presentan conidias y
conidióforos con ornamentación de pared lisa en comparación con un aislamiento
de Cladosporium recuperado de uchuva con ornamentación de pared equinulada,
lo que sugiere la inclusión de los aislamientos de gulupa dentro del complejo de
especies C. cladosporioides sensu lato (Figura 3).
La Tabla 5, muestra para cada aislamiento los rangos del ancho y largo de
conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias; mientras que la Figura 4,
ilustra para estos mismos aislamientos los valores promedio del ancho y largo de
las conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias. Al considerar los 15
aislamientos de Cladosporium evaluados, el rango promedio del ancho y largo de
conidias terminal, intercalar y ramoconidias secundarias fue de 2.7 – 3.1 x 4-5
μm, 2.9 – 3.1 x 5.2 – 6.7 μm., y 3.1 – 3.6 x 11.5 – 14.3 μm., respectivamente.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
33
Figura 3. Características microscópicas de aislamientos de Cladosporium asociados a gulupa. A. Micelio dimórfico, B. Conidióforos solitarios, C. Conidióforo micronematoso emergiendo lateralmente, D. Conidióforo emergiendo terminalmente, E. Conidióforo geniculado, F. Conidióforo macronematoso con crecimiento simpodial, G. Conidióforo con ramoconidias con 2 a 3 hilum conidial, H. Ramoconidias con cicatriz prominente en condióforo, I. Conidióforo de aislamiento FABCl45 con ornamentación de pared lisa (MBE), y J. Conidias de aislamiento de Cladosporium
recuperado de uchuva con ornamentación de pared equinulada.
A B C D
E F G H
I J
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
34
Tabla 5. Ancho y largo (μm.) de estructuras microscópicas de aislamientos de Cladosporium
caracterizados morfológicamente.
Aislamiento Conidia terminal (μm) Conidia intercalar (μm) Ramoconidia secundaria (μm)
14 3-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 3-3,5 x 5-7 (DS. 0,2 x 0,7) 3-4 x 9-19 (DS. 0,3 x 3,1)
22 2,5-3 x 4-6 (DS. 0,0 x 0,7) 3-4 x 5 -7 (DS.0,3x 0,5) 2,5-4 x 6-20 (DS.0,4 x 4,3)
21 3-3,5 x 3,5-5 (DS.0,0 x 0,2) 3-3,5 x 6-8 (DS. 0,1 x 0,5) 2,5-4 x 8-20 (DS. 0,4 x 3)
27 2,5-3 x 3,5-4 (DS. 0,1 x 0,1) 2,5-3 x 5-6 (DS. 0,1 x 0,4) 2,5-4 x 7-20 (DS. 0,3 x 3,4)
43 2-3 x 2,5-5,5 (DS. 0,2 x 0,7) 2,5-3,5 x 5-6,5 (DS. 0,1 x 0,5) 2,9-4 x 6-20 (DS. 0,3 x 4,1)
45 2,5-3,0 x 3,5 – 6 (DS. 0,1 x 0,4) 2,5-3,5 x 5-7 (DS. 0,1 x 0,5) 3-4 x 10-19 (DS. 0,3 x 2,4)
50 2-3,5 x 3,3-5,5 (DS. 0,3 x 0,6) 2,4-3,8 x 3,5-7,5 (DS. 0,3 x 0,8) 2,5-4 x 4,5-18,8 (DS. 0,4 x 3,7)
51
2,5-3 x 3,5-5 (DS. 0,1 X 0,4)
3-3,5 X 4,8-6,5 (DS. 0,1 x 0,5) 3-4,5 x 8-19 (DS. 0,4 x 2,7)
69 2,5-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 2,5-3,8 x 4,5-6,5 (DS. 0,3 x 0,5) 2,8-4 x 5,5-20 (DS. 0,3 x 3,3)
71 2,5-3,5 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,4) 2-4 x 4,5-7 (DS. 0,6x0,2) 2,5-4,5 x 6 -19,5 (DS. 0,5 x 4,3)
73 2,5-3 x 3,5-4,5 (DS. 0,2 x 0,2) 2,8-4 x 5-6,5 (DS. 0,2x0,5) 3-4 x 6,2-19 (DS. 0,4 x 3,6)
74 2,5-3,5 x 3-6 (DS. 0,3 x 0,6) 2-4 x 4,5-6,5 (DS. 0,4x0,5) 2,5-5 x 6-20 (DS. 0,6 x 4,1)
78 2,5-4 x 3,5-5,5 (DS. 0,2 x 0,4) 2,5-3,5 x 4,8-7,5 (DS. 0,2x0,7) 2,5-4,5 x 5,5-20 (DS. 0,5 x 4,5)
79 2,5-3 x 4-6 (DS. 0,2 x 0,6) 2,5-3,5 x 5-8,5 (DS. 0,2x0,8) 3-3,5 x 6,5-19 (DS. 0,2 x 3,6)
80 2,5-3 x 4-5 (DS. 0,2 x 0,3) 3-3,5 x 5-6,5 (DS. 0,2x0,5) 3-4 x 7-18,5 (DS. 0,3 x 3,2)
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
35
1.2.4 Reporte de evaluación molecular de aislamientos de Cladosporium
El reporte del servicio de identificación del centro de biodiversidad fungal - CBS,
indicó que los aislamientos de Cladosporium asociados a Roña en gulupa
pertenecen al complejo de especies C. cladosporioides sesu lato, basado en
análisis de regiones ITS (Operon rDNA nuclear, abarca el extremo 3’de 18S
rRNA, 5,8S rRNA, y el extremo 5’ de 28S rRNA), lo cual se confirmó con el árbol
filogenético generado, al observar que los aislamientos de gulupa agruparon con
aislamientos tipo de especies sensu stricto pertenecientes al complejo de
especies C. cladosporioides sensu lato y no con el aislamiento tipo de la especie
C. herbarum (Figura 5). Por Actina existe una alta identidad de los aislamientos
FABCl14 y FABCl22 con C. lycoperdinum al comparar las secuencias generadas
Figura 4. Tamaño (μm) promedio de
estructuras microscópicas de aislamientos
de Cladosporium asociados a gulupa. A.
Conidias terminales, B. Conidias intercalar,
y C. Ramoconidias secundarias.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
36
con las previamente depositada en el GenBank para esta especie; mientras que
por Factor de elongación 1-alfa, las secuencias obtenidas para los mismos
aislamientos presentaron una identidad alta con C. acalyphae.
Figura 5. Árbol filogenético construido con secuencias ITS de aislamientos de Cladosporium asociados a Roña en gulupa y de aislamientos tipo de especies pertenecientes a los complejos de especies C. cladosporioides y C. herbarum sensu lato.
1.3 DISCUSIÓN
Los análisis morfológicos por microscopía de barrido electrónico y molecular por
ITS muestran correspondencia, al determinar por ambas vías a C.
cladosporioides sensu lato como el complejo que incluye la especie a la cual
pertenecen los aislamientos de gulupa analizados. Dentro del complejo, las
especies candidatas por actina y factor de elongación 1 – alfa son C.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
37
lycoperdinum y C. acalyphae, respectivamente, dada la alta identidad de las
secuencias al realizar el BLAST en GenBank. Sin embargo, las características
microscópicas registradas para los aislamientos de gulupa claramente
corresponden con las reportadas para C. lycoperdinum en el estudio de Bensch et
al. (2010). Esta especie es encontrada en Colombia asociada a Puya sp.
(Bromeliaceae), y se distingue por presentar micelio ramificado, no constreñido en
los septos, subhialino a café pálido ó olivaceo, liso ó levemente verruculoso,
pared delgada, conidióforos macro y micronematosos, solitarios, que emergen
lateral y terminalmente de hifas, erectos. Conidióforos macronematosos
cilíndricos, con proliferación simpodial, usualmente no geniculado, hifa del
conidióforo solitaria que emerge como prolongaciones cortas en forma de cuña,
con presencia de un septo justo abajo. Conidióforos micronematosos cortos,
pálidos (más que los macronematosos), no geniculados. Ramoconidas de 3-5 μm.
de ancho, con 2 - 4 loci conidial, 0 – 3 septos, 2 – 4 hilum distales, base truncada,
conidia terminal subglobosa a ovoide, aseptada, de (2-) 3,5 – 5 x (1,5-) 2-2,5 (-3)
μm., conidia intercalar limoniforme, con 0-1 septo, de 4 – 14(-16.5) x (2-) 2,5-3
(-4) μm., y ramoconidia secundaria elipsoide a cilíndrica, algunas veces doliforme,
0-1 (-3) septos, 2-5 hilum distal de 8-32(-38) x (2,5-)3-4(-5) μm..
Igual correspondencia se encontró para las características en cultivos como
textura, color y crecimiento, entre los aislamientos estudiados y lo registrado para
C. lycoperdinum en Bensch et al. (2010), debido al crecimiento de colonias
olivaceas-gris, con bordes de color blanco en PDA, gris-humo en AEM y verde
olivaceo en AA. Al considerar las evaluaciones del crecimiento, el medio de
cultivo AA favoreció el crecimiento de los aislamientos en relación a PDA y AEM,
lo que es de interés en diagnóstico fitosanitario, además por inducir la
esporulación y facilitar la adecuada identificación de Cladosporium, Acremonium,
Fusarium, Paecilomyces, Phialophor y Scopulariopsis (Rezusta et al., 2007).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
38
Por el contrario, las características microscópicas registradas para los
aislamientos de gulupa no concuerdan con las establecidas para C. acalyphae,
principalmente en los valores (rangos) del largo y ancho de conidias terminal,
intercalar y ramoconidias secundarias, determinados para esta especie entre 4.5
– 9 x 4.5 – 6 µm., (6-) 8-17(-21) x 3.5-5(-6) µm. y 12-25 (-29) x 3-5 µm.,
respectivamente (Bensch et al., 2010). De acuerdo con lo anterior,
C. lycoperdinum es posiblemente la identidad del hongo que causa la Roña de la
gulupa en la región del Sumapaz, y no C. cladosporioides y C. oxysporum sensu
estricto, como ha sido reportado para cultivos de maracuyá y gulupa en Brasil y
Australia, respectivamente (Barreto et al., 1996; Persley, 1993).
La discrepancia entre los genes actina y Factor de elongación 1 – alfa, basado
en la alta identidad de las secuencias con C. lycoperdinum y C. acaliphae,
respectivamente, sugiere la inclusión de diferentes marcadores en el análisis
taxonómico de aislamientos para la definición de especies dentro del género
Cladosporium, incluyendo morfológicos y biológicos (Taylor et al., 2000; Schubert
et al., 2007; Bensch et al., 2010)
Este es el primer estudio que sugiere hasta nivel de especie la identidad del
agente causal de la enfermedad en Colombia, y el cual es realizado teniendo
como base aislamientos evaluados por su patogenicidad en el cultivo,
constituyéndose en un hallazgo importante al esclarecer la etiología de la
enfermedad (usualmente atribuida a Colletotrichum), requerida para proponer y
formular estrategias de manejo, además de ser la base para futuras
investigaciones en epidemiología, selección de materiales por resistencia, análisis
de la eficacia de fungicidas, estructura genética del patógeno, entre otras.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
39
2. Capítulo 2
Determinación de la patogenicidad de Cladosporium en gulupa
INTRODUCCIÓN
Las frutas de la pasión pertenecen al género Passiflora L. (familia Passifloraceae)
el cual tiene una amplia base genética. Algunas especies silvestres permanecen
sin domesticar, otras son cultivadas como plantas ornamentales, para alimento
(Cunha, 1996; Manica, 1997) y propósitos médicos para tratar la ansiedad, el
insomnio, bronquitis, asma e hipertensión (Zibadi y Watson, 2004). La mayoría de
especies de Passiflora son originarias de las regiones tropical y subtropical de Sur
América, considerándose a Brasil como el centro de diversidad de Pasifloraceae
(Cunha, 1996; Manica, 1997). De las 400 especies conocidas de Passiflora, entre
50 y 60 son comestibles. La mayoría de estas especies son desconocidas fuera
de su centro de origen y unas pocas especies son económicamente importantes,
dentro de las cuales se incluyen Pasiflora edulis forma botanica flavicarpa, P.
edulis f. edulis Sims. y P. alata Dryand (Donadio, 1983).
La fruta de la pasión púrpura (P. edulis f. edulis) es una planta perenne y
enredadera nativa de Sur América, la cual es ahora cultivada alrededor del
mundo y usada extensivamente como ingrediente de bebidas, ensaladas,
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
40
cocteles de frutas y postres. Aparte de Suramérica, las áreas más importantes de
producción de gulupa son Sur África, India, Malasia, Australia, Nueva Zelanda y
Hawai (Ulmer y Mac Dougal, 2004). En Colombia, la producción de gulupa se
concentra en los departamentos Cundinamarca, Antioquia, Boyacá, Quindío,
Huila y Tolima (ICA, 2006).Sin embargo, el área cultivada con esta especie ha
venido disminuyendo en los últimos años por problemas fitosanitarios,
principalmente enfermedades, como ha sido reportado en la región del Sumapaz
en los municipios de Venecia, Granada, San Bernardo y Tibacuy (Cundinamarca).
Las enfermedades reportadas en esta región y de mayor limitación en la
producción de gulupa son ocasionadas por diferentes grupos de patógenos,
entre los que se incluyen virus como Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean
MosaicVirus SMVA, Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV, asociados a
mosaicos y deformaciones en frutos y hojas. Otras enfermedades igualmente
importantes son las denominada Mancha de aceite ocasionada por Xanthomonas
axonopodis, el Marchitamiento vascular y Pudrición del cuello de la raíz por
especies de Fusarium, y la Roña de la gulupa con etiología en estudio (Camelo,
2010; Benitez, 2010; Ortiz et al., 2010).
La Roña del maracuyá es ocasionada por C. cladosporioides y C. herbarum en
Brasil (Barreto et al., 1996) y C. oxysporum en Zimbabwe y Australia (Bates,
1954; Persley, 1993) y afecta principalmente tejidos jóvenes de hojas, ramas,
zarcillos, botones florales y frutas. Los síntomas sobre hojas son pequeñas
manchas redondas de 3-6 mm. en diámetro, translucidas pero después llegan a
ser necrótica, de color gris en el centro, lo cual corresponde a la fructificación del
hongo. Las lesiones pueden perforar las hojas (absición) ó causar deformaciones
cuando ocurren en las nervaduras. Manchas similares pueden aparecer sobre
sépalos de botones, en flores abiertas y en ramas. Como el tejido forma cicatriz,
las ramas llegan a ser débiles y se rompen por acción del viento. En frutos
pequeños, los síntomas aparecen como manchas circulares, pequeñas, oscuras y
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
41
ligeramente hundidas de 5 mm. en diámetro. En frutos grandes, las lesiones
sobre la epidermis de la fruta crecen y llegan a ser de aspecto corchoso,
prominentes de color café, pero no alcanzan el interior de la fruta, y
consecuentemente, no afectan la calidad del jugo (Manicom et al., 2003;
Yamashiro, 1991). En Australia, la Roña de la gulupa es una enfermedad con
mayor intensidad en épocas con temperaturas bajas (20ºC) y alta humedad
relativa, especialmente en invierno (Rheinlander, 2010).
Cladosporium es un género de hongos ampliamente distribuido en el mundo, con
importantes especies fitopatógenas como Cladosporium cucumerinum
(Kwon et al., 1999), Cladosporium herbarum (Kwon et al., 2000; Kwon et al.,
2001; Abdel-Motaal et al., 2009), Cladosporium cladosporioides (Briceño y
Latorre, 2008) y Cladosporium fulvum (Agrios, 2005). El conocimiento actual
sobre la interacción planta hospedante - Cladosporium es el resultado de un
amplio número de investigaciones en el modelo de estudio C. fulvum- tomate,
especialmente en el análisis de la composición proteica del espacio apoplástico
de hojas de tomate infectadas con el hongo, con énfasis en la identificación de
proteínas de avirulencia raza-especifica (Avrs) que son secretadas por el hongo
durante la infección. Diez proteínas secretadas por C. fulvum durante la
colonización del hospedante han sido caracterizadas, cuatro proteínas efectoras
Avr2, Avr4, Avr4E, Avr9 y seis extracelulares Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6, y
Ecp7 (van Kan et al., 1991; van den Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994;
Laugé et al., 2000; Luderer et al., 2002; Westerink et al., 2002; Bolton et al.,
2008).
Debido a que se ha observado alta expresión de estas proteínas efectoras al
inicio de la infección, se ha sugerido que ellas juegan un rol en el establecimiento
de la enfermedad (Thomma et al., 2005; Kooman – Gersmann et al., 1997).
Durante la infección Avr2 inhibe al menos cuatro cisteinas proteasas de tomate,
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
42
incluyendo Rcr3, Pip1, aleurain y TDI65, importantes para la defensa basal del
hospedante (Stergiopoulos y De Wit, 2009); mientras que Avr4 contribuye a una
completa virulencia, protegiendo las hifas del hongo contra la hidrólisis por
quitinasas de la planta (Van den Burg et al., 2006; Van Esse et al., 2007). Avr9 es
altamente expresado en la interacción compatible, con una máxima expresión a
los 9 días posterior a la inoculación (De Wit, 1997) y es más relacionado con el
inhibidor carboxipeptidasa aislado de plantas, aunque no tiene la actividad
inhibitoria de carboxipeptidasa (Wubben et al., 1996).
En Colombia, el manejo de enfermedades en el cultivo de gulupa, incluyendo la
Roña, ha sido limitado por el desconocimiento de los agentes causantes, y en
aproximación a la etiología, el diagnóstico ha sido basado en aislamientos en
placas de agar. Debido a que la Roña es un factor limitante en la producción
exportable de la fruta, es necesario determinar el agente causante de la
enfermedad mediante un proceso riguroso de diagnóstico, que incluya la
evaluación de la patogenicidad de aislamientos en el hospedante, siguiendo los
postulados de Koch. Basado en lo anterior, se planteó como objetivo de este
estudio determinar la patogenicidad del agente etiológico asociado con la Roña
de la gulupa.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
43
2.1 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1.1 Localización
El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de fitopatología e
invernaderos de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional de
Colombia, sede Bogotá. En los invernaderos, los registros de temperatura y
humedad relativa indicaron valores promedio diarios de 20.2ºC y 46.1%,
respectivamente.
2.1.2 Preparación de inóculo para pruebas de patogenicidad
Un total de 15 aislamientos monospóricos, identificados hasta género como
Cladosporium, fueron cultivados entre 8 - 14 días en SNA (Agar pobre en
nutrientes) a 25ºC. para producir el inoculo requerido en las pruebas de
patogenicidad en condiciones de laboratorio e invernadero. Trascurrido este
tiempo se colectaron las conidias y para cada hongo se preparó una suspensión
conidial ajustada a una concentración de 1 x 106 conidias/mL.
2.1.3 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio
En laboratorio se realizaron pruebas de patogenicidad en frutos en estado de
cuajamiento-crecimiento y hojas jóvenes desprendidos de plantas sanas (Galindo,
2009), los cuales fueron esterilizados superficialmente por inmersión consecutiva
en alcohol al 70%, hipoclorito de sodio al 1% y agua destilada estéril, de acuerdo
con el protocolo de desinfección propuesto por Cai et al., (2009). Posteriormente,
frutos y hojas fueron dispuestos sobre rejillas contenidas en recipientes plásticos
e inoculados individualmente con cinco aislamientos de Cladosporium (FABCl14,
FABCl21, FABCl22, FABCl43 y FABCl45) por los siguientes métodos de
inoculación: T1 Con herida + 6µL. de inóculo, T2 Sin herida + 6µL. de inóculo, y
como controles T3 Con herida + 6µL. de agua destilada estéril y T4: Sin herida +
6µL. de agua destilada estéril. Por cada tratamiento fueron inoculados 4 frutos y
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
44
hojas en dos y tres puntos, respectivamente. Los órganos se incubaron en
cámara de crecimiento a 19ºC./12 h. Luz y 17ºC / 12 h. oscuridad y humedad
relativa mayor al 95%. Los ensayos fueron repetidos dos veces y las variables
evaluadas fueron periodos promedio de incubación y latencia.
2.1.4 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero
En condiciones de invernadero, 15 aislamientos de Cladosporium fueron
inoculados individualmente en frutos en estado de cuajamiento-crecimiento y en
hojas jóvenes completamente expandidas (Galindo, 2009), por los métodos de
inoculación anteriormente mencionados. Por cada aislamiento fueron inoculados
tres frutos y hojas en tres y dos puntos, respectivamente. Posterior a la
inoculación, los órganos fueron cubiertos con bolsas plásticas asperjadas
internamente con agua destilada estéril para proporcionar condiciones óptimas de
humedad relativa (95%) y favorecer la expresión de síntomas de la enfermedad.
Las variables evaluadas fueron periodos promedio de incubación y latencia.
2.1.5 Análisis de Microscopía de Barrido Electrónico de hojas inoculadas
artificialmente con Cladosporium
Hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium fueron analizadas
por microscopía de barrido electrónico. Para tal fin, cortes de 1 cm2 de tejido
foliar con y sin síntomas de roña fueron fijados en glutaraldehido al 2,5%,
deshidratados por pases consecutivos de 15 minutos en alcohol etílico al 25, 50,
70, 90 y 100%, secados en punto crítico por 2 horas y orificados por 30 minutos
en aleación oro/paladio. Finalmente, las imágenes de los cortes fueron
capturadas en un microscopio de barrido electrónico.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
45
2.1.6 Análisis estadístico
Con los datos de periodos de incubación y latencia registrados en condiciones de
invernadero, se realizó dos análisis de varianza (siguiendo un Diseño
Completamente al Azar) para establecer diferencias estadísticas entre
aislamientos inoculados en hojas y frutos. Igualmente, se realizó pruebas de
comparación de medias de Tukey para definir los aislamientos más virulentos.
2.2 RESULTADOS
2.2.1 Pruebas de patogenicidad en condiciones de laboratorio
Frutos de gulupa en estado de cuajamiento-crecimiento mostraron síntomas de
Roña posterior a la inoculación con uno de cinco aislamientos de Cladosporium
(FABCl45), a los 9 y 17 dpi. (periodo de incubación) por los métodos con y sin
herida; mientras que la expresión de signos ocurrió a los 10 y 18 dpi., un día
después de la aparición de los síntomas (Figuras 6, 7). El síntoma observado en
frutos inoculados corresponde al estado intermedio de la enfermedad,
denominado chancro, a partir del cual no hubo evolución al estado de Roña
como ocurre en condiciones de campo. En frutos con expresión de síntomas se
evidenció un hundimiento progresivo del tejido afectado, resultado de la
degradación de células epidermales e hipodermales en el exocarpo y
esclerotizadas en el mesocarpo, como se sugiere en el capítulo 3.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
46
Figura 6. Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados con herida en laboratorio. A. 3 dpi., B. 5 dpi., C. 7 dpi., D. 9 dpi., E. 10 dpi. y F. 11 dpi.
Figura 7. Secuencia de síntomas de Roña en frutos inoculados sin herida en laboratorio. A. 9 dpi, B. 10 dpi, C. 11dpi, D. Control, E. Reaislamiento del patógeno en PDA, F. Control.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
47
En hojas de gulupa se reprodujeron los síntomas de la enfermedad con dos de
cinco aislamientos de Cladosporium evaluados (FABCl14 y FABCl22). Los
síntomas de la enfermedad aparecieron a los 8 y 9 dpi. por los métodos con y sin
herida, respectivamente, lo que indica un retraso en el periodo de incubación en
hojas inoculadas por el segundo método; mientras que la expresión de signos se
presentó a los 10 y 11 dpi., dos días después de la ocurrencia de lesiones
iniciales. La enfermedad solo se presentó cuando se inoculó en el lado abaxial de
las hojas y se inició con la aparición de manchas pequeñas e irregulares de color
café en las superficies adaxial y abaxial (Figura 8A). Posteriormente, las manchas
empezaron a coalescer hacia el día 11 posterior a la inoculación, formándose una
sola mancha de color café sobre la cual se hizo visible la esporulación gris a
verde oliva del hongo a los 12 -13 dpi. Dos días después, la lesión tomó un color
verde en la periferia conforme avanzaba la senescencia de la hoja,
presentándose islas verdes (Figura 8D-F).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
48
Figura 8. Secuencia de síntomas de Roña en hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en laboratorio. A. 9 dpi, B. 11 dpi, C. 13dpi, D. 15 dpi, E. 29dpi, F. hoja inoculada
con síntomas de la enfermedad, G. Reaislamiento deLl patógeno en PDA.
El reaislamiento de los hongos inoculados en hojas y frutos permitió corroborar su
patogenicidad, luego de recuperar en PDA a Cladosporium (Figura 7E, 8G);
mientras que en hojas y frutos control inoculados con agua destilada estéril no
hubo expresión de síntomas, ni tampoco crecimiento de microorganismos en
placas de agar como era de esperarse (Figura 7F), confirmando así los
postulados de Koch.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
49
2.2.2 Pruebas de patogenicidad en condiciones de invernadero
En hojas jóvenes completamente extendidas se inició el desarrollo de síntomas
entre 7 y 11 días posterior a la inoculación con herida, y expresión de signos del
patógeno un día después de la aparición de lesiones iniciales; mientras que sin
herida los periodos de incubación y de latencia se retrasaron entre 2 y 3 días.
En plantas completas, el avance de síntomas en hojas mostró correspondencia
con lo registrado en las pruebas de patogenicidad en laboratorio, observándose
lesiones iniciales como manchas circulares de color café oscuro a claro
(necrosis), levemente hundidas, sobre las cuales la esporulación del hongo se
hace visible en el centro. En condiciones de invernadero se evidenció el
desprendimiento de tejido afectado hacia el día 13 posterior a la inoculación,
fenómeno denominado absición ó perdigoneo y que ocurre en hojas afectadas en
condiciones de campo (Figura 9).
De acuerdo con microfotografías de barrido electrónico, en hojas de gulupa
inoculadas artificialmente con Cladosporium, la topografía de la lámina foliar es
alterada en estados intermedios de la enfermedad, observándose en el centro de
la lesión una abundante esporulación del hongo y en menor extensión en la
periferia. Sobre la lesión se observó la emergencia de conidióforos solitarios en
sitios adyacentes a estomas (Figuras 10, 11, 12, 13).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
50
Figura 9. Secuencia de síntomas de Roña en hojas de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en invernadero. A. 9 dpi, B. 10 dpi, C. 11 dpi, D. 12 dpi, E. 13 dpi, F. 15 dpi, G-H.
Hojas de gulupa adultas con síntomas de Roña inducidos con y sin herida.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
51
Figura 10. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 230x) de una hoja de gulupa sana, inoculada artificialmente con agua destilada estéril.
Figura 11. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 50x) de una hoja de gulupa con síntomas de roña posterior a la inoculación artificial de Cladosporium.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
52
Figura 12. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 5.000x) de ramoconidias asociadas a síntomas de roña en una hoja de gulupa inoculada artificialmente con Cladosporium.
Figura 13. Fotografía al Microscopio de Barrido Electrónico (a un aumento de 500x) de hifas de conidióforos asociadas a síntomas de roña en una hoja de gulupa inoculada artificialmente con Cladosporium.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
53
En frutos, los síntomas de Roña se reprodujeron entre 6 y 10 días después de la
inoculación con Cladosporium por el método sin herida, e iniciaron con la
formación de manchas y ampollas acuosas de color café, sobre las cuales hubo
expresión de signos (esporulación) del patógeno entre 8 - 12 dpi (Figura 14 A-C).
Tiempo a partir del cual las lesiones empezaron a coalecer resultado del
aumento en el tamaño de las mismas y entre 9 – 12 dpi. se registró un incremento
en la esporulación del hongo, además de la formación de un halo de color verde
en el área periférica de la lesión e infecciones secundarias en otras zonas del
fruto (Figura 14D-G). Las lesiones primarias empezaron a agrietarse en la
periferia a los 13 dpi, observándose internamente una cavidad hueca hacia el día
15 posterior a la inoculación (Figura 9H-J), resultado de la degradación de células
en el mesocarpo, de acuerdo con el estudio histopatológico presentado en el
capítulo 3. Contrario a los ensayos de patogenicidad in vitro, en condiciones de
invernadero las lesiones en estado de chancro evolucionaron a Roña,
acumulándose en la superficie del fruto capas emergentes de corcho a los 23 dpi
(Figura 14K – L).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
54
Figura 14. Secuencia de síntomas de Roña en frutos de gulupa inoculadas artificialmente con Cladosporium en invernadero. A. 6dpi., B. 7dpi., C. 8dpi., D. 9 dpi., E. 10 dpi., F.11dpi., G. 12 dpi., H. 13 dpi., I. 14 dpi., J. 15 dpi., 18 dpi., y 23 dpi.
A B C
D E F
G H I
J K L
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
55
De los 15 aislamientos evaluados por su patogenicidad en condiciones de
invernadero, ocho indujeron síntomas de la enfermedad, registrándose como
patogénicos en hojas y frutos a FABCl14, FABCl21, FABCl22, FABCl51 y
FABCl80, sólo en frutos a FABCl43, FABCl45 y FABCl71 y no patogénicos a
FABCl50, FABCl69, FABCl73, FABCl74, FABCl78, FABCl79. Diferencias
estadísticas en patogenicidad fueron registradas entre aislamientos patogénicos
con relación a los periodos de incubación y de latencia promedio, con
probabilidades de 0,0001 en frutos y 0,0002 en hojas. Los aislamientos más
virulentos fueron FABCl71 en frutos y FABCl22 y FABCl51 en hojas (Figura 15).
Figura 15. Periodos de incubación y de latencia promedio registrados en condiciones de invernadero para aislamientos patogénicos de Cladosporium en frutos (A), y hojas (B).
a
ba ba
bc bc bc
bc c
a a
a
b b
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
56
Al considerar todos los aislamientos patogénicos, los periodos de incubación y de
latencia promedio en condiciones de invernadero fueron 7.7 y 9.7 días en frutos, y
9 y 10 días en hojas, respectivamente.
2.3 DISCUSIÓN
Las pruebas de patogenicidad en condiciones in vitro e invernadero establecen a
Cladosporium como el agente causante de la Roña en gulupa, luego de
reproducirse los síntomas de la enfermedad en hojas y frutos posterior a la
inoculación artificial de aislamientos del hongo, lo cual soporta los resultados del
estudio histopatológico (Capítulo 3), además de ser coherente con los reportes de
la sintomatología y etiología de la enfermedad en Brasil y Australia,
principalmente (Fischer y Rezende, 2008). Las condiciones bajo las cuales hubo
expresión de síntomas sugieren requerimientos altos de humedad relativa (95%),
temperaturas bajas (17 – 20.2°C), y tejidos receptivos al inicio de la infección,
como ha sido reportado en Australia para Cladosporium oxysporum en la fruta de
la pasión púrpura (Rheinlander, 2010). Las heridas pueden favorecer también la
expresión temprana y desarrollo de síntomas en hojas, como se registró en las
pruebas de inoculación con herida, tanto en laboratorio como en invernadero;
mientras que en frutos, la inoculación con heridas resultó en el desarrollo de
síntomas solo en condiciones de laboratorio y no en invernadero donde se
observó respuestas de cicatrización en frutos heridos e inoculados, sin progreso
alguno de la enfermedad.
El desarrollo de síntomas por el método de inoculación sin herida, demuestra que
los aislamientos patogénicos de Cladosporium tienen la habilidad para penetrar,
invadir, reproducirse y diseminarse, cumpliendo de este modo los estados de
desarrollo de la enfermedad (Agrios, 2005). El proceso de penetración es posible
que ocurra posterior a la liberación de enzimas hidrolíticas extracelulares como
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
57
lipasas, pectinasas, celulasas y proteasas, encontradas asociadas a aislamientos
de C. herbarum recuperados de lesiones de Roña en maracuyá en Brasil
(Barbosa et al., 2001).
Lesiones necróticas en hojas y frutos de gulupa podrían estar relacionadas con
producción y liberación de fitotoxinas por parte del patógeno en los sitios de
infección (Upadhyay et al., 1990), las cuales son conocidas en algunos hongos,
incluyendo especies de Cladosporium, como factores de patogenicidad y de
virulencia que inducen necrosis requerida para la colonización, entre las que se
incluyen toxinas no específicas de hospedante como las pyrelequinonas
fotoactivadas por la luz y las toxinas específicas de hospedero (Host Specific
Toxins – HST) que funcionan como determinantes de avirulencia y que inducen
muerte celular programada luego de que son reconocidas por proteínas R de
susceptibilidad bajo un modelo gen por gen. Determinantes de avirulencia
secretados por razas de C. fulvum han sido reconocidos en el espacio apoplástico
de hojas de tomate infectadas por el hongo, e incluyen a Avr2, Avr4, Avr4E, Avr9,
Ecp1, Ecp2, Ecp4, Ecp5, Ecp6, y Ecp7 (Van Kan et al., 1991; Van den
Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994; Lauge et al., 2000; Luderer et al.,
2002; Westerink et al., 2004; Bolton et al., 2008). Sin embargo, en la interacción
Cladosporium-gulupa es posible que participen toxinas no específicas de
hospedante, como Calphostin C, cladochrome, Ent-isophleichrome y
Phleichrome, previamente documentadas en C. cucumerinum, C. cladosporioides,
C. herbarum y C. phlei, respectivamente (Yoshihara et al., 1975; Weiss et al.,
1987; Arnone et al., 1988; Robeson y Jalal, 1992); mientras que producción de
HST no ha sido reportada para especies de Cladosporium, además de que
inducen muerte celular a las 48 horas, un periodo de tiempo por debajo del
periodo de incubación de la enfermedad en gulupa, estimado entre 7 – 11 dpi. en
hojas y 6 -10 dpi. en frutos.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
58
De acuerdo con Walters et al. (2007), el fenotipo de “islas verdes” observado al
inició de la senescencia en hojas desprendidas e inoculadas en laboratorio,
estaría relacionado también con producción de toxinas por Cladosporium, como
ha sido reportado para hongos necrótrofos, incluyendo a Alternaria brassicae en
hojas de canola (Brassica napus). Aunque el concepto clásico de islas verdes ha
sido aplicado para referirse a biótrofos, estos mismos autores afirman que este
fenotipo puede ser inducido también por patógenos necrótrofos, y en este caso se
denomina fenotipo de islas verdes producido por toxinas.
Basado en imágenes de microscopía de barrido electrónico, es posible que el
proceso infectivo de Cladosporium en gulupa, ocurra en algunas etapas como ha
sido descrito para el patosistema C. fulvum – tomate, donde la infección comienza
con la germinación bipolar de la conidia, seguido del recorrido de la hifa sobre la
superficie de la hoja hasta que esta encuentra un estoma abierto, lo que explica el
requerimiento de alta humedad para la infección. Después de 1 – 4 días, la hifa
penetra el estoma y entra al espacio subestomatal, mesofilo esponjoso y se
ramifica a través del apoplasto. Después de 10 – 12 días de pos- infección, el
mesofilo es altamente colonizado y el hongo emerge del estoma. La emergencia
de conidióforos, de acuerdo con la figura 13, ocurre de manera individual en
sitios adyacentes a estomas de hojas de gulupa, lo cual difiere con lo reportado
para C. fulvum en tomate, donde el hongo emerge por estomas en un
agrupamiento coordinado de más de 20 hifas (Oliver et al., 2000)
Contrario a las pruebas de patogenicidad en laboratorio, respuestas de defensa
tardías se evidenciaron en hojas y frutos de gulupa inoculados artificialmente bajo
condiciones de invernadero, y como se menciona en el capítulo 3, formación de
capas de absición y desprendimiento de tejido afectado tomaron lugar en hojas y
formación de capas de corcho y regeneración de células en el mesocarpo y
exocarpo en frutos, lo que indica que las plantas susceptibles de gulupa
despliegan respuestas de defensa estructurales durante el proceso infectivo del
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
59
patógeno. Como ha sido reportado por Mora (2011), en este estudio también se
evidenció que el progreso de lesiones iniciales y evolución de síntomas es
detenido en frutos en estados avanzados de desarrollo, lo cual puede estar
relacionado con la expresión de resistencia ontogénica conforme avanza la
formación y maduración del fruto, posiblemente en respuesta a cambios en la
porosidad de la cutícula, aumento en el contenido de cera epicutícular y a la alta
capacidad para desarrollar respuestas de defensa (Latorre et al., 2010).
Con relación a Cladosporium, los resultados sugieren distintos niveles de
virulencia en las poblaciones del patógeno, basado en los periodos de incubación
y de latencia. Sin embargo, no existe evidencia de que la virulencia diferencial
registrada en este estudio este correlacionada con razas del patógeno, como si
se ha documentado para C. fulvum en tomate (Van Kan et al., 1991; Van den
Ackerveken et al., 1993; Joosten et al., 1994; Laugé et al., 2000; Luderer et al.,
2002; Westerink et al., 2002; Bolton et al., 2008), por lo que se requiere estudios
en esa vía, incluyendo el establecimiento de variedades diferenciales.
Debido a que la enfermedad es un factor limitante en la producción exportable de
gulupa, estrategias de control pueden desplegarse considerando los diferentes
componentes del manejo integrado de enfermedades. En cuanto al control
genético, es posible que exista susceptibilidad diferencial entre materiales de
gulupa en el país, por lo que son necesarios estudios de selección de materiales
por resistencia a la enfermedad, y aunque Ortiz (2010) reportó en su estudio
reducida variabilidad genética, por análisis del ADN de 60 materiales de gulupa
procedentes de Cundinamarca, Boyacá, Huila, Tolima, Quindío y Antioquia,
mediante el empleo de marcadores AFLPs y SSRs, no se conoce si hay
correspondencia entre la baja variabilidad genética reportada y la susceptibilidad
a la enfermedad.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
60
Distintas estrategias de control cultural podrían ser consideradas para el manejo
de la enfermedad en campo, como la remoción de órganos con síntomas iniciales
de Roña antes de que esporulación del hongo ocurra, lo cual puede contribuir a
evitar la diseminación de inoculo secundario dentro del campo, el cual es
fácilmente dispersado por el viento y la lluvia (Rheinlander, 2010). Otra medida
son las podas sanitarias poco severas en cuanto a que pueden crear condiciones
desfavorables para el patógeno al incrementar la aireación dentro del cultivo,
aunque lesiones necróticas que se crean alrededor de los sitios de corte puede
proveer un sustrato para el establecimiento y colonización del hongo, como se
cree ocurre luego de la remoción foliar severa en plantaciones de uva en Chile
para los cultivares cabernet sauvignon y otros cultivares para la producción de
vino rojo, afectados por C. cladosporioides y C. herbarum (Latorre et al., 2010).
Estos mismos autores sugieren que la remoción foliar severa en uva favorece el
incremento de poblaciones epifitas de Cladosporium en diferentes vías, por daño
y necrosis asociada a lenticelas, aumento en la diseminación del inoculo por
acción del viento y por incremento de la radiación solar en el cultivo, la cual no
afecta la supervivencia del hongo dada la producción de pigmentos como
melanina en la pared celular de conidióforos y conidias, y que por el contrario
puede favorecer la activación de toxinas pyrelequinonas.
Cepas comerciales de Trichoderma podrían ser evaluadas y empleadas en el
manejo de la enfermedad en campo como ha sido reportado por Barbosa et al.
(2001). Estos autores evaluaron el efecto antagónico de T. polysporum, T.
koningii, T. viride y T. harzianum sobre el biocontrol de aislamientos de C.
herbarum asociados a Roña en maracuyá, encontrándose una efectividad
antagónica en todas las especies biocontroladoras evaluadas excepto T. koningii.
De otro lado, programas de control químico anti-resistencia pueden ser
desarrollados para el manejo de la enfermedad en campo a través del empleo de
fungicidas estándar, como oxicloruro de cobre, mancozeb, iprodione, azoxystrobin
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61
y acybenzolar, los cuales han resultado en un mayor nivel de control de la
enfermedad en Australia, por reducir significativamente la incidencia y severidad
de la Roña en aproximadamente un 30 y 80%, respectivamente, comparado con
fungicidas convencionales (Wilingham et al., 2002).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
62
3. Capítulo 3
Análisis de la sintomatología de la Roña en gulupa (Pasiflora
edulis f. edulis)
INTRODUCCIÓN
La fruta de la pasión pertenece a la familia Passifloraceae, la cual es
representada por 14 géneros. Passiflora, es el género representativo de la familia
y constituye cerca de 580 especies distribuidas en las regiones tropical y
subtropical (Silva y Sao José, 1994). El término fruta de la pasión se refiere
exclusivamente a la especie P. edulis Sims., la cual contiene dos formas
botánicas comercialmente importantes, la amarilla (P. edulis f. flavicarpa
Degener) y la púrpura ó gulupa (P. edulis f. edulis.). La fruta de la pasión púrpura
es relativamente pequeña en tamaño (4-9 cm. de longitud y 3,5-7 cm. de
diámetro), tiene epidermis de color púrpura y semillas negras
(Bora y Narain, 1997). El cultivo entra en producción al primer año, tiempo a partir
del cual el incremento en el rendimiento es continuo hasta el quinto y sexto año.
En este punto la producción disminuye gradualmente y las plantaciones deben
ser renovadas por razones económicas, aunque las plantas pueden vivir mucho
más tiempo (Ulmer y MacDougal, 2004).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
63
En Europa la fruta de P. eduis f. edulis es la más conocida, debido a su
agradable sabor para consumo como jugo fresco (Singh et al., 1991; Ulmer y
MacDougal, 2004). Sin embargo, ha sido usada ampliamente en medicina
tradicional en Sur América para tratar la ansiedad, insomnio, asma, bronquitis e
infección en el tracto urinario, debido a que extractos de diferentes partes de la
planta contienen flavonoides además de otros compuestos, los cuales son
reconocidos por desempeñar también un papel favorable en la reducción de
enfermedades cardiovasculares (Zibadi y Watson, 2004; Slayback y Watson,
2006; Zibadi et al., 2007).
.
La fruta de la pasión púrpura es la forma más tolerante al frío y crece muy bien
entre 600-2000 msnm. Sin embargo, en Kenia la fruta de la pasión púrpura es
cultivada exitosamente a una altitud de 2500 msnm. Las temperaturas frías son
favorables para iniciar la floración y fructificación (18-23ºC.), mientras que
temperaturas relativamente altas (23-33ºC) son necesarias para estimular la
producción de jugo (Wasilwa et al., 2004).
Los mayores productores de frutas de la pasión se encuentran en Sur América,
principalmente Brasil, Colombia, Perú y Ecuador (Ruggiero et al., 1996), aunque
plantaciones comerciales de frutas de la pasión son encontradas en Australia,
Hawai, E.E.U.U., India, Nueva Guinea, Kenia, Sur África, Sri Lanka y Costa Rica
(Kluge, 1998). En Colombia los departamentos productores de la fruta de la
pasión púrpura son Cundinamarca, Antioquia y Boyacá (CCI, s.f). En
Cundinamarca, la región del Sumapaz registra un área importante con cultivos de
gulupa, estimándose aproximadamente 500 ha. para el año 2005, con una
producción de 6.000 t. año (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2005). A
partir de ese año, el área sembrada aumentó paulatinamente en respuesta a la
demanda creciente de frutas de la pasión en el mundo (Akamine et al., 1954;
Pires y Sao José, 1994) y entre 2007 y 2010 la producción exportable de gulupa
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
64
pasó de 523 a 2.294, 28 t., siendo los principales importadores Holanda,
Alemania, Francia, Bélgica y Luxemburgo, Reino Unido y Suecia (Agronet, 2011).
El aumento en el área sembrada con gulupa ha traído consigo un incremento de
los problemas fitosanitarios, incluyendo enfermedades, entre las que se destacan
la Mancha de aceite por Xanthomonas axonopodis (Benítez y Hoyos, 2009;
Benítez, 2010), Virosis por Cucumber Mosaic Virus CMV, Soybean Mosaic Virus
SBMV, Cowpea Aphid-Borne Mosaic Virus CoABMV y potyvirus (Camelo, 2010),
Marchitamiento vascular y Pudrición del cuello de la raíz por especies de
Fusarium (Ortiz, 2010), y la Roña de la gulupa cuya etiología se encuentra en
estudio, aunque es asociada con Cladosporium y Colletotrichum basado en
aislamientos en placas de agar. Esta última enfermedad también conocida como
Pudrición de Cladosporium ha sido reportada en Australia (Simmonds 1932),
Zimbabwe (Bates, 1954), Brasil (Bitancourt, 1935) y Venezuela (Rondón et al.,
1995), donde es limitante por causar pérdidas significantes cuando no es
controlada. En vivero puede causar muerte de plantas, mientras que en
condiciones de campo ocasiona la muerte de ramas, retraso de la floración y
producción, además de afectar la calidad del fruto, y aunque el hongo no causa
un deterioro a la pulpa, la apariencia y aceptación de la fruta en el mercado es
reducida (Goes, 1998).
En países como Kenia, la baja productividad en este cultivo es debida
principalmente a enfermedades como la Mancha café Alternaria passiflorae,
Marchitamiento vascular Fusarium oxysporum f. sp. Passiflorae (Gardner, 1989) y
virus woodiness causado por los virus Cowpea Mosaic Virus (CoMV) y Cucumber
Mosaic Virus (CMV) transmitidos por áfidos. Estas enfermedades han reducido la
vida productiva de la fruta de la pasión de cinco a dos años (Fushimi et al., 2001)
y pérdidas de producción del 40 – 100% (Wasilwa et al., 2004).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
65
Dada la importancia económica que tiene la Roña de la gulupa en la producción
exportable de la fruta, es necesario conocer la sintomatología y etiología como
primera medida para el manejo de la enfermedad, considerándose para tal fin
diferentes vías de diagnóstico fitopatológico. El presente capítulo tiene como
objetivo caracterizar la sintomatología de la Roña en el cultivo de Gulupa.
3.1 MATERIALES Y MÉTODOS
3.1.1 Localización
El presente estudio se realizó en la región del Sumapaz en las zonas productoras
de gulupa de los municipios de Granada, San Bernardo, Venecia y Tibacuy
(Cundinamarca), y en el laboratorio de fitopatología de la Facultad de Agronomía
de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.
La región del Sumapaz fue considerada como área de estudio debido a que es la
zona de mayor producción de gulupa en el departamento de Cundinamarca,
dadas las condiciones óptimas para el desarrollo de la especie, con temperatura
promedio diaria de 17.2°C, humedad relativa promedio diaria de 82.5% y
precipitación promedio mensual de 74.3 mm (Mora, 2011).
3.1.2 Muestreo de material vegetal con síntomas de Roña
En los municipios antes mencionados, se colectó entre junio de 2009 y octubre de
2010 material vegetal de gulupa con síntomas de Roña. Hojas, ramas y frutos con
lesiones iniciales y avanzadas fueron tomados de plantas identificadas por
presentar la enfermedad, empacados cuidadosamente y llevados al laboratorio
de fitopatología de la Universidad Nacional para su posterior procesamiento y
análisis.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
66
3.1.3 Caracterización de síntomas de Roña
La sintomatología de la enfermedad se caracterizó macro y microscópicamente
en hojas, ramas y frutos. Macroscópicamente, por observación y descripción
directa de lesiones iniciales, intermedias y avanzadas. Para tal fin, se evaluó el
color, forma, elevación y aspecto de las lesiones. Microscópicamente por análisis
histopatológico de muestras con lesiones de Roña, las cuales fueron preparadas
a través del siguiente procedimiento: 1) Fijación de secciones de tejidos con y sin
síntomas de Roña en una solución de formalina- ácido acético y alcohol - FAA, 2)
Deshidratación por inmersión sucesiva de los tejidos en alcohol al 80, 90, 96 y
96%, 3) Aclarado de tejidos, mediante pases consecutivos por alcohol etílico puro
y ter-butanol, 4) Imbibición de tejidos en parafina fundida por 24 horas a 56ºC., 5)
Confección de bloques, 6) Obtención de cortes en micrótomo, con grosor de 7μm.
y 7) Montaje en láminas portaobjetos y tinción de tejidos con safranina y fast
green. Posteriormente se realizó la captura y análisis de imágenes en
microscopio de luz.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
67
3.2 RESULTADOS
3.2.1 Caracterización de síntomas de Roña
La Figura 1, ilustra los síntomas correspondientes a los estados tempranos e
intermedios de la enfermedad a nivel de frutos, en los que se observa lesiones
iniciales acuosas de color café (ampollas) que pueden o no desintegrarse (Figura
16A). Por ambos estados, se da origen a lesiones levemente hundidas que más
tarde coalescen y evolucionan a chancros, sobre los cuales se evidencia
esporulación verde oliva (Figura 16B). En frutos, donde no evoluciona la
enfermedad, se observan manchas circulares ligeramente hundidas, con bordes
definidos, de color verde en la periferia y café (necrosis) en el centro (Figura
16C).
De acuerdo con la anatomía del fruto de gulupa, en el estado de chancro la
enfermedad compromete tejidos y estructuras del exocarpo (incluyendo tricomas,
epidermis y células colenquimáticas de la hipodermis) y mesocarpo
(esclerénquima) como se observa en cortes longitudinales de frutos en el sitio de
la lesión, donde se origina una depresión del tejido (Figura 16D – E). La figura
16F-H, muestran micelio, conidióforos, ramoconidias, conidias intercalar y
terminal de Cladosporium asociadas a tejido necrótico en chancros, y en ningún
caso se encontró estructuras de Colletotrichum, como acérvulos ó conidias.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
68
Figura 16. Síntomas iniciales e intermedios de Roña en frutos. A. Estado inicial de la Roña en frutos de gulupa (formación de ampolla de aspecto acuoso), B. Estado intermedio de la enfermedad denominado chancro por desarrollo de lesiones hundidas, C. Fruto con lesiones de Roña que no evolucionan. D y E. Cortes longitudinales de frutos con síntomas de chancro a 10 X., F. Conidióforos de Cladosporium asociados a tejidos necróticos en chancros 40X., G. Conidióforo de Cladosporium soportando ramoconidia 100X. H. Conidias intercalar y ramoconidias asociadas a chancros.
A nivel de frutos, el estado más avanzado de la enfermedad se observa como una
lesión erupente de aspecto corchoso, resultado de la acumulación de capas de
tejido necrótico en la superficie. Las lesiones pueden presentar bordes regular e
irregular, de color café claro en el centro y verde en la periferia (Figura 17A-B).
Por análisis histopatológico de frutos con síntomas avanzados de Roña, se
evidenció la regeneración de tejidos afectados por el patógeno en etapas
tempranas e intermedias de la enfermedad, observándose en el sitio de la lesión
el restablecimiento de los tejidos en el mesocarpo (células esclerotizadas) y en el
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
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exocarpo (células epidermales e hipodermales en la epidermis), como se observa
en la figura 17C-D. Sobre el exocarpo regenerado se observa la acumulación de
capas de tejido necrótico que albergan estructuras del hongo, principalmente
micelio (Figura 17E-F).
Figura 17. Síntomas avanzados de Roña en frutos. A y B. Frutos de gulupa con lesiones corchosas en la superficie, C y D. Cortes longitudinales de frutos evidencia la regeneración de tejidos en el mesocarpo y exocarpo 10 y 40X (TN-C= Tejido necrótico de aspecto corchoso, EP= Epidermis, CE= Células esclereidas), E. Micelio de Cladosporium asociado a tejido corchoso en el sitio de la lesión MI, 100X. F. Tejido corchoso constituido de células muertas-CM, 100X.
En hojas de gulupa, la enfermedad se manifiesta como lesiones circulares, de
color verde en la periferia y café en el centro donde toma lugar la esporulación del
hongo (Figura 18A-B). En este órgano y en estados avanzados de la enfermedad,
el tejido afectado se desprende originando perforaciones a lo largo de la lámina
foliar (absición). La figura 18C, ilustra el arreglo anatómico de los tejidos en un
corte transversal de una hoja sana, en la que se observa epidermis
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
70
uniestratificada en las superficies adaxial y abaxial y entre ellas parénquimas en
empalizada y esponjoso. De acuerdo con la anatomía de la hoja de gulupa, el
patógeno degrada las células epidermales y los parénquimas en empalizada y
esponjoso como se ilustra en la figura 18D-E, lo que resulta en la formación de
una capa delgada de tejido necrótico que soporta estructuras de Cladosporium, y
que posteriormente se desprende de la hoja.
Figura 18. Síntomas de Roña en hojas de gulupa. A y B. Síntomas de Roña en las superficies adaxial y abaxial de la hoja, C. Corte transversal de hoja sana de gulupa 40X. (EP=Epidermis, PE= Parenquima en empalizada, PES= Parenquima esponjoso), D. Corte transversal de hoja de gulupa con síntomas de Roña 40X. (DEP=Degradación de epidermis, DPE= Degradación de parenquima en empalizada, DPES= Degradación de parenquima esponjoso), E. Lámina foliar degradada en el sitio de la lesión 10X. (DMF= Degradación de mesofilo foliar), F. Estructuras de Cladosporium asociadas a lesiones de Roña en hojas 100x.
En ramas, los síntomas iniciales de la enfermedad se observan como manchas
circulares, levemente deprimidas y de color café, las cuales en un estado
intermedio crecen y coalescen. Posteriormente, las lesiones se tornan hundidas
con presencia de signos de Cladosporium, evidenciándose daño a nivel de
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
71
tejidos internos (Figura 19A-B). La figura 19C, muestra un corte transversal de
una rama de gulupa e ilustra la anatomía y morfología de este órgano, constituido
por epidermis uniestratificada, cortex, cilindros vasculares, cambium y médula.
En ramas con la enfermedad, el daño causado por el patógeno puede extenderse
desde la epidermis hasta los cilindros vasculares y posiblemente a la médula
(Figura 19D-E).
Figura 19. Síntomas de Roña en ramas de gulupa. A y B. Lesiones intermedias y avanzadas de Roña en ramas, C. Corte transversal de una rama sana de gulupa, 10X., D. Corte transversal de una rama de gulupa con síntomas de Roña 40X., E. Estructuras de Cladosporium asociadas a lesiones de Roña en ramas de gulupa 100X.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
72
3.3 DISCUSIÓN
Los síntomas de Roña en gulupa muestran correspondencia con la
sintomatología de la enfermedad en maracuyá (Fischer y Rezende, 2008), dadas
las características de las lesiones y el progreso de las mismas en cada uno de los
órganos evaluados. La muerte de tejidos por colonización intracelular,
evidenciada por análisis histopatológicos, podría estar relacionada con la
producción y liberación de toxinas durante la patogénesis en frutos, hojas y ramas
de gulupa, como ha sido documentado para C. cucumerinum, C. cladosporioides,
C. herbarum y C. phlei, al producir toxinas del tipo perylenequinonas como
Calphostin C, cladochrome, Ent-isophleichrome y Phleichrome, respectivamente.
Estas toxinas son producidas por miembros de Ascomycota clasificados dentro de
los Phyllum Loculoascomycetes, Pyrenomycetes y Discomycetes. Estos
compuestos absorben la energía de la luz y generan especies reactivas de
oxígeno que dañan las células del hospedante, dada la sensibilidad de
macromoléculas como lípidos, proteínas y ADN a estas moléculas (Yoshihara et
al., 1975; Weiss et al., 1987; Arnone et al., 1988; Robeson y Jalal, 1992). Sin
embargo, toxinas específicas de hospedero (Host Specific Toxins) podrían
también estar jugando un papel importante en el desarrollo de la enfermedad,
como ha sido reportado en Mycosphaerellaceae, un clado hermano de
Cladosporium (Crous, 2007a, b). Las toxinas HST interfieren con la inducción de
respuestas de defensa ó inducen respuestas de defensa mediadas por muerte
celular programada en orden para generar necrosis requerida para la patogénesis
y virulencia (Friesen y Faris, 2008; Walton, 1996; Wolpert et al. 2002).
Mediante análisis histopatológico se observó colapso celular en tejidos afectados
conforme avanza el crecimiento del patógeno en los órganos evaluados. Sin
embargo, para hojas y frutos las imágenes sugieren la expresión de respuestas
de defensa por parte de la planta. En hojas el síntoma más avanzado de la
enfermedad, denominado perdigoneo, es resultado de la formación de capas de
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
73
absición a lo largo del mesófilo foliar, que de acuerdo con Agrios (2005) ocurre en
hojas jóvenes y activas de algunas especies vegetales después de la infección
por un patógeno, y consiste en la digestión de la laminilla media entre dos capas
de células adyacentes al sitio de la lesión. De esta manera, la planta aísla el área
de infección del resto de la hoja y gradualmente el tejido donde crece el patógeno
es desprendido.
Contrario a lo que sucede en hojas, en frutos el avance del patógeno hacia el
endocarpo es restringido por la formación de capas corchosas en el mesocarpo
en el estado de chancro. De acuerdo con Vance (1980), uno de los compuestos
que podría estarse depositando en el sitio de la lesión luego del ataque del
patógeno es lignina, un biopolímero resistente a la degradación por muchos
microorganismos y que es formado comúnmente en respuesta a la penetración
microbial y a daños mecánicos, como es reportado por Geballe y Galston (1983)
en Hierba cinta (Phalaris arundinacea) y trigo (Triticum aestivum), donde papilas
con contenidos de lignina son inducidas durante la penetración de tejidos por
Helminthosporium avenae y Botrytis cinerea, respectivamente. Woo et al., 2004
investigaron aspectos ultraestructurales de la interacción planta patógeno en
frutos y hojas de mandarina (Satsuma mandarin) con síntomas de Roña por
Elsinoe fawcettii. En este estudio, la infección indujo la formación de capas de
corcho debajo de los sitios infectados, las cuales estuvieron compuestas de
células compactas del hospedante con pared celular compleja y lamelación
alterna, indicando tejido lignosuberizado en la peridermis herida. Además, el
tejido del hospedante por debajo de la capa de corcho no fue invadido por hifas,
lo que sugiere que las capas de corcho en la peridermis actúan como una barrera
protectora que restringe el crecimiento de E. fawcettii en lesiones de Roña.
El análisis histopatológico en gulupa da evidencia del restablecimiento de tejidos
en el mesocarpo posterior a la estimulación de la división celular que toma lugar
debajo de la capa corchosa emergente, siguiendo posiblemente un proceso de
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
74
histogenia semejante al que ocurre en tubérculos de papa con síntomas de Roña
por Streptomyces scabies. Según Powell (2008) la Roña de la papa puede
iniciarse en lenticelas del tubérculo, en las cuales el meristemo es estimulado y
por división da origen a un tipo de células elongadas que son invadidas por el
parasito y posteriormente colapsadas; mientras tanto su contenido y pared toman
un color café, dando a la Roña su color característico. La destrucción de las
células elongadas produce lenticelas anchas con merístemos menos activos que
originan células hijas que cesan la elongación y llegan a ser suberizadas,
formándose así un tejido compacto (barrera de corcho) y más tarde
desprendimiento de células externas infectadas que permanecen adheridas al
tejido sano.
La fisiología de la planta aún cuando no fue objeto de estudio, posiblemente es
afectada en mayor ó menor extensión en hospedantes con síntomas de Roña. A
nivel de hojas, la enfermedad lleva a una reducción del área fotosintéticamente
activa, por muerte celular y pérdida de tejido posterior a la formación de capas de
absición (Bitancourt, 1935). A pesar de que no existen estudios sobre el efecto de
la enfermedad en la producción de gulupa, el daño por el patógeno puede ser
considerable en condiciones ambientales favorables, con alta presión de inóculo y
con presencia de hojas en estados fenológicos receptivos, aunque en hojas
puede verse de alguna manera compensado el daño dada la alta producción foliar
de esta especie vegetal, conocida por presentar un crecimiento indeterminado.
La enfermedad puede tener efectos mayores en otros órganos, como en ramas,
donde la funcionalidad de los cilindros vasculares es comprometida por
degradación de células del xilema y floema, lo cual afecta negativamente la
traslocación de agua, nutrientes y fotoasimilados, además de la estabilidad de
este órgano cuando el patógeno alcanza tejidos en la médula, lo que resulta en
su rompimiento y desprendimiento por acción del viento (Yamashiro, 1991). En
frutos, la enfermedad compromete la estabilidad de los mismos por degradación
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
75
de células epidermales e hipodermales en el exocarpo y esclereidas en el
mesocarpo, y en esa vía la producción es reducida por pérdida de la calidad
estética (Goes, 1998), limitándose así su comercialización en el mercado de
exportación.
Como es reportado por Fischer y Rezende (2008), sobre las lesiones de Roña se
encontró asociada esporulación fungal de color verde oliva, que basado en
características microscópicas corresponde a ramoconidias, conidias intercalar y
terminal de Cladosporium, lo que sugiere a este hongo como agente causante
de la Roña de la gulupa. Lo anterior es coherente con otros reportes, debido a
que en Brasil se ha encontrado a C. cladosporioides y C. herbarum como agentes
causante de la enfermedad en maracuyá (Barreto et al., 1996) y C. oxysporum en
Zimbabwe y Australia (Bates, 1954; Persley, 1993).
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
76
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
Las colonias de Cladosporium asociadas a Roña en gulupa presentan
micelio algodonoso ó aterciopelado, con coloración olivacea-gris y bordes
de color blanco en PDA, gris-humo en AEM y verde olivaceo en AA, con
conidióforos macro y micronematosos, ramoconidias primarias poco
frecuentes, ramoconidias secundarias, conidias intercalar y terminal con
ornamentación de pared lisa en SNA.
Los análisis morfológico y molecular por ITS y actina mostraron
correspondencia, lo que sugiere a Cladosporium cladosporioides sensu
lato y posiblemente C. lycoperdinum sesu estricto como la identidad
taxonómica de los aislamientos evaluados.
Cladosporium, es el agente causante de la Roña en gulupa, luego de
reproducirse los síntomas de la enfermedad con la inoculación artificial de
aislamientos del hongo en hojas y frutos bajo condiciones de laboratorio e
invernadero.
La Roña de la gulupa en frutos, hojas y ramas muestra correspondencia
con la sintomatología de la enfermedad en maracuyá y esta
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
77
correlacionada en todos los órganos evaluados con colapso celular a nivel
de los tejidos afectados, lo que sugiere la producción y liberación de
toxinas por el patógeno durante la infección.
La presencia de Cladosporium en lesiones de Roña evidencia su
responsabilidad en la enfermedad, y de acuerdo con el análisis
histopatológico, Colletotrichum no estaría involucrado en el desarrollo de la
patología, dada la ausencia de estructuras como acérvulos y conidias que
lo comprometan.
Respuestas de defensa estructurales se expresan posterior al desarrollo
de la enfermedad, como formación de capas de abscisión en hojas y de
corcho en frutos, las cuales evitan el progreso de la enfermedad al aislar el
patógeno de los tejidos sanos de la planta.
4.2 Recomendaciones
Partiendo del conocimiento actual sobre la etiología de la Roña en gulupa,
es necesario realizar estudios dirigidos a la selección de materiales con
resistencia a la enfermedad. Igualmente, es importante conocer la
variabilidad del patógeno a través de estudios de la estructura genética de
las poblaciones.
Pensando en la necesidad de manejo de la enfermedad, evaluación de
métodos de control cultural, biológico y químico son requeridos en
condiciones de laboratorio y campo, donde se evalué el efecto de
prácticas agronómicas sobre la intensidad de la enfermedad, incluyendo la
remoción de órganos afectados y el uso de agentes biocontrol y fungicidas
de síntesis química.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
78
El efecto de la enfermedad sobre el rendimiento y calidad de la fruta debe
ser evaluada, considerándose diferentes variables organolépticas de la
fruta, como sólidos totales solubles, color, textura, entre otros.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
79
A. ANEXO: Color de colonias de aislamientos de Cladosporium
asociados a gulupa, de acuerdo con el manual Pantone®.
AISLAMIENTO PDA AEM AA
FABCl14 451U-5835U/5535U 5615U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl21 451U- 582U/5535U 5615U-5535U-5615U /5467U 5767U-5757U/546U
FABCl22 451U-581U/5535U 5753U-5763U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl27 5825U/5535U 5763U/5463U 5757U/546U
FABCl43 4485U-4515U/5605U 5605U/5463U 5757U/546U
FABCl45 5815U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl50 5825U/5535U 5625U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl51 451U-5835U/5535U 5615U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl69 581U/5535U 5763U/5467U 5757U/546U
FABCl71 581U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl73 5815U/5535U 456U/5467U 5757U/546U
FABCl74 5825U/5535U 5753U/5467U 5767U-5757U/546U
FABCl78 5815U/5535U 5773U/5467U 5757U/546U
FABCl79 5815U/5535U 5753U/5467U 5757U/546U
FABCl80 5815U/5555U 5753U/5467U 5757U/546U
PDA: Papa-Dextrosa- Agar; AEM: Agar Extracto de Malta y AA: Agar harina
de Avena.
Caracterización etiológica de la Roña de la gulupa Pasiflora edulis Sims. en la región del Sumapaz
80
Bibliografía
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