Búsqueda de sustancias Búsqueda de sustancias biológicamente activas: biológicamente activas:
Consideraciones acerca de Consideraciones acerca de estrategias de estrategias de
“screening” y evaluación.“screening” y evaluación.
Dr. Armando Rojas RubioEscuela de Medicina, Universidad Católica del Maule
Principales modos de acción Principales modos de acción entre xenobióticos y sistemas entre xenobióticos y sistemas
biológicos.biológicos.
Bases de un programa de Bases de un programa de búsqueda de sustancias búsqueda de sustancias
biológicamente activasbiológicamente activas..
Química
BioquímicaBiología MolecularBiología Celular
Farmacología
FisiologíaFisiopatología
Farmacología reversa
Optimizarestructura
Evaluar eficacia
seguridad
Screenin
g
Fuente de diversidadquímica
Moléculas dianas
GenómicaProteómica
Bioinformática
FisiologíaFisiopatología
Quimiotecas (*)Química
combinatoria
ScreeningConvencionalAlto flujo, etc
SAR ADMEFarmacología Toxicología preclínica
Fármaco
(*) NIH 10-01-07, Anuncio la creación de la Librería de Pequeñas Moléculas para ser utilizadas en la Red de Librerías Moleculares para Centros de Screening.
http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
Proceso de descubrimientoProceso de descubrimiento
Serendipidad Etnomedicina Screening convencional o de alto flujo
No es necesario conocer la estructura del blanco. Diseño racional de fármacos
Si es necesario conocer la estructura del blanco
Etapas en la estrategia de Etapas en la estrategia de búsquedabúsqueda
Descubrimiento: Ideas Candidatos
Desarrollo: Candidatos Fármacos
Sistema de screening o tamizaje de actividades biológicas Sistema que permite la identificación de compuestos que presenten actividad sobre un blanco o función especifica,
potenciando que se conviertan en candidatos a una evaluación que permita el desarrollo hacia aplicaciones
clínicas.
Niveles del ScreeningNiveles del Screening
Nivel MolecularNivel Molecular Unión a receptores, actividad Unión a receptores, actividad
enzimática, etc,.enzimática, etc,. Nivel Celular/TisularNivel Celular/Tisular
Función celular / tisular.Función celular / tisular. Nivel Órganos/SistemasNivel Órganos/Sistemas
Visión integradoraVisión integradora
In vitro
In vivo
La búsqueda de La búsqueda de candidatoscandidatos
Identificación y validación del blanco
Tamizaje (primario y secundario)
Identificación de un líder potencial
Partida con estudios SARs
Generación de presuntos candidatos
Definición del farmacoforo
Optimización del candidato
Síntesis Química
Química Medicinal
La búsqueda de candidatosLa búsqueda de candidatos
Aspectos esenciales que tienen que ser considerados en cualquier estrategia de
screening Necesidad en MedicinaNecesidad en Medicina
Evento de amenaza a la vidaEvento de amenaza a la vida Evento autolimitadoEvento autolimitado
Disponibilidad de opción terapéuticaDisponibilidad de opción terapéutica Nivel de satisfacciónNivel de satisfacción
Ventajas sobre competidoresVentajas sobre competidores Mejor selectividad/potenciaMejor selectividad/potencia Enfoque novedosoEnfoque novedoso
Oportunidad comercialOportunidad comercial Mercado potencial (número de pacientes)Mercado potencial (número de pacientes) Duración del tratamientoDuración del tratamiento Aplicación en condición aguda o crónicaAplicación en condición aguda o crónica
Sistemas de tamizajeSistemas de tamizaje Screening primarioScreening primario: :
Diseño simple Diseño simple Blanco terapéutico definido (*)Blanco terapéutico definido (*) Alta sensibilidad y especificidad Alta sensibilidad y especificidad Usualmente una dosis.Usualmente una dosis. Recomendable ensayos en formato homogéneo y miniaturización.Recomendable ensayos en formato homogéneo y miniaturización.
Screening secundarioScreening secundario Confirmar la especificad sobre el blanco a un mayor nivel de Confirmar la especificad sobre el blanco a un mayor nivel de
complejidad (Mayor costo) complejidad (Mayor costo) Usualmente ensayos heterogéneosUsualmente ensayos heterogéneos Permitir evaluación de efecto umbral y relación dosis respuesta (mínimo Permitir evaluación de efecto umbral y relación dosis respuesta (mínimo
3 dosis).3 dosis).
Blancos en el tamizaje primarioBlancos en el tamizaje primario
All drugs that are presently on the All drugs that are presently on the market are estimated to target less market are estimated to target less than 500 biomolecules, ranging from than 500 biomolecules, ranging from nucleic acids to enzymes, G-protein-nucleic acids to enzymes, G-protein-coupled receptors (GPCRs) and ion coupled receptors (GPCRs) and ion channelschannels11 ( (
Metodologías mas usadas Metodologías mas usadas en el screening primarioen el screening primario
Ensayos basados en salidas de tipo:Ensayos basados en salidas de tipo: Radioactividad Colorimetría Turbidimetría Fluorescencia Quimioluminiscencia Bioluminiscenceia
Los sistemas de tamizaje Los sistemas de tamizaje primario/secundarioprimario/secundario
Bioquímico Celular
Caracterización sist. enzimático
Caracterización del blanco
Titulación (Km; Kd; etc) Respuesta activación/inhibición
Concentraciones Densidad celular
Potencia (IC50/EC50)
Logística del sistema de screeningLogística del sistema de screening
Bioquímico Celular
Protocolo detallado
Disponibilidad
(lotes múltiples ?)
Banco de células
Efecto de pases Estabilidad en el tiempo
Estabilidad de la señal
Seguridad
COSTOS
Variabilidad y reproducibilidad en la Variabilidad y reproducibilidad en la ventana de señal del ensayoventana de señal del ensayo
Bioquímico Bioquímico CelularCelular
Tolerancia solvente (DMSO *)Tolerancia solvente (DMSO *)
Ventana de respuesta del ensayo (máxima, media, Ventana de respuesta del ensayo (máxima, media, mínima)mínima)
Curvas de IC50/EC50 de tres días consecutivos de Curvas de IC50/EC50 de tres días consecutivos de inhibidores/activadoresinhibidores/activadores
La mayoría de las líneas celulares no son afectadas por < 0.1% DMSO La mayoría de los ensayos enzimáticos in vitro son tolerantes a 1–5% DMSO
Niveles de dosis a evaluar en Niveles de dosis a evaluar en screening primario y secundarioscreening primario y secundario
Garantizar la identificación de compuestos de baja potencia.
Evaluar varios compuestos simultáneamente en cantidades equimolares
Dianas superficie celular
Dianas intracelulares
British Journal of Pharmacology (2007) 152, 53–61
Optimización de un líder. Estudios tipo Optimización de un líder. Estudios tipo SARs y Q SARsSARs y Q SARs
Las actividades biológicas de un compuesto estan definidas por la estructura y propiedades químicas del compuesto
Los estudios SARs QSARs se utilizan para evaluar como diferentes modificaciones o descriptores moleculares (hidrofobicidad, topología y conectividad molecular, distribución de cargas, polaridad , puentes de H, etc) condicionan una actividad biológica determinada.
Definir la estructura del farmacoforo y predecir actividad biológica.
El riesgo que hay que minimizarEl riesgo que hay que minimizar
Un elevado porcentaje de las moléculas que inician Un elevado porcentaje de las moléculas que inician como candidatos fracasan al llegar a la fase clínica como candidatos fracasan al llegar a la fase clínica debido, entre otras cosas, a problemas debido, entre otras cosas, a problemas farmacocinéticos. farmacocinéticos.
Necesidad de poder predecir el comportamiento farmacocinético en humanos en etapas cada vez más tempranas.
Predicción de ADMET. El uso de Predicción de ADMET. El uso de recursos informáticosrecursos informáticos
Absorción
Distribución
Metabolismo
Eliminación
Toxicidad
Disponibilidad de herramientas informáticas (Noraymet, ADMETOX, etc) que ayudan a realizar estas predicciones sobre la base de entradas de ensayos in vitro e in vivo.
•Solubilidad•Permeabilidad•Unión a proteínas plasmáticasUnión a proteínas plasmáticas•Movimiento a través de transportadoresMovimiento a través de transportadores•Metabolismo por enzimas hepáticas (P450)Metabolismo por enzimas hepáticas (P450)•Distribución tisularDistribución tisular•CitotoxicidadCitotoxicidad
Principales razones para la falla de Principales razones para la falla de un candidato.un candidato.
Ineficacia.
Toxicidad.
Fallas en la biodisponibilidad.
Candidato selectivo, potente y optimizado Candidato selectivo, potente y optimizado y ADMET apropiada.y ADMET apropiada.
Estudios preclínicosEstudios preclínicos
Estudios preclínicos: Por que Estudios preclínicos: Por que son necesarios?son necesarios?
Demostrar su efectividad farmacológica en modelos animales
Demostrar que el candidato puede ser evaluado de forma segura en humanos.
Parte indispensable de los requerimientos de las agencias regulatorias.
Evaluación de actividad farmacológica Evaluación de actividad farmacológica en animales: en animales: La utilidad de los modelos La utilidad de los modelos
animales de enfermedadanimales de enfermedad..
A este nivel entran solamente candidatos con reconocida actividad en screening primario y secundario y favorable evaluación de ADME.
MUY ALTO COSTO
Modelos animales de enfermedad.
Modelos farmacológicos clásicos vs
modelos de animales transgénicos, knock out, knock down.
Estudios preclínicos de Estudios preclínicos de Toxicología.Toxicología.
• Necesarios para seguridad de dosis.Necesarios para seguridad de dosis.
• Realizados conforme a protocolos estándares, Realizados conforme a protocolos estándares, aprobados por las agencias reguladoras.aprobados por las agencias reguladoras.
• Realizados de acuerdo a las GLP correspondientesRealizados de acuerdo a las GLP correspondientes..
Genotoxicidad• Objetivo
• Determinar el potencial mutagénico y su posible riesgo a humanos
• Ensayos in vitro:• Mutaciones puntuales. (actividad mutagénica)
• Ensayo de Ames • Linfoma ratón (TK gen)
• Ensayos in vivo:• Aberraciones cromosómicas in vivo (actividad clastogénica)
• Análisis citogenético de medula ósea ratón.• Ensayo de micronúcleos.
Toxicidad aguda ( Dosis única)• Objetivo:
• Determinar la LD50, • Máxima Dosis Tolerada (MTD) • Nivel de NO Observación de Efectos (NOEL)
• Requerimientos de especies:• Rata, ratón.
• Parámetros: • Mortalidad, Necropsias, cambio de peso,
observaciones clínicas.
Toxicidad Sub aguda.• Objetivo:
• Determinar toxicidad después de dosis repetidas.
• Especies mas usadas:
• Rata y ratón.
• Parámetros: • Mortalidad, Hallazgos clínicos, química orina,
histología, cambio de peso.
Toxicidad Subcrónica/crónica.• Objetivo:
• Toxicidad en esquema de cronicidad.• Especies mas usadas:
• Rata y ratón.• Parámetros:
• Mortalidad, patología, histología, cambios conductuales, observaciones clínicas, cambio de peso.
Carcinogenicidad.• Objetivo:
• Evaluar el potencial tumorigénico en animales y el riesgo a humanos.
• Especies mas usadas
• Rata o ratón.
• Parámetros: • Desarrollo de tumor, lesiones pre-neoplásicas,
anatomía patológica.
En promedio, 1 de 10 000 compuestos tiene éxito En promedio, 1 de 10 000 compuestos tiene éxito en un sistema de búsqueda y posterior evaluación. en un sistema de búsqueda y posterior evaluación. Puede tomar entre 6 y 8 años.Puede tomar entre 6 y 8 años. Altísimo costo: Centenares de millones USD.Altísimo costo: Centenares de millones USD.
Descubrimiento y desarrollo de fármacos. Un largo y tortuoso camino
¿Como afrontar el reto?
Papel de las Universidades en un Papel de las Universidades en un programa de screeningprograma de screening
Aprovechar todas las potencialidades de cooperación y sinergia transversal propias de la vida universitaria
Lograr la identificación de un candidato potente y específico. Realizar la correspondiente acciones en protección de la propiedad intelectual. Estrategia de alianza para la etapa de desarrollo con la industria
.
Alan S.Verkman J. Physiol Cell Physiol 286: c465-c474, 2004
Muchas gracias