Download - Biología Celular
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1Compartimientosde la va secretora
El transporte de protenas entre compartimientosrequiere de la gemacin, translacin y fusin de estructuras membranosas.
Microscopa electrnica
Lodish et al. MCB 1999
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2El retculo endoplsmico (RE) es el compartimiento de entrada de protenas a la va secretora
El RE se extiende por toda la clula. Delimita un espacio denominado lmenque ocupa > 10% del volmen de la clula, y que es continuo con el espacioentre las dos membranas de la envoltura nuclear.
La red de tbulos puede visualizarse por inmunofluorescencia (A) o mediante compuestos lipoflicos fluorescentes como la rodamina hexil ester (B).
Voeltz et al., EMBORep 2002
El RE consiste en una red de tbulos y sacos membranosos interconectados
A B
(video disponible)
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3La estructura y dinmica del RE puede examinarse en clulas vivasempleando protenas fusionadas a GFP
La PTP1B es una fosfatasa asociada al RE por su terminal carboxilo. Debajo se visualiza el RE en una clula transfectada con un cDNA que codifica para la PTP1B fusionada a la GFP.
GFP
PTP1B
ERlmen
citosol
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4La observacin de las clulas vivas requiere de un cuidadosocontrol de las condiciones experimentales
microscopio invertido equipado para fluorescencia, con cmara de incubacin que permite mantener constante la temperatura y el CO2
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5Waterman-Storer & Salmon, CB 1998
Los microtbulos contribuyen a la organizacin espacial del RE
microtbulos RE superposicin
Anlisis de la codistribucin y dinamismo de microtbulos y retculo endoplsmico en clulas vivas. Debajo semuestra una clula microinyectada con tubulina conjugada a rodamina la cual se incorpora en microtbulos (en rojo). El RE se visualiza incubando las clulas con el compuesto lipoflico fluorescente DiOC6 (en verde).
Las flechas blancaslargas sealan lacolocalizacin de MTs y RE. Las flechas amarillassealan el margen de la clula.
Los tbulos del RE se extienden hacia la periferia celular empleando dos mecanismos diferentes: 1) asociacin con molculas motoras que se desplazan sobre los microtbulos en direccin del extremo (+)2) unin a complejos proteicos localizados en los extremos (+) de los microtbulos en fase de crecimiento
(video disponible)
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6"photobleaching" es la fotodestruccin de la fluorescencia emitida por un fluorforo (ej. el de la protena GFP). Usualmente se logra con un laser.
Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescenciadentro de una regin definida de la clula en funcin del tiempo, antes y despus de la fotodestruccin de la fluorescencia.
i
n
t
e
n
s
i
t
y
time
El perfil de recuperacin de la intensidad defluorescencia revela la cintica de difusin dela molcula fluorescente y su particin en compartimientos mviles e inmviles.
La tcnica de FRAP permite visualizar la dinmica de protenas en el RE
tiempo
FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching
100%
f
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
molculamas dinmica
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7Cambios en la movilidad de VSVG-GFPrevelados por FRAP
VSVG es una glicoprotena viral que se expresa enla membrana plasmtica de las clulas infectadas.La tcnica de FRAP revela su lta movilidad durantesu trnsito por el RE (paneles de la izquierda).
(Nehls et al, Nature CB2000)
la ventana muestrala regin de fotodestruccin de la fluorescenciacon el lser
VSVG-GFP VSVG-GFP + Tunicamicina
100% de recuperacinde la fluorescencia
40% de recuperacinde la fluorescencia
(videos disponibles)
La inhibicin de la glicosilacin de VSVG en el RE con la droga tunicamicina (TM) provoca su agregaciny retencin en el RE (paneles de la derecha).
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8Lippincott-Schwartz et al, Science 2003
La tcnica de FLIP permite analizar la movilidad y continuidad del compartimiento donde se halla la molcula fluorescente
Ciertas variantes de GFP slo se tornan fluorescentes al ser fotoactivadas con un pulso de energa UV. Asi, la movilidady destino de las molculas fluorescentes puede ser examinado independientemente de la sntesis de novo.
la intensidad de la fluorescencia total disminuye como consecuencia del pasajede molculas fluorescentes por la ventana de fotodestruccin definida.
Experimentalmente se registra la intensidad de la fluorescencia de toda la clula en funcin del tiempomientras se fotodestruye continuamente la fluorescencia dentro de una regin definida (rectangulo en rojo).
la intensidad de la fluorescencia dentro de la ventana de fotoactivacin disminuye como consecuencia de la difusin de las de molculas fluorescentes.
ventana de fotodestruccin
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9La tcnica de FLIP revela la localizacin de KDEL-GFP en compartimientos discontnuos
Nehls et al NCB2000
Las protenas solubles residentes del RE (ej. BiP) escapan al cis-Golgi como consecuencia del transporte vesicular y luego son retornadas al RE por transporte retrgrado. Estas protenas poseen la secuencia KDEL que acta como una seal de recuperacin al RE.
Los paneles superiores muestran que la fotodestruccin solo elimina la fluorescencia de KDEL-GFP del RE (compartimiento continuo) pero no de las vesculas de transporte entre el ER y Golgi (flechas). Los panelesinferiores muestran que la fluorescencia de VSVG-GFP localizada en el RE es completamente eliminada.
fotodestruccin
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La cintica del transporte de protenas en la va secretora puede analizarse por microscopa
Microscopa de fluorescencia de clulas en cultivo que expresan una variante mutada termosensible de la protena viral de membrana VSVG-ts fusionada a GFP. La incubacin de las clulas a 40C provoca la retencin de VSVG-ts en el RE. Cuandola temperatura se baja a 32C, la VSVG se pliega correctamente y se transporta hacia la superficie. Debajo se muestra la localizacin de la VSVG-GFP a distintos tiempos despus de comenzar la incubacin a 32C.
Hirschberg et al JCB 1998; Lippincott-Schwartz Hist. Cell Biol 2001
ER Golgi membrana plasmtica
fusion de vesculas con la membrana plasmtica (flechas)
videos disponibles
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La cintica del transporte tambin puede analizarse bioquimicamenteempleando endoglicosidasas especficas
la endoglicosidasa D remueve selectivamente oligosacridoscon alto contenido en manosacaractersticos del Golgi. Losprecursores del RE no soneficientemente clivados por laendoglicosidasa D.
Clulas que expresan la mutante termosensible de la VSVG fueron marcadas con un pulso de aminocidos radioactivos. A distintos tiempos despus del marcado se prepararon extractos celulares y se incubaron conendoglicosidasa D. Los productos proteicos son analizados en geles de poliacrilamida por fluorografa.
pasaje al Golgi
VSVG retenida en el RE
incremento de VSVG en el Golgi
Lodish et al. MCB 2004
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Anlisis de eventos de exocitosis mediante epifluorescencia y TIRF en clulas vivas
vesculas visualizadas por epifluorescencia (rojo) y TIRF (verde) de clulas transfectadas con VSVG-YFP. Cuando la vescula se fusiona a la MP incrementa la fluorescencia de TIRF la cual difunde post-fusin (flechas).
Toomre et al JCB2000
epifluorescencia
TIRF
TIRFM: Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (mas sobre TIRF en clase de citoesqueleto I)
videos disponibles
parte de una clula visualizada simultaneamentemediante epifluorescencia convencional y TIRF
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El anlisis gentico en levaduras permiti identificar genes claves involucrados en el trfico intracelular
Mutantes condicionales sensibles a la temperatura (denominadas mutantes sec) se clasifican en diferentes clases de acuerdo a la etapa del transporte afectada en los fenotipos mutantes.
Lodish et al. MCB 2004
El anlisis de doble mutantes revela la secuencia de eventos en la va secretora.
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Retculo endoplsmico rugoso (RER)
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Higy et al. Biochem. 2004
La secuencia seal o secuencias de insercin determinan la topologa de las protenas en la membrana el RE
La topologa de una protena de membrana describe el nmero de veces que la cadena polipeptdica atraviesa la membrana y la orientacin de los dominios de transmembrana.
lmendel RE
citosol La orientacin de la secuencia seal y de los dominios de transmembranadepende bsicamente de 3 factores:1) residuos bsicos que flanquean la
secuencia hidrofbica,2) estructura del terminal amino,3) hidrofobicidad y largo de la regin
hidrofbica.
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Topologa de protenas de membrana tipo I
El terminal carboxilo de la protena permanece en el citosol. La secuencia seal se orientacon el N-terminal hacia el citosol. Es clivada durante la translocacin.Ej: receptor de la insulina, EGFR, PDGFR, integrinas, caderinas
Una secuencia interna hidrofbica cerca del terminal carboxilo acta comosecuencia de parada de la translocacin y de insercin a la membrana.
Cooper, The Cell 2000
citosol
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Protenas de tipo II.El terminal aminopermance en el citosol.Ej: receptor de transferrina, sialil transferasa de Golgi.
Una secuencia hidrofbica interna acta comosecuencia seal, de detencin de la translocaciny de insercin a la membrana. Su orientacines similar a la de las protenas de tipo I.
Protenas con secuencia seal no clivable: Tipo II y III
Cooper, The Cell 2000
Protenas de tipo III.El terminal carboxilopermanece en el citosol.Ej: citocromo P450.Una secuencia hidrofbica interna, cercanaal terminal amino, acta como secuencia seal, de parada de la translocacin y de insercinen la membrana. La orientacin de esta secuenciaes opuesta a las de protenas de membrana tipo I.
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las protenas de tipo IV poseen varios segmentos de transmembrana
Protenas de tipo IV
Cooper, The Cell 2000
La primer secuencia hidrofbica interna cercana al terminal amino acta como secuencia seal y de insercin en la membrana; la segunda secuencia hidrofbica acta como secuencia de parada.
ejemplos de protenas de tipo IV: receptores acoplados a protenas G (receptor -adrenrgico, transportador de glucosa GLUT1, sec 61, etc.
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bicapa
ER lumen
citosol
Algunas protenas se anclan a la hemicapa ectoplsmica de la membranaplasmtica por un glicosil fosfatidil inositol (GPI)
Las protenas ancladas a membrana por GPI se insertan inicialmente en la membrana del RE como protenas de tipo I. Una GPI transamidasa cliva el dominio de transmembrana y transfiere el polipptido restante a un grupo GPI preformado.Las protenas ancladas por GPI son muy mviles en el plano de la membrana.
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Enzimas asociadas a la cara citoslica de la membranadel RE liso sintetizan fosfolpidos
La insercin de cido fosfatdico en la hemicapa citoslica del RE, catalizada por una acil transferasa (etapa 1),contribuye al crecimiento de la membrana. La adicin del grupo polar o cargado es catalizado por otrasenzimas asociadas. La sntesis de fosfatidil serina, etanolamina y fosfatidil inositol ocurre de manera similar.
Alberts et al, MBC 2002
hemicapa
hemicapa
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Las enzimas scramblasa y flipasa catalizan la translocacin de fosfolpidos
La enzima mezcladora scramblasa del RE equilibra los fosfolpidos en ambas hemicapas de la membrana. La enzima flipasaen la membrana plasmtica cataliza la translocacin de fosfolpidos especficos, generando asimetra en la distribucin lipdica.
Alberts et al, MBC 2002
PS, PE
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En su trnsito por la va secretora los polipptidos experimentandiversas modificaciones antes de alcanzar sus destinos finales:
formacin de puentes disulfuro plegado (estructura terciaria y cuaternaria) glicosilacin maduracin proteoltica
Varias familias de chaperonas asisten en el plegado de los polipptidos internalizados en el RE:
- Hsp70 (ej. BiP)- Hsp40- Hsp90- peptidil-prolil isomerasas- disulfuro isomerasa- calnexina y calreticulina
RE
Post-GolgiRE y Golgi
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La formacin y rearreglo de puentes disulfuro en las protenases catalizado por la enzima disulfuro isomerasa (PDI)
El lmen del RE es un ambiente oxidante que favorece la formacin de puentes disulfuro. La enzima PDI posee dos cistenas en su sitio activo que son rpidamente interconvertidasentre su forma oxidada, formando un puente disulfuro, y su forma reducida (di-tiol).
Lodish et al. MCB 2004
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La rotacin de los polipptidos en las uniones peptdicas que preceden a prolinas es catalizada por peptidil-prolil-isomerasas
N
C
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BiP, calnexina y calreticulina contribuyen al plegado del polipptido de diferentes maneras
Lodish et al. MCB 2004
La chaperona Bip se une a regiones hidrofbicas del polipptido y evita su agregacin. Las chaperonas Calnexinay Calreticulina reconocen regiones glicosiladas (monoglucosiladas) y contribuyen a monitorear el plegado del polipptido.
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En protenas N-glicosiladas, oligosacridos de 14 residuos se transfierena la cadena naciente en un proceso co-traduccin
La enzima oligosacaril transferasa, asociada a la cara luminal del RER, transfiere el oligosacridoprecursor a residuos asparagina en la secuenciaAsn-X-Ser/Thr del polipptido naciente.
Lodish et al. MCB 2004
La glicosilacin incrementa la solubilidad de las protenas, inhibe la agregacin y estabiliza la conformacin del polipptido.
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El oligosacrido precursor se sintetiza en el citosol asociado al dolicol,un lpido poli-isoprenoide inserto en la membrana del RE
Enzimas asociadas a la membrana del RE, catalizan a partir de nucletido-azcares, la sntesis del oligosacrido precursor. La tunicamicina es una droga que inhibe a la enzima de la primer reaccin.
Lodish et al. MCB 2004
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Procesamiento del oligosacrido precursor en el ER
1- transferencia del oligosacrido precursor a la cadena polipeptdica naciente. 2 y 3- Dos glucosas terminales son removidas por GI y GII. Calnexina y calreticulina se unen al oligosacrido monoglucosilado
y facilitan el plegado del polipptido por la accin de las disulfuro isomerasas y prolil isomerasas.4- La GII eventualmente remueve la ltima glucosa y el polipptido deglucosilado se disocia de las chaperonas. El polipptido
puede ser reglucosilado por la glucosil transferasa si aun no alcanz la conformacin nativa.5- El polipptido que no alcanz la conformacin nativa es eventualmente demanosilado y exportado al citosol via EDEM. 6- La protena correctamente plegada no se re-glucosila y es competente para su exportacin al Golgi.
Lodish et al. MCB 2004
glucosidasa I glucosidasa II
glucosidasa II
glucosil transferasamanosidasa
EDEM
degradacin
glicoprotenaplegada
A Golgi
ismero reconocidopor EDEM para suretrotranslocacin
calreticulin
calnexin
45
oligosacariltransferasa
6
EDEM: ER Degradation Enhancing Manosidase
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Ellgaard et al, Science 1999
Man9
El ciclo de deglucosilacin-glucosilacin actacomo un control de calidad del plegado
Calnexina y calreticulina retienen a los polipptidos monoglucosilados en el RE. Glucosidasa II remueve la glucosa terminal y termina la retencin por calnexina/calreticulina. Glucosil transferasa (GT) actacomo un sensor del plegado y solo re-glucosila a polipptidosparcialmente plegados. Estos sonnuevamente retenidos porcalreticulina o calnexina.
* ERp57 es una disulfuro isomerasa que cataliza la formacin de puentes disulfuro en el polipptido.
sensor del plegado
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Tsai et al NRMCB2002
EDEM(lectina)
EDEM = ER Degradation Enhancing Manosidase es una lectinade la membrana del RE que se une a un ismero especfico del oligosacrido con 8 manosas y lo transfiere al translocon.
Ubiquitin-ligasa
ERAD (ER-Associated Degradation)
ERAD es un proceso que involucra varias etapas:
- seleccin del substrato con defectos en el plegado ("misfolded")- desplegado del substrato y transferencia al translocn (1)- translocacin del substrato hacia el citosol (2)- ubiquitinacin y degradacin en el proteosoma (3,4)
El control de calidad esta acoplado a mecanismosde degradacin asociados al RE (ERAD)
sec61
(man8)
(Man)8(GlcNAc)2
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IRE1 oligomerizacin procesamiento de Hac/XBP1 mRNA sntesis de chaperonas (ej. BiP) y de EDEM
PERK oligomerizacin fosforilacin de eIF-2 sntesis de protenas
ATF6 exportacin al Golgi proteasas clivan el TM translocacin al ncleo sntesis de chaperonas (ej. BiP)
El control de calidad en el RE esta acoplado a mecanismos adaptativosque disparan una respuesta transcripcional (UPR)
(Unfolded protein response = UPR)
Transmembranesensors
- IRE1- PERK- ATF6
IRE1
PERK
ATF6
Estrs del RE. Es un estado en el cual el influjo de polipptidos al RE excede su capacidad de plegar y/o procesar los polipptidos.En ese estado se acumulan protenas mal plegadaso estados intermediarios y se dispara la respuesta UPR. BiP
BiP
BiP
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1. Ire1 y PERK son protenas de transmembrana del RE capaces de dimerizar en su porcin luminal. En condiciones normales BiP se une a la reginluminal y previene la dimerizacin. Durante elde estrs del RE, BiP se disocia y se favorece la dimerizacin de Ire1 y PERK.
2. El dmero de Ire1 se autofosforila yactiva el dominio de endoribonucleasa que remueveel intrn en el mRNA de Hac1 (XBP1 en mamferos).
3. Los dos exones del factor de transcripcin Hac1/XBP1son ligados y forman un mRNA maduro.
4. El mRNA es traducido en el citosol, Hac1/XBP1 se transloca al ncleo y activa la transcripcin de genes quecodifican para chaperonas del RER (ej. BiP) y componentesde la maquinaria de degradacin (ej. EDEM) .
Lodish et al. MCB 2004
Mecanismo de respuesta transcripcional mediado por IRE1
ATF es una protena de transmembrana de tipo II, que seune a BiP por el dominio luminal. La disociacin de BiPcomo consecuencia de estrs, desenmascara secuenciasde localizacin a Golgi en ATF. En Golgi, el dominio detransmembrana de ATF es clivado y ATF soluble se transloca al ncleo, activando transcripcin.
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ocurre en sitios discretos, sin ribosomas asociados (tER) requiere del reclutamiento transitorio de protenas
citoslicas y del ensamble de un complejo multiproteico es en gran medida un proceso selectivo ocurre en estructuras tubulo-vesiculares cuyo
movimiento depende de microtbulos
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Existe un transporte bi-direccional de protenas entre el RE y Golgi. El transporte RE Golgi es mediado por vesculascon cubierta COP II. El transporte retrgrado Golgi RE esmediado por vesculas con cubierta de protenas COP I.
cis Golginetwork
Las vesculas que emergen del RE se fusionan formando estructurastubulo-vesiculares que se tranlocan al cis Golgi por microtbulos
Debajo se muestra la localizacin de una mutante termosensible de VSVG-GFP que es retenida en el RE a 40C (A).Cuando la temperatura se baja a 32C la VSVG-GFP se acumula rpidamente en sitios de exportacin tER o ERES (B). A tiempos posteriores la protena ya ha llegado al Golgi (C).
Ellgaard & Helenius, NRMCB 2003
A B C
video disponible (Presley et al 1997)
Los sitios de exportacin del RE, tER o ERES, son subdominios de la membrana del RE a partir de los cuales emergen las vesculas con cubierta de COP II.
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El transporte antergrado hacia el Golgi depende de dinenas que se translocan hacia el extremo (-) de microtbulos
El Golgi (en naranja) poseeuna localizacin perinuclear.
ncleo
Donaldson & Lippincott-Schwartz, Cell 2000
protenas decoatmeros
microtbulos
membranaplasmtica
Las estructuras tubulo-vesiculares emergentes e intermediarias se unen a dinenasy microtbulos y migran en direccin al centrosoma de localizacin perinuclear.
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Las protenas cargo de transmembrana son seleccionadas en base aseales o motivos localizados en sus dominios citoslicos
Bonifacino and Glick, Cell 2004
Las seales de exportacin consisten en motivos de aminocidos cidos, bsicos o hidrofbicosy son esenciales para su interaccin con las protenas de la cubierta COP II.
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La exportacin de las protenas cargo solubles ocurre de manera pasiva o por mecanismos activos
Barlowe, TICS 2003
Se postulan dos modelos de exportacin de protenas cargo solubles del RE: (a) incorporacin pasiva de protenasen las vesculas COP II; (b) concentracin activa de las protenas mediada por receptores de transmembrana. En ambos modelos, las protenas residentes del RE (R) son diferencialmente retenidas en el lmen de la vescula en formacin.
Las enzimas amilasa yquimiotripsingeno son ejemplos de exportacinpasiva (a) cuya concentracin ocurre en el compartimientotubulovesicular. ERGIC53 es un receptor requerido para lasecrecin de varias glicoprotenasque responden al modelo de exportacin (b)
R
Rpasivo,no ocurreconcentracindel cargo
activo,concentracindel cargo
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El proceso de formacin de vesculas con cubierta COP II ocurre de acuerdo a la siguiente secuencia:
1) Asociacin de la GTPasa Sar1 a la membrana del RE. Este paso requiere del intercambio del GDP por GTP en Sar1catalizado por la protena de membrana sec 12 (GEF). Sar1-GTP inserta una alfa hlice del N-terminal en la membranadel RE e inicia su deformacin.
2) Sar1-GTP recluta las protenas sec23/sec24 las cuales ensamblan una cubierta que curvan la membrana. Existen al menos 4 isoformas de protenas Sec24 las cuales poseen diferentes sitios de interaccin para diversas seales deexportacin de protenas de transmembrana (cargo).
3) La cubierta de sec23-sec24 recluta complejos de protenas sec13/31 que ensamblan una capa externa y completanla formacin de la vescula cubierta.
4) Fisin de la vescula y desensamble de la cubierta, evento que requiere de la hidrlisis del GTP de Sar1 (no mostrado).
Modelo de ensamble de la cubierta de protenas COP IILas protenas de la cubierta deforman la membrana y seleccionan cargos
Bonifacino & Glick, Cell 2004
1
2
3
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Protenas solubles residentes del RE que escapan al Golgi retornan al RE por un mecanismo especfico dependiente del tetrapptido KDEL
La secuencia KDEL esta presente en el terminalcarboxilo de protenas solubles del RE (ej. BiP).Esta secuencia es reconocida por un receptor de transmembrana en el medio ligeramente cidodel cis Golgi. El complejo KDEL/Receptor retornaal RE en vesculas con cubierta COP I. En el medioneutro del RE el complejo se disocia.
RE lumenpH ~ 7
cis GolgipH < 7
Lodish et al. MCB 1999
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Ejemplos: KKXX RXREstas seales son requeridas para la interaccincon protenas COP I que recubren las vesculasde retorno al RE.
Protenas de membrana residentes del RE poseenseales de retencin especficas en su tallo citoslico
Las seales de retencin al RE representan mecanismos de control de calidad. Algunas protenas oligomricas exponen las seales de retencin en los monmeros pero estas quedan ocultas en la estructura cuaternaria de los oligmeros (A). En otros casos, la fosforilacin de serinas adyacentes recluta protenas 14-3-3 que enmascaran la seal de retencin (B). Algunas protenas de membrana forman complejos con protenas citoslicas que ocultan la seal de retencin (C).
citosol
RElmen
complejoC
Al Golgicitosol
RElmen
fosforilacinB
Al Golgi
COP Irecuperacinal RE
citosol
RElmen
oligomerizacinA
Al Golgi
COP Irecuperacinal RE
14-3-3
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Modelo de ensamble de cubiertas COP I
1. La GTPasa ARF-GDP se asocia a un receptor asociadoa la membrana del Golgi que intercambia el GDP por GTP. ARF-GTP se inserta en la membrana e inicia su deformacin.
2. ARF-GTP recluta complejos protecos del citosol denominadoscoatomeros y que ensamblan la cubierta COP I. Las subunidadesde los coatomeros seleccionan las protenas cargo y tambin unaARF-GAP.
3. La hidrlisis de ARF-GTP mediada por ARF-GAP disparala fisin y desensamblaje de la cubierta COP I.
Las subunidades de los coatmeros reconocenmotivos en los dominios citoslicos deprotenas de transmembrana. Ej: KKXX y RXR
ERGIC/VTC y cis Golgi cisterna
ERGIC: ER to Golgi Complex; VTC: Vesicular Tubular ClusterLodish et al. MCB 1999
3
2
1
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El Golgi es una estructura dinmica y polarizada dondese procesan, de manera secuencial, glicoprotenas y glicolpidos
GolgiSacos del Golgi en una clulavegetal. Microscopa electrnica
cis
trans
El Golgi consiste de sacos o cisternas que transportan material de manera antergrada. Puesto que el Golgi es una estructuradinmica, en estado estacionario, existe un continuo reflujo de protenas por transporte retrgrado. El sitio de entrada del Golgise denomina cis-Golgi, las cisternas intermedias constituyen el medial-Golgi, y las mas distales, el trans-Golgi. Vesculas y tbulos que emergen del trans-Golgi forman la red del trans-Golgi (TGN).
principales funciones del Golgi- Modificacin y procesamiento de carbohidratos en lpidos y protenas- Distribucin y transporte- Sitio de anclaje de protenas de sealizacin, distribucin y del citoesqueleto
transporteantergrado transporte
retrgrado
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La inhibicin del flujo de protenas a travs del Golgiprovoca su desaparicin
Sciaky et al., JCB 1997
La incubacin de clulas con brefeldina A, una droga que inhibe la exportacin de protenas del RE al Golgipero no el transporte Golgi RE provoca la reabsorcin del cis-Golgi en el RE. Este efecto se visualiza filmandola redistribucin de una galactosil transferasa fusionada a GFP desde el Golgi al RE (fotos debajo).
video disponible
Golgi RE
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44
manosidasa
manosidasaGlcNAc transferasaGlcNAc transferasa
Gal transferasa
fucosiltransferasa
sialiltransferasa
lisosomalprotein
GlcNAc fosfotransferasa
P
Las distintas cisternas del Golgicontienen una batera de enzimasque modifican los oligosacridosde las protenas en trnsito
las glicosil transferasas son protenas de transmembrana, cuyo dominio catalticointraluminal agrega monosacridos especficosa los aceptores en trnsito. Cada enzimamantiene una localizacin intra-Golgi restringida.
Dependiendo de la protena, se observan dos tiposde N-oligosacridos en las protenas maduras:- oligosacridos con alto contenido de manosa(similar al precursor que proviene del RE)
- oligosacridos complejos. Resultan de la eliminacin de manosas y el agregado de GlcNAc,galactosa y cido silico en el medial/trans-Golgi.
Lodish et al. MCB 1999
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(ER, red delcis Golgi)
(trans Golgi)
(red del trans Golgi)
(motivos en protenas aceptoras:Asn-X-Ser o Asn-X-Thr)
Estructuras de oligosacridosencontradosen glicoprotenas
(trans Golgi)
(red del trans Golgi)
tipos:
O-oligosacridos
N-oligosacridos- alta manosa- complejos
Lodish et al. MCB 1999
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Las estructuras tubulo-vesiculares que emergen del trans-Golgi forman una red o TGN. Lass vesculas requieren de una accincoordinada de traccin de la membrana mediada por molculas motoras asociadas a microtbulos y eventos de fisin mediadapor la generacin y acumulacin de diacil glicerol. Un aumento descontrolado del proceso de fisin produce la fragmentacin delGolgi en pequeas vesculas (b); en contraste, su inhibicin produce la formacin de largas estructuras tubulares (c).
Bard & Malhotra, ARCDB 2006
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47
Transporte a lisosomas: Las hidrolasas lisosomales son direccionadasdel trans-Golgi a endosomas tardos mediante una seal de M6P
la seal de manosa 6-fosfato es introducida por la GluNac fosfotransferasadel cis-Golgi. Esta enzima se une a precursores lisosomales N-glicosiladosreconociendo una seal tridimensional en la estructura nativa. En unaprimera reaccin la enzima transfiere GluNac fosfato al carbono 6 de manosas. En un segundo paso otra enzima remueve la GluNac.
M6P
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48
Los precursores lisosomales se unen a receptores de M6P en el trans-Golgi y se empaquetan en vesculas cubiertas con clatrina
Receptores de transmembrana de M6P concentran a los precursores lisosomales en el trans-Golgi y son empaquetados en vesculas de clatrina (1). Estas vesculas se fusionan con endosomas tardos donde el pH cido provoca la disociacindel complejo M6P-receptor (2). Fosfatasas remueven el fosfato de las M6P. Los precursores lisosomales se segregan en vesculas de transporte que se fusionan a lisosomas (3). Los receptores de M6P son retornados al Golgi (4) o, raramentetransportados a la superficie donde contribuyen a internalizar precursores lisosomales.
Lodish et al. MCB 1999
1
23
pH 5-5,5
pH 6,5
4
-
49
La Clatrina contribuye a la formacin de vesculas que emergen dedel trans-Golgi y de la membrana plasmtica
Cada molcula de clatrina consiste de tres subunidades grandes y tres pequeas. Numerosas molculas de clatrina ensamblan una celda proteica asociada a la membrana.
video
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Protenas adaptadoras son reclutadas por ARF-GTP a la membranaque dar origen a vesculas de clatrina
Las protenas adaptadoras cumplen tres funciones esenciales:
- seleccionan las protenas cargo- reclutan molculas de clatrina a la membrana- interaccionan con protenas accesorias que regulan el ensamble y desensamble de las protenas de la cubierta (ej. Arf).
Bonifacino & Traub, ARB 2003
TGN,endosomas
TGN, PM
TGN,endosomas
TGN,endosomas
Las protenas adaptadoras descriptas son monomricas (GGA) o tetramricas (AP1).
Las protenas adaptadoras asociadas a clatrinareconocen motivos especficos en los dominioscitoslicos de protenas de transmembrana. Ej:
NPXY AP2YXX AP1 y AP2LL AP2
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Modelo de formacinde vesculas con clatrina cargo
Arf
(AP)
La formacin de vesculas en el TGN ocurre de acuerdo a la siguiente secuencia:
1. ARF-GTP se asocia al TGN y recluta complejos de protenas adaptadoras(ej. AP, GGAs) que a su vez reclutan protenas cargo y molculas de clatrina.
2. El ensamble de la canasta de clatrina deforma la membrana.3. Fisin del cuello y formacin de la vescula. Este evento requiere de la
GTPasa dinamina y de la hidrlisis de GTP.4. Desensamble de la canasta de clatrina por chaperonas
(hsp70, auxilina), proceso que requiere de hidrlisis de ATP.
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microscopa electrnica
La GTPasa dinamina es esencial para la fisin de vesculas con clatrina. Este proceso requiere de la hidrlisis del GTP
molculas de dinamina detectadascon un anticuerpo anti-dinamina unidoa granos de oro coloidal
cuello
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Transporte a la membrana plasmtica: Anlisis por video-microscopa de fluorescencia en clulas vivas revela
que del TGN emergen vesculas y estructuras tubulares
Hirschberg et al., JCB 1998
Clulas transfectadas con VSVG-GFP. La flecha seala la produccin de una estructura tubular y la fisin de una vescula del extremo distal.
video disponible
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En clulas epiteliales polarizadas existen mecanismos selectivos de transporte de protenas a la membrana apical y basolateral
Algunas protenas apicales de membrana se transportan al dominio apical por una va directa a partir del Post-Golgi (A, rojo). Otras protenas se transportan al dominio apical por una va indirecta que involucra el transporte e insercin en la membranabasolateral y luego su re-direccionamiento por endocitosis a la cara apical (B, rojo). Este proceso se denomina transcitosis.
apical
basolateral
The Art of MBC, Garland Publ. 1995
protenas ancladas por GPIy el virus de la influenza sonmarcadores apicales. El virusVSV, caderinas e integrinasson marcadores basolaterales.
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Determinantes moleculares que contribuyen al direccionamientode protenas a los dominios apical y basolateral
seales para localizacin apical y basolateraltipo localizacin de la seal ejemplos
basolateralYXX..............................citoplasmtica..............VSVG, caderinasLL/IL................................citoplasmtica..............receptor de Fcotras................................citoplasmtica..............TfR, LDLR
apicalanclaje de GPI..................membrana..................Thy-1N-oligosacridos...............luminal........................eritropoietinatransmembrana.................membrana..................hemaglutinina
Microdominios (~70 nm dimetro) formados en la membrana del trans-Golgi y en la membranaapical de las clulas epiteliales, denominadoslipid rafts, concentran protenas ancladas porGPI y protenas que poseen un dominio de transmembrana mas largo que el resto.
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Keller et al, Nature CB 2001
La segregacin de protenas al dominio apical y basolateral puedevisualizarse empleando protenas fluorescentes
observacin de unplano superficial (A)
A
B
observacin de unplano ecuatorial (B)
Clulas epiteliales polarizadas se transfectaron con cDNAs que codifican para protenas fluorescentes. A la izquierda se muestra la localizacin apical de una YFP modificada mediante el agregado de un ancla de GPI. A la derecha se muestra la localizacin basolateral de una YFP fusionada a la protena VSVG. Las clulas se observan en dos planos confocales (A y B).
YFP-GPI VSVG-YFP
A
B
A
B
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Keller et al, Nature CB 2001(video disponible)
Visualizacin de la segregacin de protenas del dominio apical y basolateral en el Golgi
Clulas transfectadas con CFP-GPI (verde) y VSVG-YFP (rojo). Note la segregacin de tbulos conteniendo CFP-GPI y VSVG-YFP de la misma estructura (flechas).
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El dominio apical en clulas epiteliales es equivalente al axnen neuronas y el dominio basolateral al soma y dendritas
Alberts et al. MBC 2002
VSVGVSVG
HA
HA
influenza virus+ VSV virus influenza virus
+ VSV virus
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Las clulas poseen mecanismos de exocitosis constitutivos y regulados
Alberts et al. MBC 2002
protenas cuya secrecin es regulada forman agregados en el trans-Golgicon las protenas cromogranina A y By la secretogranina II.
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Protein Type Example Site of Synthesis
Constitutive Secretory Proteins
Serum proteins Albumin Liver (hepatocyte) Transferrin (Fe transporter) Liver Lipoproteins Liver, intestine Immunoglobulins Lymphocytes Extracellular matrix proteins Collagen Fibroblasts, others Fibronectin Fibroblasts, liver Proteoglycans Fibroblasts, others
Regulated Secretory Proteins
Peptide hormones Insulin Pancreatic -islet cells Glucagon Pancreatic -islet cells Endorphins Neurosecretory cells Enkephalins Neurosecretory cells ACTH Anterior pituitary lobe Digestive enzymes Trypsin Pancreatic acini Chymotrypsin Pancreatic acini Amylase Pancreatic acini, salivary glands Ribonuclease Pancreatic acini Deoxyribonuclease Pancreatic acini Milk proteins Casein Mammary gland Lactalbumin Mammary gland
Ejemplos de protenas secretadas en forma constitutiva y regulada
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Las protenas de secrecin y de membrana frecuentemente requieren del procesamiento proteoltico en el trans-Golgi para generar la forma madura
Una familia de endoproteasas denominadaspro-protein convertasas (PC) y furinas se localizan en la red del trans-Golgi y clivanpolipptidos despus de la secuencia dibsicaArg-Arg o Lys-Arg.
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La insulina se secreta de manera regulada en clulas beta del pncreas
El aumento de glucosa en sangre produce una mayor captacin por los receptores GLUT2 (1). La degradacin de la glucosa a piruvato produce ATP (2) el cual induce el cierre de canales de potasio dependientes de ATP (3). Esto provoca una depolarizacin localizada de la membrana (4) que induce la apertura de los canales de calcio dependientesde voltaje (5). El aumento de calcio citoslico dispara la fusin de vesculas secretoras que contienen insulina (6).
Lodish et al. MCB 2004
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Exocitosis reguladaMicroscopa electrnica de una clula beta del pncreas endcrino
que exocita vesculas conteniendo insulina
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Exocitosis regulada
Microscopa electrnica de mastocitos antes (A) y despus (B) de liberar sus grnulos de histamina. La exocitosis es disparada por la agregacin de los receptores de IgE en su superficie
Secrecin de histamina por mastocitos
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Exocitosis reguladaLas neuronas secretan neurotransmisores en respuesta a la
llegada de un potencial de accin al terminal axonal
axn
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66
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Las protenas Rabs y SNARE controlan la especificidad de la fusin entre membranas del compartimiento donor y aceptor
v-SNARE
t-SNAREs
Las GTPasas Rab-GDP se encuentran en el citosol. El intercambio del GDP por GTP catalizadopor un GEF induce la asociacin de Rab-GTP ala membrana de la vescula de transporte. Rab-GTPinteracciona con receptores en la membrana aceptoraanclando la vescula a la membrana blanco.
Protenas integrales de membrana denominadasv-SNARE se incorporan a la vescula durantesu formacin. La fusin requiere de la formacinde un complejo tetramrico entre v-SNARE, y t-SNAREs.
Eventos posteriores al desensamble de la cubierta
SNARE: Soluble NSF Attachment REceptors
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Los complejos trans-SNARE se forman entre dominios coiled coil dev-SNARE y t-SNAREs. Los complejos trans-SNARE cumplen dos funciones: inducir la fusin de las membranas y contribuir a la especificidad de la fusin. El calcio dispara la fusin.
Posterior a la fusin de las membranas, lasprotenas -SNAP reclutan a la ATPasa NSFa los complejos cis-SNARE. NSF hidroliza el ATPy desensambla los complejos cis-SNARE.
v-SNARE
t-SNAREs
NSF: N-ethylmaleimide Sensitive Factor
+ Ca2+fusin
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69
-
70
Las vesculas cubiertas median transporte de materiales entre compartimientos. Eventos esenciales son la asociacin de GTPasas al sitio de emergencia de la vescula, el reclutamiento de las protenas de la cubierta y la seleccin del cargo.
Lodish et al 2004
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71
La cubierta se desensambla despus de formarse la vescula.
Lodish et al 2004
Se exponen protenas que determinan la especificidad de la fusin con receptores en la membrana aceptora.
v/t-SNAREcomplex
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Visualizacin del proceso de formacin de vesculas cubiertas.
El ensamble de la cubierta provoca la curvatura de la membrana.
Microscopa electrnica
Lodish et al 2004
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Resumen de tipos de vesculas cubiertas y GTPasas involucradas
Lodish et al MBC 2004
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Resumen de las propiedades de las cubiertas proteicasinvolucradas en el transporte vesicular
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Resumen de la gnesis, transporte y fusin de vesculas
1. Ensamble de la cubierta. Evento disparado por la asociacin de una GTPasa (esfera roja) a la membrana del compartimientodonor. Las protenas cargo y protenas v-SNARE se concentran en la vescula en formacin.
2. Gemacin. Los componentes externos de la cubierta se ensamblan en una malla que curva la membrana y forman la vescula.3. Fisin del cuello entre la vescula y el compartimiento donor. En este evento intervienen protenas accesorias.4. Desensamble de la cubierta. Participan chaperonas, fosfoinostidos y GTPasas. Las protenas de la cubierta son recicladas5. Transporte de la vescula hasta el compartimiento aceptor mediado por microtbulos y protenas motoras.6. Anclaje mediado por la interaccin de las GTPasas Rab y sus receptores. 7. Fusin mediada por la formacin de los complejos trans-SNARE (v- y t-SNARE + SNAP 25).
Bonifacino & Glick, Cell 2004