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Denis Viera Julio 2012
Análisis de los Azúcares Glicósidos Diterpénicos de las
hojas de Stevia Rebaudiana Bertoni y la utilización de
equipos HPLC como método analítico
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Stevia rebaudiana es una planta originaria de Paraguay productora de glicósidos de tipo diterpenoide, los cuales son considerados 300 veces más dulce que la sacarosa y su aporte energético es bajo, además de presentar otras propiedades terapéuticas.
Stevia Rebaudiana
Bertoni
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Estos glicósidos son considerados como dietéticos porque su estructura no es metabolizada por el organismo humano. Presentan características de estabilidad al calor (198-200°C) y no se fermentan.
El contenido de glicósidos en la planta se encuentra en mayor concentración en las hojas, siendo aproximadamente de 15%, según la variedad.
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Los principales componentes hasta ahora aislados e identificados son: Steviósido, Rebaudiósido A y C (denominado también Dulcósido B).
Los componentes menores son Steviolbiósido, Rebaudiósido B, D, E y Dulcósido A.
La existencia de Steviolbiósido, Rebaudiósido B, algunos autores postulan que estos son productos que se originan en el proceso de extracción.
Compuestos de Interés
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Desde el punto de vista de su empleo como edulcorante, nos interesa en especial el Steviósido y el Rebaudiósido A.
El contenido medio aproximado de estos componentes en las hojas es de 7% y 3% respectivamente.
El poder edulcorante relativo, tomando como comparación el dulzor de la sacarosa, es 300 veces mayor para el Steviósido y 450 veces mayor para el Rebaudiósido A.
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Tanto el Steviolbiósido como el Rebaudiósido B son débilmente dulces, en tanto que el Steviol es insípido.
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Reactivos: Metanol y cloroformo (grado
analítico). Metanol, acetonitrilo y Agua (grado
HPLC)
Equipo: HP series 1100 sistema HPLC
(Hewlett-Packard, Avondale, PA), también con una columna amina NH2 column Zorbax, 5 um, 150 X 4.6 mm (Du Pont, Wilmington, DE), automuestrador G1313A, UV-DAD detection y un software (Chemstation integration Software).
Equipo HPLC y Reactivos a
utilizar
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Preparación de la Muestra
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Las hojas son secadas en un horno con una temperatura aproximada de 60°C.
10 muestras de polvo (dp<30 mesh ASTM) 0.595mm de hojas secas de S. rebaudiana son replicadas en tamaño de 1g.
Se procede a una extracción en un sistema soxhlet secuencialmente con cloroformo (200mL) por 3 horas y metanol (200mL) por 5 horas
Preparación de la muestra
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Equipo Soxhlet en serie
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Se debe tener en cuenta que las hojas de stevia es una mezcla compleja de varios compuestos por lo cual se debe hacer extracciones según las polaridades de los componentes y de solventes.
Las etapas secuenciales de extracción se realizan con una primera extracción con un solvente de polaridad intermedia para remover impurezas , su extracto esta libre de glicósidos diterpénicos. Normalmente se utiliza Cloroformo (grado analítico).
Justificación del procedimiento de
Extracción con sistemas soxhlet
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Secuencialmente se realiza una segunda extracción con un solvente de polaridad alta, para poder tener en el extracto los glicósidos diterpénicos. Normalmente se utiliza Metanol (grado analítico).
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Los extractos de metanol son evaporados en un rotovaporador para secado en vacío
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Se disuelve en porciones de 50mL de metanol grado-HPLC.
Alicuotas (2mL) de cada solucion son filtradas (Syringe Filter, Nylon, 0.22 um)
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Luego son pasados a través de una pre-columna de limpieza
Finalmente podemos ingresarlo al equipo HPLC, inyectando 5uL.
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Para optimizar la separación de los azúcares glicósidos diterpénicos , steviósido y Rebaudiósido A, utilizamos la siguiente condición de operación HPLC:
Elución Gradiente: 84:16 a 70:30, v/v, acetonitrilo/agua(pH 5),el gradiente lineal cambia dentro del periodo de 15 min, , flujo 2mL/min; UV detector 210nm, Temperatura ambiente
Elución Isocrática: 80:20, v/v, acetonitrilo/agua(pH 5), flujo 2mL/min; UV detector 210nm, Temperatura ambiente
High-Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
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Los compuestos en cada muestra son identificados mediante la comparación de sus tiempos de retención con los de los estándares de referencia (Patrones).
Características cromatográficas del esteviósido y rebaudiósido A se muestran en la Tabla 1.
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Ejemplo de un Cromatograma de Stevia
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Se ha analizado varios procedimientos para la separación de azúcares glicósidos diterpénicos para poder inyectar al equipo HPLC y poder tener un cromatograma de nuestros analítos, hemos escogido este procedimiento ya que ha sido comprobado y consta en varios papers, este documento nos ayudará para su posterior uso en diferentes etapas de investigación para la industria de Stevia.
Conclusión