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Análisis Citométrico de la Función
Plaquetaria: Técnicas de Análisis
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ESTUDIO CLINICO DE LA HEMOSTASIA: INTEGRACION DE FUNCION PLAQUETARIA Y COAGULACION
• El estado actual del conocimiento de la hemostasia, su regulación y su patología exige incluir el análisis de la función plaquetaria en el estudio de los fenómenos prohemorrágicos y protrombóticos.
• El desarrollo actual de la citometría de flujo la convierte en una tecnología de elección para ese fin.
• La disponiblidad de técnicas citométricas en sangre entera potencia el valor diagnóstico y pronóstico de la citometría de flujo en el estudio clínico de la hemostasia.
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LA PREGUNTA CLAVE:¿HAY VIDA MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA?
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LA RESPUESTA:HAY VIDA (SIN NUCLEO) MAS ALLA DE ESTE HISTOGRAMA!!!
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LAS DIEZ MEJORES “EXCUSAS” PARA NO ESTUDIAR LA FUNCION PLAQUETARIA POR CITOMETRIA DE FLUJO
• Los citómetros de flujo son para analizar leucocitos.
• Las plaquetas son demasiado pequeñas para ser detectadas.
• Las plaquetas sólo se pueden estudiar en forma de PRP.
• Las plaquetas se activan con mucha facilidad.
• No hay marcadores fenotípicos de plaquetas.
• Hay demasiados marcadores fenotípicos de plaquetas.
• Pero si en la Hemostasia lo importante es la coagulación...
• Pero si ya se usa un contador de plaquetas...
• Pero si ya se usa el agregómetro...
• Pero si ya las estudian en el Centro de Transfusiones...
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ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA
• Permite estudiar la función plaquetaria en condiciones cuasi-fisiológicas
• La manipulación mínima previene la activación artefactual de plaquetas
• Evita la pérdida potencial de subpoblaciones plaquetarias
• Requiere pequeños volúmenes de muestra (pocos microlitros de sangre)
• Permite el análisis simultáneo de plaquetas y otras células sanguíneas
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ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN SANGRE ENTERA
PE
L
+ADP
+ADPBASAL
BASAL
WB PRP GFP WP Positive control
0
20
40
60
80
100
*
*
*
% P
late
lets
CD
62P*
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ESTUDIO COMPLETO DE LA HEMOSTASIA: CITOMETRIA FUNCIONAL VERSUS AGREGOMETRIA
ADP
SS Log
FS
Log
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CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
Hasta ahora, el análisis citométrico de
plaquetas más habitual es el de anticuerpos
antiplaquetarios:• Autoanticuerpos
• Aloanticuerpos:
• Inmunofenotipo de HPA-1a
• Detección de anticuerpos maternos y fetales anti-
HPA-1a
• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en
trombopenias
• Analisis de IgG asociadas a plaquetas en
aloinmunización
• Cross-match de plaquetas
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• La función plaquetaria también se puede analizar
ampliamente en sangre entera por citometría de flujo• Activación plaquetaria in vivo• Reactividad plaquetaria in vitro• Interacciones plaqueta-plaqueta• Interacciones plaquetas-leucocito• Interacciones plaquetas-eritrocito• Liberación de micropartículas procoagulantes• Alteraciones en el recuento de plaquetas• Alteraciones en la morfología de la plaqueta• Maduración normal y patológica de la plaqueta• Monitorización del tratamiento antiagregante
CITOMETRIA DE FLUJO EN EL ANALISIS DE PLAQUETAS
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ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
ANALISIS DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
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• La preparación y el procesamiento de la muestra deben
ser cuidadosos para mantener las funciones intrínsecas
• Las condiciones del análisis citométrico se deben
adaptar para acotar la población de plaquetas
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
RBC
Plaquetas
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• La extracción debe realizarse en reposo y con el
mínimo traumatismo
• Se recomienda desechar los primeros mL de muestra
• La sangre entera se debe anticoagular con citrato
• Las muestras se diluyen (1:100) para minimizar la
formación de agregados plaquetarios
• Se utiliza un anticuerpo monoclonal contra una proteína
constitutiva de la superficie de la plaqueta para identificar
y seleccionar la población plaquetaria
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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• Preparar todos los reactivos necesarios anticipadamente• Dispensar la sangre sobre anticoagulante• Diluir la sangre (antes de 30 min) con el tampón adecuado• Opciones de ensayo:
Þ Fijar MarcarÞ Activar Fijar MarcarÞ Activar Marcar FijarÞ Marcar Activar FijarÞ Marcar y activar simultáneamente Fijar
• Diluir en tampón adecuado o fijador• Analizar p0or citometría de flujo
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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Muestras fijadas
• Ventajas:• Fácil de realizar antes de 30
minutos de la toma de muestra• Mejor estimación estática del
estado de activación plaquetario
• Desventajas:• Impide estudiar las respuestas de
activación plaquetaria• Algunos epitopos se pueden
alterar por el fijador
Muestras frescas
• Ventajas:• Posibilidad de medir la
activación plaquetaria in vivo y la reactividad plaquetaria a varios agonistas
• Desventajas:• La preparación es crítica debido
a la activación espontánea de las plaquetas con el tiempo
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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• En ausencia de agonistas exógenos se determina el estado de activación in vivo de las plaquetas circulantes
• La adición de un agonista permite analizar la reactividad in vitro de las plaquetas circulantes.
+ADPBASAL
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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• Los agonistas más utilizados para la estimulación
de plaquetas son:
• Agonistas fuertes: Trombina y TRAP
• Agonistas débiles: ADP, Colágeno, Tromboxano A2
• Ionóforos de Calcio: Ionomicina, A23187
• Esteres de forbol: PMA
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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BASAL COLLAGEN
ADP THROMBIN
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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[ Ca2+
[
= 100 nMPlaqueta en
reposo
Plaqueta
activada
STD
gránulos densos
mitocondrias
gránulos a
Ca2+ en sangre = 10.000 en citosol
Ca2+
Ca2+
Canales específicos
GPIIb/IIIa
Ca2+
STD
GD
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• La respuesta plaquetaria se puede estimar con:
•Anticuerpos monoclonales contra marcadores de
activación
•Fluorocromos específicos de funciones bioquímicas
•Parámetros morfológicos asociados a cambios
funcionales
CD62P
Con
taje
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro
Ca libre citosólico 2+
Actina G
Cambio detectado
Aumento reversible
Polimerización a Actina F
Marcador Citométrico
FLUO-3 AM
Falacidina
Faloidina
Cambios en FS
Cambios en SS
Emisión de Fluorescencia
Aumento reversible
----
Aumento reversible
Tamaño
Granularidad
Aumento o Disminución
Desgranulación
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PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Mepacrina
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Gránulos densos(Número)
Complejosgp IIb/IIIa(Número)
Complejosgp b/V/IX(Número)
Liberación delcontenido
Disminución ensuperficie
Aumento ensuperficie
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Disminución
Disminución
Aumento
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PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Complejosgp IIb/IIIa
Conformaciónalterada
Conformaciónalterada
Unión deligandos
Expresión deLIBS y RIBS
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
contra ligandos
Anticuerposespecíficossimultáneos
Anticuerposespecíficos
contra neoepítopos
Aumento
Aumento
Aumento
Modificación dela resonancia de
fluorescenciaFRET
![Page 24: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/24.jpg)
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Fosfolípidosaniónicos
Aumento Aumento
Aumento
Aumento Aumento
Aumento
Factores de lacoagulación
CD62P(P-Selectina)
CD63(gp53)
Aumento
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
contra V y VIIIa
Annexina V
Aumento
![Page 25: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/25.jpg)
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
CD107a(LAMP-1)
CD 107b(LAMP-2)
Gp40
CD40L
Parámetro Cambio detectadoMarcador
CitométricoEmisión de
Fluorescencia
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Aumento
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
Anticuerposespecíficos
![Page 26: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/26.jpg)
PARAMETROS CITOMETRICOS DE ACTIVACION PLAQUETARIA
Detección de plaquetas activadas in vivo:• Objetivos:• Detección de plaquetas activadas circulantes• Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico
• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre completa periférica• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
![Page 27: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/27.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Detección de plaquetas activadas ex vivo:• Objetivos:• Determinación de la respuesta a agonistas exógenos• Estimación del riesgo protrombótico o prohemorrágico• Monitorización de tratamientos antiplaquetarios• Caracterización del perfil de activación plaquetaria
• Aspectos metodológicos:• El análisis se efectúa en sangre periférica• Activación con agonistas plaquetarios: ADP, trombina, etc.• Identificación de plaquetas: CD41, CD49 o CD61 con PE• Cuantificación de P-selectina: CD62P-FITC• Cuantificación del receptor activo de fibrinógeno: PAC-1 FITC
![Page 28: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/28.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
TUBO MUESTRA Agonista CD41-PE+CD62P-FITC
Solución Stop(Tyrode a
+4°C)0 40µL None 10µL + 5µL 2 mL
1 36µL 4µL of 50µMADP
10µL + 5µL 2 mL
2 36µL 4 µL of100µMTRAP-6
10µL + 5µL 2 mL
TIEMPO 10 min37°C
5 min37°C
Análisis en+/- 15 minutos
Análisis de laActivación
ex vivo
Análisis de la activación
in vitro
Procedimiento típico de un ensayo de activación plaquetaria
![Page 29: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/29.jpg)
Anticuerpos CD41/GPIIb
Clone Bindingconditions
Epitope resistantto fixation
Special effect Forms andPart. No
P2 Only whenCD41 isnaturally
complexed toCD61 (GPIIIa)
Yes
Blocks thebinding offibrinogen toplatelets;inhibitsaggregation
IM0145
IM0718 Biot
IM0649 FITC
IM1416 PE
SZ22 CD41 evendissociatedfrom CD61
ND
None
IM0539
IM0720 Biot
IM1756 FITC
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
![Page 30: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/30.jpg)
Clone Bindingconditions
Epitope resistantto fixation
Special effect Forms andPart. No
SPAN12 Only on intactThrombin
receptor, i.e.before theactiation ofthrombin
No
Inhibitsthrombin-activation
IM2086
IM2583 PE
WEDE15 Both on intactand thrombin-
cleavedreceptor No
None
IM2085
IM2584 PE
Anticuerpos contra el receptor de trombina
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
![Page 31: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/31.jpg)
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
50
1006D1 (GP1b)AK1 (GP1b/IX)FMC25 (GPIX)S12 (P-selectin)PAC110E5 (GPIIb-IIIa)OKM5 (CD36)
5.0
[Thrombin] U /ml
Perc
ent o
f Max
imal
Fluo
resc
ence
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
![Page 32: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/32.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Expresión de P-selectina (CD62P):
CD62P-FITC
+ ADPBASAL
+ADP
BASAL
FS
log
CD62P-FITC
Con
taje
![Page 33: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/33.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:• Objetivos:·Medición del riesgo protrombótico o prohemorrágico·Monitorización de tratamientos antiplaquetarios·Caracterización del perfil de activación plaquetaria
• Aspectos metodológicos:·El análisis se efectúa en sangre periférica·Activación con agonistas específicos·Identificación con CD41, CD49 o CD61 con PE·Medida cinética de la liberación de calcio con Fluo-3 o Fluo-4
![Page 34: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/34.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:
+ADP
![Page 35: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/35.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA ACTIVACION PLAQUETARIA
Inducción de la activación:
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ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Medida de la expresión de superficie procoagulante:
• Objetivos:• Cuantificación de la expresión de fosfatidilserina en la
superficie de la plaqueta activada
• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
Aspectos metodológicos:
• El análisis se efectúa en sangre periférica
• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
• Medida de fosfatidilserina con Anexina V-FITC
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ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Medida de la expresión de superficie procoagulante:
![Page 38: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/38.jpg)
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:• Objetivos:• Detección y cuantificación de fragmentos circulantes de
membrana plaquetaria que expresan fosfatidilserina
• Diferenciar micropartículas activadas y no activadas
• Evaluación de la contribución plaquetaria a la coagulación
Aspectos metodológicos:
• El análisis se efectúa en sangre periférica
• Identificación con CD41 o CD61 con PE o PC5
• Medida de fosfatidilserina con Annexina V-FITC
• Método normalizado en Biocytex
![Page 39: Análisis Citométrico de la Función Plaquetaria: Técnicas de Análisis](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022012317/54bb580449795958418b5c2d/html5/thumbnails/39.jpg)
BASAL
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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A23187 67mM
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
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A23187 67mM
ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
BASAL
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ANALISIS CITOMETRICO DE LA FUNCION PLAQUETARIA
Análisis cuantitativo de micropartículas plaquetarias:
Number of Pathological Samples : n = 22
Test A Test B
CD61/CD41 Annexin V/CD41
Mean 7745 1362
SD 3474 570
Range 1839 - 13620 400 - 2280
Results expressed in number of events / µl whole blood
Micropartículas activadas
Micropartículas plaquetarias
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A B C
D E
F
G
RBC
Plaquetas
ADP
Basal
ADPADP
A23187A23187 Basal
ADPBasal
EJEMPLO DE ANALISIS CITOMETRICO INTEGRADO DE LA FUNCION PLAQUETARIA