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Analisi di tossine algali tramitecromatografia liquida/spettrometria di massa
e-mail: [email protected] Bogialli, Antonio Di Corcia
Università di Roma,“La Sapienza”Dipartimento di ChimicaPiazza Aldo Moro, 5
00185 Roma
I CIANOBATTERI POTENZIALMENTE TOSSICI: IMPLICAZIONI SANITARIE E GESTIONE DEL RISCHIODipartimento Ambiente e connessa Prevenzione Primaria
Roma, 15 novembre 2007
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2
SPETTROMETRIA DI MASSA: PERCHE’?
Quando c’è necessità di risposte affidabili
sulla presenza di contaminanti
Sviluppo di metodi basati su LC/MS tandem per l’analisi di tossine algali
“ I metodi basati soltanto sull’analisi cromatografica, senza l’uso di un rivelatore spettrometrico, non sono utilizzabili come metodi di conferma”
(Dir. 2002/657/CE)
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3
H
HCH3
H
CH3
H
H
NH
CH3
HO
NH
COOHH
N
O
CH3
CH2
NH
O
CH3
H
R1
O
R2
O
NH
H CH3
COOHH
CH3
O
(5) Adda
(6) D-Glu (7) N-metildeidroalanina (Mdha)
(1) D-Ala
(3) D-eritro-ββββ-metilAsp
CIANOTOSSINE SELEZIONATE
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4
Adda (3) D-Glu (iso) (4)
N -methyldehydrobutyricacid (Mdhb) (5)
Arg (2)D-erythro- ββββ -methylAsp (1)
COOH
H
C H3
O
CH 3
H
CH 3HN H
O
O
C H3
O
NNH
O
H
CH 3
N H
H
H
CH3
H
CH 3H
H
N H
NH 2
N H
O
NH
H COOH
Nodularina
(STANDARD INTERNO PER L’ANALISI DI ACQUA DI LAGO)
CIANOTOSSINE SELEZIONATE
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5
CylindrospermopsinaAnatossna-a
CIANOTOSSINE SELEZIONATE
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6
0,5 L acqua di lago
EXTRACELLULARE TOTALE
4°C -18°C
0,45 µm FASCIA NERA
ESTRAZIONE DI MCs DA ACQUA: SPE
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7
a) 0,5 L acqua di lago (0,5 g GCB)
• evaporazione a 50evaporazione a 50°°CC
•• ricostituzione delricostituzione delresiduoresiduo
•• iniezione 50/250 iniezione 50/250 estratto finaleestratto finale
b) RI-ESTRAZIONE DEGLI ANALITI
Eluizione in back-flushing:
1 mL CH3OH + 4 mL CH2Cl2/CH3OH (80:20 v/v)
10 mmol/L TFA
PROCEDURA DI ESTRAZIONE PER MCs: SPE
Procedura utile per MC-LW
SI AGGIUNGE LA NODULARINACOME COMPOSTO DI CONTROLLO
PER L’ESTRAZIONE (QC o SS)
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8
PRESTAZIONI DEL METODO DI ESTRAZIONE
96 ± 6MC-LW
102 ± 5MC-LA
100 ± 5MC-LR
98 ± 6MC-YR
102 ± 8NOD
99 ± 6MC-RR
Resa diestrazione, %
Composto
0,5 L di ACQUA DI LAGO n=4 100 ng/L
•Applicabile ad acqua potabile e di lago•Volumi da 0,5-2 L •Indipendente dalle
concentrazioni di tossine
METODO DI ESTRAZIONE AFFIDABILE E ROBUSTO
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9
CYL e ANA-a NELLE ACQUE
5 mL campione + IS
filtrazione
0.5 mL iniettati direttamente all’apparato LC/MS/MS
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
411
10,24
11,04
11,04
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00Time0
100
%
0
100
%
0
100
MRM of 3 Channels ES+416 > 336
416 > 194652
159 > 142
1,40e5
MRM of 3 Channels ES+
MRM of 3 Channels ES+
%
A
B
C
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
411
10,24
11,04
11,04
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00Time0
100
%
0
100
%
0
100
MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+416 > 336
416 > 194652
159 > 142
1,40e5
MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+
MRM of 3 Channels ES+MRM of 3 Channels ES+
%
A
B
C
Acqua di lago contaminata con 1000 ng/L CYL
IS
CYL
CYL
LOQ = 300 ng/L
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10
CYL e ANA-a NELLE ACQUE
5 mL campione + IS
filtrazione
0.5 mL iniettati direttamente all’apparato LC/MS/MS
Acqua di lago contaminata con 50ng/L
di ANA-aLOQ 13ng/L
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11
Sistema di separazione
cromatografica
Sorgente di ioni
Analizzatore di massa
Rivelatore
Presentazione del segnale
Elaboratore di segnale
Campione
A B C
m/z
LC/MS
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12
MRM MODE
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13
MRM MODE
![Page 14: Analisi di tossine algali tramite cromatografia liquida ...old.iss.it/binary/baaq/cont/Metodi chimici_LCMS_Bogialli.119702768… · Sviluppo di metodi basati su LC/MS tandem per l’analisi](https://reader030.vdocumento.com/reader030/viewer/2022011820/5f656d45177c6b5aed014664/html5/thumbnails/14.jpg)
14
MRM MODE
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15
Modalità di acquisizione ESI+, MRM
Scelta di due transizioniper ciascun analita
Adda
m/z 135
N H
C H3
C H3
CH3
O
C H O H
H++
+
N H
C H3
C H3
CH3
O
C H33
O H
+
O C H3
++
[M+2H]2+
ANALISI LC/MS/MS
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16
PRECURSOR ION SCAN
OCH3
++OCH3
++ Ar
Ar
Ar
O C H3
++
IDENTIFICAZIONE MCs IN FULL-SCAN
Collision cellQ1 Q3
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17
PRECURSOR ION SCAN inj 50/500 RETINATA ALBANO
450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100m/z0
100
%
2: Parents of 135ES+ 981
[M+H]+
inj 50/500 RETINATA ALBANO
450 452 454 456 458 460 462 464 466 468 470 472 474 476 478 480 482 484 486 488 490 492 494 496 498 500 502 504 506m/z0
100
%
1: Parents of 135ES+ 491
[M+2H]2+
Demetil-MC-LR(Albano,dicembre 2004)
MC-LR [M+H]+ 995MC-YR
00,00,00,inj 50/500 RETINATA ALBANO
5,40 5,60 5,80 6,00 6,20 6,40 6,60 6,80 7,00 7,20 7,40 7,60 7,80 8,00 8,20 8,40 8,60 8,80 9,00 9,20 9,40 9,60
Time0
100
%
0
100
%
2: Parents of 135ES+ 6,956,34
1: Parents of 135ES+ 6,96
6,32
?
?
Full-scanbicarica
Full-scanmonocarica
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18
MeOH
ACN
ISOMERI Dem-MC-RR
470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540m/z
0
100
%
470 475 480 485 490 495 500 505 510 515 520 525 530 535 540m/z
0
%
512.5
513
513.5
Eluizione a gradiente
Quantificazione: stessa risposta
molare
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19
CROMATOGRAMMA MCs 50 ng/L
4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00Time0
100
%
0
100
%
MC-RR
MC -YR
MC-LR
IS
MC -LA
MC-LW
0
100
%
0
100
%
0
100
%
-
-
0
100
%
4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00Time0
100
%
0
100
%
MC-RRMC-RR
MC -YR
MC-LR
IS
MC -LA
MC-LW
0
100
%
0
100
%
0
100
%
-
-
0
100
% È possibile quantificare le MCs a conc.comprese tra
2 ng/L (MC-RR)
e 9 ng/L (MC-LW)
0.5 L acqua di lago contaminata con 50 ng/L MCs(20 volte inferiore al limite di
attenzione OMS)
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20
MONITORAGGIO LAGHI DI ALBANO E VICO
centro sup.-5 m-10 m-15 m-20 m-25 m-30 m
Specie algali presenti nei laghi : Planktothrix rubescens (MCs)
Cylindrospermopsis raciborskii , Albano (CYL)
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21
MONITORAGGIO LAGHI DI ALBANO E VICO
Progetto in Collaborazione con
Università di Roma Tre e Regione Lazio
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22
CYL ALBANO
Cylindrospermopsis raciborskii fioritura estiva (2004)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
sup. -5 -10 -15 -20 -25 -30
m
[CY
L],
ug/L
SETTEMBRE OTTOBRE NOVEMBRE
Dato mancante
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23
ALBANO: PROFILO DI PRODUZIONE MCs
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
sup. -5 -10 -15 -20 -25 -30
PROFONDITA' [m]
C [u
g/L]
MC-YR Dem MC-RR Dem MC-LR
Albano aprile 2005, contenuto totale
Microcistine rivelate:
1. Dem-MC-RR (2 isomeri)
2. MC-RR
3. MC-YR
4. Dem-MC-LR
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24
VICO: CAMPIONE DI POZZO
00,02-Feb-200700,25/250 500 ml VICO DICEMBRE POZZO 5 F.N.+ 25 ng NOD(SURR) +7.5 ng IS B.E.crom.come MCTESSU614
2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 3: MRM of 6 Channels ES+ TIC
4,36e4
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 2: MRM of 9 Channels ES+ TIC
1,71e3
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ Sum
1,12e3
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ 512,5 > 134,8
493
Dem-MC-RR
NODULARINA (SURROGATO)
IS
00,02-Feb-200700,25/250 500 ml VICO DICEMBRE POZZO 5 F.N.+ 25 ng NOD(SURR) +7.5 ng IS B.E.crom.come MCTESSU614
2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00Time0
100
%
0
100
%
0
100
%
0
100
%
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 3: MRM of 6 Channels ES+ TIC
4,36e4
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 2: MRM of 9 Channels ES+ TIC
1,71e3
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ Sum
1,12e3
MCTESSU2088 Sm (Mn, 2x1) 1: MRM of 5 Channels ES+ 512,5 > 134,8
493
Dem-MC-RR
NODULARINA (SURROGATO)
IS
pozzo 5 campionato a dicembre 2006. Il campione risulta contaminato da dem-MC-RR (~ 4 ng/L).
QC ESTRAZIONE
QC DETECTOR
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25
1 g
5 g
ESTRAZIONE DA CAMPIONI DI PESCE: MSPD
FORNOGC
POMPA HPLC
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26
COLONNA C-18FASI MOBILI
H20 10 mM HCOOHACN 10 mM HCOOH
ACQUISIZIONE IN MODALITA’MRM (Multi Reaction Monitoring),
IONOZZAZIONE POSITIVA
ESTRAZIONE DA CAMPIONI DI PESCE: MSPD
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27
0
10
20
30
40
50
60
70
80
ANA MC-RR NOD MC-YR MC-LR MC-LA MC-LW
RE
CO
VE
RY
(%
)
60°C 80°C 100°C
ESTRAZIONE CON MSPD + HOT WATER
Condizioni di estrazione:4 mL H2O 10 mM HCl 80°C
3.863 (4)51 (4)MC-LW
3.172 (9)50 (8)MC-LA
4.071 (9)49 (7)MC-LR
3.976 (9)51 (8)MC-YR
1.680 (5)45 (8)NOD
1.662 (6)41 (3)MC -RR
0.574 (5)38 (10)ANA-a
LOQ, ng/gH2O (pH 2)H2OComposto
Applicabile a 4 diversi tipi di pesce di lago (persico, carassio, muggine e trota)
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28
Omogenizzazione del campione
Estr. con solventi organici
e centrif.
Purificazione degli estratti ⇒⇒⇒⇒ SPE
Evap. e concentr. degli estratti
Ridissoluzione degli estratti
Iniezione nel sistema LC/MS
ANALISI DI CONFERMA TESSUTI:TEMPI
Preparazione del campione (MSPD)
Estrazione con acqua (HWE)
Iniezione diretta e analisi LC/MS
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29
Tutti i bianchi presentano un composto incognitocon lo stesso ione molecolare, stesso pattern di
frammentazione e tempo di ritenzione vicino a quelloall’anatossina-a.
Falso positivo dell’anatossina-a
COMPOSTO INCOGNITO FENILALANINA
ANA-a IN CAMPIONI BIOLOGICI
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30
O
NH2
OH
CONFRONTO ANA-a E Phe
52.8%27%10.5%9.7%165.234Ana-a
13.4%50%34.4%2.2%165.191Phe
166 >>>> 149166 >>>> 131166 >>>> 107166 >>>>91
Transizioni, (m/z) e abbondanze relativeMassa esatta,
(m/z)Composto
CH3
O
NH
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31
ANA-a NEL PESCE
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32
CONCLUSIONI
•Sviluppo di un metodo specifico e sensibile per la determinazione di MCs a livelli di pochi ppt nelle acque
•Sviluppo di un metodo specifico e rapido per la determinazione di MCs e ANA-a a livelli di pochi ppb in 4 diversi tipi di pesce
•Iniezione diretta di CYL e ANA-a con LOQ di 300 ppt e 50 pptnelle acque
•Possibilità di determinare MCs di cui non si possiedono gli standard
•Monitoraggio del lago di Albano e Vico: si evidenza la presenza di 4 varianti di MCs e CYL, con concentrazioni totali superiori al
limite di attenzione per MC-LR
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RINGRAZIAMENTI
1. Bogialli, S. et al. Environ. Sci. Technol., 2006, 40, 29172. Bogialli, S. et al. J. Chromatogr A,. 2006, 1122, 1803. Bogialli, S. et al. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6586
Pubblicazioni
Gruppo di lavoro Prof. Di Corcia