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6 LAGARTOS
3 LAGARTOS
1 LAGARTO
CRISTALES DE PROTEÍNA
Tamaño. Forma
Frágiles. Sensibles
- Interacciones débiles- Alto contenido de solvente (20-80%)
* Difusión Derivados complejos* Estructura Nativa
No-centrosimétricos
- Sólo 65 G. Espaciales
Alto volumen celdilla elemental
- Gran número de reflexiones- Baja intensidad del espectro- Intensidad decrece drásticamente en el tiempo
CRISTALIZACIÓN
Principio:- Mínimo de solubilidad- Población única
* Difusión Derivados complejos* Estructura Nativa
Factores:
- {Proteína}: 5-30 mg/ml- {Precipitante}: sales, disolventes, PEG- pH: buffer- T: 4,20º- Aditivos:
- Iones M- Inhibidores- agentes reductores
DIFUSIÓN DE VAPOR
Precipitante
Proteína + Precipitante
1mm
N2
X-Ray
Detector
La debe ser proporcional al tamaño del objeto.
La distancia entre puntos es inversamenteproporcional a la distancia entre nudos de la red.
A medida que nos alejamos del centro ladifracción es más débil.
La geometría de los puntos de difracción estárelacionada con la geometría de la red.
PROBLEMA DE LA FASE
EspacioReal
EspacioRecíproco
Densidadelectrónica (x y z)
Factor deestructura
|F(h k l)| + (h k l)
TF
siempre
???
(x y z) = 1/V |F(h k l)| exp {-2i (hx+ky+lz)+ i (h k l)}
I(h k l) |F(h k l)|2
??
SOLUCIÓNRemplazamiento MolecularRemplazamiento IsomorfoMAD
FAMILIA ESTRUCTURAL GLOBINAS
Hemoglobin (ascaris suum) Hemoglobin (lucina pectinata) Hemoglobin (urechis caupo)
Myoglobin (sperm whale) Leghemoglobin (lupinus luteus) Hemoglobin (glycera dibranchiata)
1mbc 2gdm 2hgb
1flp 1ithb1ash
Percentage identity matrix
1flp 1001ithb 22.8 1002gdm 21.2 18.0 1001mbc 18.5 15.1 17.0 1002hbg 24.4 23.1 19.9 22.1 1001ash 13.3 10.1 15.8 15.9 14.6
REMPLAZAMIENTO MOLECULAR
Determinar las posiciones de las moléculas dentro de la celdilla cristalina.
Modelo Cuerpo Rígido Función de Rotación
Función de Translación
Parámetros:- Completitud y calidad de los datos.
- Homología entre el modelo molecular y las moléculas reales que constituyen el cristal ( > 30%).
- Tamaño del modelo molecular respecto al contenido de la celdilla.
REMPLAZAMIENTO ISOMORFO MULTIPLE - MIR
Incluir átomos pesados en el cristal nativo que queden en posiciones fijas de la molécula sin deformar ni la celdilla ni la conformación de la proteína.
LAS DIFERENCIAS EN INTENSIDADES DEBEN SEREXCLUSIVAMENTE DEBIDAS A LOS ATOMOS PESADOS
MÉTODO:
1. Preparación de, al menos, un derivado (Hg, Au, Pt, U, Sm...Xe,Kr).
2. Toma de datos de difracción para nativa y derivados.
3. Aplicación de función de Patterson y obtención coordenadas del metal.
4. Refinamiento parámetros átomo pesado y cálculo ángulos de fase.
5. Cálculo de mapas de densidad electrónica de la proteína.
MIR
Derivado de Sm de Hal2
INCONVENIENTES:
1. Errores en |FPH| y |FP|.
2. No isomorfismo (4% < dmin).
3. Desorden en sitios minoritarios.
4. Escalado.
MAD
VENTAJAS:
1. No hay problemas de isomorfismo.
2. Da mejores resultados a alta resolución.
DISPERSIÓN ANÓMALA:
Espectro de fluorescencia de un cristal de proteína con Se-Met.
Para determinadas E del haz de Rayos X se produce un fenómeno de absorción y resonancia de electrones
de capas internas.
Modificación de la contribución del átomo pesado a cada spot de difracción (efecto anómalo).
F(h k l) F (-h, -k, -l)
( |F|anom)2 (x, y , z) anom
MÉTODO:
1. Inclusión de dispersores anómalos en la estructura.
Categoría Dispersor Anómalo
Metaloproteínasmetales de transición Fe, Cu, Zn, Mnotros metales Ca, Mo
Remplazamiento de metalesCa2+, Mg2+ por Lantánidos Tb,Ho,YbZn por Mercurio Hg
Complejos con átomos pesadosderivados comunes Pt,Au,Hg,Pb,W,UCompuestos con “cluster” Ta,W
Proteínas modificadasSelenometionina o selenocisteína SeTelurometionina Tenucleótidos Bromados o Iodados Br, I
2. Medida del espectro de absorción.
3.Toma de datos de difracción de rayos X a diferentes longitudes de onda.
4. Medida de los pares de Friedel { (h k l ), (-h, -k -l)}
INCONVENIENTES:-Medidas cuidadosas.
-Uso de diferentes Radiación sincrotrón.
MAD
|FCAL| + CAL
SÍNTESIS DE FOURIER
{(x y z)}
(x y z) = 1/V |FOBS| exp {-2i (hx+ky+lz)+ iCAL}
F= fj exp{2i(hx+ ky+ lz)}
|FOBS| DATOS EXPERIMENTALES
Cristalógrafo
MR - MIR - MAD
MR - MIR - MAD
MODELO INICIAL ERRORES GRAVES
MEJORA DE LAS FASES
REFINAMIENTOMODELADO
MODELO FINAL
- Gráfico- Experiencia Cristalógrafo- Elimina errores más graves
- Analítico.-Datos estereoquímica
REFINAMIENTO
El modelo cambia para minimizar las diferencias entrelos datos experimentales y los obtenidos a partir delmodelo.
ET = Exray + Eempirical
Exray= {|FOBS | - k |FCAL|}2
Eempirical=bonds Kb(b-bo)2 + angles K(- o)2 + torsional K(1+ cos(n-))+ VDV +......
TIPOS:
- Mínimos cuadrados. - Gradiente conjugado. - Dinámica Molecular.
T
U(x)
x
CONTROL: - Estereoquímica. - Factor de desacuerdo, R.
R {|FOBS | - k |FCAL|}/ {|FOBS | }
MAPA DE DENSIDAD ·ELECTRÓNICA
El mapa de densidad electrónica depende de la resolución.
BAJA: 5Å
MEDIA: 3Å
ALTA: 1.7Å
TRAZADO DE LA CADENA POLIPEPTÍDICA
MODELO FINAL CON ESFERA DE SOLVATACIÓN
VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL
Plot de Ramachandran
1. R y Rfree (R < 0.2, Rfree =R+(5-10)% )
2. Estereoquímica del modelo frente a la ideal.
3. Distribución de factores térmicos.
4. Ajuste en densidad.
VALIDACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL
.......................................................................ATOM 1 CB ASP 9 -31.877 64.364 9.711 1.00 37.33 6ATOM 2 CG ASP 9 -31.408 65.701 9.162 1.00 41.83 6ATOM 3 OD1 ASP 9 -32.254 66.612 8.998 1.00 44.35 8ATOM 4 OD2 ASP 9 -30.189 65.848 8.918 1.00 43.38 8ATOM 5 C ASP 9 -32.205 62.836 7.764 1.00 28.21 6ATOM 6 O ASP 9 -31.876 63.319 6.683 1.00 30.25 8ATOM 9 N ASP 9 -33.860 62.883 9.631 1.00 33.61 7ATOM 11 CA ASP 9 -32.913 63.691 8.811 1.00 31.98 6.......................................................................
MODELO ESTRUCTURAL FINAL
FICHERO DE COORDENADAS “pdb”
Coordenadas:(x, y, z)
Factor de ocupación
Factor térmico (B)
INFORMACIÓN DEL MODELO ESTRUCTURAL
TIPOS:
- ESTÁTICA {x y z}:- Estruct. terciaria. Dominios Funcionales
- Estruct. Cuaternaria.
- DINÁMICA {B}:- Flexibilidad funcional en bucles.-Termoestabilidad.
INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA.
INTERACCIONES PROTEINA-LÍPIDOS.
INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO:
- Reconocimiento.
- Estabilización.
- Procesos Catalíticos.
SUPERFICIES MOLECULARES:
- Determinación de zonas accesibles.
- Importancia del Potencial Electrostático.
ESTRUCTURA CUATERNARIA
Concanavalina de Cannavalia Brasiliensis
La diferente agregación de los monómeros en la estructura cuaternaria provoca variaciones en su función biológica.
GCMBE
FEBS Letters 405, 114-118 (1997)
INTERACCIONES PROTEINA-PROTEINA
S-Adenosilmetionina Sintetasa
El centro activo se crea porel empaquetamiento de dos monómeros.
GCMBE (1999)
MONÓMERO
TETRÁMERO Sitio de unión a metionina
ESTRUCTURA CUATERNARIA
HAL3at
El empaquetamiento cristalino es función del estado de agregación biológico de la proteína.
GCMBE (1999)
Trímero (unidad fisiológica)
Empaquetamiento Cristalino.
FLEXIBILIDAD FUNCIONAL EN BUCLES
Lipasa Fungica Candida A
Lid
GCMBE (1999)
TERMOESTABILIDAD
GCMBE
Mutante Termoresistente TR1
B= BNAT -BMUT
Un puente salino provoca la estabilización del plegamiento.
PROTEINS 33: 567-576 (1998)
INTERACCIONES PROTEINA-LIPIDOS
GCMBE
Complejo Ternario Lipasa-Colipasa-Micela
La unión del complejoLipasa-Colipasa a una micela de sal biliar esnecesaria para su activación in vivo.
EMBO Journal Vol. 16, 18, 5531-5536 (1997)
El anclaje del complejo proteico a la micela se produce mediante residuospolares en la superficie micelar y mediante residuos hidrofóbicos y aromáticos en el interior de la micela.
INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO
Complejo ternario Hal2p-Metal-sustrato
Hal2p hidroliza PAP a AMP. Es imprescindible la presencia de metales divalentes.
EMBO Journal (1999). En prensaGCMBE
Hal2p es inhibida por Li y Na.CLAVE para la tolerancia salina ya que es esencial parala vida celular.
SITIO DE UNIÓN A METALES
SITIO DE UNIÓN AL SUSTRATO
SUPERFICIES MOLECULARES
Aspartato Descarboxilasa (PanD)
El centro activo es inaccesible. Se propone movimiento relativo de protómerospara permitir la entrada del sustrato.
Nature Struct. Biol. (1998).STRUCTURE (1999)
GCMBE
PanD descarboxila L-Asp para producir Ala.
La superficie molecular sugiere interacción con otros componentes celulares.
Barril beta doble
INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: RECONOCIMIENTO
GCMBE
-Glucosidasa de Bacillus polymyxa
El Glu 405 puede acomodar Glucosa y Galactosaal estabilizar el OH(4) ecuatorial o axial.
J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)
Glu405
INTERACCIONES PROTEINA-LIGANDO: PROCESOS CATALÍTICOS
Lipasa pancreática
La apertura del flap en el dominio catalítico permite la entrada del sustrato.
J. BIOL. CHEM. Vol.271, 18007-18016 (1996)
La estabilización del sustrato se realiza mediante residuos hidrofóbicosy la hidrólisis mediante la tríada catalítica (Ser, His, Asp).
SUPERFICIES MOLECULARESZONAS ACCESIBLES
Mutante FNR-E301A
PROTEINS. (1999).GCMBE
La mutación provoca la creación de una cavidad que modifica el procesode reoxidación de la enzima.
Od
La nueva cavidad permite el acceso del O molecular y la formación intermedio de la reacción flavin-hidroperóxido.
SUPERFICIES MOLECULARESPOTENCIAL ELECTROSTÁTICO
Mutante FNR-R264E
BIOCHEMISTRY. (1998).GCMBE
El potencial electrostático creado por los residuos cargados puede determinarla interacción entre proteína-proteína o proteína-ligando.
Líneas de campo en la FNR.
Sección del potencial en la FNR.
SUPERFICIES MOLECULARESPOTENCIAL ELECTROSTÁTICO
Octámero BglA
GCMBE
El Glu306 en la superficie del octámero podría servir como “atractor” de azucares en BglA.
J. MOL. BIOL. 275, 491-502 (1998)