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Conceptos bsicos para el trabajo en microbiologa
Laboratorio de Microbiologa Enolgica y Biotecnologa Centro de Estudios Enolgicos EEA Mendoza, INTA -Argentina
Conceptos bsicos para el trabajo en microbiologaBioseguridad Laboratorio Esterilizacin Medios de cultivo Grupos importantes para la enologa
BioseguridadMaterial de apoyo CD Comisin de Acreditacin de Lab. Microbiologa (AAM) (bioseguridad.pdf) Desinfectantes Gabinetes de seguridad biolgica (tipos y procedimientos seguros) Recomendaciones para la implementaciones de HACCP para vinos (IICA) Requisitos para los locales Control microbiolgico embotellado
Bioseguridad y Laboratorio microbiolgicoImportante conocer antes de montar un laboratorio Se trabaja con organismos vivos: microorganismos Grupos de riesgo: Tipo I: escaso o nulo riesgo individual y comunitario. Nivel de Bioseguridad I: diseo y medios de contencin. Lab bsico: mesadas microbiologa (inocuas) y tcnicas apropiadas de
Normas bsicasSeal en la puerta Informar a personal externo. Cerrar puertas durante trabajo. No pipetear con la boca No comer, beber, fumar o guardar comida ni cosmticos No usar la boca para cortar cintas o pegar etiquetas Mantener laboratorio Limpio y ordenado Contar con desinfectantes para mesadas y accidentes Lavarse las manos al abandonar el laboratorio. Inactivar todos los materiales que salen del laboratorio. Usar guardapolvo y no sacarlo del laboratorio.
Instalacin de laboratorioAdecuar el lugar (techos lisos, pisos, tuberas, iluminacin) Habitacin con puerta (corrientes) Mesadas (continua con pared) Fciles de limpiar Servicios (gas, luz, agua) Droguero y almacenamiento (heladera) Bsico: Estufa Autoclave u olla presin Heladera Balanza Equipo de filtracin con vaco Microscopio Flujo laminar (disposicin) Peachimetro y agua destilada
Mas info en: Libro Fugelsang Laboratory Setup pp 303
Campanas de flujo laminarCmaras de area limpia
No protege al operador
HEPA: se recuperan 3 partculas cuando el filtro es sometido a una dosis de 100.000 partculas Considerar procedimientos seguros (recomendaciones AAM-CD)
Decontaminantes y desinfectantesMezclas de alcohol 70% Hipoclorito de sodio + bacterias y hongos - esporas corrosivo metales
Desinfeccin general 1g/L cloro libre (1000 ppm) Soluciones comerciales (50g/L-50.000 ppm) Fenil-fenol 0,1% 1:50 (1g/L desinfeccin general) 1:10 (5g/L inactivacin virus o patgenos). Lisoform
Otros decontaminates y desinfectantes
Inactivacin de material antes de desechar o lavar Autoclave bolsas autoclavables. Sumergir material en Hipoclorito de sodio.
Introduccin a la microbiologa microscopioBinocular Importante oculares Eleccin de buena ptica Epifluorescencia?
TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS
Campo claro
Campo oscuro
Contraste de fase
USOS Y CUIDADOS Modo de enfoque Precauciones Precaucin al enfocar Objetivos secos sin aceite ni agua Cuidado al rotar los objetivos Apagar la lampara cuando no se usa Cuidar la limpieza No limpiar con alcoholes y solo papel tissue Condiciones para guardado Platina semi baja Limpiar objetivos Cubrirlo
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones Qumicos
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosCONTINUO DISCONTINUOAutoclave: 1/2 atm 3/4 atm 1 atm
Autoclave Tindalizacin112 C 30 min 116 C 20 min 121 C 15 min
IMPORTANTE: eliminar vapor qu esterilizo?
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosFlameado Estufa mechero horno elctrico 160-170 C -2 horas 180 C -1 horaQu esterilizo?
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosDiferentes tipos de filtros IMPORTANTE diam poro 0,2 m bacterias 0,45 m levaduras (ojo VBNC) 2 m filtracion no-esteril
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor humedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosEsterilizacin de superficies y ambientes U.V. Letal tiempo de exposicin 180-250 nm no penetra Ionizantes placas de petri , termolbiles
Introduccin a la microbiologa Esterilizacin Calor hmedo Calor seco Filtracin Radiaciones QumicosCIDAS o ESTATICOS Alcohol otros 70% conc./composicin
Cultivomedios de cultivo temperaturas oxgeno pH otros monitores con y sin inhibidores mesfilos aerobios-anaerobios acidricos Resistentes a cicloheximida
Microorganismos importantes para el vino
Grupos microbianos importantes para la fermentacin Levaduras Bacterias lcticas
S. cerevisiae O. oeni
VINO
Acidos orgnicos, aa, azcares, factores de crecimiento, etc.
MedioGrado alcohlico bajo pH temperaturas de almacenamiento SO2
Microorganismo alterador: es aquel m.o. que no es deseado en un lugar y tiempo determinado. Ej: M.o. benficos M.o. alteradores
Grupos microbianos importantes para control Hongos Levaduras Bacterias lcticas Bacterias acticas Bacterias mesfilas (coliformes, higiene, etc)
Levaduras: distintas especies importancia de algunas no-Saccharomyces Bacterias: eleccin de medios Mtodos especficos para vinos Interpretacin del resultado
Resultados
Expresin e incertidumbre
Origen del m.o. alteradoresTres etapas donde los m.o. pueden entrar al vino y afectar su calidad Equipamiento de bodega higiene Uva alterada acticas hongos Uva daada altera porcentajes Jugo de uva pH > 3,6 favorece S.c. BAL (Lb, Leuc., Ped.) Acticas
Materia prima
Fermentacin
Conservacin
Botella o barrica Factores higiene exclusion de O2 SO2 adecuada dosis calidad insumos (corchos)
Origen del m.o. alteradores
Hongos
Materia prima Baja higiene bodega
Podredumbre
Botrytis cinerea Alternaria Mucor Aspergillus (toxinas) Penicillium (toxinas)Otros
OTA
Bacterias lcticasPicado lctico BAL heterolctico, actico glicerol, etanol diacetilo
Fermentacin lcticaPiridinas (aa lisina y ornitina) Olor Ratn reptrogusto Fructosa Fermentacin mantica (agridulce) acrolena Amargo + fenoles
homoAc.lctico
Polisacaridos extracelulares Aceite
Acidez voltil Gas Turbidez
Aminas biogenas Carbamato de etilo
Bacterias acticas Picado acticoOxidacin del etanol Bacterias acticas Sensibles al SO2 aerobias
Gluconobacter Acetobacter
Uvas daadas
higiene bodega
control de oxigeno
Alteraciones por LevadurasVeloPichia membranifaciens Candida vini Candida krusei
Deuteromycetes
Levadura de velo (ferm y oxida) Oxidan el etanol Osmofilas algunas especies Producen acetaldehido, esteres y acidos voltiles
RefermentacionesPrincipal levadura de contaminacin en mostos concentrados Vinos edulcorados con mostoZygosaccharomyces bailii
Schizosaccharomyces pombe
Saccharomycodes ludwigii
Saccharomyces cerevisiae
Brettanomyces/DekkeraLevadura Ascomyceta FOH completa (lenta) Barricas y botellas Lenta Resistir SO2 (100 mg/L total 16-50 mg/L libre) Resistir 15% etanol
VBNCImportantes en conservacin o crianza y botella Cultivo puede dar negativo Bioluminiscencia Epifluorescencia Tcnicas alternativas alto limite de deteccin no diferencia levaduras de bacterias colorantes no carcinognicos (intercalan en ADN) decontaminacin
Nuevos fluorocromos liberados por la enzima esterasa Citometra de flujo PCR
Citometra de flujo
LASER PMT 1 PMT 2
Resultados representados en 3 dimensiones: * Tamao y estructura (SSC) / fluorescencia (FL1) * Densidad de poblacion = color - Tamao-estructura (SSC) - poblacion
- fluorescencia (FL1) - poblacion
Fin de fase exponencial de crecimiento (OH 5% vol)
2/3 de FA (OH 8% vol)
OH 11% vol
Fin de FA
Diagnostico de fermentaciones
Gewurz 2008 250
200
150
100
50
0 09-oct
11-oct
13-oct
15-oct
17-oct
19-oct
21-oct
23-oct
25-oct
27-oct
29-oct
Testigo
20 g/HLActivador complejo
40 g/HL fosfato diamonico
20
18
0,7 1,1 5,7
1
16
P p l to e m i n a m o uai n n i l o p r l l
14
7,8
12
10
8,3
8
6
11,5 6
4
9,5
2
0 Tmoin 20g/Hl Activateur complexe base de levures inactives zone 1 (levures trs actives) Zone 2 (levures actives) 40 g/Hl phosphate di-ammonique
Zone 3 (levures peu actives)
PCR en tiempo real
Tolerancia microbiolgica Criterio segn tipo de vinoVino filtrado Elevado pH Vino sin filtrar Bajo pH ( 0,5 g/L) Bajo etanol Elevado etanol Concentracin de S02 molecular Temperatura de almacenamiento
Recuento microorganismos residuales en botella 10 x 105/mL 10 x 104/mL 10 x103/mL 100/mL 10/mL 1/mL
Posibilidad de comercializacin Vinos dulces Vinos secos % riesgo alteraciones 100% 100% ++++ ++++ ++++ +++ + ( comercializacin local) ++++ Tiempo de tranquilidad Conservacin varias semanas 1 a 2 meses Varios mesesexportacin Zona segura Zona segura Zona segura
100/botella 130/L 10/botella
3 meses 4 meses Zona segura
Seminario envasado de vinos 1980
IMPORTANCIAIDENTIFICACIN del m.o. alterador Condiciones para el crecimiento Origen Deteccin
Metabolismo Incidencia Control
PREVENCION
Microorganismos contaminantes importantes para el vino
Conocer Controlar Prevenir