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INMUNOLOGA ESPECIAL
GENERALIDADES
Lic. TM Henry A. C amp os Pa juelo
06/03/2013
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Mtodos ana ltic os basados en la rea cc inAntgeno - Ant icuerpo (Ag-Ac ).
Antgeno: Estruc tura capaza de generar unarespuesta inmunolgica Y Propios
Y No prop ios
ANTGENO
EPTOPE
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Protena produc ida por el c uerpo en respuesta aalgo extrao.
Ana lito: Todo lo que se mide en una p rueba delaboratorio:
Antic uerpo
Antgeno
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CADENA LIGERA
CADENA PESADA
ZONABISAGRA
PUENTES DISULFURO (2)
REGIONESCONSTANTES
REGINVARIABLE
SITIO DE UNINANTIGNICA(PARATOPO)
ESTRUCTURA DEL ANTICUERPO IgG
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TIPOS DE ANTICUERPO
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CASO HIPOTTICO
VIRUS EPTOPE
VIH A, B, C, D, E
HEP B A, B, D, E, F
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CASO HIPOTTICO
VIRUS EPTOPE EPTOPE ESPECFICO
VIH A, B, C, D, E C
HEP B A, B, D, E, F F
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Mezc la de a nticuerpos (antisuero polic lona l) cadauno de los cua les puede unirse a d iferentes puntosde unin d el antgeno o ep top e.
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ANTGENODETERMINANTES
ANTIGNICOS
INOCULACINDEL Ag ENCONEJO
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DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACINDE ANTICUERPOS
CLULA PLASMTICA
ANTICUERPO
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LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTNDIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES
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PURIFICACIN DE ANTICUERPOS
ANTISUERO:
MEZCLA DEANTICUERPOS(POBLACINHETEROGNEA)
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ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI ANTGENO X
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Rea c tivo anti antgeno X
Ad
nti Eptope 1el Ag X
Anti Eptope 3del Ag X
Anti Eptope 2del Ag X Anti Eptope 4
del Ag X
Anti Eptope 7del Ag X
Anti Eptope 6del Ag X
Anti Eptope 5del Ag X
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Muy espec ficos para un eptope simple en unantgeno multiva lente. Se prod ucen a partir deuna lnea celula r simple usando tec nologa parahibridomas y lneas celula res de m ieloma de ra tn.
Hibridomas son c lulas tumorales prod uc toras de anticuerposque p rod ucen va rias c op ias del mismo a ntic uerpo.
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ANTGENODETERMINANTES
ANTIGNICOS
INOCULACINDEL Ag ENRATN
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DESARROLLO DE CLULAS PLASMTICAS(LINFOCITOS B ACTIVADOS) Y FORMACINDE ANTICUERPOS
CLULA PLASMTICA
ANTICUERPO
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LOS DIVERSOS ANTICUERPOS FORMADOS ESTNDIRIGIDOS A DIVERSOS EPTOPES
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CLULAS TUMORALES: Clulas de mieloma de ratn Se van a fusiona r con las c lulas p lasmticas (linfoc itos B ac tivad os)
prod uc toras de anticuerpos
Estas clulas pueden crecerindefinidamente en cultivocelular (inmortales)
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LOS LINFOCITOS B OBTENIDOS DEL BAZO DEL RATN SE FUSIONAN CONLAS CLULAS DE MIELOMA DE RATN PARA FORMAR LAS HIBRIDOMAS
HIBRIDOMAS(inmortales)
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SELECCIN YAISLAMIENTO DEHIBRIDOMASFORMADAS
Los anticuerpos que forman lasdiferentes colonias son analizadospara conocer su capacidad de unirsea un antgeno determinado
El hibridoma ms eficiente y queresulte de inters se expande
Y Por cultivo celularY Por induccin de tumores en ratones
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LOS ANTICUERPOSMONOCLONALESPRODUCIDOS SE PURIFICAN
Reconocen especficamente a un nico eptope deun determinado antgeno (poblacin homognea)
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Inmunoensayos Direc tos: Med ic in d irec ta delc omp lejo Ag-Ac.
Precipitacin Inmunodifusin
Ag lutina c in Reac cin de Wida l Floculacin
VDRL
Inmunoensayos Ind irec tos: Requieren e l uso de
ma teria l ma rcado p ara medir el c omplejo Ag-Ac
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LA MARCACIN DE ANTICUERPOS O DE ANTGENOS PERMITEN LA DETECCIN DELCOMPLEJO Ag-Ac
-Ac
INMUNOENSAYOS INDIRECTOS
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Clasificac in d e los Inmunoensayos Ind irec tos
Seg n el tipo de ma rc ador Radioinmunoensayos
Enzimoinmunoensayos Fluoroinmunoensayos
Quimioinmunoensayos
Seg n el mtod o d e sep arac in Homogneos
Heterogneos
Segn e l d iseo del ensayo Competitivos
No c om pe titivos (sndw ic h)
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Radioinmunoensayos
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Se utiliza un marcador rad ioac tivo: I, H
La med ic in se rea liza con un c onta dor decentelleo
RIA (Rad ioinmuno ensayo)
IRMA (Ensayo Inmunoradiomtrico) RR
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RIA
COMPETITIVO
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IRMA
NO COMPETITIVO
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Enzimoinmunoensayos
Se utiliza una enzima como marcador: Fosfata sa
Alca lina , Peroxidasa La med ic in se rea liza colorimtricamente
ELISA (Ensayo Inmunoabsorbente Liga do a Enzima)
WESTERN BLOT (Elec troinmuno transferenc ia)
E E
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ELISA DIRECTO
POCILLO RECUBIERTO CON ANTICUERPOS
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ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON MUESTRA PROBLEMA
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ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL PRIMER LAVA DO
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ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON CONJUGADO
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ELISA DIRECTO
RESULTADO DEL SEGUNDO LAVADO
ELISA DIRECTO
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ELISA DIRECTO
INCUBACIN CON SUSTRATO
ELISA DIRECTO
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ELISA DIRECTO
FORMACIN DE PRODUCTOS COLOREADOS
ELISA DIRECTO
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ELISA DIRECTO
PRODUCTO FINAL LUEGO DE LA ADICIN DE SOLUCIN DE PARADA
WESTERN BLOT
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WESTERN BLOT
Ac.Primario(muestra)
Bandas(antgenos)
Ac. Sec undario(conjugado)
Sustrato
Membrana denitrocelulosa
Antgenos
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Fluoroinmunoensayos
Se utiliza como marcador una sustanc iafluorescente: isotioc ianato de fluorescena,ficoeritrina , ficocianina
IFD (Inmunofluoresc enc ia Direc ta )
IFI (Inmunofluoresc enc ia Ind irec ta )
Citometra De FlujoF F
IFD
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IFD
Tejido (muestra) quepresenta el Ag d e inters Ac marcado (reac tivo)
que reconoc e elantgeno de inters
Ob servac in d el prepa rad oc on el microsc opio defluorescencia
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Quimioinmunoensayos
Se utiliza como marcador una sustanc ia quegenera luminiscenc ia: luminol, isoluminol, ster deacridina, rutenio
QL (Quimioluminisc enc ia )
EQL (Elec troq uimioluminisc enc ia ) QQ
EQL
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EQL
CT O AG OELE ROD - M NET
Cam po e lc tric o
Luminiscencia
Antgeno de inters(muestra)
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Homogneos: El complejo Ag-Ac no requiere sera islado p ara la lec tura
Monitoreo teraputic o d e frmacos, detec c in
de d rogas de a buso
Heterogneos: El complejo Ag-Ac requiere sera islado para la lec tura (lavados)
ELISA
INMUNOENSAYOS HOMOGNEOS YHETEROGNEOS
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TUBO DEREACCIN
REACTIVO DE AcDE FASE SLIDA
SE MIDE ELCOMPLEJO Ag-Ac
LAVAR Y AISLAR ELCOMPLEJO Ag-Ac
TCNICA HOMOGNEA
TCNICA HETEROGNEA
MUESTRA (Ag)
+
REACTIVO DE Ac
MARCADO
+
HETEROGNEOS
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Competitivos
Nocompetitivos(sndwich)
COMPETITIVO
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Cantidad limitada deanticuerpos
FORMATO COMPETITIVO
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CONCENTRACIN
LE
CTURA
RELACININVERSA
NO COMPETITIVO (SNDWICH)
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48/49FORMATO NO COMPETITIVO
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CONCENTRACIN
LE
CTURA
RELACINDIRECTA