“Cursos de capacitación y actualización para la prevención y vigilancia de EETs”
Etiología y diagnóstico de las Encefalopatías
Espongiformes Transmisibles de los
animalesLaboratorio de Referencia para EET de los Laboratorio de Referencia para EET de los
AnimalesAnimalesCentro de Investigación en Ciencias Centro de Investigación en Ciencias
Veterinarias y Agrícolas - INTA CastelarVeterinarias y Agrícolas - INTA Castelar
Origen de la EEBOrigen de la EEB
• Garrapatas, Garrapatas, organoclorados????organoclorados????
•Enfermedad Enfermedad espontánea????espontánea????
• Origen exótico????Origen exótico????
• Origen humano???? Origen humano???? ((Colchester & Colchester Lancet. 366, 856; 2005).
Hipótesis sobre el origenHipótesis sobre el origen• ScrapieScrapie
• ScrapieScrapie ??
Ovino:Ovino: gen gen SipSip ssAA/s/sAA 150-200 días150-200 días
ssAA/p/pAA 300 días300 días
ppAA/p/pAA
PRNPPRNP1936: Transmisión experimental de Scrapie
Scrapie: enfermedad genética?Scrapie: enfermedad genética?
Agente etiológicoAgente etiológico
Características del agente de Características del agente de EETEET
-Hay cepas -Barrera de la especie-Tamaño similar a virus
-No hay respuesta de anticuerpos-Resistencia (calor, radiaciones, nucleasas)-Sensibilidad parcial a proteasas-Ácido nucleico?
(tiempo de incubación, lesiones SNC)
Modelo de agente de TSEModelo de agente de TSE
Debe explicarDebe explicar
--Falta de respuesta de anticuerposFalta de respuesta de anticuerpos
-Existencia de cepas -Existencia de cepas (tiempo de incubación, lesiones)(tiempo de incubación, lesiones)
-Barrera de la especie -Barrera de la especie (transmisión estocástica)(transmisión estocástica)
Calor húmedo121 ºC, 1 atm, 20 minIncompleta
133 ºC, 3 bar, 20 min133 ºC, 3 bar, 20 min
Calor seco138 ªCIncompleta
Métodos químicos
Hidróxido de Sodio 1N, 24 hsHidróxido de Sodio 1N, 24 hsHidróxido de Sodio 2N, 2 hsHidróxido de Sodio 2N, 2 hsHipoclorito de Sodio 12 hsHipoclorito de Sodio 12 hs
Inactivación del agente de EEBInactivación del agente de EEB
Agentes hipotéticos de "Scrapie"Agentes hipotéticos de "Scrapie"
• VirusVirus
LentosNo convencionales
• "Virino“
• Agentes no convencionales
PRIONES
Hipotéticos
Alper et al., BBRC 22: 278 (1966)Pattison & Jones, Vet Rec 80: 2 (1967)Griffith, Nature 215: 1043 (1967)
Merz et al., Merz et al., Acta Neuropathol Acta Neuropathol 5454: 63 (1981): 63 (1981)
SAF: Scrapie Associated FibrilsSAF: Scrapie Associated Fibrils
PrPPrP
“Pequeñas partículaspartículas proteináceas que resisten la inactivación por métodos que modifican ácidos nucleicos”
PrionesPriones
Stanley B. Prusiner. Science 216: 136-144, 1982
PrPPrPCC: proteína normal del : proteína normal del huespedhuespedPrPPrPScSc: proteína patogénica de : proteína patogénica de ScrapieScrapie
Isoformas de PrPIsoformas de PrP
NormalNormal PrP PrPCC (33-35 kD)(33-35 kD)
Asociada aAsociada aenfermedadenfermedad PrPPrPScSc (33-35 kD)(33-35 kD)
PrPPrP27-3027-30 (27-30 (27-30
kDkD))
Proteinasa Proteinasa KKDetergentDetergentee
++
++
--
--
Isoformas PrPIsoformas PrPCC y PrP y PrPScSc
PrPPrPCC PrPPrPScSc
DetergentesDetergentes soluble insoluble
ProteasasProteasas sensible resistente(PrP27-30)
--hélice (%)hélice (%) 42 30
hoja hoja (%)(%) 3 43
Modelo de nucleación-polimerizaciónModelo de nucleación-polimerización
PrPC PrPSc
(Equilibrio entre las dos isoformas)
Nucleación(muy lenta)
Incorporación de monóméros PrPSc (rápida)
Núcleo infeccioso Estructuraamiloide Fragmentación
en núcleos infecciosos
PrPrPP
Tiempo de incubaciónTiempo de incubación AñosAños Diagnóstico preclínicoDiagnóstico preclínico No No PrevenciónPrevención No No Signos clínicosSignos clínicos Neurológicos Neurológicos TratamientoTratamiento No No CuraCura No No EvoluciónEvolución Rápida Rápida DesenlaceDesenlace FatalFatal Diagnóstico definitivoDiagnóstico definitivo Post Post mortemmortem
Encefalopatías Espongiformes Encefalopatías Espongiformes TransmisiblesTransmisibles
NHNHCOOHCOOH
Prusiner, Science 278: 245 (1997)
108108 189189
LLFF
TTVV
MurinoMurinoBovinoBovino
8686
OctapéptidosOctapéptidos
136136
AAVV
142142 154154
HHRR
171171QQRRHH
OvinoOvino
IIMM
CaprinoCaprino
ELW/00
Polimorfismos en PrP animalesPolimorfismos en PrP animales
Scrapie:Scrapie:95% QQ95% QQ171171
Esquema del gen PRNP de los ovinos
Valina (V) Fenilalanina (F) Arginina (R) Arginina (R) Alanina (A) Leucina (L) Histidina (H) Glutamina (Q)
Histidina (H)
136 141 154 171
Polimorfismo del gen PRNP
Nivel de Riesgo Polimorfismo RAZAS
R1 ARR / ARRCharollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Hampshire, Suffolk, Blackface, Cheviot, Texel
R2AHQ / AHQARR / AHQ
Bluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel
R3
AHQ / ARQBluefaced Leicester, Blackface, Cheviot, Texel
AHQ / ARHARR / ARH
Texel
ARR / ARQ*Charollais, Bleu de Maine, Bluefaced Leicester, Texel Blackface, Cheviot, Hampshire , Suffolk
R4
VRQ / ARR Blackface, Cheviot, Texel
VRQ / ARH Charollais, Bleu de Maine, Texel
VRQ / AHQ Blackface, Cheviot, Texel
ARQ / ARQCharollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot
ARQ / ARHARH / ARH
Texel
R5VRQ / VRQVRQ / ARQ
Charollais, Bleu de Maine, Blackface, Cheviot,Texel
Alelos y genotipos más frecuentes del gen PRNP
Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad
ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción
ARR / AHQARR / ARHARR / ARQ
2 Ninguna restricción para su reproducción
AHQ / AHQARH / ARHAHQ / ARHARQ / ARHARQ / AHQARQ / ARQ
3Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP
ARR / VRQ 4Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino
ARQ / VRQARH / VRQAHQ / VRQVRQ / VRQ
5Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración / sacrificio del ovino
Grupos de riesgo de adquisición de Scrapie por resistencia / susceptibilidad genética
P C RP C R
SecuenciaciónSecuenciación
Manual o AutomáticaManual o Automática
Determinación de genotiposDeterminación de genotipos
PCR - RFLPPCR - RFLP
PCR - ELISAPCR - ELISA
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Nro
. ab
solu
to
1
Genotipos
ALRQ / ALRQ
ALRR / ALRQ
ALRR / ALRR
ALHQ / ALRQ
VLRQ / ALRQ
ALHQ / ALHQ
ALRH / ALRQ
AFRQ / ALRQ
ALRH / ALRR
ALRH / ALRH
AFRQ / ALRR
VLRQ / ALRR
VLRQ / VLRQ
ALHQ / ALRR
ALHQ / ALHR
VLRQ / ALHQ
AFRQ / AFRQ
AFRQ / ALHQ
VLRQ / ALRH
VLRQ / AFRQ
VLRH / ALRH
VLRH / ALRR
AFRR / ALRR
ALHR / ALHR
ALHQ / ALRH
Determinación de las frecuencias de genotipos
47.
33%
29.
00%
9.5
0%
4.6
7%
4.5
0%
3.6
7%
0.8
3%
0.3
3%
0.1
7%
ALRQ
ALRR
ALHQ
ALRH
VLRQ
AFRQ
ALHR
VLRH
AFRR
Determinación de las frecuencias de los diferentes alelos
Genotipo Grupo NSP Grado de resistencia / susceptibilidad Porcentaje
ARR / ARR 1 Ninguna restricción para su reproducción 16,38
ARR / AHQARR / ARHARR / ARQ
2 Ninguna restricción para su reproducción 25,25
AHQ / AHQARH / ARHAHQ / ARHARQ / ARHARQ / AHQARQ / ARQ
3Dependiendo de la raza, tiempo máximo para su venta o uso limitado para su reproducción en campos asociados a NSP
50,51
ARR / VRQ 4Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino1,36
ARQ / VRQARH / VRQAHQ / VRQVRQ / VRQ
5Prohibido su uso para reproducción dentro del plan NSP, tampoco para su venta. Reglamentación de castración /
sacrificio del ovino6,48
Determinación de las frecuencias de los grupos de riesgo
Cepas de ScrapieCepas de Scrapie
-20 definidas por pasaje en ratón20 definidas por pasaje en ratón
- Nor 98: aislada de casos de campo:- Nor 98: aislada de casos de campo:
Definida por:Definida por:- - ClínicaClínica- Histopatología- Histopatología- “R” en 171: susceptible- “R” en 171: susceptible
Casalone et al. Proc Natl Acad Sci 101:3065, 2004
Cepas de BSECepas de BSE
BASE: Bovine Amyloidotic Spongiform EncephalopathyBASE: Bovine Amyloidotic Spongiform Encephalopathy
1: Italia1: Italia
2) Francia: 2) Francia: Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004 Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004
3) Japón?? 3) Japón??
Biacabe et al , EMBO reports, 5: 110, 2004
“Molecular analysis of ovine prion protein identifies similaritiesbetween BSE and an experimental isolate of natural scrapie,CH1641”. Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999Hope et al., J Gen Virol. 80: 1, 1999
““Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”Distinct molecular phenotypes in bovine prion diseases”
Diagnóstico de EETDiagnóstico de EET
•Solamente en el Solamente en el post post mortemmortem
•““Test del tercer párpado” (in vivo) para Test del tercer párpado” (in vivo) para
“scrapie”“scrapie”
-Histopatología-Histopatología
-Detección de PrP:-Detección de PrP:
InmunohistoquímicaSAF
Western Blot ELISA
Histopatología(Lesión espongiforme)
Inmunohistoquímica(Depósitos de PrP)
En ovinosEn ovinos
SAF: Scrapie Associated FibrilsSAF: Scrapie Associated Fibrils
Medula Oblongata (Región del Obex)
1) Médula espinal
2) Cerebro
3) Región del Obex
4) Area utilizada para WB/ELISA
5) Muestra de elección
Tests rápidos
Scrapie- IDEXX Herdchek
- InPro CDI-5
BSE
-Prionics Check Western
-Prionics LIA
-TeSeE (BioRad)
-CDI InPro
- CediTect BSE Test
- Enfer TSE Kit version 2.0, automated sample preparation
- IDEXX HerdChek BSE Antigen Test Kit, EIA
- Institut Pourquier Speed´it BSE
- Prionics Check PrioSTRIP
- Roboscreen Beta Prion BSE EIA Test Kit
- Roche Applied Science PrionScreen
Métodos de referencia:Métodos de referencia:
-Histopatología -Histopatología
--InmunohistoquímicaInmunohistoquímica
-Western blot -Western blot
Métodos utilizados en el Programa de Vigilancia de
Argentina
Test rápidos:Test rápidos:
--Western blot (Prionics)Western blot (Prionics)
- - Enfer TSE (ensayo piloto-2003)Enfer TSE (ensayo piloto-2003)
Detección de PrPDetección de PrPScSc en sangre en sangre (Scherr et al.,(Scherr et al., J. ChromatJ. Chromat 697: 223, 1997)697: 223, 1997)
Unión de PrPUnión de PrPScSc a plasminógeno en soporte a plasminógeno en soporte sólido sólido
(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)(Fischer et al., Nature 408: 479, 2000)
Detección de PrPDetección de PrPScSc en orina en orina (Shaked et al., J Biol Chem (Shaked et al., J Biol Chem 276: 31479, 2001)276: 31479, 2001)
““Protein misfolding cyclic amplification”Protein misfolding cyclic amplification”(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)(Saborio et al. Nature 411: 810, 2001)
Detección de secuencias cortas de ADN asociadas a EET en sangre
( Schütz et al, Clin Diagn Lab Inmunol. 12 (7): 814-820, 2005)
Algunos métodos en estudio Algunos métodos en estudio (in vivo)(in vivo)
Laboratorio de referencia para el Laboratorio de referencia para el diagnóstico de EET de animalesdiagnóstico de EET de animales
B. J. Carrillo F.J. Blanco Viera E. L. WeberM. AlegreF. CapellinoF. DelgadoS. DuffyD. FunesL. JiménezE. LeónA. MarcosS. MartínezG. PintoC. SotoC. VallejosC.HirschvogelA. MarcosG. FigueroaS. CarcellerA. Elisei
Centro de Investigación en Ciencias Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y AgronómicasVeterinarias y Agronómicas
CastelarCastelar
GRACIAS