“dogma central” de la biologÍa molecular · la estructura del adn • la estructura del adn?...

“DOGMA CENTRAL” DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

Temin, Premio Nobel 1975

Creo en el ADN todopoderoso creador de todos los seres vivos, Creo en el ARN, su único hijo, que fue concebido por obra y gracia de

la ARN polimerasa. Nació como transcrito primario, padeció bajo el poder de nucleasas,

metilasas y poliadenilasas. Fue procesado, modificado y transportado.

Descendió del citoplasma y a los pocos segundos fue traducido a proteína.

Ascendió por el Retículo endoplasmático y el complejo de Golgi y está anclado sobre la membrana plasmática a la derecha de una proteína

G. Desde ahí ha de controlar la traducción de señales en células normales

y apoptóticas. Creo en la biología molecular, los transgénicos, el pbr322, la terapia

génica y la biotecnología; en la secuenciación del genoma humano, la corrección de las mutaciones, la clonación de Dolly y la vida eterna.

AMÉN

PROCARIOTAS VS. EUCARIOTAS

LA ESTRUCTURA DEL ADN

•  La estructura del ADN? Respuesta a preguntas:

– ¿Cómo se replica el ADN en las divisiones nucleares?

– ¿Cómo hace el ADN que se sinteticen proteínas específicas?

•  La estructura del ADN fue determinada tras reunir evidencia de diferentes tipos: Watson y Crick solo la reunieron y dedujeron

Figura 11.4 Cristalografía de Rayos X: Reveló la Estructura Básica en forma de Hélice de la Molécula de ADN

Evidencia Crucial: cristalografía de rayos X del ADN (Rosalind Franklin y Maurice Wilkins) Permite saber la posición de los átomos respecto a otros

Watson y Crick vieron resultados

QUIZ •  El dogma central de la biología molecular

sostiene que

A. El ADN se replica, luego se transcribe en ARN y por último el ARN se traduce a proteínas. B. El ARN se replica, luego se transcribe en ADN y por último el ADN se traduce a proteínas. C. El ADN se transcribe, luego se replica en ARN y por último el ARN se traduce a proteínas. D. El ARN se transcribe, luego se replica en ADN y por último el ADN se traduce a proteínas.

La Estructura del ADN •  Qué más se sabía?

–  El ADN es un polímero de nucleotidos. – Cuatro nucleótidos: con cuatro BN diferentes –  Existen dos purinas (adenina y guanina) y dos

pirimidinas (citosina y timina). –  Erwin Chargaff (1950) è No importa el

organismo, siempre las cantidades: •  A=T •  C=G •  ….La cantidad total de purinas es igual a la

cantidad de pirimidinas (Regla de Chargaff) –  Linus Pauling había sugerido que ADN debía

tener puentes de H pero no había visto las cristalografías de rayos X

La Estructura del ADN •  Los esqueletos de azúcar-fosfato de cada

hebra están en la parte exterior de la hélice. •  Las bases nitrogenadas están en el centro

de la hélice. •  Los puentes de Hidrógeno entre las bases

complementarias mantienes unidas a las dos hebras, así: – A siempre se aparea con T (dos puentes de

hidrógeno). – G siempre se aparea C (tres enlaces de

hidrógeno).

La Estructura del ADN

•  Francis Crick y James D. Watson establecieron la estructura general del ADN construyendo modelos: – La molécula de ADN tenía forma de

hélice (Cristalografía de Franklin) – Sabían las distancias dentro de la hélice

(2nm de ancho) – Sabían proporciones de nucleótidos

(Chargaff) – Estructura química de los nucleótidos

Figura 11.6 ADN es una Doble Hélice

La Estructura del ADN •  Cuatro características resumen la

arquitectura molecular del ADN:

– La molécula de ADN es una doble hélice.

– El diámetro de la molécula de ADN es uniforme.

– El giro en el ADN es hacia el lado derecho

– Las dos hebras corren en diferentes direcciones (es decir, son antiparalelas).

Figura 11.7 El Apareamiento de las Bases en el ADN es Complementario

Las hebras son antiparalelas:

Enlaces fosfodiester: Grupo Fosfato con grupo OH …Una hebra de ADN tiene un grupo 5’ fosfato en un extremo (el extremo 5’), y un grupo 3’ hidroxilo en el otro extremo (en el extremo 3’).

Figura 11.7 El Apareamiento de las Bases en el ADN es Complementario

Hay otros grupos que pueden hacer Puentes de H…….. Y están libres Clave para la interacción con proteínas importantes

La Estructura del ADN •  El material genético tiene cuatro

características que son esenciales para su función:

– Millones de nucleótidos: Almacena toda la información genética de un organismo.

– Es susceptible a mutación.

– Apareamiento perfecto de bases:

•  Replicación de forma exacta durante el ciclo de división celular.

•  Transcripción a RNA de forma exacta: responsable del fenotipo de un organismo.

REPLICACIÓN DEL ADN

•  El bioquímico americano Arthur Kornberg demonstró que la molécula de ADN contenía la información necesaria para su propia replicación.

•  Mezclando en tubo de ensayo: – ADN – Deoxiribonucleótidos – Una enzima

DETERMINACIÓN DEL MECANISMO DE REPLICACIÓN DEL ADN


•  Teóricamente, el ADN podría servir en si mismo como molde de una de las siguientes formas: – Replicación Semiconservativa – Replicación Conservativa – Replicación Dispersiva

Figura 11.8 Modelos de Replicaión de ADN

Modelo semiconservativo

Modelo conservativo

Modelo dispersivo

usaría cada hebra parental como molde para la nueva hebra.

construiría una hélice completamente nueva basada en el molde de la hélice doble vieja.

usaría fragmentos de la molécula original de ADN como moldes para el ensamblaje de dos moléculas.

Cómo se demostró? •  Matthew Messelson y Franklin Stahl en

1957è marcaje por densidad. •  Utilizaron ADN marcado con Nitrógeno

“pesado” (15N): es más denso que el normal (14N): alimentar cultivos de bacterias.


Figura 11.9 Experimetno de Meselson–Stahl

•  La replicación del ADN tiene dos pasos:

– Separación de las dos cadenas (ruptura de puentes de H)

– Unión de desoxinucleótidos en una hebra nueva naciente (polimerización)

MECANISMOS MOLECULARES DE LA REPLICACIÓN DE ADN

•  Siempre en replicación: Nucleótidos nuevos se adicionan por el extremo 3’OH libre de la cadena que nace.

•  Se utilizan nucleósidos TRI-fosfato


Figura 11.10 Cada Cadena Nueva Crece desde Su Extremo 5’ a su Extremo 3’

La energía para la síntesis de nucleótidos de la cadena naciente viene del rompimiento de los enlaces que unen a esos tres fosfatos.

QUIZ

•  La replicación del ADN es: A. Dispersiva B. Conservativa C. Holística D. Semiconservativa

•  Un complejo de replicación (conjunto de proteínas) grande cataliza la replicación del ADN è reconoce una secuencia en el ADN específica para empezar = origen de replicación – La enzima DNA polimerasa es la que

hace la replicación como tal


•  El ADN es replicado en ambas direcciones desde el origen, formándose así dos horquillas de replicación.

•  En la replicación del ADN, ambas hebras actúan como molde.


(Horquillas de replicación)

Este modelo es el correcto: Complejo de replicación es estacionario (se une a estructuras nucleares)

•  La enzima DNA helicasa utiliza energía del ATP para desdoblar las dos hebras de ADN.

•  Cromosomas pequeños, como los que hay en bacterias, tienen un sólo origen de replicación.


Figura 11.12 Replicación en ADN pequeño y Circular

Cromosoma circular de bacterias: Un solo origen de replicación Pero enzima DNA polimerasa es muy rápida: 1000bases/seg = 20 minutos para replicar todo el cromosoma

Cromosomas quedan entrelazados y enzima topoisomerasa los separa

EN EUCARIOTAS HAY MÚLTIPLES ORÍGENES DE REPLICACION

•  Cromosomas grandes.

•  La replicación ocurre en diferentes sitios de manera simultánea.


•  LA ADN POLIMERASA…..

Sitio activo: une el sustrato con el templado

Reconoce los distintos nucléotidos

•  IMPORTANTE: Las ADN Polimerasas no pueden construir una hebra sin que haya una hebra pre-existente, llamada iniciador, cebador o primer como punto de partida. –  Es un ARN corto complementario a la hebra

molde –  Lo sintetiza la enzima primasa –  La ADN polimerasa añade nucleótidos al 3´del

primer –  Cuando se ha replicado la hebra de ADN, el

primer se degrada (es de ARN!!!) y se reemplaza por ADN correspondiente


Figura 11.14 No se Replica ADN sin Un Iniciador


•  Varios tipos de ADN polimerasa en una célula – Bacteria 5, Humanos 14 – Solo una replica ADN cromosomal (III en

procariotas, δ en humanos) – Las otras se encargan de la eliminación del

primer y la reparación del ADN.

Figura 11.15 Muchas proteinas se Encargan de la Horquilla de Replicación

ADN polimerasa

Helicasa

Primasa

•  Las nuevas bases siempre son adicionadas por el extremo 3’ de la hebra naciente.

•  Las hebras en el ADN molde son antiparalelas.

•  Entonces: una hebra se sintetiza continuamente = Hebra líder

•  La otra hebra (la hebra rezagada) estará en la orientación contraria (por que se sintetiza en la dirección contraria a la que el ADN se está abriendo).


Figura 11.16 Las Dos hebras Nuevas se Forman en Distintas Direcciones

una hebra se sintetiza continuamente = Hebra líder

Figura 11.16 Las Dos hebras Nuevas se Forman en Distintas Direcciones

Hebra líder

Hebra rezagada

•  La hebra rezagada debe crecer en piezas relativamente pequeñas y discontinuas, llamadas fragmentos de Okazaki.

•  Cada fragmento de Okazaki requiere una hebra iniciador (primer) de ARN sintetizado por primasa

•  La ADN polimerasa III sintetiza ADN complementario desde el extremo 3’ del nuevo iniciador y trabaja hacia el fragmento previo de Okazaki.


•  Cuando la ADN polimerasa III alcanza al fragmento previo de Okazaki, ésta es liberada.

•  La ADN polimerasa I entonces reeemplaza el iniciador ARN del fragmento previo de Okazaki con ADN.

•  Finalmente, DNA ligasa cataliza la formación de enlaces fosfodiester que unen los dos fragmentos de Okazaki.


Figura 11.17 Hebra Rezagada

Replica la mayor parte del ADN

Figura 11.17 La Hebra Rezagada

Reemplaza el iniciador o primer con ADN (hace replicación usando hebra ya sintetizada como primer)

Pega los fragmentos (enlaces fosfodiester)

Figura 11.18 Telomeros y Telomerasa

Problema: en el extremo de molécula lineal de ADN no hay íniciador de dónde iniciar replicación

Este pedazo de cadena sencilla se corta: los extremos de cromosomas se van haciendo más cortos!!

Extremos de cromosomas = Telómeros. Tienen ADN repetitivo

•  En los telómeros: –  En humanos hay 2500 repeticiones TTAGGG

que son necesarias para estabilidad del cromosoma

–  En cada replicación se pierden 50-200 bases – Después de 20-30 ciclos de replicación ya no

hay telómero – la célula no se puede dividir •  Esto resulta en la muerte celular y explica

en parte el porqué las células no pueden vivir por el mismo tiempo que el organismo.


•  Pero vivimos mucho más de 20 divisiones celulares!!! – Las células germinales y muchas

cancerígenas tienen una enzima = Telomerasa

– Cataliza la adición de secuencia telomérica perdida.

– Es proteína + ARN que sirve de molde


Figura 11.18 Telomeros y Telomerasa

Las dos hebras resultantes quedan a la misma longitud

Reparación y Corrección del ADN

•  Errores en replicación: –  Esenciales para evolución (mutaciones) –  Muchos son o neutrales o letales

•  Para minimizar el número de errores, nuestras células tienen tres mecanismos de reparación:

–  Corrección

–  Reparación por falta de apareamiento (Mismatch)

–  Reparación por Escición de bases dañadas por mutágenos

•  Corrección: – La misma ADN polimerasa – Error è Quita nucleótido errado y pone el

correcto – La tasa de error de la ADN polimerasa es

1 en 10,000. – Con corrección = 1 en 1000,000,000!!!.


•  Reparación por falta de apareamiento (por mismatch) – es un mecanismo que escanea el ADN

nuevo para detectar uniones equívocas de las bases.

– Escanea ADN metilado (viejo) – Corrige en hebra no metilada (nueva)


•  La reparación por escición – Errores por daños que no ocurren en

replicación (químicos, radiación y reacciones químicas espontáneas)

– Error: casi siempre dímeros de timina •  Enzimas cortan hebra con más bases •  ADN polimerasa y ligasa reparan

Hebra tiene más bases


QUIZ •  Las enzimas encargadas de romper los

puentes de hidrógeno y replicar el ADN reconociendo el extremo 3’OH libre del primer de ARN, son respectivamente:

A. Helicasa y ADN polimerasa B. Primasa y Topoisomerasa C. ssbp y Ligasa D. Girasa y Fosfatasa

TRANSCRIPCIÓN (ARN) / “expresión de genes”

Gen

Genotipo

Proteína

Fenotipo

Luc

Luciferasa

MECANISMOS MOLECULARES DE LA TRANSCRIPCIÓN - PROCARIOTAS

ARN Polimerasa

Iniciación

•  Promotor à Secuencia de reconocimiento y unión de la ARN pol.

•  ARN polimerasa à Enzima encargada de sintetizar el ARN a partir del ADN

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/stages.htm


Elongación

•  Horquilla à 20 nucleótidos •  Lectura à 3’ – 5’ •  Síntesis à 5’ – 3’

http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/stages.htm

Anti-paralelas


Terminación

•  Secuencia de terminación


MECANISMOS MOLECULARES DE LA TRANSCRIPCIÓN - EUCARIOTAS

•  ARN mensajero

– Maduración

Exón Exón Exón Intrón Intrón

ARNm primario

Codificantes No codificantes



•  Splicing

– ARNm Maduro

Exón Exón Exón Intrón Intrón

ARNm-primario

Exón Exón Exón

ARNm

TRADUCCIÓN (PROTEÍNA) / “expresión de genes”

Tipos de ARN

1.  ARN mensajero

2.  ARN transferencia

3.  ARN ribosómico

MECANISMOS MOLECULARES DE LA TRADUCCIÓN

ARNm

•  Producto de la transcripción

•  Sintetizado en el núcleo

•  Viaja al citoplasma


ARNt (transferencia)

–  Leer el ARNm

–  Carga un amino ácido

específico

–  Interactua con el ribosoma

Anticodón

Amino ácido

ARNt

http://www.slh.wisc.edu/genetics/basics_transcription.dot


ARNr

•  Dos subunidades

•  Interactúa con el ARNm y ARNt

•  Síntesis de proteínas


Lectura del ARNm

ARNm

Codones

Anti-codones

http://www.slh.wisc.edu/genetics/basics_transcription.dot


Ribosoma 1.  Sitio A à el ARNt de

adhiere

2.  Sitio P à Se forma el enlace peptídico

3.  Sitio E à se libera el ARNt

http://library.thinkquest.org/04apr/00217/en/biology/rna/index.html


Iniciación

Elongación

Terminación


MECANISMOS MOLECULARES DE LA TRADUCCIÓN - PROCARIOTAS

MECANISMOS MOLECULARES DE LA TRADUCCIÓN - EUCARIOTAS


CÓDIGO GENÉTICO

-  Degenerado: un único aminoácido corresponde a varios codones en el ARNm.

-  Si sólo cambia el tercer nucleótido del codón, por lo general con ciertas excepciones, codifica para el mismo aminoácido.

Si todo quedó claro, entonces veamos un ejemplo

TACTTTGACACGGTAGATATC C.templado

ATGAAACTGTGCCATCTATAG C. complementaria

¿RNAm? AUGAAACUGUGCCAUCUAUAG

¿Polipéptido? AUG-AAA-CUG-UGC-CAU-CUA-UAG Met - Lys – Leu -Cys - His – Leu – STOP

Usen la tabla del código genético anterior

QUIZ •  Una secuencia de ADN que corresponde a un

gen de 300 nucleótidos, al traducirse sería una proteína de ______ aminoácidos

A. 100 B. 99 C. 900 D. 897 E. 97

Aplicaciones Prácticas de la Replicación del ADN

•  La técnica de la Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) es un método simple para hacer múltiples copias de una secuencia de ADN en el laboratorio. – Utiliza la replicación pero en un tubo!

•  Los ciclos de una PCR son:

–  Los fragmentos de ADN de doble cadena son denaturados (por calor) para producir hebras simples = DENATURACION.

–  Un iniciador corto (primer o cebador) es adicionado así como dNTPs (de las cuatro clases) =ANILLAJE.

–  La DNA polimerasa cataliza la producción de nuevas hebras de ADN=POLIMERIZACION

Figura 11.20 La Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR)


•  Problema con la polimerasa – enzima – denaturaciónè Taq polimerasa (Kary Mullis, Nobel)

•  Para qué se usa? – Para tener muchas copias de un

fragmento pequeño de ADN – Para diagnóstico y detección


•  Qué necesitamos entonces antes de hacer una PCR? – Saber la secuencia (primers deben ser

complementarios)

•  Cómo determinar la secuencia?

Método de secuenciación de Sanger

•  Es también una replicación •  Pero se añaden unos nucleótidos

especiales para parar la reacción en ciertos lugares…..

Figure 11.24 Sequencing DNA (Part 1)

Figure 11.24 Sequencing DNA (Part 2)

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