UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD: IZTAPALAPA

DIVISION: CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

CARRERA: INGENIERIA DE LOS ALIMENTOS

MATERIA: SERVICIO SOCIAL

TITULO: MODIFICACION ENZIPlATICA DE UN CONCENTRADO PROTEINICO DE

AMARANTO

MATRICULA: 90337334

ASESOR: MAESTRA SANCHEZ DIAZ LIMA DULCE MARIA #

Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA . . . .

A QUIEN CORRESPONDA

Por medio de la presente se hace constar que el (la):

ING. DULCE MARIA SANCHEZ -DIAZ LIMA

del Departamento de BIOTECNOLOGIA

de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

TITULO: MODlFlCAClON ENZlMATlCA DE UN CONCENTRADO PROTElNlCO DE AMARANTO

ALUMNO: GONZALEZ CASTAÑEDA NANCY

LICENCIATURA: IlNGENlERlA DE LOS ALlh'iENTOS

PERIODO: MARZO 30, 1995- SEPTIEMBRE 30, 1995

Se extiende la presente para los fines que al interesado convengan, en la Ciudad de México, D.F. a los veinte días del mes de Mayo de mil novecientos noventa y seis.

Atentamente, "Casa Abierta al Tiempo"

M. EN C. A.

*LPO

UNIDAD IZTAPALAPA ,U.'. r " A .. -2 . 734 " w i

I

a

NOMBRE:

MATRICULA:

LICENCIATURA:

ASESOR:

PROYECTO:

González Castañeda Nancy

90337334

Ingeniería de los Alimentos

Ing. Dulce María Sánchez-Díaz Lima

Modificación Enzimática de un Concentrado Proteínico de Amaranto.

En este proyecto, se investigó el efecto de la hidrólisis realizada por a- Quimiotripsina sobre un concentrado proteínico de amaranto obtenido por extracción alcalina, modificandolo a los tiempos de reacción 5, 10 y 30 minutos.

Los resultados mostraron que la a-quimiotripsina puede o no actuar, dependiendo de ias condiciones de concentración de sustrato y enzima que se empleen.

A concentraciones de sustrato y enzima bajas, es decir de 70 y 21 mg / ml respectivamete (condiciones del tratamiento A), y a los tiempos de reacción 5, 10 y 30 min, la hidrólisis no ocurre a pesar de mantener las condiciones óptimas de pH y To para que la enzima actúe.

A concentraciones mayores es decir, 100 mg / ml de sustrato y 36 mg / ml de enzima (condiciones del tratamiento B), la hidrólisis si se presenta, pero la acción de la enzima solo genera dos polipéptidos de bajo peso molecular (menores a 14,200), que en el CPA sin modificar no se observan.

El CPA sin modificar presentó una composición de 6 polipéptidos diferentes en su perfil electrofor6tico. Este número aumentó a 8 una vez aplicado el tratamiento de hidrólisis.

A pesar de que el número de polipéptidos generados por la acción de la enzima fue pequeño, se cree que las propiedades funcionales del CPA modificado pueden haber cambiado favorable o desfavorablemente, por tanto este trabajo propone la realización de otros proyectos en los que se analice tanto la composición del CPA extraído por el método alcalino y la de otros concentrados obtenidos por diferentes métodos de extracción como el uso de diferentes peptidasas, con el objeto de obtener mejores resultados.

[NDICE

Justificaclón

Introducción ”.I

Antecedentes ”-

Objetivos ” I.

Metodolegía

AcWdades realizadas ..., “-.”U...- .... Metas alcanzadas

Resultados n

Discusiones

Coaclnslones y.

Recornendaclones

Bibliografla

2

4

5

11

11

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25

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29

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“Modificaci6n Enzimdtica ” de un Concentrado

Proteínico Amaranto”

JUSTIFICA CIdN:

Debido a su escasez y a la importancia que tienen como nutrimento las proteínas en la actualidad se han convertido en uno de los focos de principal atención de la mayoría de los biotecnólogos en alimentos, pues a pesar de existir ;.ma gran cantidad de Nitrógeno en la Tierra, éste se encuentra en forma elemental en la atmósfera y no es aprovechable para satisfacer las necesidades biológicas del ser humano, ya que para la síntesis de sus proteínas, de ácidos nucleicos y de otras sustancias nitrogenadas de gran interés, sólo utiliza el nitrógeno orgánico proveniente de los polipéptidos que obtiene de su dieta (2).

La disponibilidad de proteínas en cantidad suficiente plantea numerosos problemas, porque su producción representa elevados costos en comparación de los invertidos en la obtención de glúcidos y carbohidratos. Con el fin de satisfacer este crecimiento continuado de la demanda de proteínas, hay que encontrar nuevas fuentes proteicas, así como mejores tecnologías para su utilización. Por estas razones es importante que las proteínas alimenticias conserven sus propiedades físicas, químicas y biológicas y resulta fundamental conocer los efectos de los diferentes tratamientos tecnológicos, porque pueden influir favorablemente causando una mejora de su calidad nutricionai y de sus propiedades funcionales (4,5).

Muy recientemente dentro de la Industria Alimentaria ha surgido una rama dedicada a la obtención de ingredientes proteicos, siendo numerosas las empresas que ofrecen una amplia gama de productos proteicos líquidos, concentrados, granulados, congelados, deshidratados, etc. , que poseen propiedades bien definidas. Actualmente, se realizan muy diversas investigaciones que representan grandes retos para los científicos especializados en la alimentación, como lo es la transformación de productos vegetales ricos en proteína, en una serie de productos alimenticios deseables y nutritivos; tal es el caso de la proteína de soya cuya utilización ha pasado por diversas etapas: desde la incorporación de soya a carne molida de res, uso

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que se observó al principio de la década de los setenta, hasta los enfoques modernos de estructuración de fibras texturizadas de soya, destinadas a obtener productos similares a la carne, dentro de muy diversos productos (8). Para que las proteínas vegetales puedan ser usadas y consecuentemente aplicadas a la Industria Alimentaria, estas deben proveer a los alimentos de los aminoácidos esenciales, e idealmente deben mejorar las características referidas como propiedades funcionales del sistema alimentario al que son adicionadas (9).

Para aumentar la funcionalidad de proteínas con propiedades funcionales bajas, la modificación química ha sido ampliamente estudiada. Entre las técnicas de modificación química, la acilación con anhídridos ácidos ha sido ampliamente estudiada en proteínas de diferentes fuentes vegetales. Aunque las proteínas succiniladas son funcionalmente superiores a las no modificadas, la incorporación de proteínas modificadas químicamente a los alimentos, deberá ser estrictamente regulada, en las normas que garanticen la seguridad de los mismos, ya que nutricionalmente los enlaces succinilados de estas proteínas no son hidrolizados por las proteasas gástricas y pancreaticas. En contraste las proteinas modificadas enzimáticamente, es poco probable que presenten problemas de seguridad; así la modificación enzimática es una alternativa viable en la obtención de diferentes ingredientes proteicos con características diferentes a las originales (1 O).

Así mediante la modificación enzimática se pueden obtener ingredientes útiles para el ser humano, pues se tienen antecedentes que indican que mediante modificaciones enzimáticas es posible lograr mejorías la calidad de ciertos aislados proteínicos (6). Sin embargo, al realizar una modificación enzimática de un sistema alimentario, es de vital importancia considerar los aspectos nutrimentales y funcionales, que generalmente se visualizan de manera aislada. Muy pocas veces estos dos aspectos se evalúan conjuntamente y es muy importante subrayarlo, ya que un cambio substancial en la estructura nativa de la proteína, tendrá una influencia significativa en las propiedades generales del alimento, , es decir una modificación de sus propiedades funcionales y / o sensoriales (12).

Este trabajo por tanto, tiene por objeto obtener información acerca de la acción que ejerce la a-quimiotripsina en un concentrado proteínico de amaranto, obtenido por extracción alcalina. Los resultados del mismo serán empleados en una investigación posterior, que tendrá por objeto analizar los cambios de las propiedades funcionales del concentrado modificado, si es que en este análisis previo se lleva a cabo la modificación enzimática. A su vez dichas investigaciones forman parte de una intensa búsqueda acerca de la obtención y aplicaciones de concentrados proteínicos de amaranto obtenidos por diferentes métodos de solubilización, que se realiza en esta universidad.

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INTRODUCCIÓN

El uso de los concentrados y aislados proteínicos en los alimentos se ha incrementado a partir de 1940 y actualmente, se les extrae de diversas fuentes como: levaduras, hongos, leguminosas, oleaginosas, cereales y diversas plantas. Los métodos de concentración y aislamiento proteínico a escala industrial se han desarrollado y operado en función de su costo y eficiencia. Algunas de las tecnologías del aislamiento proteínico utilizan métodos de extracción con disolventes, tratamientos a pH extremos y finalmente el secado y aislado. Este producto final se espera sea un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que el material original, con la misma calidad nutrimental (aunque no lo es en la mayoría de los casos), no obstante, la apariencia sensorial no es la adecuada (1 2).

La selección del procesamiento y las propiedades de un concentrado o aislado están parcialmente determinadas por la fuente de que se obtenga, es decir cereal, leguminosa u oleaginosa, p. ej. las proteínas de reserva de las oleaginosas y leguminosas se extraen generalmente en medios acuosos, mientras que para los cereales es más común el uso de surfactantes y disolventes orgánicos (1 2).

En el caso de concentrados proteínicos de amaranto se muestra selectividad en cuanto a la fracción proteica extraída, dependiendo del método de solubilización empleado. En el presente trabajo será empleado el concentrado obtenido por extracción alcalina, por ser uno'de los métodos de extracción con mayor rendimiento (1 3).

En los últimos años en Europa, Estados Unidos y Japón se han desarrollado diversas técnicas cuya finalidad es modificar las proteínas, física química o enzimáticamente, para lograr en ellas propiedades funcionales o aumentar el valor nutricional que no tienen o que está en menor grado en su estado natural. Este principio es el mismo que se aplica desde hace muchos años . La modificación enzimática de un concentrado proteínico de amaranto, bajo la acción de la quimiotripsina plantea la obtención de un producto que puede tener características diferentes a las del concentrado original. Por tanto este trabajo representa una opción para el tratamiento tecnológico de cierta fracción proteica del amaranto, que pudiera ser benéfico si se obtiene un producto con mejores propiedades funcionales y que podría ser utilizado en la Industria de los Alimentos.

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ANTECEDENTES

Amaranto:

En México una planta que posee características agronómico - alimentarias prometedoras es el Amaranto, perteneciente a la familia Amaranthaceae, tiene una gran versatilidad de uso como forraje, como grano y como verdura. Existen múltiples variedades de amaranto, pero la que se da en nuestro país corresponde a la Amaranthus hypochondriacus; su consumo data de la época de los aztecas, quienes lo llamaban “huautli”, que significa alegría, muy probablemente en alusión a lo colorido de la planta. a la llegada de 10s españoles esta semilla perdió mucha importancia pues los conquistadores lo asociaban con costumbres paganas y solo en zonas muy reducidas se continuo SU cultivo. después de tantos siglos, en los últimos años se han redescubierto muchas de sus cualidades nutritivas y sus ventajas de cultivo

Los granos de amaranto contienen cerca de 12 al 16 % de proteína cruda, la cual contiene un muy buen balance de aminoácidos esenciales y un alto contenido de lisina, aminoácido esencial deficiente en los cereales convencionales (4). Presenta un alto contenido de grasas donde se destaca la presencia del ácido linoleico, en mayor porcentaje, siguiendo los ácidos oleico y palmítico (8). Con respecto a la calidad nutricional de los granos de amaranto, se tienen numerosos informes, que sostienen que esta es similar a la de la caseína de la leche (6). En relación a las propiedades fisicoquímicas de la semilla de amaranto se ha informado que la globulina parece ser un agente emulsificante relativamente estable a la temperatura y presenta una hidrofobicidad muy alta en relación a otras proteínas vegetales (6). En el grano de Amaranthus cruentus, el 65 % de la proteína se encuentra en el germen y la cubierta de la semilla y el 35 % en el peristemo amiláceo. Sin embargo la mayor cantidad de la proteína se encuentra en los cuerpos proteínicos, que contienen un diámetro de 1.5 a 2 mm en el embrión y endospermo, y de menor tamaño en el peristermo ( I 2). Tradicionalmente las proteínas de fuentes vegetales se han aislado y fraccionado por extracciones secuenciales con diferentes solventes. El agua y las soluciones salinas de fuerza iónica baja extraen la fracción definida como albúmina, las soluciones salinas las globulinas, el etano1 las prolaminas y 10s ácidos 0 alcalis extraen las gluteninas. En consecunecia las proteinas de diversas fuentes vegetales se han fraccionado bajo este esquema de

(3).

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extracción. Este conocimiento es fundamental si se quiere realizar la modificación enzimática de un concentrado proteínico de amaranto, ya que dependiendo de la fracción proteínica extraída se encontraran con prioridad ciertos aminoácidos esenciales en particular (1 2).

a = Quimiotripsina.

La Quimiotripsina pertenece al grupo de las serin - proteasas; estas enzimas son denominadas así pues se caracterizan por poseer un residuo de serina reactivo, que es esencial para su actividad enzimática. Todas estas enzimas realizan la hidrólisis parcial de cadenas polipeptídicas largas o cortas. Entre estas, las más conocidas son la tripsina, quimiotripsina y elastasa, que son enzimas digestivas de los animales superiores sintetizadas por las células del pancreas y secretadas vía el ducto pancreático hacia el duodeno. Todas realizan la hidrólisis de enlaces peptídicos, pero con diferente especificidad (14). El pancreas las sintetiza en forma de zimógenos y una vez que son secretadas hacia el tracto digestivo estas se activan. Las tres enzjmas trabajan en conjunto durante la digestión; este hecho sugiere que se encuentran relacionadas de alguna forma. Sus secuencias de aminoácidos muestran similitud, pues tiene los mismos aminoácidos en 62 de sus 257 posiciones. Las tres tienen histidina en la posición 57,' ácido aspártico en la 102 y serina en la 195, que son los principales aminoácidos involucrados en su mecanismo catalítico. (1 5)

La a -quimiotripsina es una endopeptidasa, es decir, puede romper ciertos tipos de enlaces peptídicos en cualquier lugar de la cadena peptídica en que se hallen situados; es específica para aquellos enlaces en los que la función carbonilo es aportada por restos de aminoácidos aromáticos., por ejemplo, la tirosina, triptofano y fenilalanina; también hidroliza las amidas y esteres de estos aminoácidos. en realidad, los ésteres de la tirosina son los sustratos más activos que se conocen para la quimiotripsina. Dicha enzima también cataliza la transferencia del grupo acilo aromático a aceptores de acilo distintos al agua, por ejemplo el amoniaco, otros aminoácidos y alcoholes. Los anillos aromáticos que antiguamente se creían eran indispensables para la acción de la quimiotripsina pueden ser dispensables, ya que las sustitución del anillo bencénico de un resto de fenilalanina por un anillo de ciclohexilo o de algún grupo hidrocarbonado voluminosos no introduce un gran descenso de la actividad. Y se ha demostrado que ni siquiera el grupo a -amino del aminoácido aromático es necesario ya que puede sustituirse por un átomo de hidrogeno, por un grupo hidroxilo o por un átomo de cloro. De esta manera se puede decir que la a -quimiotripsina no es en absoluto una peptidasa Y

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podría designarse con mayor exactitud, como una transferasa de grupos acilo hidrofóbicos. Su centro activo posee dos rasgos distintivos, una zona hidrofóbica para la orientación y del sustrato sobre el centro activo y una porción catalítica para separar y transferir el grupo acilo (7).

En contraste con la quimiotripsina, el lado cationico de la cadena de tripsina, prefiere los residuos de aminoácidos básicos como arginina o lisina. La elastasa por su parte hodroliza rápidamente la casi indigerible proteina elastina, rica en alanina, glicina y valina; tiene afinidad por los aminoácidos con pequeños residuos no polares, principalmente la alanina. En contraste con la tripsina y quimiotripsina hidroliza los enlaces peptídicos muy lentamente ya que sus pequeños sustratos no son suficientemente inmovilizados en la superficie de la enzima, para que la catálisis ocurra con eficacia (1 4).

Electroforesis

La electroforesis es una de las técnicas más empleadas en Bioquímica, la razón de ello, es que el aparato con el que se realiza es muy simple y es útil para múltiples propósitos. Esta puede ser empleada para evaluar el punto isoeléctrico y peso molecular de una proteína, así como para analizar una mezcla de estas, pues tiene un amplio poder de resolución. (1 4).

La electroforesis es mucho más que un proceso de sedimentación, pero en ambos casos una fuerza o gradiente ocasiona que la proteína se transporte en dirección de dicha fuerza. En el caso de la sedimentación la fuerza involucrada es la gravedad, así que la velocidad de migración depende de la masa de la proteína. En la electroforesis la fuerza o gradiente de fuerza es el potencial eléctrico, así que la velocidad de migración depende de la carga neta de la partícula y más que de su masa (15).

Por tanto la electroforesis es un método en el cual, moléculas cargadas en solución, principalmente proteínas y ácidos nucléicos, migran en respuesta a un campo eléctrico. La velocidad de migración o movilidad a través del campo depende de la fuerza del mismo, así como de la carga neta, tamaño y forma de las moléculas sometidas a él. Otros factores que afectan la velocidad de migración son la fuerza iónica, viscosidad y temperatura del medio en el cual se mueven las moléculas (6).

Como una herramienta de análisis la electroforesis es sencilla rápida y altamente sensible; también es empleada como una técnica de separación analítica de moléculas biológicas. Generalmente se realiza en geles que se forman en tubos o placas. Cuando el gel se forma en tubos, estos son de

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aproximadamente 12 cm de longitud y 3 - 5 mm de diámetro. Los geles delgados y planos se forman en un sandwich de vidrio que se compone de dos delgadas placas separadas por una tira en cada uno de sus extremos.

En la mayoría de las unidades de electroforesis el gel se coloca entre dos cámaras con buffer; estas contienen electrodos contrarios, de manera que la única conección entre ambos es el gel.

Matrices o Soportes.

Generalmente las muestras se corren en soportes como papel, acetato de celulosa, almidón, agarosa o poliacrilamida. AI final de la electroforesis , la matriz debe conservarse y poder ser autoradiografiada o almacenada.

Los geles de poliacrilamida son el producto de la polimerización del monómero acrilamida, y un comonómero entrecruzador, siendo el N,N-metilen-bis- acrilamida (BIS), el más usado. Sin embargo, se ha experimentado con otros agentes entrecruzadores como el N,N-dialiltartadiamida (DATD), Acrilamida, 1,2- dihidroxietilen bis acrilamida (DHEBA), etilendiacrilato (EDA), polietilenglicol 200, 400 (PEGDA 200, PEGDA 400) (1).

MONÓMERO - ENTRECRUZADOR. TAMAÑO DEL GEL.

El tamaño del poro de un gel de poliacrilamida puede ser determinado de dos maneras:

1. Ajustar el porcentaje total de acrilamida, esto es, la suma de los pesos del monómero y el entrecruzador. Esto es expresado como % TI por ejemplo un gel 20 % T contendría 20 % (ph) de acrilamida más BIS, mientras que T% aumenta el tamaño del poro decrece.

2. La otra manera de ajustar el tamaño del poro es variar la cantidad de entrecruzador, expresada como un porcentaje de la suma del monómero y el entrecruzador (BIS). Esto es un gel 20 %T - 5 % BIS tendría un 20 % (ph) de acrilamida más BIS. El BIS tendría 5% del peso total de la acrilamida (1).

POLIMERIZACIÓN. La reacción de polimerización de un gel de poliacrilamida, es efectuada por métodos químicos o fotoquímicos.

l . En el método químico se emplea como iniciador de la reacción el persulfato de amonio o persulfato de potasio, siendo el primero el más utilizado. El

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catalizador más usado es la amina cuaternaria N,N,N,N- tetrametietilendiamina (TEMED).

2. En el método fotoquímico son usados riboflavina y TEMED. La polimerización se inicia cuando se expone a la luz ultravioleta, Righetti ha demostrado que la fotopolimerización con riboflavina es de menos de 8 horas para lograr un 95 % de la conversión de monómero a polímero. La reacción puede ser inhibida por cualquier radical libre que pueda intervenir en la reacción. También puede ser inhibida por la presencia excesiva de oxígeno, por ello se recomienda desairear con Argon la solución del polímero, para eliminar el oxígeno que pueda interferir en la reacción (1 ).

Sistemas Buffer

Se emplean dos tipos de sistemas buffer:

1. Continm. La solución del buffer del gel de separación es la misma que contiene el tanque de la cámara.

2. Discontinuo. Un gel de concentración, se coloca sobre un gel de separación, cada capa se prepara con diferentes soluciones buffers, a su vez hay una cámara para cada gel, las que contendrán bufferes distintos. El gel de concentración, tendrá funciones sobre la compactación de la muestra antes de entrar a la zona de separación, esto es para evitar que posteriormente la muestra se difunda durante la separación (1 ).

Separación de proteinas en su forma nativa.

La separación de proteínas en esta forma puede darse en ambos sistemas, continuo o discontinuo, este es un método muy utilizado cuando se trabaja con extractos crudos, evitando la adición o el tratamiento con agentes desnaturalizantes.

Separacidn de proteínas por su peso molecular.

En este tipo de separación los polipéptidos son tratados con SDS, un detergente aniónico, que desnaturaliza y confiere una carga neta negativa proporcional a la longitud del polipéptido. Cuando se trata la proteína con SDS y un agente reductor, el polipéptido se encuentra rodeado de una carga negativa (3).

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Relación entre resistencia, voltaje, corriente y potencia.

Dos ecuaciones básicas son importantes en la electroforesis; la primera es la ley de Ohm, que establece que la corriente ( I=ampers) es directamente proporcional al voltage ( E=volts) e inversamente proporcional a la resistencia ( R=ohms). I=E / R . La segunda es P = El, que establece que la potencia ( P=watts), como medida del calor que se genera, es el producto del voltaje y la corriente. Esto es P = I R.

En la electroforesis un parámetro eléctrico debe mantenerse constante, la corriente, el voltaje o la potencia. En modo corriente constante (la velocidad es directamente proporcional a la corriente), la velocidad se mantiene pero se genera calor. En el modo voltage constante. la velocidad disminuye pero no se genera calor adicional durante la corrida. En modo potencia constante la velocidad disminuye, pero la cantidad de calor permanece constante.

Carga neta de las proteinas Is, determinada por el pH del medio.

Las proteínas son compuestos anfotéricos, es decir contienen residuos ácidos y básicos y su carga neta la determina el pH del medio.

Existe un pH en el cual la carga neta de la proteína es cero, a ese pH se le llama punto isoelécrico. En una solución con pH por arriba del punto isoeléctrico la proteína tiene carga neta negativa y migra hacia el ánodo en el campo eléctrico. A pH por abajo de su punto isoeléctrico la carga neta de la proteína es positiva y migra hacia el cátodo.

El pH de una solución en un sistema de electroforesis debe permanecer constante, para así mantener la carga y movilidad de las proteínas. Por esta razón las soluciones empleadas en electroforesis son buffers.

Mantener la temperatura constante.

En cada etapa de la electroforesis la regulación de la temperatura es importante. La polimerización de los geles es una reacción exotermica y si no se controla esto pueden causarse irregularidades en el tamaño de los poros del gel. Por tanto debe mantenerse la temperatura constante llevando a cabo la reacción rodeada de un liquido enfriante. También mantener la

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temperatura constante es muy importante para evitar la desnaturalizacidn de las proteínas termolábiles.

OBJETIVOS

OBJETlVO GENERAL:

Evaluar la actividad enzimática de la a - quimiotripsina, e hidrolizar un concentrado proteínico de amaranto.

Determinar la actividad enzimática de la a - quimiotripsina, variando: tiempo, concentración de sustrato y temperatura.

Modificar el concentrado proteínico, obtenido por extracción alcalina, a los tiempos 5, 10 y 30 minutos.

Obtener el patrón electroforético y determinar el porcentaje de hidrólisis del concentrado protaínico modificado.

I. Obtención del concetrado proteínico de amaranto (CPA). II. Determinación de la actividad enzimática de la a - quimiotripsina. 111. Modificación enzimática del concentrado proteínico de amaranto. IV. Análisis electroforético. V. Determinación del porcentaje de hidrólisis.

Estos cinco procedimientos bAsicos son detallados a continuación:

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f. Obtención del CPA.

7. J Desgrasado de la Hanna de Amaranto (HA).

Este proceso fue realizado empleando como solvente acetona con 99 % de pureza. Se colocaron lotes de 300 g de HA con 1 I de acetona que fueron sometidos a un baño de hielo y agitación durante 12 h, una vez transcurrido este tiempo, la fase líquida fue decantada y al sedimento nuevamente se le adicionó solvente puro, manteniendo la mezcla bajo las mismas condiciones durante. las siguientes 12 h. La HA desgrasada (HAD) fue secada en estufa durante 4 h a 40 O C , para eliminar los residuos de solvente.

1.2 Extracción alcaina del CPA.

Se preparó una suspensión de HAD al 10 % con agua, que fue llevada a pH 10 con una solución de NaOH (% 50) y se sometió a agitación magnética por 60 min; la suspensión se centrifugó durante 20 min a 5000 rpm. El sobrenadante resultante se ajustó a pH 4 con ácido tricloroacético al 10 % y nuevamente fue centrifugado para la obtención del concentrado. El segundo precipitado obtenido fue secado en estufa durante 4 h a 40 O C ; una vez seco, el concentrado fue pulverizado para ser empleado en las demás etapas del proyecto.

If. Actividad enzlinática de fa quimiot/!bsina.

Sustrato: Fue preparada una solución de caseína al 1% en regulador de fosfatos (Na2HP04 - KH2P04) pH = 7.6 y 0.05 M . Enzima: Se elaboró una solución de enzima en el buffer de fosfatos (antes mencionado 3 Na2HP04 - KH2P04, pH = 7.6 y 0.05 M ), con una concentración de 500 pg / ml. Se pesaron 0.05 g de a - quimiotripsina que se doraron a 100 ml con-el buffer.

12

Condiciones de reacción: Con estas dos soluciones, se preparó una serie de tubos en los que el sustrato fue sometido a la acción de la enzima a una temperatura y tiempo determinados:

I

I 1.9 1.9

I 3 I

10 I o. í I 15

o. I 1.9 45 o. 1 1.9 30 o. 1 1.9 20 o. 1 1.9

Nota Cada uno de las muestras fue realizada por triplicado.

Cada uno de los tubos fue sometido a un baño con agua caliente a 37 OC; una vez que cada tubo alcanzó esa temperatura, se adicionó la sol. de enzima, manteniendo la temperatura constante durante la reacción.

Término de la reacción: Para suspender la hidrólisis, se agregó a cada tubo 3 ml de ácido tricloracético al 5%.

Posteriormente, los tubos se centrifugaron a 2000 rpm durante 20 min y al sobrenadante le fue determinada su absorbancia a una longitud de onda de 280 nm.

Iff. Modificación enz/inafica.

La hidrólisis enzimática fue realizada a los tiempos 5, 10 y 30 min. Esta modificación se realizó probando dos tratamientos designados como A y B, en los cuales se combinaron concentraciones diferentes de concentrado proteínico de amaranto y enzima. Para los dos tratamientos se tiene:

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Trufamiento A:

Sustrato: Se preparó una solución de concentrado en agua, pesando 0.7 g de CPA más 10 m1 de agua. (Por triplicado para cada tiempo de reacción) Concentración de sustrato = 70 mg / ml.

Enzima: Se preparó una solución de 0.210 g de enzima + 9.79 m1 de agua. Concentración de enzima = 21 mg / ml.

Trafamienfo B

Sustrato: Se preparó una solución de CPA en agua, pesando 1 .O g de CPA más 1 O ml de agua. (Por triplicado para cada tiempo de reacción) Concentración de sustrato = 100 mg / ml.

Enzima: Se preparó una solución de 0.350 g de enzima + 9.65 ml de agua. Concentración de enzima = 36 mg / ml.

Condiciones de reacción:

Una vez preparadas todas las soluciones de los tratamientos A y B, estas se sometieron al siquiente L. proceso:

C@ND!CIONES 6PTlMAS ?X pH Y TEMPERATCIPA E HlDR.bLlS!S

El pH de la solución sustrato (soluciones de CPA de A y 6) se ajustó a 8 empleando NaOH 6N; posteriormente en un baño de agua caliente se incrementó su temperatura a 37 OC. Bajo estas condiciones se adicionaron 100 pL de solución de enzima, dejando que la reacción transcurriera a los 5, 10 y 30 min respectivamente. (NOTA: Las muestras a los diferentes tiempos, de los dos tratamientos A y B, fueron elaboradas por triplicado).

Para suspender la hidrclisis, la enzima fue inactivada elevando la temperatura a 87 OC, durante un tiempo de 5 min.

El pH de cada una de las muestras hidrolizadas se ajustó a 7, empleando HCI 0.1 N.

14

Por último Cada uno de los hidrolizados fue secado en estufa a 40 O C , durante 4.5 h y posteriormente pulverizado.

I K Análisis Electro foré tic0

Cada una de las muestras de los tratamientos A y 6, fueron analizadas por electroforesis, para determinar en cual de los dos tratamientos y a que tiempo de reacción el porcentaje de hidrólisis del CPA era mayor. Para tal efecto cada muestra hidrolizada (MH) fue sometida al siguiente proceso:

Desnaturalkación de las muestras.

Se preparó una solución de hidrolizado en buffer cuya concentración fue de 1 O mg / ml. Estas muestras se designaron como A l -5, A l -1 O, A l -30 y B1-5, 61-10, B1-30.

Se tomo 1 ml de la solución anterior y se le agregó 1 m1 de buffer. La concentración de estas muestras fue de 5 mg / ml y se les designó como A2-5, A2-1 O, A2-30, 82-5, B2-1 O, B2-30.

Posteriormente se tomo 0.1 ml de cada muestra, a este volumen se le adicionó 0.1 ml de tratamiento desnaturalizante* y la mezcla se colocó en un baño a ebullición durante 2 min. Terminado esto, las muestras se guardaron en congelación hasta ser aplicadas en los geles de acrilamida. Ver pag 17.

Preparación de los geles de actkrmida.

Los geles de separación y empaquetamiento fueron elaborados en base a la composición descrita por el manual Koeffer Scientific Electrophoresis Instruments, como a continuación se describe:

15

SOLUCIONES EMPLEADAS.

* Solución 9 Acrilamida Bis

58.4 g

200 ml Agua 1.6 g

Guardar a 4 OC

* Solución 10 Acrilamida I 58.4 g Bis

Guardar a 4 aC en oscuridad 200 ml Glicerol 75% 1.6 g

Solución 1 1 ó Buffer 1 1 Tris

200 ml Ajustar el p H a 8.8 con HCI y refrigerar

* Solución 13

A ua 500 r n l Guaradar a To ambiente * SDS = Dodecil sulfato de sodio

1 * Solución 3 Persulfato de amonio

0.5 g

1 Agua I 5 ml Preparar continuamente

Sol. Teñidora Metano1 50% 454 ml

Ac. Acético 46 ml glacial Azul de Coomassie

1.25 g

* Sol. Decolorante Ac. acético I 225 ml glacial Agua 2625 ml Mezclar (agua + acético] + etanol

~~~ ~-

1 * Solución 15 ó Buffer I

Tris base

Su pH debe ser 6 .8

* Buffer del tanque Tris base 18 g Glicerol 99 % 84.4 m1

-SDS 10 % 60 ml 1 Agua 1 61t

El pH debe de ser 8.6

I * Tratamiento desnaturalizante

Sol. 15

Mercapto-etanol 2 ml Glicerol 99 % 4 ml Sol. 13

2.5 m1

10 ml Agua 0.25 ml Brornofenol 1% *

1 ml

* 1 0 0 rng de brornofenol / 10 m1 de agua

COMPOSICIÓN DE LOS GELES

I GEL DE EMPAQUETAMIENTO I Sol. 9 Sol. 15 Sol. 13 Agua Sol. 3

.780 m1 T.5 ml 60 pl

3.65 ml 30 pI

ITEMED* 6 pl I * TEMED = N,N,N’,N’- Tetrametiletilendiamina Volumen calculado para dos placas

I GEL DE SEPARACIóN (Gradiente tineal 10 - 20 %)

I 10 % 20 % Sol. 9 Sol. 10

1.17 ml

0.24 ml 1.41 m1 Agua 35 pL 35 pL Sol. 13 0.88 ml 0.88 m1 .Sol. 1 1 2.35 m1

TEMED 2.5 pl 2.5 pI Volumen total para dos placas

- -

Sol. 3 6.2 pi 6.2 pl

La metodología para llevar a cabo la electroforesis fue la siguiente:

1. Se lavaron y secaron las placas para hacer el sandwich. 2. Se colocó una de las placas en la base, en seguida las 2 gomas y se

atornilló formándose así uno de los sandwich. 3. Ambos sandwich se colocaron en su soporte. 4. Se acomodó cerca de las placas el formador de gradientes hoffer, con el

5. Se cerraron las llaves del Hoffer, y se colocaron su manguera y agujas de

6. Se prepararon las soluciones correspondientes ( I O y 20 % ), del gel de

7. AI agregar el persulfato y el TEMED, el proceso se realizó con rapidez para

mixer y una mosca (mixer ai lado derecho del hoffer).

aplicación.

separación.

evitar la gelificación durante el llenado.

17

8. Se tomaron 1.5 ml de la solución al 20 % y Se colocaron en el vas0 derecho del Hoffer, con agitación. Se agregó el mismo volumen de la solución al 10 %, pero fue depositada en el vaso izquierdo.

9. La aguja de vaciado se colocb hacia dentro de una de las placas y se abrió la llave de la solución 20 %.

?O. Una vez que salió el primer volumen de la solución 20%, se abrió la llave izquierda y se vaciaron, completamente las dos soluciones. Las placas se llenaron hasta 54 de su volumen.

11. Inmediatamente se enjuagó con agua el formador de gradientes Hoffer, y se agregó cuidadosamente. una poca de esa agua al gel en formación, de esta manera el meñisco se formó con el agua y no con el gel.

12. La placa se dejó gelificar durante 1 h. 13. Una vez preparado el gel de separación se elaboró el gel de

empaquetamiento de acuerdo a la formulación antes mencionada. 14. AI igual que con el gel de separación una vez que el persulfato de amonio

y el TEMED fueron agregados, el proceso fue llevado con mayor rapidez. 15. Ei gel de empaquetamiento se aplic6 con jeringa de 5 ml, dejando que se

derramara, para colocar los peines con los que se forman los posos de cada placa. En este punto, se evitó que se formaran burbujas en la solución para no tener problemas de resolución en la placa.

16. El gel de empaquetamiento se dejó gelificar durante 30 min. 17. Una vez listas las placas se retiraron los peines y cuidadosamente se

agregó en los posos formados un poco de buffer del tanque. 18. Se elaboró un diagrama de aplicación de las muestras para cada una de

las placas, así se registró la concentraci6n y posición de las mismas ~

respecto de un marcador o Dalton Marck (DM) de composición conocida. 19. Las placas con muestra se desmontaron y se colocaron en el soporte del

tanque donde se llevaría a cabo la aplicación de la corriente eléctrica. 20.La cerda fue llenada con buffer del tanque cerrada cuidadosamente y

conectada a la fuente de poder, 21. La electroforesis se realizó a un voltaje constante (200 V), durante 30 min. 22. Se apagó la fuente de poder; el buffer de la celda fue eliminado y los geles

23. La tinción de las placas, se realizó colocando los geles en solución

Posteriormente los geles fueron revelados colocándolos en solución decolorante, durante 4 h.

fueron retirados de las placas con ayuda de una curia.

teñidora durante 1 % h .

El marcador empleado para esta electroforesis se compone de 7 polipéptidos de diferentes pesos moleculares:

18

Componentes del Marcador (Dalton Marck)

Polipéptido

14,200 cx - Lactoalbúmina 36.1 O0 Gliceraldehído 3 - fosfodeshidrogenasa 20,l O0 lnhibidor de Tripsina 66,000 Albúmina Bovina 24,000 Tripsinógeno 45,000 Albúmina de Huevo 29,000 Anhidrasa Carbónica

Peso Molecular (Daltons)

Posteriormente fue necesario aplicar las muestras del tratamiento B en:

3 Geles de acrilamida con gradientes lineales 15 % - 25%, 1 O % - 25 %. 3 Geles de acrilamida de concentración 20 %. 3 Geles de acrilamida para polipéptidos muy pequeños.

La elaboración de los geles con gradientes lineales, es igual a la descrita anteriormente, excepto por la formulación del gel de separación:

GEL DE SEPARAC16N Concentración

10 % 15 % 25 % Sol. 9 1.17 ml 1.755 ml Sol. 10 * 2.35 ml Sol. 1 1 0.88 ml 0.88 ml 0.88 ml Sol. 13 0.035 ml 0.035 ml 0.035 ml Agua 1.41 m1 0.83 m1 0.24 m1

TEMED 2.5 pI 2.5 pl 2.5 pl Sol. 3 6.2 pl 6.2 pl 6.2 pl

* En este caso para lograr que el monórnoro tuviera una concentración de 25% la Suluciún IO fue elaborada de la siguiente forma:

Acrilamida .............. 69.4 g Bis ............. Agua ............. 200 ml

2 g

19

Los geles de separación de concentración 20 % se elaboraron adicionando el doble de cantidad que la empleada para formar el gradiente 10 % - 20 % (Ver tabla de la pag. 17 ), pero se aplicaron con una jeringa de 5 m1 sin utilizar el formador de gradientes :

GEL DE SEPARACIÓN 20% Sol. 9

0.48 m1 Agua 0.07 m1 Sol. 13 1.76 ml Sol. 1 1 4.7 ml Sol. 10

-

TEMED 5 PI Sol. 3 12.4 pl

Nota: Volumen para dos placas

EL ECTROFORESIS DE POLIPÉP~~DOS PEQUEÑOS.

Los geles para polipéptidos pequeños, se elaboraron empleando otras soluciones, y el tratamiento de las muestras también fue diferente:

20

SOLUCIONES EMPLEADAS.

* Solución 1 ' el de se aración

0.1875 Acrilamida

A ua 100 ml Guardar a 4 "C

* Solución 2 ' (gel ernpaquetarniento) Acrilamida

200 ml Agua 1.6 g , Bis 58.4 g .

Guardar a 4 "C

* Solución 3 . , (buffer g. separación) Trizrna base Trizma - HCI

16.1 g

50 ml Agua 2.7 g

Guardar a 4 "C

* Solución 4 *

buffer . em a vet. Trizma base 0.075 Trizma - HCI A ua 50 ml Guardar a 4 "C

* Solución 5 dodecil sulfato - sodio

1000 ml Guardar-a T o ambiente

* Solución 6 *

ersufato-amonio Persulfato de 100 mg amonio

1 .O ml Preoarar continuamente

* Solución 7 Azul de brornofenol

Azul de bromofenol

*Buffer del tanque PP

Glicina 142.7 g Trizma base

Agua 50 ml Sol 5 '

6.14 g Trizma HCI 25.66 g

5 I t

(Polipéptidos Pequeiios)

2 2 2 1 3 9

21

Formulación de los geles de separación y empaquetamiento.

Etectroforesis Polípéptidos Pequetíos

GEL DE SEPARACIóN GEL DE EMPAQUETAMIENTO Sol. 1 '

12 pl 24 pl TEMED 0.50 ml 1.70 ml Glicerol 99% 1.91 ml 1.75 ml Agua 15 pI 48 Sol. 6 ' 50 pl 1 70 pI Sol. 5 '

1.25 ml - Sol. 4 ' - 4.24 ml Sol. 3 '

1.26 ml - Sol. 2 - - 9.07 mi

Tratamiento de las muestras.

Las muestras del tratamiento B, es decir los hidrolizados en polvo (a los tiempos de reacción 5, 10 y 30 min) fueron diluidas en el siguiente buffer:

Buffer para diluir muestras (Electroforesis de Polipeptidos Pequefios)

.Sol. 4 '

Glicerol 1.0 ml Sol. 5 ' 1.25 m1

6 .O5 m1 Agua 23 mg Ditiokeitol 1.5 m1

La concentración de las muestras fue de 10 y 5 mg/ml. Su preparación se realizó diluyendo 0.01 g y 0.05 g de muestra en 1 ml del buffer anterior, obteniendo 10 mg / ml y 5 mg /ml respectivamente. Después fueron sometidas a ebullición durante 90 S y de cada una de ellas se tomó 1 O0 pl, a los que se les adicionó 100 pI de Solución 7'. Ya listas fueron guardadas en el congelador hasta su aplicación.

El marcador empleado para esta electroforesis fue la cx - Lactoalbúmina que tiene un peso molecular de 14,200 D.

22

La técnica se llevó a cabo de la siguiente forma;

1. Se lavaron y secaron las placas para hacer el sandwich. 2. Se colocó una de las placas en la base, en seguida las 2 gomas y se

atornilló formándose así uno de los sandwich. 3. Ambos sandwich se colocaron en su soporte. 4. Se preparó el gel de separación en base a la formulación antes

5. Se aplicó con jeringa de 5 m1 por uno de tos extremos de cada placa. 6. Se dejó gelificar durante 20 min. 7. Posteriormente se elaboró el gel de empaquetamiento (Ver pag. 22), y se

8. Se colocaron los peines cuidando que no se formaran burbujas en la

9. Se dejó gelificar durante 15 min. I O . Una vez gelificado se retiraron los peines y los posos fueron llenados con

buffer del tanque. 11. Se elaboró un mapa de aplicación, indicando la posición y cantidad de

muestra que sería colocada en cada uno de los posos de ambas placas. 12. Se aplicaron las muestras en concentraciones de 5 y 7 P I , pero colocando

primero 3 p l del Dalton Marck, en las posiciones previamente elegidas. 13. Las placas con muestra se desmontaron y se colocaron en el soporte del

tanque donde se llevaría a cabo la aplicación de la corriente eléctrica. 14. La celda fue llenada con buffer del tanque cerrada cuidadosamente y

conectada a la fuente de poder. 15. La etectroforesis se realizó a un voltaje constante (200 V), durante 30 min. 16. Se apagó la fuente de poder; et buffer de la celda fue eliminado y los geles

17. La tinción de las placas, se realizó colocando los geles en solución

Posteriormente los geles fueron revelados colochdolos en solución decolorante, durante 4 h.

mencionada (Ver pag. 22)

aplicó de igual forma que el gel de separación.

solucibn.

fueron retirados de las placas con ayuda de una cuña.

teñidora durante 1 % h .

NOTA: Cada muestra fue analizada por triplicado en las diferentes placas de electroforesis.

% Determinación del porcen f a j e de Hidrólisis

Esta determinacih de basó en el análisis del contenido de Nitrógeno soluble en Ácido Tricloroacético (TCA) y el contenido de Nitrógeno total, que fueron determinados en base al método micro- Kjeldal del A. O. A. C., 1978.

23

Contenido de Nitrógeno Total

A 1 g de CPA se le diluyó en 100 m1 de agua y 1 ml de esa solución fue ensayada por el método de micro-Kjeldal.

Contenido de Nitrógeno Soluble en TCA

A 1 g de CPA hidrolizado (a sus respectivos tiempos 5, 10 y 30 min, del tratamiento B), se diluyó en 100 ml de agua. De esta solución se tomaron 1 O ml y se diluyeron con 10 m1 de ácido tricloroacético (TCA)al 20 %. La mezcla se mantuvo en agitación durante 3 h y posteriormente fue centrifugada a 4500 rpm. 1 ml del sobrenadante fue ensayado por el método micro-Kjeldal.

Méfodo Micro-Kjeldal

En un matraz Qeldal, se colocaron 8 perlas de ebullición, 1 ml de muestra, 8 g de mezcla catalítica y 3 ml de ácido sulfúrico (H2S04). Esta mezcla se digirib durante 3 h, después de este tiempo el matraz fue enfriado y su contenido transferido a la copa del microdestilador, añadiendo pequeños volúmenes de agua para evitar la pérdida de N. Se agregó un volumen igual de sosa al 40 % y se llevó a cabo la destilación recibiendo el NH4 liberado en un vaso de precipitado que contenía 10 ml de ácido bórico al 2 */O y 5 gotas de indicador Qeldal. El destilado se recibió hasta un volumen de 60 m1 y posteriormente fue titulado con HCI 0.01 N, hasta observar el cambio de color de amarillo a lila pálido.

El porcentaje de Nitrógeno Total y Nitrógeno Soluble en TCA, se determinó como:

% N = (g X N X14.007 X 100 % > I mg demuestra

Donde: g = gasto de HCI en la titulación N = Normalidad del HCI

El Grado de Hidrólisis (GH) se determinó empleando la relación:

24

GH = (%N soluble en TCA / %N Total) X 100

NOTA: Las determinaciones se realizaron por triplicado para c/ muestra.

ACT/VIDADES REALIZADAS

Las actividades realizadas en este trabajo pueden agruparse en dos categorías: 1. Actividades experimentates, que constituyeron aproximadamente el 60 %

del trabajo realizado, y en las cuales fue llevada a cabo la metodología antes descrita.

2. Revisión bibtiográfica, que constituyó un 40 % del trabajo.

Estas actividades fueron completadas con una serie de entrevistas semanales con la asesora, y culminaron con la elaboración del informe final.

El material y equipo necesarios para la realización del proyecto fue proporcionado por el Laboratorio de Fisiología Postcosecha de Frutas y Hortalizas. Edificio “S” -157 - del Departamento de Biotecnología de la UAM - l.

METAS ALCANZADAS

Los objetivos planteados al inicio de este trabajo, fueron cubiertos satisfactoriamente. Mediante el trabajo realizado, se pudo evaluar la acción de la aquimiotripsina en un Concentrado Proteínico de Amaranto obtenido por extracción alcalina.

25

RESUL TADOS

Se desgrasó y extrajo tanto Concentrado Proteínico de Amaranto (CPA), como fue necesario para realizar todo el proyecto.

Acfividad Enzimcífica de fa a - Quimiofr/joina

La lectura de absorbancia en cada uno de los tratamientos fue la siguiente:

Tiempo de reacción Absorbáncia (mid

1 Promedio 3 2 10

2.286 2.284 2.289 2.285 45 2.273 2.278 2.270 2.272 30 2.320 2.3 17 2.320 2.3 18 20 2.255 2.255 2.253 2.256 15 2.057 2.055 2.059 2.057

La curva que se obtiene graficándo densidad óptica contra el tiempo de reacción es la siguiente:

26

Hidrólkb Enz/ináfica.

Las placas de electroforesis, para los tratamientos A y B revelaron lo siguiente:

TRATAMIENTO A

Geles d e acrilamida Gradiente 10 - 20 %

Muestras 10 mg / ml Muestras 5 mg 1 ml

,A1,5 6

6 A230 6 .A1,30 6 A2,lO 6 A1,lO 6 A2,5

CPA SIM *~ 6 CPA SIM 6 - * CPA S/M = CPA sin modificación enzimática

MUESTRA No. BANDAS OBSER. MUESTRA No. BANDAS OBSER.

TRATAMIENTO E j

Geles de acrilamida Gradiente 10 - 20 Oh

Muestras 10 mg I mi

Más de 6 [poca 823 Sin definición B1,5

Muestras 5 mg / mi MUESTRA No. BANDAS OBSER. MUESTRA No. BANDAS OBSER.

definición) ,B1,10 B 1,30 CPA S/M * * CPA S/M = CPA sin modificación enzimática

6 CPA S/M 6

I t 821 O B2,30

I1

11 11

Geles d e acrilamida Gradientes 1 O - 25 % y 15 - 25 Oh

Las muestras del tratamiento B que fueron aplicadas en estos geles, no presentaron una buena resolución, es decir, no se observaron con claridad bandas en cada una de las aplicaciones realizadas. Esto mismo ocurrió con los geles de acrilamida al 20 %.

27

Geles de acrilamida para Polipéptidos Pequeños.

Se aplicaron únicamente las muestras del tratamiento B:

Muestras 10 mg I ml

B2.1 O a B1.10 B2,5 1 Sin definición 8 B1,5

Muestras 5 mg 1 ml MU ESTRA MUESTRA I No. BANDAS OBSER. No. BANDAS OBSER.

11

B1,30

* CPA SlM = CPA sin modificación enzimática 6 6 1 CPA S/M CPA SIM *

8 I B2,30 I II

DETERMINACI~N B, 30 min 8, 10 min B, 5 rnin W Nitrógeno Soluble en TCA 0.66 % 0.78 7% 0.35 % (20 W ]

W Nitrógeno Total (En el CPA, Sin Modificación)

12.92 %

Grado de Hidrólisis B, 30 min B, 10 min B, 5 min 2.77 76 5.08 % 6 %

28

DISCUSldN

Acfividad Emmáfica

Se esperaba que la a - quimiotripsina hidrolizara la caseína, pues este sustrato, contiene 20 residuos de aminoácidos sobre los cuales podía actuar:

2 residuos de Triptofano O 8 residuos de Fenilanina

10 residuos de Tirosina

Más aún pues las condiciones de reacción: concentración de sustrato, concentración de enzima, pH y temperatura, eran óptimas para realizar la hidrólisis (7).

La ley de Lambert y Beer establece que en una solución, la magnitud de la absorción de luz está relacionada directamente con la concentración de la sustancia absorbente. Considerando esto se esperaba que la absorción de luz se incrementara a los diferentes tiempos de reacción de la enzima sobre el sustrato, debido a la presencia de un mayor número de residuos aminoácidos capaces de absorber luz ultravioleta. Los resultados muestran este comportamiento, pues por acción de la a - quimiotrpsina, se formaron nuevos polipéptidos con carbonos terminales de los aminoácidos Phe, Tyr, Trp, que incrementaron la absorción de luz. Esto se observa con claridad en la gráfica de la página no. 26 hasta los 20 min de reacción; después de este tiempo la absorción disminuye, pero nuevamente vuelve a incrementarse a los 45 min.

Esto significa que la enzima si se encontraba activa antes de realizar el tratamiento de hidrólisis d e l CPA.

ffidrdisk. Geles gradien fe 10 - 20 %

En estos geles, las muestras del tratamiento 4 a sus diferentes tiempos de reacción 5, 10 y 30 min, presentaron el mismo número de bandas que el CPA sin modificar. Esto significa que a estas concentraciones de Enzima y Sustrato, ef CPA no sufre hidrólisis enzimática.

Sin embargo la resolución de las bandas difirió entre las muestras de 5 y 10 mg / ml. En téminos generales las bandas con mejor definición fueron las de las muestras de concentración 5 mg / ml en aplicaciones de 5 y 7 4. Las muestras de I O mg / ml, en apticaciones de 5 y 7 pl se observaron como grandes manchas, donde no se apreciaban los polipéptidos del CPA.

29

EL Dalton Marck en estos geles presentó una muy buena definición en aplicaciones de 3 pl.

En los geles del tratamiento E se observó que una de las bandas del CPA ya no aparecía y en la parte correspondiente a los polipéptidos de menor peso molecular, no se observaban bandas bien definidas. Este comportamiento fue igual en las diferentes muestras, es decir a los 5, 10 y 30 min de reacción. La resolución de las bandas, al igual que en el tratamiento A, fue buena en las muestras con concentración de 5 mg / ml pero en aplicaciones de 3 pl. Las muestras de 10 mg / ml, no presentaron una buena definición y solo se observaron como grandes manchas aún en la aplicación más baja de 3 pl.

Considerando los resultados antes mencionados, fue eliminado el tratamiento A, por no ocurrir la hidrólisis enzimática, y las muestras del tratamiento B fueron analizadas en los geles con gradiente 1 O - 25 %, 15 - 25 % y geles sin gradiente 20 % .

Geles gradien fe 10 - 25 %, 15 - 25 % y 20 %

La razón de aplicar las muestras del tratamiento B en estos geles es la siguiente:

En un gradiente lineal, sabemos que el tamaño del poro en gel es diferente con respecto a la posición:

Geles de ucrlamida Gradien fe Lineal f Tamaño del poro)

Tamaño I O000 O 0 0 0 O O O 0

O O O O

Gel de Separación 1

10 %

20 %

Por lo tanto en función de su peso molecular cada polipéptido avanza en el gel, hasta llegar a un tamaño de poro por el que ya no puede atravesar. En base a esto, se esperaba que las muestras del tratamiento B presentaran bandas mejor definidas, para así determinar el número de polipeptidos de menor tamaño que se originaron al aplicar la a - quimiotripsina; sin embargo, esto no ocurrió, pues aún en las muestras de concentración 5 mg / ml en aplicaciones de 3 y 2 pl no se observaron los polipéptidos de menor tamaño.

Geles de acriamida para po1l;oéptidos pequeños (GPPJ

En estos geles las muestras del tratamiento B a los tiempos 5, 10 y 30 min, presentaron el mismo número de bandas, pero revelaron la presencia de 2 polip6ptidos que no se presentan en el CPA sin modificar.

A diferencia de los geles con gradiente lineal, la definición de las bandas fue muy clara en aplicaciones de 5 y 7 pl para las muestras con I O mg /ml de concentración. En contraste, las muestras de 5 mg f ml en aplicaciones de 5 y 7 pl, no se observaron una vez reveladas las placas. Esto indica que bajo estas condiciones de sustrafo y enzima si ocurrió. la modificación enzimática.

Porcen fqe de Hidrbfisk

Los geles de acrilamida de polipéptidos pequeños, mostraron que la acción de la enzima fue la misma a los diferentes tiempos de reacción, pues se observa el mismo número de bandas en todas las muestras.

En base a lo anterior se esperaba que los resultados del grado de hidrólisis fueran iguales para los tres tiempos de reacción; sin embargo fueron diferentes y de acuerdo con ellos el mayor y menor grado de hidrólisis ocurrió a los 10 y 5 min respectivamente de actividad enzimhtica.

Los resultados del grado de hidrólisis determinados por el método de micro - Kjeldal, son una manera indirecta de cuantificar la actividad de la enzima sobre el sustrato; por otro lado la electroforesis es uno de los métodos más sensibles en la identificaci6n de compuestos biológicos, por tanto se puede considerar que los perfiles electroforéticos muestran claramente la diferencia

31

entre los polipéptidos presentes en el CPA antes y después de la modificación enzimática, lo cual no ocurre con el método micro - Kjeldal.

CONCLUSIONES

La enzima ~1 - quimiotripsina, es una endopeptidasa capaz de hidrolizar parcialmente un CPA extraído alcalinamente; para que esto ocurra se debe considerar que :

A concentraciones de sustrato y enzima bajas, es decir de '70 y 21 mg / m1 respectivamente (condiciones del tratamiento A), y a los tiempos de reacción 5, 10 y 30 min, la hidrólisis no ocurre a pesar de mantener las condiciones óptimas de pH y To para que la enzima actúe. Sin embargo a concentraciones mayores es decir, 100 mg / ml de sustrato y 36 mg / ml de enzima (condiciones del tratamiento B), la hidrólisis si se presenta, pero la acción de la enzima solo genera dos polipéptidos de bajo peso molecular (menores a 14,200), observándose así 8 bandas en los perfiles electroforéticos de los hidrolizados del tratamiento B y 6 bandas en el perfil electroforktico del CPA sin hidrolizar. También se observó que bajo tales condiciones el comportamiento de la enzima fue el mismo a los diferentes tiempos de reacción del tratamiento B (5, I O y 30 min).

En el caso de los dos tipos de electroforesis empleados es decir de polipéptidos grandes (peso molecular de entre 66,000 y 24,000), y la de polipdptidos pequeños (peso molecular menor a 14,200) se pudo observar que tanto las aplicaciones y concentración de las muestras se comportaron de una manera diferente. En la electroforesis de polip6ptidos grandes, los perfiles electroforéticos con una buena resoluci6n fueron los de las. muestras con una concentración de 5 mg / m1 en aplicaciones de 3 pl, en cambio para la electroforesis de polipéptidos pequeños, los perfiles electroforéticos mejor definidos fueron los observados en las muestras de concentración I O mg /ml en aplicaciones de 5 y 7 pl.

32

El grado de hidrólisis determinado por el método de micro - Kjeldal no fue acorde a los resultados que mostró la electroforesis, sin embargo por ser esta última un método de mayor sensibilidad, se consideran verdaderos los perfiles electroforéticos que se obtuvieron, por lo tanto el grado de hidrólisis a los diferentes tiempos de reacción de la enzima fue el mismo.

A pesar de que el número de polipéptidos generados por la acción de la enzima fue pequefio, se cree que las propiedades funcionales del CPA modificado pueden haber cambiado favorable o desfavorablemente, con respecto a las del CPA sin modificar.

RECOMENDACIONES

Se recomienda, probar otros tratamientos con concentraciones mayores de enzima y sustrato que las del tratamiento B, y no solo con el CPA extraído por el metodo akalino, sino también experimentar con otros concentrados que ya han sido obtenidos por diferentes métodos de extracción.

En su defecto se recomienda analizar la composición de aminoácidos de los polipéptidos del CPA alcalino, para así poder predecir con una mejor exactitud el comportamiento que se esperaría al emplear la endopeptidasa a - quimiotripsina a diferentes concentraciones de enzima y sustrato o bien utilizar otras peptidasas con las que se obtuvieran mayores grados de hidrólisis.

En ambos casos se recomienda emplear la electroforesis, como método de análisis de polipéptidos, debido a su alta sensibilidad.

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