distribuciÓn espaciotemporal de nrg,...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
DISTRIBUCIÓN ESPACIOTEMPORAL DE NRG, ERBB2 Y ERBB4 EN LA REGIÓN
VENTRICULAR DURANTE EL PROCESO DE SEPARACIÓN CARDIACA EN EMBRIÓN DE
POLLO
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS CON ESPECIALIDAD EN MORFOLOGÍA
P R E S E N T A
BLANCA ARIADNA CARRILLO AVALOS
DIRECTORA DE TESIS:
CONCEPCIÓN SÁNCHEZ GÓMEZ
CODIRECTORA DE TESIS: ADRIANA BECERRIL MONTES
MÉXICO, D. F., Noviembre de 2008.
I
II
III
La investigación fue realizada en el Departamento de Biología del Desarrollo
y Teratogénesis Experimental del Hospital Infantil de México Federico
Gómez.
Este trabajo recibió apoyo del Programa Institucional de Becas de Posgrado
y del Protocolo HIM/2007/006.
IV
DEDICATORIA
Para Marco y para Ana.
Siempre juntos, siempre unidos.
V
AGRADECIMIENTOS
A mi familia Marco, tu paciencia y amor han sido lo más importante para mí.
Ana, me estimulas a ser cada vez mejor y a alcanzar metas cada vez más altas. ¡Te quiero, chiquilla!
Papá y mamá, sin su apoyo no lo hubiera logrado. ¡Mil gracias por todo! Brtko, gracias por tu interés y por haber estado conmigo.
A todos los amo todo.
A la Dra. Becerril Por haber me dado esta oportunidad y apoyarme tanto durante todo este tiempo,
gracias por su amistad y sus consejos.
A la Dra. Sánchez Con su entusiasmo e increíble paciencia me guió a través del desarrollo del corazón
y de la investigación. Gracias por su gran interés y su gran apoyo.
Mis dos directoras de tesis: He aprendido mucho con ustedes y han nutrido mucho mi visión. Gracias por las
invaluables enseñanzas.
Dr. Ricardo García Cavazos Dr. Manuel Arteaga Dra. Norma Herrera Dra. Adriana Jarillo
Gracias por haber aceptado ser sinodales y por sus observaciones y comentarios.
Alex Por tu paciencia y tu guía a través del mundo de la investigación y por tu interés y
apoyo, ¡muchas gracias!
Marcela Por tu interés y tu confianza en estos tiempos, ¡eres una gran amiga!
A Laura, Maru, Israel, Rigoberto, por todo su apoyo, sus comentarios y su interés
sobre el proyecto.
Laboratorio de Biología del Desarrollo y Teratología Experimental Quienes rápidamente me aceptaron, gracias por su interés y amistad,
Lucy, Laura, Sra. Lidia, Sr. Mario y Oswaldo.
Familias Carrillo y Avalos Por su interés y apoyo; especialmente, gracias Madrina, Cris y Flavio (compadres).
1
ÍNDICE Página
Abreviaturas utilizadas 2
Relación de ilustraciones
Figuras 5
Tablas 6
Resumen 7
Abstract 9
Introducción 11
Antecedentes
Anatomía cardiaca 13
Desarrollo del tabique interventricular 16
Neuregulinas 21
Justificación 27
Objetivo General 28
Objetivos Específicos 28
Material y método 29
1. Inmunofluorescencia 30
2. Citometría de Flujo 32
Resultados 34
1. Inmunofluorescencia 34
2. Citometría de Flujo 40
Discusión 42
Conclusiones 47
Sugerencias para trabajos futuros 48
Bibliografía 49
Anexo A. Soluciones y Reactivos 54
Anexo B. Técnicas 56
2
ABREVIATURAS UTILIZADAS
A AD Atrio Derecho
AI Atrio Izquierdo
APH Polo arterial del corazón
ARIA Inductor de actividad del receptor de Acetilcolina
C CIV Comunicación interventricular
CF Citometría de flujo
E EGF Dominio semejante al factor de crecimiento epidermal
F FITC Isotiocianato de fluoresceína
G GGF Factor de crecimiento glial
H HRG Heregulina
HIMFG Hospital Infantil de México Federico Gómez
I Ig Dominio semejante a inmunoglobulina
IF Inmunofluorescencia
3
L LA Atrio izquierdo
M MH Corazón maduro
MVS Microvalvas Septales
N NDF Factor de neu diferenciación
NRG Neuregulina
P PA Atrios primitivos
PBS Solución amortiguadora de fosfatos
PCNA Antígeno nuclear de proliferación celular
PI Tracto de entrada
PLA Atrio izquierdo primitivo
PO Tracto de salida
PRA Atrio derecho primitivo
PTLV Región trabeculada del ventrículo izquierdo
PTRV Región trabeculada del ventrículo derecho
R RA Atrio derecho
RT Cuerpo trabeculado
S SIVP Septum interventricular primitivo
SMDF Factor derivado de neuronas sensitivas y motoras
SSC Citrato salino de sodio
4
St Estadio
SV Seno venoso
T TAV Tabique atrioventricular
TE Tracto de entrada
TI-A Tabique Inter-Atrial
TIV Tabique interventricular
TS Tracto de salida
V VD Ventrículo Derecho,
VI Ventrículo Izquierdo,
VSM Valva Septal de la Mitral
5
RELACIÓN DE ILUSTRACIONES
FIGURAS Página
Figura 1 Regiones anatómicas del ventrículo derecho. 14
Figura 2 Regiones anatómicas del ventrículo izquierdo. 14
Figura 3 Anatomía del tabique y sus relaciones con las cámaras 15
Cardiacas.
Figura 4 Cavidades cardiacas presentes en la etapa de tubo 16
recto según Davis.
Figura 5 Esquema basado de De la Cruz y colaboradores, que 18
ilustra la aparición progresiva de los segmentos cardiacos.
Figura 6 Esquema de los tres tipos de isoformas de NRG 1. 22
Figura 7 Estrategia experimental. 29
Figura 8 Fotografía tomada en el microscopio confocal para 31
detectar la expresión de ErbB4 en el corazón de St 20.
Figura 9 Resultados que exhibe el programa Cell Fit al analizar 33
la citometría de flujo.
Figura 10 Secuencia de expresión de fluorescencia de NRG en el 35
TIV en desarrollo en embriones de pollo de estadios
16 al 32.
Figura 11 Secuencia de expresión de fluorescencia de ErbB2 en el 37
TIV en desarrollo en embriones de pollo de estadios
16 al 32.
Figura 12 Secuencia de expresión de fluorescencia de ErbB2 en el 38
TIV en desarrollo en embriones de pollo de estadios
16 al 32.
Gráfica 1 Resultados de Inmunofluorescencia por proteína y por 39
estadio en miocitos del TIV en desarrollo de corazones de
embriones de pollo.
6
Gráfica 2 Resultados de citometría de flujo para cada estadio y 41
proteína en miocitos de la región ventricular de corazones
de embriones de pollo.
TABLAS Página
Tabla 1 Medias de datos obtenidos por medio de 39
microscopia confocal para cada estadio y proteína.
Tabla 2 Medias de datos obtenidos por medio de
citometría de flujo para cada estadio y proteína. 41
7
DISTRIBUCIÓN ESPACIOTEMPORAL DE NRG, ERBB2 Y ERBB4 EN LA REGIÓN VENTRICULAR DURANTE EL PROCESO DE SEPARACIÓN
CARDIACA EN EMBRIÓN DE POLLO
RESUMEN El tabique interventricular (TIV), se divide en tercios basal, medio y apical; los
dos últimos forman su región muscular. Con respecto al desarrollo de ésta se
ha investigado en corazón de pollo la proliferación de los miocitos cardiacos,
identificándose cuatro fases: premorfogenética, temprana de morfogénesis,
tardía de morfogénesis y fase de histodiferenciación. Varios estudios
experimentales indican que entre los factores moleculares que participan en
el patrón diferencial de actividad proliferativa y de diferenciación durante el
desarrollo del TIV pueden encontrarse las neuregulinas (NRG), familia de
factores de crecimiento implicados en el desarrollo del corazón; la NRG que
se sintetiza en el endocardio actúa a través de ErbB2 y ErbB4, sus
receptores en el miocardio, para regular las propiedades de crecimiento de
las células miocárdicas del ventrículo que dan lugar a la formación de las
trabéculas. Sin embargo, no se ha establecido qué procesos morfogenéticos
regula esta proteína; un primer acercamiento es determinar el patrón espacio
temporal de expresión de la NRG y sus receptores durante la morfogénesis
del TIV y correlacionarlo con las fases de su desarrollo. Mediante
inmunofluorescencia con microscopia confocal se llevó a cabo rastreo de las
proteínas en el TIV en corazones de embrión de pollo desde el estadio 16, en
el que aún no se encuentran trabéculas, hasta el estadio 32, en el que el TIV
ya es una estructura madura; se midió la intensidad de la fluorescencia sobre
fotografías del extremo cefálico y del extremo caudal de las trabéculas o el
septum interventricular primitivo obtenidas de cortes histológicos.
Posteriormente se realizó la técnica de citometría de flujo para cuantificar el
número de miocitos positivos a las proteínas NRG, ErbB2 y ErbB4.
8
La inmunofluorescencia mostró que durante todos los estadios hay expresión
de la NRG en las células de endocardio y de miocardio, y que en el estadio
30, que corresponde a la fase de histodiferenciación, los miocitos la expresan
con mayor intensidad. ErbB2 se expresa en las células del miocardio, en
todos los estadios, presentando la mayor intensidad durante el estadio 30. En
el endocardio se encontró expresión en el estadio 18. ErbB4 presenta su pico
de mayor intensidad durante el estadio 30 en los miocitos; en el endocardio
no se encontró expresión.
La citometría de flujo mostró que los porcentajes de células positivas a las
tres proteínas son mayores en el estadio 30.
Los resultados indican que la expresión de NRG y sus receptores analizada
por microscopia confocal muestra distribución espacial semejante en las
trabéculas y en el TIV en desarrollo. Que la expresión de ErbB2 en células de
endocardio durante el estadio 18 sugiere regulación autócrina y que la
presencia de NRG en los miocitos ventriculares indica síntesis de esta
proteína en ellos. Además, en cuanto a la expresión temporal de las
proteínas, se encontró que en la fase de premorfogénesis la NRG producida
por el miocardio puede ser importante para el inicio de la formación de las
trabéculas, mientras que en la etapa de morfogénesis temprana, la cantidad
requerida de las proteínas para regular la adhesividad de los miocitos es baja
o bien el complejo NRG/ErbB2-4 no es tan importante en este proceso.
Durante la fase de morfogénesis tardía, los bajos niveles de NRG y de ErbB4
encontrados sugieren que la acción de NRG no es tan importante para la
proliferación celular, contrario al estadio 30, donde los altos niveles de las
tres proteínas indican que son necesarios para estimular la
histodiferenciación de los miocitos,
9
SPATIO-TEMPORAL DISTRIBUTION OF NRG, ERBB2, AND ERBB4 IN THE VENTRICULAR REGION DURING CARDIAC SEPPARATION
PROCESS IN CHICKEN EMBRYO
ABSTRACT The interventricular septum (IVS) is divided in basal, middle and apical thirds;
the latter two are part of its muscular region. In relation to the development of
this region there are studies made in chicken embryos about proliferation of
cardiac myocytes, by which there have been identified four phases:
Premorphogenetic, Early Morphogenetic, Late Morphogenetic, and
Histodifferentiation. Several experimental reports show that amongst the
molecular agents that may have a role in the differential pattern of
proliferative activity during the IVS development are the neuregulins (NRG),
family of growth factors implied in heart development; the NRG synthesized in
endocardium acts through ErbB2 and ErbB4, its receptors in myocardium, in
order to regulate the growth properties of the myocardial cells of the ventricle
which give rise to trabeculations. However, the morphogenetical processes
that this protein regulates have not been established; a first approach is to
determine the spatio-temporal pattern of this protein and its receptor’s
expression during the morphogenesis of the IVS, and to correlate this
information with the phases of development. Immunofluorescence by confocal
microscopy was carried out to trace these proteins in the heart of chicken
embryos of stages 16 (when there are no trabeculations yet) to 32 (in which
the IVS is already a mature structure); fluorescence intensity was measured
on images of the cephalic and caudal regions of the trabeculations or the IVS
obtained from histological slices.
Afterwards, flow cytometric assays were performed to quantify the number of
positive myocytes to NRG, ErbB2 and ErbB4.
10
The immunofluorescence assays exhibit that there is expression of NRG
through all the stages in the endocardium and myocardium cells, and that in
stage 30 (Histodifferentiation phase), the myocytes express it more intensely.
ErbB2 is expressed in myocardium cells throughout all the stages, showing
the highest intensity during stage 30. There was found expression of ErbB2 in
stage 18 in endocardium. ErbB4 displays a peak of intensity in myocytes in
stage 30; expression in endocardium was not shown.
Flow cytometric assays exhibited that the percentages of positive cells to all
three proteins are the highest in stage 30.
The results indicate that through immunofluorescence the expression of NRG
and its receptors shows similar spatial distribution in trabeculations and in
developing IVS. The expression of ErbB2 in endocardium cells during stage
18 suggests autocrine regulation, and the presence of NRG in ventricular
myocytes indicates its synthesis in those cells. Moreover, in relation to the
temporal expression of the proteins, there was found that in
Premorphogenetic phase the NRG produced by myocardium can be
important for the beginning of trabeculations formation, meanwhile, in Early
Morphogenetic phase, the required quantity of the proteins to regulate the
adhesivity of myocytes is low or the NRG/ErbB2-4 complex is not too
important in this process. During the late morphogenetic phase, the NRG and
ErbB4’s low levels suggest the action of NRG is not very important for cellular
proliferation, contrary to stage 30, where the high levels of all three proteins
indicate they are necessary for myocytes histodifferentiation.
11
DISTRIBUCIÓN ESPACIOTEMPORAL DE NRG1, ERBB2 Y ERBB4 EN LA REGIÓN VENTRICULAR DURANTE EL PROCESO DE SEPARACIÓN
CARDIACA EN EMBRIÓN DE POLLO
INTRODUCCIÓN
Las malformaciones congénitas cardiovasculares tienen una frecuencia de
1% en recién nacidos vivos, de 10% en fetos y de 20% en abortos
espontáneos (Hoffman, 1995). También se sabe que más del 30% de las
cardiopatías congénitas están asociadas a malformaciones extracardiacas
como parte de un síndrome (Maroto et al, 2001). Al principio de la
investigación de estas malformaciones sólo se involucraban cardiólogos,
embriólogos y anatomistas; sin embargo, los avances actuales en la genética
han permitido mayor conocimiento del origen de estas patologías.
Los métodos para diagnosticar estas malformaciones durante la vida
postnatal incluyen la clínica, electrocardiografía, rayos X, ecocardiografía y
cateterismo. Algunos de estos procedimientos también se pueden aplicar a
los fetos en el vientre materno. Todos ellos son fundamentales para el
diagnóstico preciso de las malformaciones cardiacas, que es el primer paso
para disminuir la morbilidad y la mortalidad en el tratamiento quirúrgico
(Buendía, 2005).
A pesar del éxito de las correcciones quirúrgicas aún no se sabe cuál es el
origen de muchas de las malformaciones, lo que es sumamente importante
dada la necesidad actual de prevención de enfermedades más que de
tratamiento (Buendía, 2005).
Actualmente se sabe que muchas de las cardiopatías, como defectos del
tabique a nivel atrial, defectos en la tabicación atrioventricular, persistencia
12
del conducto arterioso, aorta bivalva, coartación de la aorta, alteraciones
troncoconales, cardiomiopatías, etc., tienen origen en alteraciones genéticas
y del microambiente celular (Markwald y Moreno, 2001).
Algunos avances en el estudio de las alteraciones genéticas se han logrado a
través de la manipulación de ratones transgénicos, en los cuales se puede
silenciar un gen en particular para observar las consecuencias de su
ausencia en el desarrollo cardiaco. Desde luego hay que tomar en cuenta
que la alteración en la morfología cardiaca puede no deberse sólo a la
ausencia de una proteína única, pero este tipo de estudios es útil para valorar
su relevancia y su papel dentro de los diferentes niveles de regulación
(Markwald y Moreno, 2001).
Las investigaciones de alteraciones genéticas deben complementarse con
las técnicas de embriología básica, que son de suma relevancia, pues a la
vez que proporcionan información sobre el desarrollo cardiaco normal,
aportan datos sobre el origen de las malformaciones, así como la manera en
que éstas se van produciendo. Estos estudios de embriología básica
emplean diversas técnicas como inmunofluorescencia, hibridación in situ,
citometría de flujo y cultivo celular, entre otras.
13
ANTECEDENTES ANATOMÍA CARDIACA Tanto en humanos como en aves el corazón consta de cuatro cámaras: dos
ventrículos y dos atrios. El atrio derecho es la cámara que recibe la sangre
desoxigenada desde el seno coronario y las venas cavas inferior y superior.
Se comunica con el ventrículo derecho a través de la válvula atrioventricular
derecha (tricúspide) y éste bombea la sangre desoxigenada hacia la
circulación pulmonar. El atrio izquierdo es la cámara que recibe la sangre
oxigenada desde las venas pulmonares y se comunica a través de la válvula
atrioventricular izquierda o mitral con el ventrículo izquierdo, desde donde la
sangre oxigenada será bombeada hacia la aorta para que pase a la
circulación general (Anderson y Becker, 1981; O’Rahilly, 1989).
Ambos ventrículos se dividen en tres regiones anatómicas: el tracto de
entrada, que incluye la válvula atrioventricular y el aparato de tensión; el
cuerpo trabeculado; y el tracto de salida (Anderson y Becker, 1981) (Figuras
1 y 2).
Un tabique común que separa a las cámaras cardiacas derechas de las
izquierdas. Con base en las cavidades que separa, el tabique cardiaco
consta de tres regiones: interauricular, atrioventricular e interventricular
(Anderson y Becker, 1981) (Figura 3). En el caso del tabique atrioventricular
(TAV) la valva septal de la válvula tricúspide se inserta más apical que la
inserción septal de la valva anterior de la mitral, por lo que el lado derecho
del tabique se relaciona con el atrio derecho por arriba de la válvula y con el
ventrículo derecho por debajo de la misma, y forma la porción membranosa
de la pared septal del ventrículo izquierdo adyacente a la sigmoidea
coronariana derecha (O’Rahilly, 1989; Sánchez et al, 1990). Por lo anterior,
14
se sabe que esta porción se encuentra entre el atrio derecho y el ventrículo
izquierdo (O’Rahilly, 1989).
Fig. 1. Corazón de pollo en el que se muestra
disecado el ventrículo derecho, delimitando
sus tres regiones anatómicas: TE cámara de
entrada; RT cuerpo trabeculado, no
totalmente disecado pues se encuentra aún
cubierto por la pared del ventrículo; y TS
cámara de salida (Laboratorio de Biología del
Desarrollo, HIMFG).
Fig. 2. Corazón de pollo en el que
se muestra disecado el ventrículo
izquierdo, delimitando sus tres
regiones anatómicas: TE cámara de
entrada; RT cuerpo trabeculado; y
TS cámara de salida (Laboratorio
de Biología del Desarrollo, HIMFG).
15
Fig. 3. Fotografía de un corazón maduro de pollo en disección frontal, que ilustra la anatomía
del tabique y sus relaciones con las cámaras cardiacas. En este modelo biológico la valva
septal de la tricúspide corresponde a una serie de microvalvas que se insertan directamente
sobre el tabique sin músculos papilares. AD Atrio Derecho, AI Atrio Izquierdo, VD Ventrículo
Derecho, VI Ventrículo Izquierdo, TI-A Tabique Inter-Atrial, TA-V Tabique Atrioventricular, TI-
V Tabique Interventricular, MVS Microvalvas Septales, VSM Valva Septal de la Mitral. Las
líneas negras separan los tercios del TIV (Laboratorio de Biología del Desarrollo, HIMFG).
El tabique interventricular (TIV), se divide en tres tercios: basal o de tractos
de entrada y de salida de los ventrículos; medio; y apical; los dos últimos
forman la región muscular del TIV que divide el cuerpo trabecular de los
ventrículos (Figura 3). Esta región se extiende desde el ápice del corazón
hasta el espacio que separa los orificios pulmonar y tricúspide del aórtico y el
mitral.
16
DESARROLLO DEL TABIQUE INTERVENTRICULAR Según los estudios de embriología descriptiva de Davis (1927), en la etapa
en tubo recto del desarrollo del corazón, se encuentran presentes cinco
regiones o cavidades cardiacas primitivas, que darán lugar a otras tantas
cámaras definitivas en el corazón maduro: en sentido cefalocaudal, el bulbo
aórtico que formará las grandes arterias, el bulbus cordis que dará origen al
ventrículo derecho, el ventrículo izquierdo y los atrios primitivos derecho e
izquierdo que formarán dichas cavidades definitivas (Figura 4).
Fig. 4. Esquema basado en los trabajos de embriología descriptiva que muestra las
cavidades cardiacas primitivas presentes en la etapa en tubo recto mencionadas por Davis
(1927). AB bulbo aórtico, BC bulbus cordis, LV ventrículo izquierdo, A atrios primitivos
derecho e izquierdo; 1, 1’ Surcos inter-bulbares derecho e izquierdo; 2,2’ Surcos
Bulboventriculares derecho e izquierdo; 3,3’ Surcos Atrioventriculares derecho e izquierdo.
Sin embargo, la embriología descriptiva no considera que el desarrollo sea
un proceso dinámico, secuencial, progresivo e ininterrumpido; los estudios se
realizan en una sola etapa del desarrollo, sin poder analizar al mismo
organismo progresivamente. En contraste, De la Cruz y cols (1989),
17
demostraron mediante marcaje in vivo en embriones de pollo, que en la
etapa de corazón en tubo recto sólo están presentes dos segmentos
cardiacos: el primordio de la región trabeculada del ventrículo derecho y el
correspondiente del ventrículo izquierdo. Además mencionaron que los
primordios de los tractos de entrada y salida ventriculares, y de los atrios y
las grandes arterias aparecen progresivamente durante la cardiogénesis (De
la Cruz et al. 1989, 1991, 2001) (Figura 5).
Para el estudio del desarrollo del TIV se han utilizado tanto técnicas de
embriología descriptiva como experimental. Así han surgido dos hipótesis
principales para explicar el origen de la región muscular del TIV (tercios
medio y apical). La primera expone que se forma por el crecimiento de las
bolsas ventriculares, y la segunda señala el origen trabecular. Ambas ideas
se detallan a continuación.
Streeter (1948) al describir corazones de embriones humanos de la
Colección Embriológica del Instituto Carnegie, menciona que durante el
horizonte XI observó protrusión del miocardio cubierto de endocardio en las
regiones ventriculares; aunque no pudo saber si el endocardio, el miocardio o
los dos juntos inician la formación de las trabéculas.
El mismo autor describió en secciones representativas de corazones de
horizontes XIV al XVII, que los ventrículos derecho e izquierdo forman dos
bolsas trabeculadas que al ir creciendo van adosándose y adhiriéndose hasta
adquirir una pared común. La cresta del tabique interventricular primitivo
surge primero y va adquiriendo más tejido en la región inferior a medida que
los ventrículos van creciendo. De manera que el tabique interventricular
crece desde arriba hacia abajo, siendo la cresta su parte más antigua y la
región apical la más reciente. Posteriormente, en el horizonte XVIII el tabique
18
Fig. 5. Esquema basado en los trabajos de embriología experimental de De la Cruz y
colaboradores, que ilustra la aparición progresiva de los segmentos cardiacos. St: Estadio;
PRA: Atrio derecho primitivo; PLA: Atrio izquierdo primitivo; SV: seno venoso; APH: polo
arterial del corazón; RA: Atrio derecho; LA: Atrio izquierdo; ;MH: Corazón maduro PO: tracto
de salida primitivo; PTRV: primordio de la región trabeculada del ventrículo derecho; PTLV:
primordio de la región trabeculada del ventrículo izquierdo; PI: tracto de entrada primitivo;
PA: Atrios primitivos. (De la Cruz, 1998).
19
interventricular se fusiona con el tejido de los cojines del canal AV,
formándose así el tabique membranoso y aislando ambos ventrículos.
Concordantemente, De Vries y Saunders (1962) describieron en corazones
de embriones humanos de la misma colección que en el horizonte XIV la
región del ventrículo derecho al rotar ventromedialmente, produce un
plegamiento del miocardio que coincide externamente con el surco
interventricular, formando una cresta que fue considerada como el inicio del
tabique interventricular, que posteriormente, en el horizonte XV, se
observaba más prominente debido al plegamiento ventral y coaptación de las
paredes ventriculares.
Respecto a la segunda hipótesis, Rychterová (1971) mediante el análisis del
corazón de embrión de pollo observó que las trabéculas al principio van
creciendo al parejo de la pared muscular y están separadas entre sí por
espacios intertrabeculares, que se van volviendo más estrechos mientras que
el músculo de las trabéculas se torna más grueso. También explica que la
formación de las trabéculas entre los estadios 28 y 38 HH ocurre por medio
de proliferación y no por diferenciación.
Harh y Paul (1975), por medio de estudios de marcaje in vivo en corazones
de embrión de pollo concluyeron que las trabéculas son los únicos elementos
que participan en el desarrollo del tabique. Además, encontraron que la
morfogénesis del tabique resulta de un crecimiento hacia abajo más que uno
hacia arriba, en dirección a los cojines endocárdicos. Con respecto al modelo
de desarrollo del TIV propuesto por Streeter (1948) comentaron que si fuera
cierto que al ir creciendo los ventrículos hacia abajo coalescen sus paredes y
se forma el tabique de manera pasiva, nunca deberían observarse
comunicaciones interventriculares (CIV), lo que no concuerda con la
20
frecuencia actualmente conocida de CIV en humano (20% de todos los
pacientes con cardiopatías congénitas) (Maroto et al, 2001).
Recientemente, por medio de experimentos de marcaje in vivo en embriones
de pollo, se demostró que la fusión de las trabéculas que se originan en las
paredes ventriculares a una trabécula central ubicada sobre el surco
interventricular (trabécula principal) inicia la formación del TIV. Durante este
proceso las trabéculas se van ramificando hasta formar láminas, y
simultáneamente ocurre importante proliferación de los miocitos de la región
inferior, de manera que el tabique en desarrollo se va alargando en sentido
contrario al de los cojines endocárdicos hasta formar al TIV maduro
(Contreras et al, 2008a).
Este mismo grupo (Contreras et al, 2008b) también ha investigado el
significado de la proliferación de los miocitos cardiacos en el desarrollo del
TIV de corazón de pollo por medio de estudios histológicos y de
inmunohistoquímica detectando el antígeno nuclear de proliferación celular
(PCNA). Observaron que en etapas tempranas las células de los tercios
medio y apical son iguales entre sí, y que en etapas más avanzadas las
células del tercio medio mostraron cada vez mayor diferenciación que las del
tercio apical y, finalmente, al analizar el corazón maduro las células de
ambos tercios mostraron las mismas características de diferenciación. En los
análisis de inmunohistoquímica observaron que las células que exhibieron
mayor intensidad de expresión de PCNA se encontraron por igual en ambos
tercios en etapas tempranas, y que posteriormente fue el tercio apical el que
mostró mayor intensidad, hasta que en el corazón maduro en ambos tercios
se observó disminución de la señal de PCNA. Estos resultados fueron
concordantes con el crecimiento del TIV en sentido contrario a los cojines
endocárdicos. Con base en estos resultados los autores identificaron la fase
premorfogenética, que abarca los estadios 9 a 16-17 y durante la que ocurre
21
formación de las trabéculas; la fase temprana de morfogénesis, que ocurre
durante los estadios 18-22 y cuyo proceso fundamental es la adhesión
celular; la fase tardía de morfogénesis, en los estadios 24-28 con la
proliferación celular como el proceso más importante; y la fase de
histodiferenciación, presente del estadio 30 en adelante.
Varios estudios experimentales en sistemas in vitro y en embriones
transgénicos indican que entre los factores moleculares que pueden estar
implicados en este patrón diferencial de actividad proliferativa y de
diferenciación durante el desarrollo cardiaco se encuentran las neuregulinas
(NRG) (Meyer and Birchmeier, 1995; Gassman et al, 1995).
NEUREGULINAS
Son una familia de factores de crecimiento implicados en el desarrollo del
sistema nervioso, sistema neuromuscular y corazón, que llevan a cabo su
efecto a través de receptores. Se ha observado que estos factores estimulan
la proliferación celular, diferenciación, supervivencia o el destino de la
población celular (Falls, 2003).
Las NRG fueron descubiertas por medio de diferentes estudios, entre los
cuales se encuentra la búsqueda de los ligandos del oncogene ErbB2, ya
conocido por su papel en el cáncer de mama y de ovario (Michelin y Mayo,
1997), así como la del inductor de actividad de los receptores de acetilcolina
y la del factor de crecimiento glial (GGF). Todas estas investigaciones fueron
publicadas el mismo año, hablando de diferentes funciones de la misma
proteína (Falls, 2003).
Posteriormente se descubrió que la familia de las NRG es codificada por 4
genes diferentes que presentan expresión diferencial. Según el gen que les
22
da origen se les llama NRG1 si es el gen 1 y así sucesivamente. (Longart
and Buonanno, 2002.)
Fig. 6. Esquema de los tres tipos de isoformas de NRG 1. N dominio N terminal; C dominio C
terminal; Ig dominio similar a inmunoglobulinas; EGF dominio similar al factor de crecimiento
epidermal; GGF factor de crecimiento glial; CRD dominio rico en cisteína. La flecha señala el
sitio de proteólisis. Note que el dominio C-terminal corresponde a la región intracitoplásmica
y el dominio N-terminal marca la región de la proteína que se secreta.
Debido a recombinaciones alternas y múltiples promotores del gen de NRG1,
se producen por lo menos 15 isoformas diferentes que se distinguen por tres
características estructurales: el tipo de dominio semejante al factor de
crecimiento epidermal (EGF): α o β; la secuencia N Terminal: tipo I, II o III; y
si la proteína se liberará de la membrana mediante proteólisis o si
permanecerá como una proteína transmembranal (Figura 6).
23
Las isoformas I y II son semejantes a las inmunoglobulinas (Ig) en un
dominio, por lo que se les llama NRG-Ig (Figura 6). Un dominio del tipo III es
rico en cisteína, y se denomina NRG-CRD. El tipo I también se puede dividir
según su dominio EGF en α y β. Los tres tipos de isoformas son sintetizados
como precursores transmembranales que después sufren proteólisis,
liberándose las isoformas solubles activas que generan señales parácrinas,
en el caso de los tipos I y II, y la isoforma transmembranal activa en el caso
del tipo III. (Carraway III, 1996; Falls, 2003).
Durante el desarrollo embrionario el gen de NRG1 se expresa en células
derivadas de todas las capas germinales: corazón, neuronas, glía, hígado,
estómago, pulmones, bazo y piel. Algunas de las isoformas son: ARIA
(Inductor de Actividad del Receptor de Acetilcolina), GGF, HRG (Heregulina),
NDF (Factor de Neu Diferenciación) y SMDF (Factor Derivado de neuronas
Motoras y Sensitivas) (Lee et al, 1995; Falls, 2003). Se hará referencia a las
NRG1 sólo como NRG en adelante.
Las NRG se unen a receptores del tipo tirosincinasa, conocidos como
receptores ErbB que se encuentran en la superficie celular (Elenius et al,
1997); éstos son importantes en el crecimiento, diferenciación y
supervivencia celulares (Longart and Buonanno, 2002). Los Erb constituyen
una familia de proteínas formada por los receptores de EGF, ErbB2, ErbB3 y
ErbB4, y al contactarse con la proteína señal (NRG) pueden formar
homodímeros o heterodímeros; ErbB2 funciona a través de
heterodimerización con ErbB3 o ErbB4 (Carraway III, 1996). El dominio EGF
de las NRG se une al dominio N terminal del receptor ErbB4 y es suficiente
para producir dimerización, fosforilación de los residuos de tirosina de ErbB2
y activación de las rutas de señalización, llevando a respuestas celulares
como estímulo o inhibición de proliferación, apoptosis, migración,
diferenciación y adhesión. Aparentemente las NRG interactúan con ErbB2
24
sólo después de unirse a ErbB4. (Kramer et al, 1996; Meyer et al, 1997;
Longart and Buonanno, 2002; Falls, 2003). El dominio Ig se une a
constituyentes de la matriz extracelular como la heparina (Kramer et al,
1996).
Se ha establecido que el endocardio regula la actividad de las células del
miocardio embrionario mediante señales difusibles o parácrinas. Se ha
demostrado que se expresan NRGs del tipo I en el endocardio del corazón
de ratón en desarrollo, incluyendo el endotelio de atrios y ventrículos, aunque
es particularmente prominente en el endotelio de los cojines endocárdicos.
Por otro lado, los receptores ErbB2 y ErbB4 se expresan en el miocardio, y
ErbB3 en células del mesénquima del cojín endocárdico y bulbus cordis
(Meyer and Birchmeier, 1995; Carraway III, 1996; Falls, 2003). Además, se
ha demostrado que NRG I es la isoforma que se expresa primero durante la
embriogénesis, encontrándose en el mesénquima cefálico y ganglios
craneales, así como en el endocardio; mientras que las isoformas II y III son
detectadas a mediados de la gestación de ratón (Meyer et al, 1997).
Aparentemente este sistema de señalización es intermediario de
interacciones celulares locales que llevan a diferentes pasos en el desarrollo
cardiaco. La NRG que se sintetiza en el endocardio actúa junto con ErbB2 y
ErbB4 en el miocardio para regular las propiedades de crecimiento de las
células miocárdicas del ventrículo que dan lugar a la formación de las
trabéculas (Carraway III, 1996).
Lo anterior se ha demostrado por medio de mutaciones dirigidas en ratones:
NRG Ig -/- (Inactivación de tipos I y II, pero tipo III normal): mueren al 10.5
día de gestación y tienen defectos del desarrollo cardiaco, de neuronas
sensoriales craneales y simpáticas (Carraway III, 1996).
25
NRG1 -/- (Inactivación de todas las isoformas de NRG1 con dominio EGF
α): tienen defectos en el desarrollo de mama, pero no en el de corazón
(Carraway III, 1996).
ErbB4 -/-: ratones que no expresan ErbB mueren a la mitad del desarrollo
uterino debido a la ausencia de desarrollo de músculo cardiaco (Gassman
et al, 1995).
ErbB2 -/-: en ratones con deleción del gen de ErbB2 se observó ausencia
completa de las trabéculas (Lee et al, 1995).
También se ha observado la falta de formación de trabéculas ventriculares en
el corazón en desarrollo en embriones de pollo a los que se infectó con
retrovirus que expresaban ribozimas que inactivaban a la NRG I. (Zhao and
Lemke, 1998).
Estos hallazgos indican que la NRG tipo I con dominio EGF β, junto con sus
receptores ErbB2 y ErbB4, son indispensables para el desarrollo normal de
trabéculas en el corazón, y por lo tanto para el desarrollo del TIV.
Aunque, como ya se mencionó, por medio de experimentos realizados en
ratón se sabe que la NRG se expresa principalmente durante la
embriogénesis temprana (Meyer et al, 1997), y que tiene un papel
predominante en la formación de trabéculas que después dan lugar al
tabique interventricular, no se conoce con exactitud si el efecto de esta
proteína en los miocitos ventriculares del corazón embrionario es sobre
proliferación o la diferenciación de los miocitos. Tampoco se ha identificado
en qué fase de la morfogénesis cardiaca sobresale su expresión.
26
Por otro lado, estudios in vitro sugieren que la NRG es capaz de regular la
proliferación, diferenciación, sobrevivencia y destino de células en cultivo. En
el corazón, la NRG puede actuar como mitógeno que estimula la proliferación
de células mesenquimatosas de los cojines endocárdicos y como factor de
diferenciación que promueve la formación de trabéculas desde las células del
miocardio ventricular, aunque no hay acuerdo sobre la acción que realiza
(Lee et al, 1995).
27
JUSTIFICACIÓN
La información que existe sobre el posible papel de la NRG en la
morfogénesis de la región muscular del TIV se ha obtenido de manera
indirecta. Mediante estudios en cultivo primario de corazones de aves o
mamíferos en etapa postnatal y embrionarios se involucra a la NRG en la
regulación de proliferación, apoptosis, migración, diferenciación, adhesión y
sobrevida. Por su parte la producción de embriones transgénicos y knock out
de mamíferos y el uso de retrovirus en aves indican su posible papel en la
formación de las trabéculas, que como ya se mencionó son los componentes
embrionarios de la región muscular del TIV. Sin embargo, no se ha
establecido qué procesos morfogenéticos regula esta proteína. Un primer
acercamiento es determinar el patrón espacio temporal de expresión de la
NRG y sus receptores durante el desarrollo de la región muscular del TIV y
correlacionarlo con los procesos involucrados (proliferación, apoptosis,
diferenciación) determinados en las fases de morfogénesis del TIV. La
información lograda será útil para comprender mecanismos moleculares que
regulan el desarrollo normal las trabéculas y del TIV, que al alterarse pueden
ocasionar cardiopatías congénitas graves como comunicación interventricular
en la región muscular del tabique y ventrículo único.
28
OBJETIVO GENERAL
Determinar la distribución espaciotemporal de la NRG1 y los receptores
ErbB2 y ErbB4 y correlacionarla con las etapas de morfogénesis del TIV.
OBJETIVOS PARTICULARES
1. Determinar la distribución en el espacio y en el tiempo de NRG, ErbB2 y
ErbB4 en cortes histológicos, mediante inmunofluorescencia y microscopia
confocal en el TIV en desarrollo de corazones embrionarios de pollo de
estadios 16-32.
2. Cuantificar la población de miocitos de la región ventricular que expresa
NRG, ErbB2 y ErbB4 por medio de citometría de flujo en los estadios 16-
32.
29
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron huevos fértiles de gallinas Gallus domesticus, cuyos cascarones
se desinfectaron con alcohol al 70% y se incubaron a 37°C, con 86% de
humedad, para obtener embriones de diferentes estadios: 16, 18, 20, 22, 24,
26, 28, 30 y 32. La edad se calculó con referencia a la tabla de Hamburger y
Hamilton (1951). Se llevó a cabo rastreo de las proteínas mediante
inmunofluorescencia empleando microscopia confocal y citometría de flujo.
Los resultados se correlacionaron con los conocimientos previos de las
etapas de la morfogénesis del TIV.
Fig. 7. Estrategia experimental.
30
1. Inmunofluorescencia.
Se seleccionaron tres embriones de cada edad mencionada; en etapas
tempranas (16 y 18) se tomó el embrión completo y en edades posteriores
sólo se tomó el corazón. Los especímenes una vez lavados en PBS (solución
amortiguadora de fosfatos) (Anexo A.Soluciones I) fueron fijados en formol al
3.7% durante 24 horas (Anexos A.Soluciones II, B.Técnicas I). Después
fueron deshidratados, transparentados y posteriormente embebidos en
Paraplasto (Anexo B.Técnicas II). Se realizaron cortes frontales del corazón
de 5 μm de espesor y se colocaron en serie en portaobjetos preparados con
Poly-L-Lysine (Sigma-Aldrich). Luego para rastrear las proteínas NRG, ErbB2
y ErbB4 mediante microscopia confocal se llevó a cabo la técnica de
inmunofluorescencia (Anexo B.Técnicas III).
En los cortes histológicos se analizaron los extremos superior e inferior del
TIV en desarrollo, midiendo la intensidad de la fluorescencia a través del
programa LSM 5 del microscopio confocal Axiovert 100M. Para ello se tomó
una fotografía del extremo cefálico y otra del extremo caudal de la trabécula
principal (St 18-22) o el TIV en desarrollo (St 24-32) de un corte sí y dos no,
para evitar captar la misma célula. Sobre cada una de las fotografías se trazó
una línea de 90 μm con el programa LSM 5 del microscopio confocal Axiovert
100M para conocer los niveles de intensidad del canal verde a lo largo de
ella, canal en el que se expresó el anticuerpo fluoresceinado secundario para
cada proteína (Figura 8). Este valor se obtuvo a una longitud de onda de
excitación de 488 nm y de emisión de 505 a 530 nm con láser de argón. El
yoduro de propidio utilizado para contrastar los núcleos fue leído en el canal
rojo a una longitud de onda de excitación de 543 nm y de emisión de 560 nm
con láser de helio - neón. Los valores de la intensidad del canal verde a lo
largo de la línea trazada se promediaron obteniendo un nuevo valor para
cada fotografía, y después todos los nuevos valores de cada fotografía por
31
proteína y por estadio se emplearon para sacar un promedio final. Dichos
promedios se analizaron mediante el programa Excel de Microsoft Office de
manera conjunta para la obtención de promedios y gráficas.
Fig. 8. Fotografía tomada en el microscopio confocal para detectar la expresión de ErbB4 en
el corazón de St 20. Observe la línea trazada a través del tejido y la gráfica de la intensidad
de fluorescencia que se genera.
32
2. Citometría de flujo
Para cuantificar el número de miocitos positivos a las proteínas NRG, ErbB2
y ErbB4, se perfundieron los corazones de embriones normales en las
edades antes mencionadas con buffer de permisión (Anexo A.Soluciones V),
luego se disecó la región ventricular de cada corazón y se procedió a
disgregar sus células (Anexo B.Técnicas IV). Una vez que se comprobó que
se contaba con una suspensión de por lo menos un millón de células se
procedió a distribuirla equitativamente en 13 tubos eppendorf y a
continuación se aplicaron anticuerpos primarios policlonales producidos en
conejo anti-NRG (HRG C-20 sc-348 Santa Cruz Biotechnology), anti-ErbB2
(Neu C-18 sc 284 Santa Cruz Biotechnology) o anti-ErbB4 (ErbB4 C-18 sc
283 Santa Cruz Biotechnology) y anticuerpos secundarios anticonejo hechos
en cabra y acoplados a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Caltag
Laboratories) para identificar a las proteínas mencionadas (Anexo B.Técnicas
V). Para asegurar que las células analizadas fueran miocitos se empleó
como marcador una miosina específica de corazón de pollo (MF20,
Hybridoma) con su anticuerpo secundario anticonejo hecho en cabra (Alexa
Fluor 594, Molecular Probes). Posteriormente todas las muestras se leyeron
en un citómetro de flujo Vecton Dickinson y se analizaron con el programa
Cell Fit.
Después se obtuvieron gráficas indicando el número de eventos o número de
células que cumplieron con las especificaciones ya mencionadas. Primero se
solicitó identificar todas las células presentes y separar los miocitos del resto
(eritrocitos y otras) sólo por tamaño y peso, observándose las deseadas en el
cuadrante superior (Figura 9A). En este grupo de células se realizó el control
del anticuerpo secundario para la cadena pesada de miosina específica de
cardiomiocitos de pollo, presentándose en el cuadrante superior derecho de
la gráfica (Figura 9B); además se identificaron las células que fueron
33
positivas para el anticuerpo primario y secundario para la miosina, las que
también se observan en el cuadrante superior derecho de la gráfica (Figura
9C), reconociendo así con toda certeza a los miocitos de corazón de pollo
que se deseaban estudiar. Posteriormente se hizo el control del anticuerpo
secundario para la proteína en estudio, ya fuera NRG, ErbB2 o ErbB4,
encontrando la representación de las células positivas en el cuadrante
superior derecho (Figura 9D). Finalmente se analizaron las células positivas
para los anticuerpos primarios (MF20, anti-NRG, anti- ErbB2 o anti-ErbB4)
para la proteína de elección, estudio que se realizó por triplicado (Figura 9E,
F y G).
Fig. 9. Resultados que exhibe el programa CellFit al analizar la citometría de flujo. En este
ejemplo se presentan los del estadio 32 para la NRG.
34
RESULTADOS 1. Inmunofluorescencia.
NRG
Durante todos los estadios se encontró expresión de la NRG de color verde
dentro de las células del endocardio y del miocardio, con distribución
dispersa en el primero y en agregados en el segundo. Se distingue el núcleo
de la célula por su coloración roja debido al yoduro de propidio. La intensidad
aparente de la expresión de la proteína tanto en células del endocardio como
en las del miocardio es muy semejante en todos los estadios. Sin embargo,
al analizar cuantitativamente, en las células del endocardio la fluorescencia
es más intensa durante los estadios 16 y 18, disminuyendo durante el estadio
20, para desaparecer durante el resto de los estadios. En contraste, en el
miocardio la fluorescencia es variable a lo largo del tiempo. Para obtener
información exacta sobre la intensidad de fluorescencia en los miocitos se
trazaron las líneas sobre este tipo celular (Figura 10). La tabla 1 y la gráfica 1
muestran los promedios de los valores obtenidos para cada estadio. En ellas
se observa que a lo largo del tiempo el estadio en el que los miocitos
expresan la fluorescencia con mayor intensidad es el 30, que corresponde a
la fase de histodiferenciación y aunque también los estadios 16 y 26
sobrepasan al resto, no alcanzan niveles tan altos como el estadio 30. Los
estadios 16 y 26 corresponden a las fases de premorfogénesis y
morfogénesis tardía, respectivamente.
35
Fig. 10. Secuencia de expresión de fluorescencia de NRG en el TIV en desarrollo en
embriones de pollo de estadios 16 al 32.
36
ErbB2
Se encontró expresión de ErbB2 en las células del miocardio, con
distribución en agregados, de color verde, en todos los estadios. En las
células del endocardio sólo se encontró expresión en el estadio 18, con
distribución dispersa (Figura 11). La expresión de la proteína aparentemente
es un poco más intensa durante los estadios 18 y 20; sin embargo, en la
tabla 1 y gráfica 1 se observa el mayor pico de intensidad durante el estadio
30, que como ya se indicó, corresponde a la fase de histodiferenciación.
Durante los estadios 18, de morfogénesis temprana, y 24, de morfogénesis
tardía, también hay gran intensidad de expresión en los miocitos, aunque
menor que en el estadio 30.
ErbB4
La distribución de la expresión de esta proteína es muy semejante a la de
ErbB2, en las células del miocardio, con distribución en agregados (Figura
12). En las células del endocardio no se encontró expresión. La tabla 1
muestra los valores obtenidos para esta proteína, en la que se encuentra que
durante el estadio 30, que corresponde a la fase de histodiferenciación,
ErbB4 presenta su pico de mayor intensidad, aunque los estadios 18 y 20,
ambos correspondientes a la fase de morfogénesis temprana, presentan
niveles cercanos de intensidad. Esta proteína presenta en el estadio 24, fase
de morfogénesis tardía, la menor intensidad de todos los estadios y
proteínas.
En la tabla 1 se resumen los valores medios de la expresión de las tres
proteínas durante todos los estadios estudiados, y en la gráfica 1, estos
valores se muestran en relación con las etapas del desarrollo del TIV.
37
Fig. 11. Secuencia de expresión de fluorescencia de ErbB2 en el TIV en desarrollo en
embriones de pollo de estadios 16 al 32.
38
Fig. 12. Secuencia de expresión de fluorescencia de ErbB4 en el TIV en desarrollo en
embriones de pollo de estadios 16 al 32.
39
Microscopia confocal
St NRG ErbB2 ErbB4 16 26.42 17.07 16.4618 19.07 35.64 49.6820 15.79 18.83 51.9922 18.78 17.60 17.3024 14.96 28.22 10.4526 23.24 16.80 17.8628 16.50 14.61 21.4730 29.67 42.18 53.8232 21.95 18.71 14.85
Tabla 1. Medias de datos obtenidos por medio de microscopia confocal para cada estadio y
proteína.
Gráfica 1. Resultados de Inmunofluorescencia por proteína y por estadio en miocitos del TIV
en desarrollo de corazones de embriones de pollo.
40
2. Citometría de flujo
Los datos obtenidos a través de este análisis son el número de células
positivas a la cadena pesada de miosina específica de cardiomiocitos de
pollo que expresan la proteína en estudio (NRG, ErbB2 o ErbB4). Este
número de células se conoce como “eventos”, y son los que se encuentran
en el cuadrante superior derecho de cada gráfica obtenida. El total de
eventos medidos fue de 10,000 para todos los estudios, y el porcentaje de
eventos positivos del primer ensayo, fue sumado a los otros dos ensayos y
así se obtuvieron los promedios para cada proteína por estadio (Tabla 2).
Al graficar los datos de la tabla 2 se observa que los porcentajes de miocitos
positivos a NRG son mayores en los estadios 16 y 30, con menores
cantidades en el resto del tiempo; aunque hay un pequeño pico en el estadio
22 a partir del que sigue los mismos aumentos y disminuciones que los
receptores (Gráfica 2). Los porcentajes más bajos son durante los estadios
20, 24 y 26.
ErbB2 también mostró un pico muy importante durante el estadio 30, y otro
menor en el estadio 22.
Mientras tanto, ErbB4 muestra tres picos durante los estadios 16, 20 y 30,
éste último el más importante.
ErbB2 presenta un porcentaje menor al de ErbB4 durante la fase de
premorfogénesis; sin embargo, durante el estadio 18 el porcentaje de ambos
receptores es muy semejante entre sí. Durante el estadio 20 el porcentaje de
ErbB4 es mucho mayor al de ErbB2, y a partir del estadio 22 los porcentajes
de ambas proteínas siguen los mismos aumentos y disminuciones; aunque
41
durante el estadio 22 es un poco mayor el porcentaje de ErbB2, y durante los
estadios 28, 30 y 32 es un poco mayor el porcentaje de ErbB4.
Citometría de flujo
St NRG ErbB2 ErbB4 16 7.99 % 2.21 % 6.08 % 18 1.78 % 2.33 % 1.98 % 20 0.44 % 3.70 % 6.03 % 22 2.41 % 3.95 % 3.71 % 24 0.67 % 2.02 % 2.08 % 26 1.26 % 3.17 % 3.17 % 28 1.99 % 0.45 % 1.25 % 30 12.56 % 10.41 % 11.55 % 32 1.67 % 0.10 % 1.22 %
Tabla 2. Medias de datos obtenidos por medio de citometrías de flujo para cada estadio y
proteína.
Gráfica 2. Resultados de citometría de flujo para cada estadio y proteína en miocitos de la
región ventricular de corazones de embriones de pollo.
42
DISCUSIÓN
Las cardiopatías congénitas tienen una incidencia de 4-50/1,000 recién
nacidos vivos, y de éstas el tabique ventricular permeable es el tipo más
común, principalmente en la región muscular, presente en 2 al 5% de los
niños menores de un año. Este defecto cierra espontáneamente durante el
primer año de vida en el 85-90% de los casos (Hoffman and Kaplan, 2002).
Ahora se sabe que el balance entre las proteínas de señalización (factores
de crecimiento), los factores de transcripción y el metabolismo es
determinante en la formación correcta de las estructuras (Markwald &
Butcher, 2007); sin embargo no queda claro cuál o cuáles de estos
elementos falla durante el desarrollo anómalo de la región muscular del TIV.
El análisis por inmunofluorescencia (IF) fue útil para conocer el tipo celular en
el que se expresan la NRG y sus receptores. Además permitió cuantificar,
aunque de manera indirecta, la cantidad de proteína presente en los miocitos
de la trabécula central (morfogénesis temprana) y el TIV en desarrollo
(morfogénesis tardía). Esto se logró mediante la determinación de la
intensidad de fluorescencia emitida por los anticuerpos que reconocen a las
proteínas objeto de este estudio. Por su parte la citometría de flujo (CF)
permitió distinguir las células miocárdicas en suspensión por su tamaño y la
presencia de MF20, proteína característica de este tipo celular. En ellas se
estableció la presencia de NRG ErbB2 y ErbB4 utilizando los mismos
anticuerpos que en la técnica de IF. A pesar de las diferencias metodológicas
entre la IF y la CF los resultados de la distribución temporal de las tres
proteínas obtenidos con ambas técnicas fueron coincidentes.
43
1. Expresión de NRG, ErbB2 y ErbB4 en la región ventricular del corazón embrionario de pollo durante la morfogénesis del TIV
Mediante IF no se observó en las trabéculas ni en el TIV en desarrollo
diferencia significativa en la distribución espacial (el extremo cefálico y el
caudal) de NRG ni sus receptores. Por esta razón los datos obtenidos para
cada estadio y proteína fueron analizados en conjunto, sin hacer distinción
entre los extremos. No obstante, fue sorprendente haber encontrado
positividad de las células de endocardio a ErbB2 durante el estadio 18, ya
que no se encuentra en la literatura revisada algún antecedente sobre la
presencia de ErbB2 o ErbB4 en endocardio. Este hallazgo podría significar
una regulación autócrina de las células del endocardio a través de su ligando,
la NRG. No obstante, esto no puede ser probado a través de los métodos
llevados a cabo en este estudio.
Por otro lado, el anticuerpo primario policlonal anti-NRG empleado, identifica
solamente la región C-terminal de la proteína que corresponde a su dominio
citoplásmico y por esta razón, no se une a la región de la molécula que es
separada del resto a través de proteólisis y que contiene la región EGF que
efectúa la señalización parácrina.
Interesantemente, las observaciones en los cortes histológicos analizados
por IF mostraron positividad a NRG tanto en endocardio como en miocardio.
Estas observaciones fueron reforzadas al medir el grado de fluorescencia del
anticuerpo anti-NRG únicamente en los miocitos.
La positividad de NRG en endocardio no sorprende tomando en cuenta las
características del anticuerpo y también que se sabe que esta proteína se
sintetiza en el endocardio y es liberada desde ahí para llevar a cabo
44
señalización parácrina en el miocardio (Brutsaert, et al, 1998), uniéndose
primero a ErbB4 y luego formando el heterodímero con ErbB2 (Falls, 2003).
En contraste, no se esperaba la presencia de NRG en los miocitos en todos
los estadios analizados, demostrada a través de la IF. Sin embargo al
determinar mediante CF la positividad de los miocitos ventriculares a dicha
proteína se encontró que ambos resultados son concordantes, lo que indica
que en esas células ocurre síntesis de NRG. Así mismo estos hallazgos
difieren de los reportes de varios investigadores quienes a través de métodos
variados han probado la síntesis de NRG exclusivamente en el endocardio
(Meyer & Birchmeier, 1995; Kramer, et al, 1996). Quizá la diferencia en los
resultados se deba a que la región de la molécula que rastrearon fue el
dominio EGF (secretado) y no la región C-terminal transmembranal, como se
hizo en este estudio. De la misma manera, los niveles de intensidad de
fluorescencia de NRG en miocardio a lo largo del estudio (Tabla 1, Gráfica 1),
sólo podrían explicarse a través de la síntesis de novo en estas células.
2. Distribución de las proteínas NRG, ErbB4 y ErbB4 y su correlación con los procesos morfogenéticos de la región muscular del TIV.
Los métodos de IF y CF utilizados en este estudio valores de NRG muy
diferentes de los de sus receptores durante las etapas premorfogenética y de
morfogénesis (16-28HH). En contraste, en el estadio 30 los valores de las
tres proteínas presentaron un pico de máxima expresión (Graficas 1 y 2).
Durante la fase premorfogenética (St 16) se halló por IF y CF que en el
estadio 16 existe un pico de expresión de NRG, por su parte la CF mostró
que el porcentaje de células positivas a ErbB4 y a NRG es elevado (Tablas 1,
2, Gráficas 1,2). Estos resultados sugieren que en la fase de
premorfogénesis la NRG producida por el miocardio es importante para el
inicio de la formación de las trabéculas.
45
La IF y la CF mostraron en la fase de morfogénesis temprana (St 18-22) que
durante el estadio 22 las tres proteínas se encuentran casi al mismo nivel de
intensidad, aunque bajo (Tabla 1, Gráfica 1), lo que coincide con un pico de
miocitos positivos a las proteínas (Tabla 2, Gráfica 2). Este estadio
corresponde al tiempo en que las láminas trabeculares comienzan a
adherirse a la trabécula central (Contreras, et al, 2008b). Los resultados
podrían significar que la cantidad de las proteínas necesaria para regular la
adhesividad de los miocitos es baja o bien que el complejo NRG/ErbB2-4 no
es tan importante en este proceso.
Durante el estadio 24 de la fase de morfogénesis tardía (St 24-28), cuando la
proliferación es el proceso más importante (Contreras, et al, 2008b), tanto
NRG como ErbB4 presentan su nivel de intensidad más bajo (Tabla 1,
Gráfica 1), lo que coincide con un escaso porcentaje de miocitos positivos a
estas dos proteínas determinado por CF (Tabla 2, Gráfica 2). Estos
resultados junto con el hecho que ErbB4 es el receptor al que se une en
primer lugar la NRG, pueden indicar que en este estadio la acción de NRG es
menor que en otros estadios y que puede no ser indispensable para la
proliferación celular.
A partir del estadio 26, la NRG y sus receptores siguen los mismos aumentos
y disminuciones, aunque no a los mismos niveles.
Durante la fase de histodiferenciación (St 30-32) el mayor pico de expresión
de las tres proteínas se encontró en el estadio 30 (Tablas 1, 2, y Gráficas
1,2), cuando el TIV ya se ha cerrado por completo, ha cesado la proliferación
celular y las células han iniciado la diferenciación a miocitos maduros. Esto
indica que los altos niveles de las tres proteínas son necesarios para
46
estimular la histodiferenciación de los miocitos, una vez que ya se ha
formado el TIV.
Con relación a la señalización parácrina de la NRG sintetizada en endocardio
y que efectúa su acción en miocardio se confirma al observar la presencia de
NRG en el primero y de sus receptores en el segundo. Así mismo, los bajos
niveles de intensidad de NRG por IF y de porcentaje por CF en la fase de
morfogénesis temprana comparados con los altos niveles de los receptores
apoyan la idea de que en esta etapa la fuente principal de NRG es el
endocardio. En contraste, al inicio de la fase de histodiferenciación, NRG y
sus receptores observados en los miocitos alcanzan los mayores niveles tano
por IF como por CF. Estos hallazgos sugieren que la NRG es secretada por
los miocitos y puede llevar a cabo una señalización autócrina durante este
periodo.
De esta manera pueden identificarse dos formas de señalización (parácrina y
autócrina) de la misma proteína y a través de los mismos receptores, aunque
sintetizada por dos tipos celulares diferentes (endocardio y miocardio). Así
podría considerarse que la NRG sintetizada en endocardio contribuye a la
adhesión celular, mientras que la NRG sintetizada en miocardio es
importante para la diferenciación de miocitos del TIV.
La información lograda en este trabajo es importante en el conocimiento de
los posibles mecanismos moleculares reguladores del desarrollo normal del
TIV y además permite hacer inferencias sobre los posibles mecanismos que
están alterados en los corazones con enfermedades cardiacas congénitas
que involucran las trabéculas y la región muscular del TIV.
47
CONCLUSIONES
1. La expresión de NRG y sus receptores analizada por microscopia
confocal no mostró diferencia significativa en la distribución espacial (el
extremo cefálico y el caudal) de las trabéculas o en el TIV en desarrollo.
2. Se encontró expresión de ErbB2 en células de endocardio durante el
estadio 18 lo que indica una regulación autócrina de las células del
endocardio a través de su ligando NRG. Este hecho no ha sido reportado
en la literatura.
3. Los resultados de IF y CF muestran la presencia de NRG en los miocitos
ventriculares, lo que indica que en estas células ocurre síntesis de esa
proteína.
4. En la fase de premorfogénesis la NRG producida por el miocardio puede
ser importante para el inicio de la formación de las trabéculas.
5. La NRG regula dos procesos distintos del desarrollo del TIV: en la fase
de morfogénesis temprana la molécula sintetizada en el endocardio
(mecanismo parácrino) contribuye a la adhesión de las trabéculas. En la
fase de histodiferenciación la NRG sintetizada en miocardio (mecanismo
autócrino) es importante para la maduración de los miocitos
ventriculares.
48
SUGERENCIAS PARA TRABAJOS FUTUROS
1. Llevar a cabo técnicas para la identificación definitiva de NRG en
miocardio, tales como hibridación in situ y PCR.
2. Efectuar las técnicas analizadas en este protocolo en los estadios 14 y
34, para complementar la información sobre las etapas premorfogenética
y de histodiferenciación.
3. Con los datos anteriores realizar estudios para evaluar los efectos de
NRG y saber si induce la proliferación o la diferenciación de los miocitos
ventriculares en cultivo de órgano in vitro.
49
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54
ANEXOS
A. SOLUCIONES Y REACTIVOS I. PBS 2x
NaCl 5.9726 g
Na2HPO4 4.2588 g pH 7.2
KH2PO4 1.7414 g
Agua destilada 500 ml
II.- FORMALDEHÍDO AL 3.7% Formaldehído al 37% 10 ml
PBS 1x 90 ml
100 ml
III. PBS TWEEN 20
500 μl de Tween 20 para 1 litro de PBS 1x
IV. SSC 20X NaCl 175 g
Citrato de sodio 88 g
1. Disolver en 900 ml de agua destilada
2. Ajustar el pH a 7.0
3. Aforar a un volumen total de 1 litro
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V. BUFFER DE PERMISIÓN Glucosa 1 g
NaHCO3 0.58 g
Ácido pirúvico 0.27 g
1. Pesar los sólidos y colocarlos en un vaso de precipitado
2. Agregar 80 ml de agua destilada
3. Agitar hasta que se disuelvan
4. Ajustar pH a 7.3
5. Colocar en una probeta y aforar a 100 ml con agua destilada
6. Filtrar
VI. SAPONINA 0.1 g de saponina en 100 ml de PBS 1x
VII. ANTICUERPOS
Anticuerpo Producido en Laboratorio
Anti-NRG (HRG C-20 sc-348) Conejo Santa Cruz
Biotechnology
Anti-ErbB2 (Neu C-18 sc 284) Conejo Santa Cruz
Biotechnology
Anti-ErbB4 (ErbB4 C-18 sc 283) Conejo Santa Cruz
Biotechnology
Anticuerpos secundarios anticonejo
acoplados a isotiocianato de fluoresceínaCabra
Caltag
Laboratories
Miosina específica de corazón de pollo
(MF20) Conejo Hybridoma
Anticuerpo secundario anticonejo (Alexa
Fluor 594) Cabra
Molecular
Probes
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B. TÉCNICAS
I. FIJACIÓN EN FORMALDEHÍDO AL 3.7% 1. En una caja de Petri colocar los embriones en edades tempranas (St
16 y 18) en formaldehído y perfundir los embriones en edades
posteriores con Ringer para limpiarlos y después perfundir con
formaldehído
2. Permitir impregnación en la caja de Petri con formaldehído durante 30
minutos a temperatura ambiente
3. Colocar las muestras en frascos de vidrio con formaldehído
etiquetados y almacenar a 4°C durante 24 horas.
4. Iniciar técnica de inclusión en paraplast.
II. TÉCNICA DE INCLUSIÓN EN PARAPLASTO 1. Deshidratación en alcoholes graduales para muestras fijadas con
formaldehido
1. Agua destilada 10 minutos
2. Alcohol 30% 10 minutos
3. Alcohol 35% 10 minutos
4. Alcohol 40% 10 minutos
5. Alcohol 50% 10 minutos
6. Alcohol 60% 10 minutos
7. Alcohol 70% 10 minutos
8. Alcohol 80% 10 minutos
9. Alcohol 90% 10 minutos
10. Alcohol 96% 10 minutos
11. Alcohol absoluto 20 minutos
12. Alcohol absoluto 20 minutos
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2. Transparentar 1. Aceite de cedro/alcohol absoluto 1:1 1 hora
2. Aceite de cedro puro 24 horas
3. Preinclusión (en horno de inclusión a 58 – 60°C) 1. Aceite de cedro/cloroformo 1:1 30 minutos
2. Cloroformo 30 minutos
3. Paraplast/cloroformo 1:1 60 minutos
4. Paraplast I 1 hora
5. Paraplast II 24 horas
4. Inclusión 1. Colocar las muestras en moldes de plástico con paraplast
2. Con ayuda de un microscopio estereoscópico orientar las muestras
III. PREPARACIÓN DE MUESTRAS PARA MICROSCOPIA CONFOCAL 1. Desparafinación e hidratación de laminillas
I. Colocar las laminillas en una canastilla de vidrio durante 1 hora a 60° C.
II. Pasarlas por cajas que contengan:
1. Xilol 10 minutos
2. Alcohol absoluto 5 minutos
3. Alcohol 96% 5 minutos
4. Alcohol 90% 5 minutos
5. Alcohol 80% 5 minutos
6. Alcohol 70% 5 minutos
7. Alcohol 50% 5 minutos
8. Agua destilada 5 minutos
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3. Inmunofluorescencia
1. Hacer recuperación de antígenos.
2. Lavar con agua destilada.
3. Lavar con PBS Tween 20 (T20).
4. Limpiar las laminillas y delimitar la zona con Dakopen™.
5. Aplicar bloqueador de proteínas e incubar durante 5 minutos. Al
terminar, decantar el bloqueador.
6. Aplicar el anticuerpo primario e incubar durante 20 minutos en una
cámara húmeda. Al terminar, decantar el anticuerpo.
7. Lavar dos veces con PBS T20.
8. Apagar la luz.
9. Aplicar el anticuerpo secundario fluoresceinado e incubar durante 20
minutos en una cámara húmeda. Al terminar, decantar el anticuerpo.
10. Lavar dos veces con PBS T20.
11. Aplicar RNasa durante 20 minutos en una cámara húmeda. Al
terminar, decantar.
12. Lavar dos veces con SSC 20x.
13. Limpiar las laminillas y retirar el Dakopen™.
14. Adicionar medio de montaje con yoduro de propidio y montar con
cubreobjetos.
15. Sellar con barniz.
16. Colocar en una caja opaca a 4° C y proteger de la luz.
17. Leer en microscopio confocal.
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IV. OBTENCIÓN DE MATERIAL PARA CITOMETRÍA DE FLUJO
1. Incubar huevos durante el tiempo necesario para obtener embriones
de la edad deseada
2. Colocarlos en una caja de Petri estéril que contiene buffer de
permisión
3. Perfundir los corazones con buffer de permisión limpio y disecar la
región ventricular
4. Colocar las regiones ventriculares de los corazones obtenidos en un
microtubo con buffer de permisión limpio. Incubar durante 10
minutos en frío (4° C)
5. Retirar el buffer con una pipeta Pasteur estéril y agregar colagenasa
líquida a 2 μg/ml por 30 minutos en agitación a 37° C
6. Retirar la colagenasa y agregar colagenasa con EGTA a 5mM,
incubando por 10 minutos en agitación a 37° C
7. Triturar la suspensión con una varilla de vidrio con punta esmerilada
que se ha limpiado con alcohol al 96% o al 100%
8. Tomar la suspensión con pipeta Pasteur estéril sin tocar el fondo y
filtrarla a otro microtubo a través de una membrana de poros de 50
μm.
9. Centrifugar a 1800 rpm por 4 minutos
10. Decantar el sobrenadante, quedando un botón celular en el fondo
11. Agregar 200 μl de albúmina sérica bovina al 1% (BSA 1%) y agitar
manualmente. Incubar durante 20 minutos en frío
12. Realizar conteo celular con cámara de Neubauer para asegurarse de
que la cantidad de células es igual o mayor a 1 millón
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V. TÉCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA CITOMETRÍA DE FLUJO
1. Agregar 100 μl de saponina, agitar 30 segundos en vortex a
velocidad media e incubar por 4 minutos en frío
2. Centrifugar a 1800 rpm por 4 minutos y retirar el sobrenadante
3. Agregar el anticuerpo primario e incubar por 20 minutos en frío
4. Lavar: agregar 100 μl de saponina, agitar 30 segundos en vortex a
velocidad media e incubar por 4 minutos en frío. Posteriormente
centrifugar a 1800 rpm por 4 minutos y decantar sobrenadante.
Llevar a cabo en tres ocasiones
5. Agregar el anticuerpo secundario fluoresceinado e incubar por 20
minutos en frío
6. Lavar como se indica en el paso 4
7. Fijar con 200 μl de formol al 2% durante 5 minutos en frío
8. Centrifugar a 1800 rpm durante 4 minutos
9. Suspender en 200 μl de PBS 1x – EDTA 5 mM
10. Leer en un citómetro de flujo 50,000 eventos
11. Analizar con el programa Cell Fit