1. Procesos de Bioseparacin Universidad Politcnica del Estado de Morelos M.C. Guillermo Garibay Bentez Rompimiento Celular 2. Conceptos Algunos de los productos biotecnolgicos son extracelulares y no requieren ser extrados de la clula Si el producto es intracelular, una vez realizada la separacin gruesa de las clulas, una operacin necesaria para la liberacin del producto es el rompimiento de la misma 3. Cuerpos de Inclusin Algunas protenas eucariticas recombinantes producidas por microorganismos no son secretadas por la clula recombinante y constituyen productos intracelulares, los cuales pueden estar en forma activa o desnaturalizada. Las protenas intracelulares desnaturalizadas con frecuencia forman cuerpos de inclusin insolubles. 4. Fundamentos Estructura de la pared celular Sistemas celulares de secrecin Mtodos de rompimiento celular Mtodos de permeabilizacin celular 5. Estructura de la pared celular 6. Sistemas Celulares de Secrecin Se llama secrecin al movimiento de un soluto a travs de la membrana celular al exterior de la clula. Tambin se considera como secrecin cuando, como en el caso de algunas protenas, ests quedan atrapadas en el espacio periplsmico o entre la membrana y la pared celular. 7. Mtodos de Rompimiento Celular Mtodo Tcnica Principio Ejemplos Qumico Choque Osmtico Ruptura Osmtica de membrana Ruptura de Globulos Rojos Disolucin Lpidica Desestabilizaci n de la pared celular por solventes orgnicos Rompimiento de Levaduras por tolueno Digestin enzimtica Digestin de la pared celular Tratamiento Alcalino Solubilizacin de membranas por saponificacin 8. Mtodos de Rompimiento Celular Mtodo Tcnica Principio Ejemplos Mecnico s Molido en molinos de perlas Las clulas son prensadas entre perlas de vidrio Tratamiento de suspensione s celulares a gran escala Homogeneizaci n Las clulas se rompen por fuerzas de corte al pasar por un orificio pequeo Tratamiento de suspensione s celulares a gran escala 9. Osmsis 10. Choque Osmtico Las clulas son primero equilibradas en un medio de alta presin osmtica (e.g. 1M sacarosa), luego son rpidamente diluida. El agua entra rpidamente a la clula, incrementando la presin osmtica causando lisis. Tcnica restringida a clulas debilitadas. Choque osmtico suave permite liberar protenas en E. coli sin afectar la viabilidad celular. Puede ser utilizada para liberar protenas 11. Digestin Enzimtica Lisis utilizando Fagos; la adicin del bacteriofago T4 causa lisis, sin embargo no es muy recomendable a escala industrial ya que los fagos residuales pueden llevar a una lisis prematura en lotes subsecuentes. Lisozimas. Alto costo de las enzimas. Inmovilizacin celular. 12. Permeabilizacin Alterar la estructura de la pared y la membrana celular para facilitar la difusin del producto hacia el exterior de la clula. 13. Rompimiento y Permeabilizacin 14. Detergentes 15. Disolucin Lipdica (extraccin por solventes) Los solventes no polares permeabilizan las clulas permitiendo la liberacin de proteinas. Los solventes actan disolviendo componentes hidrofbicos en la pared, como lo son los fosfolipidos en bacterias gram-negativas. Uso limitado debido a que pueden inhibir las actividades biolgicas. 16. Mtodos Mecnicos 17. Equipo de Rompimiento Celular Molinos de Perlas de Alta Velocidad Homogeneizadores de Alta Presin Microfluidizadores 18. Molino de Perlas 19. Velocidad del agitador La velocidad perifrica normalizada de los anillos se utiliza para comparar molinos diferentes. Para impulsores montados excntricamente: con Donde: Dm = Dimetro promedio de los anillos excntricos (mm). Para el caso de impulsores concntricos se utiliza directamente el dimetro del impulsor e = Dimetro de la flecha del agitador (mm) d = Dimetro de los anillos del agitador (mm) n = Velocidad angular del agitador (rpm) 20. Operacin Intermitente Molino Perlas El rompimiento celular intermitente en molinos de perlas agitados a altas velocidades sigue una cintica de primer orden. La ecuacin para la operacin intermitente es: Donde: Rm = concentracin mxima de protena obtenible (M/L3) R = concentracin de protena liberada en el tiempo (M/L3) t = tiempo de operacin (tiempo de residencia de las clulas en el molino k = Constante de velocidad especfica de primer orden, depende de tipo de clula, tipo y velocidad del agitador, 21. Liberacin de protena a partir de S. cerevisae en un molino de perlas utilizando diferentes agitadores 22. Cintica de rompimiento intermitente En el rompimiento intermitente para la obtencin de una enzima de S. cerevisae, se utiliz un molino de perlas de alta velocidad de 4 litros obtenindose los siguientes datos: tiempo (s) R x 102 (Kg/Kg) 0 0 15 1.025 30 2.150 45 2.525 60 3.425 Mx 10 23. tiempo (s) A x 102 (mol/min- Kg) 0 0 15 0.625 30 1.150 45 1.675 60 2.150 Mx 6.700 24. Tarea Tiempo de Residenci a (min) Ln (Rm/Rm-R) 3 0.037 5 0.090 10 0.160 15 0.225 20 0.300 25 0.365 30 0.437 Tiempo de Residenci a (min) Ln (Rm/Rm-R) 3 0.060 5 0.150 10 0.225 15 0.325 20 0.425 25 0.525 30 0.650 La desintegracin celular intermitente con dos tipos de agitacin utilizados en un molino de perlas producen los siguientes datos:Agitador 1 Agitador 2 Estimar la cociente cintica (k) para cada tipo de agitador Calcule el tiempo para el cual se obtiene el 80% de rompimiento con cada tipo de agitador 25. Mtodos directos de medicin de rompimiento celular Rompimiento promedio (L) Donde: C0 = Conteo de clulas intactas al inicio C = Conteo de clulas intactas 26. P1 = 850 bar, P2 = 500 bar, 27. Bibliografa Tejeda-Mansir, A., Montesinos-Cisneros, R.M. y Guzmn, R. 1995. Bioseparaciones. UniSon, Mxico Panda A.K., Bioprocessing of Therapeutics Proteins from the Inclusion Bodies of Escherichia Coli, Adv Biochem Engin/Biotechnol (2003) 85: 4393