diseÑo de un sistema de entrega a partir de peliculas
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DISEÑO DE UN SISTEMA DE ENTREGA A PARTIR DE PELICULAS POLIMERICAS PARA TRANSPORTE DE PEPTIDOS CON ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA
Karen Julieth Ardila Pérez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Programa Microbiología
Bogotá, 2019
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DISEÑO DE UN SISTEMA DE ENTREGA A PARTIR DE PELICULAS BIOPOLIMERICAS PARA TRANSPORTE DE UN PEPTIDO CON ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA
Karen Julieth Ardila Pérez
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ciencias - Microbiología
Director José Manuel Lozano Moreno, PhD
Profesor Titular Departamento de Farmacia
Grupo de investigación Mimetismo molecular de los agentes infecciosos Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Programa Microbiología
Bogotá, 2019
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DEDICATORIA
A Dios que me regala la oportunidad de compartir este presente con mis padres
4
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por su apoyo incondicional, la paciencia, dedicación, por confiar, por
creer en mí y su preocupación por el avance de mi tesis; Al grupo de investigación
Mimetismo Molecular de los Agentes infecciosos liderado por el profesor José
Manuel Lozano Moreno, a él gracias por su acompañamiento en este proceso por
ser parte de mi crecimiento personal y profesional, por confiar en mí.
Agradezco así mismo al Grupo Procesos de Transformación de Materiales para la
Industria Farmacéutica del Departamento de Farmacia por permitir hacer parte de
mis ensayos y al posgrado Interfacultades de Microbiología, a la Universidad
Nacional de Colombia; realmente me siento muy afortunada de ser parte de esta
institución.
Gracias a la vida por este proceso, gracias a todas las personas que me apoyaron
y creyeron en la realización de esta tesis.
5
RESUMEN La piel es el órgano externo que le permite a los seres vivos, especialmente a los
vertebrados superiores mantener la integralidad del organismo frente a agresiones
de diverso origen como son de tipo físico, químico, biológico, mecánico, que
podrían alterar su estructura e impidir su correcto funcionamiento.
Como blanco de las estrategias terapéuticas la piel es el medio natural apropiado
para administrar principios activos evitando efectos adversos locales
especialmente en personas e individuos que necesiten de un tratamiento
adecuado para el control de infecciones causadas por agentes patógenos de
diverso origen o para otros tipos de manejo como las quemaduras y heridas.
En el presente estudio, se desarrolló una formulación como sistema de entrega
tipo película polimérica integrando un péptido antimicrobiano, como potencial
opción terapéutica de aplicación en eventuales infecciones cutáneas, esto
teniendo en cuenta la multirresistencia presentada por los patógenos bacterianos
a los antibióticos de elección terapéutica. Para el diseño de este sistema de
entrega, se usó como base el método de casting estandarizado, variando
condiciones hasta obtener un sistema deseado. A este sistema de presentación se
le determinaron algunas propiedades mecánicas, así como de mucoadhesión. Por
otra parte, se evaluó el perfil de liberación simulada del péptido antimicrobiano en
el sistema mediante experimentos de diálisis, evidenciando la liberación eficaz de
del péptido formulado en éste a partir del sistema de entrega. Finalmente se retó
el sistema integrado con el péptido antimicrobiano frente a cepas bacterianas
ATCC para comprobar su funcionalidad.
Palabras clave: péptido antimicrobiano, películas poliméricas, lesión de piel,
sistemas terapéuticos.
6
ABSTRACT
The skin is the external organ that allows living beings, especially higher
vertebrates, to maintain the integrality of the organism against aggressions of
different origin such as physical, chemical, biological, mechanical, that could alter
its structure and preventing its proper functioning.
As a target of therapeutic strategies, the skin is the appropriate natural means to
administer active principles avoiding local adverse effects especially in people and
individuals that need an adequate treatment for the control of infections caused by
pathogens of different origin or for other types of management. like burns and
wounds.
In the present study, a formulation was developed as a polymer film delivery
system integrating an antimicrobial peptide, as a potential therapeutic option for
application in eventual cutaneous infections, taking into account the multi-
resistance presented by the bacterial pathogens to the antibiotics of therapeutic
choice. For the design of this delivery system, the standardized casting method
was used as a base, varying conditions until obtaining a desired system. This
system of presentation was determined some mechanical properties, as well as
muco-adhesion. On the other hand, the simulated release profile of the
antimicrobial peptide in the system was evaluated by dialysis experiments,
evidencing the effective release of the peptide formulated therein from the delivery
system. Finally, the integrated system with the antimicrobial peptide was
challenged against bacterial strains ATCC to check its functionality.
Keywords: Antimicrobial peptide, polymer films, skin injury, therapeutic systems.
7
Contenido RESUMEN ............................................................................................................................................ 5
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 6
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................ 9
LISTA DE TABLAS.................................................................................................................................. 9
LISTA DE GRAFICAS ............................................................................................................................ 10
LISTA DE ANEXOS .............................................................................................................................. 10
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS .............................................................................................. 11
INTRODUCCION ................................................................................................................................. 13
1. Marco teórico ............................................................................................................................ 15
1.1 Compuesto de tipo peptídico .................................................................................................. 15
1.1.1 Péptidos antimicrobianos ................................................................................................ 15
1.1.2 Mecanismos de actividad antimicrobiana de péptidos ................................................... 16
1.2 Síntesis de péptidos................................................................................................................. 18
1.2.1 Identificacion y caracterizacion de peptidos .................................................................... 19
1.3 POLIMEROS SINTETICOS FORMADORES DE PELICULAS .......................................................... 22
1.3.1 Quitosano ......................................................................................................................... 22
1.3.2 Pullulan ............................................................................................................................. 23
1.2.3 Sistemas adhesivos para el transporte del principio activo ............................................. 24
2. OBJETIVOS ................................................................................................................................. 25
2.1 Objetivo General ..................................................................................................................... 25
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................................................... 25
3. Diseño Metodológico ................................................................................................................ 26
3.1 Selección y síntesis de péptidos .............................................................................................. 26
3.2 Caracterización de péptidos antimicrobianos sintetizados .................................................... 26
3.2.1 Determinación de la pureza del péptido mediante HPLC ................................................ 26
3.2.2 Espectroscopía de masas (MALDI-TOF) ............................................................................ 27
3.2.3 Análisis de patrones de estructura secundaria por dicroísmo circular (DC) .................... 27
3.2.4 Péptidos diseñados y sintetizados a ser evaluados.......................................................... 28
3.3 Obtención de películas polimericas como sistemas de entrega ............................................. 28
3.3.1 Elaboración de las películas ............................................................................................. 28
3.3.2 Incorporación del principio activo a la película ................................................................ 28
8
3.4 Microscopia electrónica de barrido (SEM) .............................................................................. 29
3.5 CARACTERIZACION DE LAS PELICULAS POLIMERICAS ............................................................. 29
3.5.1 Determinación de propiedades mecánicas ...................................................................... 29
3.5.1.1 Resistencia a la ruptura por tensión ............................................................................. 29
3.5.1.2 Evaluación de la capacidad adhesiva. ........................................................................... 30
3.6 Material Microbiológico .......................................................................................................... 30
3.6.1 Cepas de trabajo............................................................................................................... 30
3.6.2 Caracterización y pruebas bioquímicas ............................................................................ 31
3.6.3 Curvas de crecimiento Bacteriano. .................................................................................. 31
3.7 Liberación in vitro del principio activo .................................................................................... 31
3.8 Cuantificación de proteína total .............................................................................................. 32
3.9 Actividad antimicrobiana in vitro ............................................................................................ 32
4. Resultados y Discusión .............................................................................................................. 34
4.1 Estandarización del método de elaboración de las películas. ................................................. 34
4.2 Determinación de las propiedades mecánicas ........................................................................ 36
4.3 Determinación morfológica por microscopía electrónica de barrido (SEM) .......................... 39
4.4 Cuantificación de proteínas totales mediante BCA ................................................................. 40
4.5 Actividad antibacteriana in vitro ............................................................................................. 43
Conclusiones ..................................................................................................................................... 48
Recomendaciones ............................................................................................................................. 49
Anexos ............................................................................................................................................... 50
Bibliografía ........................................................................................................................................ 58
9
LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. ESQUEMA ESTRUCTURAL DEL PÉPTIDO .......................................................................... 15 FIGURA 2. MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS ....................................... 17 FIGURA 3. ESQUEMA GENERAL PARA LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE SÓLIDA. ............. 18 FIGURA 4. GRUPOS USADOS EN LA PROTECCIÓN TEMPORAL DEL GRUPO ALFA–AMINO DE
LOS AMINOÁCIDOS ............................................................................................................................ 19 FIGURA 5. ESQUEMA DE DC EN EL QUE SE MIDE LA DIFERENCIA EN ABSORCIÓN ................. 20 FIGURA 6. ESPECTROS DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS CON ESTRUCTURAS
SECUNDARIAS REPRESENTATIVAS ............................................................................................. 21 FIGURA 7. DIFERENCIA ESTRUCTURAL ENTRE LA QUITINA Y QUITOSAN. ................................ 22 FIGURA 8. ESTRUCTURA QUÍMICA DEL PULLULAN ............................................................................. 24 FIGURA 9. ENSAYO DE RUPTURA POR TENSIÓN EN INSTRUMENTO TA.XT PLUS TEXTURE
ANALYSER ............................................................................................................................................ 29 FIGURA 10. ENSAYO DE ADHESIÓN ......................................................................................................... 30 FIGURA 11. ENSAYO LIBERACIÓN IN VITRO DEL PRINCIPIO ACTIVO ............................................ 32 FIGURA 12. DISEÑO ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA INVITRO .................................... 33 FIGURA 13. PELÍCULAS POLIMÉRICAS OBTENIDAS ............................................................................ 35 FIGURA 14. TENSIÓN PELÍCULA SOLA .............................................................................................................. 36 FIGURA 15. TEST DE TENSIÓN DE LAS PELÍCULAS OBTENIDAS ........................................................................ 37 FIGURA 16. TEST DE ADHESIÓN ........................................................................................................................ 38 FIGURA 17. ENSAYO EX VIVO FUNCIONALIDAD MUCOADHESIVA ................................................................... 39 FIGURA 18. CARACTERIZACIÓN DE FORMULACIONES DE PÉPTIDOS EN PELÍCULAS POR
MICROCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO ................................................................................ 40 FIGURA 19. ENSAYO CUANTIFICACIÓN POR BCA ................................................................................ 41
LISTA DE TABLAS
TABLA 1. PÉPTIDOS EVALUADOS ............................................................................................................. 28 TABLA 2. COMPONENTES DE LA FORMULACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE LA MEMBRANA
POLIMÉRICA ......................................................................................................................................... 34 TABLA 3. PARÁMETROS USADOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS PELÍCULAS ....................... 35 TABLA 4. CARACTERÍSTICAS DE LAS PELÍCULAS OBTENIDAS EN EL ESTUDIO........................ 36 TABLA 5. DETERMINACIÓN DE TENSIÓN Y ADHESIÓN DE LAS PELÍCULAS POLIMÉRICAS .... 38
10
LISTA DE GRAFICAS GRAFICA 1. ENSAYO DE LIBERACIÓN DEL PÉPTIDO (PROTAMINA) DE LA PELÍCULA
POLIMÉRICA ......................................................................................................................................... 41 GRAFICA 2. LIBERACIÓN DE PÉPTIDOS Y ANÁLOGOS DE LAS PELÍCULAS POLIMÉRICA ........ 42 GRAFICA 3. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS ATCC 12228 ................................................................................................................... 43 GRAFICA 4 ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA PSEUDOMONAS
AERUGINOSA ATCC 27853 ....................................................................................................................... 44 GRAFICA 5. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS
EPIDERMIDIS ATCC 35983 ........................................................................................................................ 45 GRAFICA 6. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS
AUREUS ATCC 6538 ................................................................................................................................. 46 GRAFICA 7. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA SALMONELLA
TYPHIMURIUM ATCC 7953 ...................................................................................................................... 47
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A. CURVAS DE CRECIMIENTO BACTERIANO ......................................................................................... 50 ANEXO B. CUANTIFICACIÓN POR BCA ENSAYO PILOTO DE LIBERACIÓN .......................................................... 52 ANEXO C. CUANTIFICACIÓN POR BCA ENSAYO DE LIBERACIÓN PÉPTIDO-PELÍCULA ..................................... 53 ANEXO D. ESTADÍSTICA ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA (D.O) VS TIEMPO (T) FRENTE A LA
CEPA STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 12228 ............................................................................... 55 ANEXO E. ESTADÍSTICA ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA (D.O) VS TIEMPO (H) FRENTE A LA
CEPA PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 27853 ................................................................................... 56 ANEXO F. ESTADÍSTICA ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA (D.O) VS TIEMPO (H) FRENTE A LA
CEPA STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 35983 ............................................................................... 56 ANEXO G. ESTADÍSTICA ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA (D.O) VS TIEMPO (H) FRENTE A
LA CEPA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 .................................................................................... 56 ANEXO H. ESTADÍSTICA ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA (D.O) VS TIEMPO (H) FRENTE A
LA CEPA SALMONELLA TYPHIMURIUM ATCC 7953 ................................................................................. 57
11
LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
Abreviatura Termino
Trp Triptófano
Arg Arginina
kDa kilo Dalton
DCC N,N 'diciclohexilcarbodiimida
Boc tert-butiloxicarbonilo
Fmoc 9-flurenilmetiloxicarbonilo
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia
MALDI-TOF Espectroscopía de masas desorción/ionización láser asistida por matriz
CD Dicroísmo Circular
SEM Microscopía electrónica de Barrido
O.D Densidad óptica
rmp Revoluciones por minuto
µL Microlitros
LB Luria bertoni
ATCC American Type Culture Collection
BCA Ácido bicinconínico
BSA Seroalbúmina bovina
Pro (P) Prolina
Arg (R) Arginina
12
Ser (S) Serina
Val (V) Valina
Gly (G) Glicina
Ile (I) Isoleucina
Asn (N) Asparagina
Leu (L) Leucina
Lys (K) Lisina
Ala (A) Alanina
13
INTRODUCCION
La resistencia de los agentes microbianos patógenos a los antibióticos hace que la
humanidad se aproxime a una crisis de salud pública de orden global, en especial
por el resurgimiento de entidades patogénicas consideradas extintas y por la
aparición de nuevas pandemias, especialmente de tipo viral en las regiones
tropicales y subtropicales del mundo.
Una alternativa que ofrece soluciones parciales a los mecanismos microbianos de
resistencia a los antibióticos convencionales está constituido por una generación
de compuestos de naturaleza proteica, denominados como “péptidos
antimicrobianos”. Estas moléculas han demostrado poseer mecanismos
implicados en la destrucción de múltiples patógenos microbianos de amplio
espectro. Sin embargo, la administración de estos compuestos en un individuo que
lo requiriese está sometida a la degradación por parte de proteinasas del agente
patógeno, así como del hospedero, por lo que su administración debe asegurar el
logro del blanco terapéutico deseado mediante el empleo de sistemas de entrega
poliméricos biodegradables para asegurar la preservación de su integridad y
potencia antibacteriana.
El uso de polímeros sintéticos ha tenido un gran auge en la industria farmacéutica
debido a sus características de compatibilidad, adhesión, de ser fácilmente
degradables, y la versatilidad para emplearse en diferentes condiciones, siendo
bastante útiles para la entrega de una amplia variedad de agentes terapéuticos
entre estos péptidos, proteínas, vacunas entre otros. En la actualidad uno de los
polímeros naturales o biopolímeros más importantes y usado como biomaterial es
el quitosan, polisacárido catiónico lineal; sus propiedades bioadhesivas “lo hacen
apto para ser utilizado sobre heridas abiertas, lo que sumado a sus actividades
hemostática y cicatrizante, así como a su biodegradabilidad, lleva a la
regeneración de la zona lesionada” (Fuentes y Pastor, 2009).
14
Teniendo en cuenta lo anteriormente mencionado, el presente estudio busca
desarrollar sistemas poliméricos de entrega bioadhesivos para péptidos
antibacterianos modelo, que sean capaces de formar sistemas de tipo película
polimérica a partir del aprovechamiento de las propiedades de algunos
compuestos como el quitosano, un biopolímero de gran interés y su potencial
aplicación para el tratamiento de heridas de la piel, formando parte de sistemas
diseñados para el transporte y entrega de péptidos antimicrobianos y sus
análogos, como principios activos.
15
1. Marco teórico
1.1 Compuesto de tipo peptídico
Compuesto químico formado por la unión de aminoácidos por medio de enlaces
amida que reciben el nombre de enlaces peptídicos, que son el resultado de la
reacción del grupo carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro (figura
1), con eliminación de una molécula de agua. Compuestos por un grupo NH2 que
no ha reaccionado (el extremo amino) y un grupo COOH que tampoco ha
reaccionado (el extremo carboxilo).
FIGURA 1. ESQUEMA ESTRUCTURAL DEL PÉPTIDO
Fuente: Lesmes et al., Evaluación de la respuesta funcional de anticuerpos inducidos por pseudopéptidos y su impacto en el desarrollo de potenciales nuevos medicamentos para
la Malaria, trabajo de investigación, Universidad Nacional de Colombia, 2011.
1.1.1 Péptidos antimicrobianos
Son moléculas efectoras claves de la inmunidad innata, “han surgido en los
últimos 25 años como una familia de sustancias con gran potencial para uso
clínico, debido a sus múltiples mecanismos de acción, amplio espectro de
actividad y bajo potencial de resistencia” (Lozano JM, et al, 2014). Los péptidos
antimicrobianos son catiónicos, su longitud es variable, de 12 a 50 aminoácidos
como triptófano (Trp) y la arginina (Arg), los cuales han demostrado tener actividad
antimicrobiana, su tamaño molecular es más pequeño que 10.000 kDa. Poseen
16
propiedades anfipáticas, permitiéndoles interactuar simultáneamente con lípidos y
moléculas con carga negativa. Se han descrito y caracterizado más de 1500
péptidos antimicrobianos, su espectro de actividad es amplio, incluyendo
antibacteriano, antiviral, antifúngico y antitumoral. (Lesmes et al, 2009).
Estos péptidos antimicrobianos se han encontrado en casi todos los seres vivos,
desde los procariotas, con las bacteriocinas, hasta los eucariotas, como
mamíferos, anfibios, insectos y plantas, con una familia diversa de péptidos.
Existen en el “momento varios productos en estudio clínico de fase II y III, que se
utilizan de forma tópica o intravenosa para el tratamiento de infecciones
localizadas y sistémicas” (Tellez, 2010).
Entre los factores importantes, tales como el aumento de la resistencia microbiana
a antibióticos y el número limitado de estrategias terapéuticas disponibles para
hacer frente a los patógenos, se puede evidenciar la necesidad de desarrollar
nuevos compuestos que pueden ser utilizados como herramientas moleculares
para controlar la propagación de enfermedades infecciosas (Lesmes et al, 2009).
1.1.2 Mecanismos de actividad antimicrobiana de péptidos
Las características que presentan estos péptidos ayudan a la interacción e
inserción en las paredes celulares aniónicas y membranas de fosfolípidos los
patógenos causando un daño en las membranas biológicas, la inhibición de la
síntesis de ADN, ARN y proteínas y la activación de enzimas microbianas.
Inicialmente hay una interacción con la membrana de los microorganismos, lo
hace mediante interacciones electroestáticas, posterior a esto “los péptidos
antimicrobianos generan áreas de inestabilidad en la membrana, permitiendo la
translocación de estos mismos a través de la bicapa externa; una vez localizados
en la membrana, pueden sufrir modificaciones en su conformación y producir
daños en la membrana o internamente” (Tellez, 2010). Para esto el péptido usa
diferentes mecanismos (figura 2), nombrados a continuación:
17
Mecanismo de barril: Después de interacción con la membrana, “los péptidos se
reorientan de forma perpendicular formando una empalizada con sus cadenas
laterales hidrofóbicas que encaran el centro hidrofóbico de la membrana y sus
cadenas polares, y enfrentan el centro creando un poro hidrofílico, lo que genera
una pérdida del equilibrio osmótico y del potencial de membrana” (Tellez, 2010).
Mecanismo forma anular: “Los péptidos se unen a la membrana al alcanzar una
concentración límite que hace que los lípidos se doblen formando un canal
delimitado por la cabeza de los grupos lipídicos asociados a los péptidos,
formando un canal mixto del péptido con los lípidos de la membrana” (Tellez,
2010).
Mecanismo de alfombra: En este, a diferencia de los otros, el péptido permanece
asociado con la cara externa formando una especie de alfombra que debilita la
membrana y causa su colapso, ocasionando la muerte celular por pérdida del
citoplasma (Tellez, 2010).
FIGURA 2. MECANISMO DE ACCIÓN DE PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
Fuente. Biljana Mojsoska and Håvard Jenssen. Peptides and Peptidomimetics for Antimicrobial
Drug Design. 2015 Sep; 8(3): 366–415.
18
1.2 Síntesis de péptidos
El método a elección para la obtención de péptidos es el de síntesis química en
fase solida descrito en 1963 por Merrifield, que se fundamenta en acoplar
covalentemente la cadena del péptido mediante el aminoácido correspondiente al
extremo C de la secuencia a un soporte polimérico insoluble (resina),
posteriormente el péptido anclado es prolongado por una serie de ciclos de
adición (figura 3), acoplando con N, N 'diciclohexilcarbodiimida (DCC) el
aminoácido protegido y realizando la desprotección del grupo α–amino con una
solución de ácido trifluoroacético en diclorometano. Le sigue una neutralización
para que el siguiente residuo pueda ser acoplado por medio de DCC. Cuando se
obtiene la secuencia peptídica deseada, los grupos protectores de las cadenas
laterales se eliminan y el péptido se separa del soporte sólido mediante
saponificación o el uso de HBr. (Stawikowski et al, 2013)
FIGURA 3. ESQUEMA GENERAL PARA LA SÍNTESIS DE PÉPTIDOS EN FASE SÓLIDA.
19
Se han estudiado varios grupos protectores dentro del que se destaca el tert-
butiloxicarbonilo (Boc) y el grupo 9-flurenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) los cuales son
lábiles en medio ácido y básico correspondientemente. (Figura. 4)
FIGURA 4. GRUPOS USADOS EN LA PROTECCIÓN TEMPORAL DEL GRUPO ALFA–AMINO DE LOS AMINOÁCIDOS
1.2.1 Identificacion y caracterizacion de peptidos
Para verificar la pureza de las moléculas el método más usado actualmente es la
Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC) de fase inversa (RP-HPLC), su
identidad es verificada por MALDI-TOF (Espectroscopía de masas
desorción/ionización láser asistida por matriz) y la determinación de la estructura
secundaria se realiza por medio de Dicroísmo Circular (CD).
La cromatografía líquida de alta eficacia es una herramienta muy eficiente para la
separación de mezclas complejas tanto de compuestos de bajo peso molecular
como de proteínas y ácidos nucleicos. Consiste en una fase estacionaria no polar
(columna) y una fase móvil. La muestra en solución es inyectada en la fase móvil.
Los componentes de la solución emigran de acuerdo a las interacciones no-
covalentes de los compuestos con la columna. Estas interacciones químicas
determinan la separación de los contenidos en la muestra. (Aguilar et al, 1996).
La espectrometría de masas MALDI-TOF es una técnica analítica muy sensible
con alta capacidad de análisis y precisión en la determinación de masas
20
moleculares proteicas, generando información en la estructura y masa del péptido
(Dave, et al, 2011)
Luego de haber confirmado la pureza del compuesto se realiza el analisis
por Dicroísmo Circular (DC), técnica permite estimar el contenido de estructuras
secundarias (α-hélice, lamina β paralela, al azar, entre otras), midiendo la
capacidad de las moléculas de absorber diferencialmente la luz polarizada
circularmente a izquierda y a derecha.
El dicroísmo circular se expresa frecuentemente como la propiedad que
poseen algunos materiales de absorber la luz a diferentes grados
dependiendo de la forma de polarización del haz incidente. Se dice que un
material presenta dicroísmo circular cuando la absorción de la luz
circularmente polarizada en una dirección (derecha) es diferente de la
absorción de la luz circularmente polarizada en la dirección opuesta
(izquierda) (Figura 5). Cuando la luz se polariza circularmente, surge un
componente secundario de absorbancia, el cual se mide como el cambio
entre la luz polarizada circularmente a la derecha e izquierda y la diferencia
resultante se expresa como absorbancia (Martínez, 2013).
FIGURA 5. ESQUEMA DE DC EN EL QUE SE MIDE LA DIFERENCIA EN ABSORCIÓN
La rotación del plano y la diferente absorción de los componentes circularmente
polarizados (dicroísmo circular) varían de acuerdo con la longitud de onda,
21
pudiéndose obtener espectros, es decir gráficas de la rotación o elipticidad contra
la longitud de onda. Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente
en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de
la radiación electromagnética. El resultado es que los diferentes elementos
estructurales tienen espectros CD característicos (Figura 6). Por ejemplo, las
proteínas alfa-helicoidal tienen bandas negativas en 222 nm y 208 nm y una
banda positiva a 193 nm. Las proteínas con láminas beta antiparalelas plegadas
(ß-hélices) tienen bandas negativas en 218 nm y bandas positivas a 195 nm,
mientras que las proteínas desordenadas tienen muy baja elipticidad por encima
de 210 nm y bandas negativas cerca de 195 nm (Greenfield, 2006).
FIGURA 6. ESPECTROS DE POLIPÉPTIDOS Y PROTEÍNAS CON ESTRUCTURAS SECUNDARIAS REPRESENTATIVAS
22
1.3 POLIMEROS SINTETICOS FORMADORES DE PELICULAS
Los polímeros son moléculas de gran tamaño formadas por la unión de varios
monómeros mediante enlaces covalentes. Según su origen se pueden clasificar en
polímeros naturales o sintéticos. Dentro de los polímeros naturales o biopolímeros,
el más abundante es la celulosa sintetizada en las plantas, seguido de la quitina
que “se encuentra en los caparazones de crustáceos y exoesqueletos de
artrópodos como una estructura que da soporte y protección” (Kurita, 2006).
En cuanto al uso de polímeros como transportadores de sustancias, se debe tener
en cuenta su “compatibilidad con ambientes fisiológicos, estabilidad de los mismos
durante el tiempo de liberación del fármaco, facilidad para su manufactura y el
costo frente a otros sistemas terapéuticos farmacéuticos” (Moreno, 2011).
1.3.1 Quitosano
La quitina es el polímero natural más abundante luego de la celulosa,
encontrándose en los exoesqueletos de crustáceos como cangrejos y camarones
y en menor cantidad en la pared celular de hongos, bacterias, levaduras y en las
cutículas de insectos (Rinaudo, 2006) (Figura 7).
FIGURA 7. DIFERENCIA ESTRUCTURAL ENTRE LA QUITINA Y QUITOSAN.
23
El quitosan es un polímero catiónico que se obtiene de la quitina por
desacetilación alcalina y se caracteriza por la presencia de un gran número de
grupos amino en su cadena, un método común para la síntesis de quitosan es la
desacetilación de la quitina. El quitosan es insoluble en agua, pero soluble en
soluciones ácidas como el ácido glutámico, ácido clorhídrico, ácido acético y ácido
láctico. (Ahmed y Aljaeid, 2016). La disolución ocurre por la protonación del grupo
amino (-NH2) en el C-2 de la unidad de D-glucosamina repetida, por esto, el
polisacárido es convertido en un polielectrolito catiónico en medio acídico.
(Rinaudo,2006). Este material ha sido considerado como uno de los biopolímeros
más prometedores para el desarrollo de películas poliméricas debido a sus
excelentes propiedades, tales como la abundancia, no toxicidad, biodegradabilidad
y biocompatibilidad (Long Xu, et al. 2015).
1.3.2 Pullulan
El Pullulan es uno de los polímeros más ampliamente estudiados; es un
polisacárido lineal neutro soluble en agua, producido por el hongo Aureobasidium
pullulans a partir de almidón. El contenido de átomos de carbono e hidrógeno en
este exopolisacárido tiene una fórmula química C6H10O5, como se puede
observar en la (Figura. 8) está unida por enlaces α-(1→6) glicosídicos vinculados a
residuos de maltotriosa. (Cheng.2011). Es un polímero biodegradable, no
higroscópico, fácilmente soluble, las soluciones obtenidas son translucidas y
viscosas, tiene una alta adherencia y forman películas impermeables al oxígeno,
las cuales son térmicamente estables y elásticas. (Rekha et al., 2007). El
biopolímero es un candidato potencial para su aplicación en diversos sectores
industriales como alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos, biomédicos
entre otros. (Choudhury et al, 2013)
24
FIGURA 8. ESTRUCTURA QUÍMICA DEL PULLULAN
1.2.3 Sistemas adhesivos para el transporte del principio activo
Los apósitos para heridas juegan un papel importante en la gestión de la
cicatrización; en particular, los apósitos elaborados con polímeros se utilizan
ampliamente para heridas exudativas, ya que, por lo general estos apósitos son
biodegradables, biocompatibles y no tóxicos para la piel (Valencia, 2016).
El quitosan es un polisacárido policatiónico natural que se usa en diversos
sistemas de administración de fármacos debido a sus propiedades favorables,
como la biocompatibilidad, la no toxicidad, la biodegradabilidad y la capacidad de
formación de gel. El quitosano puede aumentar la permeabilidad para celular de
las membranas mucosas abriendo las uniones estrechas y, por lo tanto,
mejorando la penetración de los compuestos farmacológicos (Can, 2013).
Las películas elaboradas con pullulan han sido evaluadas utilizando como principio
activo extractos de origen natural como la caléndula, demostrando actividad
antiséptica, antiinflamatorias, bactericida y anti fúngicas, el propósito de usar como
principio activo péptidos antimicrobianos es magnificar esta actividad logrando una
eficaz curación de infecciones, la película permitirá la permanencia del contacto
del péptido con la herida y la perfecta dosificación del mismo.
25
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General Diseño y obtención de películas poliméricas en las cuales se incorpore un ingrediente activo de origen peptídico antimicrobiano, caracterización y su evaluación en ensayos de actividad funcional antibacteriana.
2.2 Objetivos Específicos
Determinar las características de compatibilidad entre agentes poliméricos seleccionados y péptidos antibacterianos modelo, en un sistema de película polimérica.
Evaluar la capacidad de difusión de péptidos antibacterianos modelo desde una película polimérica a un sistema de estudio in vitro
26
3. Diseño Metodológico
3.1 Selección y síntesis de péptidos
La síntesis se realiza con aminoácidos protegidos por t-Boc en el amino alfa
terminal mediante el proceso de síntesis de péptidos en fase sólida, la resina a
emplear se debe activar en solución N,N-diisopropiletilamina al 5% en
diclorometano con lavados en agitación constante.
Para acoplar el primer aminoácido a la resina, se usa dimetilformamida o
diclorometano como solventes; luego se remueve el grupo protector t-Boc con el
activador N,N´-diciclohexilcarbodiimida en una concentración del 50% en ácido
trifluoroacético con agitación constante y realizando lavados para retirar el exceso
de ácido, posterior a esto se adiciona el siguiente aminoácido, de la forma
anteriormente indicada hasta tener el largo de cadena deseada.
3.2 Caracterización de péptidos antimicrobianos sintetizados
3.2.1 Determinación de la pureza del péptido mediante HPLC
Se pesa una cantidad apropiada de cada uno de los péptidos y se solubilizan en
agua a una concentración de 1mg/ml, de esta solución se toman 15 µL y se llevan
a un volumen total de 100µl con agua, colocando la muestra en una columna
waters C18 um Corp. XBridge, luego se procede a pasarla por el equipo de
cromatografía de alta eficiencia a una longitud de onda de 215 nm y se analiza de
0% a 70% de solvente A (agua + 0,05% TFA) a solvente B (acetonitrilo+0.05% de
TFA) en 10 minutos con un flujo de 1 ml por minuto (Niño, 2016).
27
3.2.2 Espectroscopía de masas (MALDI-TOF) Para la obtención de los espectros se usa un espectrofotómetro de masas en
modo reflectron, a una longitud de onda de 337 nm con impulsos de 3 ns. Los
espectros se obtienen por una serie de 10 pulsos de láser para asegurar
condiciones comparables. La matriz utilizada es a-ciano-4- hidroxicinámico (CCA)
(Sigma Chemical Co., Saint Louis, MO), esta matriz se prepara como una solución
saturada en 1 ml de TA (Acetonitrilo al 40% en ácido trifluoroacético al 0,1%). Las
muestras se disuelven en TA para dar una concentración de 100 pmol /pL. Para el
análisis MALDI-TOF se diluye la muestra en una solución saturada de 10 pmol /
mL concentración, luego se realizan alícuotas de 0,5 mL de la mezcla matriz de
muestra que se vierten sobre la placa diana, se dejan secar al aire y se analizan
(Lesmes et al., 2009).
3.2.3 Análisis de patrones de estructura secundaria por dicroísmo circular (DC)
Los análisis por dicroísmo circular se realizan a temperatura ambiente en una
celda sometida a flujo de nitrógeno en un espectropolarímetro Jasco J-810. Se
registran espectros en un intervalo de longitudes de onda entre 190-250 nm en
una celda rectangular de una trayectoria óptica de 1 nm. Para obtener la
estructura se realiza una disolución del liofilizado de cada compuesto purificado en
buffer fosfato de sodio (PBS), 50 mM pH 7,0, o en solución acuosa 0-30% de
2,2,2-trifluoroetanol (TFE) para un volumen final de 500 µL. Se emplea una
concentración media en cada caso de 0,2 mM para cada molécula en la mezcla 0-
30% agua-TFE. Los resultados se expresan como la media de la elipticidad molar
(θ); sus unidades son grados × cm2 × dmol–1, de acuerdo con la relación (θ) = θλ
/(100lcn), donde θλ es la elipticidad medida, l la trayectoria óptica, c la
concentración del compuesto y n es el número de residuos de aminoácidos en la
secuencia (Lesmes et al., 2011).
28
3.2.4 Péptidos diseñados y sintetizados a ser evaluados
Péptido Secuencia Protamina PRRRRSSSRPVRRRRRVSRRRRRRGGRRRR Análogo Ψ 2075 PRRRRSRP Análogo Ψ 2076 VRRRRRPR 38611- Mastoparán 8 INLKALAALAKRLL Análogo Ψ 38620 INLKALAAL[CH2NH]AKRLL Análogo Ψ 38621 INLKALAALd[CH2NH]AKRLL
TABLA 1. PÉPTIDOS EVALUADOS
3.3 Obtención de películas polimericas como sistemas de entrega
3.3.1 Elaboración de las películas
Las biopelículas se elaboraron mediante el método casting (evaporación de
solvente), para el cual se realizaron diferentes mezclas de polímeros
seleccionados y plastificantes hasta obtener la película adecuada con
características requeridas. La dispersión obtenida se vertió en un molde circular y
se llevaron al horno a una temperatura deseada hasta observar la solidificación de
la misma, luego fuero almacenadas en condiciones controladas de humedad
relativa para posteriores determinaciones.
3.3.2 Incorporación del principio activo a la película La adicción del péptido antimicrobiano se realizó en la etapa de mezcla de los
polímeros (Dispersión) colocando la cantidad a evaluar, verificando su perfecta
incorporación en la misma.
29
3.4 Microscopia electrónica de barrido (SEM)
Por medio de una metodología de microscopía electrónica de barrido, se pudo observar
y evaluar microestruturalmente la formulación obtenida visualizando diferentes campos,
permitiendo detallar su morfología, propiedades y la compactación de cada uno de los
materiales. Realizado en el Laboratorio de Microscopía Electrónica de Barrido de la
Universidad Nacional de Colombia en el edificio de Geociencias - Manuel Ancízar.
3.5 CARACTERIZACION DE LAS PELICULAS POLIMERICAS
3.5.1 Determinación de propiedades mecánicas
3.5.1.1 Resistencia a la ruptura por tensión
Para la realización de este ensayo se utilizó el equipo TA.XT plus Texture
Analyser (analizador de textura) (Figura. 9) que se programo en el modo de
tensión y se tomaron las películas en determinadas dimensiones, se sujetan en las
mordazas del equipo por cada extremo, la película es halada por la mordaza
superior a una velocidad de 0,5 mm/s y a una distancia de 20 mm (Vallejo, 2010),
midiendo la fuerza de tensión y la elongación de la película.
FIGURA 9. ENSAYO DE RUPTURA POR TENSIÓN EN INSTRUMENTO TA.XT PLUS TEXTURE ANALYSER
30
3.5.1.2 Evaluación de la capacidad adhesiva. Este ensayo se realizó mediante el analizador de textura ajustándolo en el modo
de adhesión.
Se tomó un recuadro de la película polimérica y se sujeta de sus cuatro extremos
en un soporte metálico, la sonda del equipo se acerca a la muestra a una
velocidad de 0,5 mm/s aplicando una fuerza de 5 N (Vallejo y Pulido, 2012), la cual
se mantiene durante 1 min como tiempo de contacto entre la sonda y la muestra,
se emplea extracto de mucosa intestinal fetal bovina para simular las condiciones
de adhesión. (Figura. 10)
FIGURA 10. ENSAYO DE ADHESIÓN
3.6 Material Microbiológico
3.6.1 Cepas de trabajo
En la selección de las cepas de trabajo se realizó una revisión bibliográfica y
teniendo en cuenta el cepario del grupo de investigación mimetismo molecular de
los agentes infecciosos, se decidió trabajar con las siguientes cepas ATCC:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228/35983) Salmonella typhimurium (ATCC 7953)
31
Mantenidas en congelación a -80°C, se realiza la activación de las mismas en
caldo LB incubando a 37°C por 24 horas.
3.6.2 Caracterización y pruebas bioquímicas Comprobando la pureza de las cepas a trabajar se aislaron y realizaron pruebas
bioquímicas incluida tinción de Gram, oxidasa, indol y siembra en agares
selectivos.
3.6.3 Curvas de crecimiento Bacteriano. Para evaluar el comportamiento de cada una de las cepas bacterianas se
realizaron curvas de crecimiento, a partir de escala de McFarlan 0,5 activando las
bacterias en caldo Luria bertoni (LB) posteriormente se toman 500µL del
microorganismo y se colocan en un elermeyer con 20ml de LB, dejando en
agitación constante 200 rpm, a 37°C durante 24 horas, se realiza medición
espectrofotométrica a 620 nm.
3.7 Liberación in vitro del principio activo
Por medio del método de diálisis, se evaluó la correcta separación de las
moléculas permitiendo la liberación del péptido antimicrobiano de la película
polimérica.
Cada una de las películas a evaluar (1mm-1mm) fueron puestas en una
membrana de diálisis MwCo: 6-8000 con 1mL de PBS 20 mM, la cual se colocó en
un vaso de precipitado con 5 ml de PBS 1x (100mM) con agitación constante, el
ensayo se llevó a cabo durante veinte (20) días, tomando muestra diariamente del
dializado, remplazando la cantidad tomada con nuevo PBS.
32
FIGURA 11. ENSAYO LIBERACIÓN IN VITRO DEL PRINCIPIO ACTIVO
3.8 Cuantificación de proteína total
La cuantificación de proteínas totales se realizó por el método de ácido
bicinconínico (BCA), usando el Kit Protein Assay de Thermo Scientific™, que
permitió calcular el péptido obtenido mediante el ensayo de liberación; la
cuantificación se llevó a cabo en placas de polietileno de 96 pozos, se evalúo por
duplicado cada una de las muestras, inicialmente se realizaron curvas de
calibración con estándar de seroalbúmina bovina (BSA) desde una concentración
de 2mg/ml, en los pozo siguientes debajo de la curva se sirven cada una de la
muestra a evaluar, usando como blanco PBS 20X. Se realizaron lecturas a 570nm
pasados 30 y 60 minutos a 37°C una vez puesto el reactivo de BCA.
3.9 Actividad antimicrobiana in vitro
Con el fin de evaluar la efectividad del método obtenido se realizó un ensayo
invitro de actividad antimicrobiana usando las películas poliméricas vs cepas
ATCC, en placas de polietileno de 96 pozos, inicialmente se activaron las
bacterias, como controles se usaron antibióticos ampicilina, tetraciclina,
kanamicina, se agregan 50µL a [1:100], los péptidos 100µL [1mg/ µL], bacterias 50
33
µL, películas 150 µL, se agregó medio LB llegando a un volumen final por pozo de
250 µL se realizaron mediciones de densidad óptica (DO) a 620 nm en el equipo
Multiskan EC.
Diseño del ensayo
FIGURA 12. DISEÑO ENSAYO DE ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA INVITRO
Análisis estadístico Por medio de Microsoft excel se aplicó análisis de varianza (ANOVA)
34
4. Resultados y Discusión
4.1 Estandarización del método de elaboración de las películas.
Las condiciones del estudio se siguieron de acuerdo a las propuestas en el trabajo
de Vallejo (2010), obteniendo películas uniformes sin formación de burbujas y con
un tiempo óptimo de desarrollo de la prueba. Inicialmente se realizaron varias
formulaciones con diferentes polímeros y solventes incluyendo el quitosan,
pullulan, glicerina, sorbitol, agua, ácido acético, ácido láctico, las cuales fueron
vertidas en moldes con diferentes materiales. Luego de realizar varias pruebas se
logró la formulación con las propiedades adecuadas, obtenido una mezcla
homogénea de los componentes.
Formulación final:
Composición Formulación I
Pullulan 1,0% p/v
Quitosan 1,5% p/v
Sorbitol 2,0% v/v
Ácido láctico 25 mL
Volumen final 30 mL
TABLA 2. COMPONENTES DE LA FORMULACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE LA MEMBRANA POLIMÉRICA
Adicional a esto se diseñó una nueva película con actividad adhesiva (Formulación II), la cual se usó para colocar sobre la película con el principio activo dándole mayor soporte y adhesión a las mismas.
Composición Formulación II
Pullulan 1.25% p/v
Gelatina 1% p/v
Propilenglicol 1.5% v/v
Volumen final 30 mL
35
En la (Tabla. 3) se describen los parámetros utilizados en la preparación de las películas de estudio, usando polímeros quitosan, pullulan, sorbitol como plastificante y ácido láctico como solvente en la formulación I.
TABLA 3. PARÁMETROS USADOS PARA LA PREPARACIÓN DE LAS PELÍCULAS
Posterior a esto se realizó la incorporación de principio activo (péptido
antimicrobiano) a la formulación número 1, siguiendo todos los pasos
anteriormente nombrados. En la dispersión obtenida se pudo evidenciar que hubo
un perfecto acople del péptido a los demás componentes de la membrana
polimérica; una vez se lleva al secado se hizo el desmolde de la misma
obteniendo películas uniformes, (Figura. 13) finalmente obtenemos nueve
películas, ocho con la formulación número uno que contienen el principio activo y
una de adhesión, a cada una se le determinaron propiedades físicas y mecánicas,
se midió su espesor (mm) con un pie de rey (Tabla.4) presentando uniformidad.
FIGURA 13. PELÍCULAS POLIMÉRICAS OBTENIDAS
36
TABLA 4. CARACTERÍSTICAS DE LAS PELÍCULAS OBTENIDAS EN EL ESTUDIO
4.2 Determinación de las propiedades mecánicas
En cuanto a las propiedades mecánicas al realizar el ensayo de tensión (Figura14-
15), las películas se elongaron sin rompimiento de tal manera que cuando fueron
liberadas de las mordazas retornaron a su longitud inicial, por lo anterior el
comportamiento de las películas es de tipo elástico, el cual permanece durante el
esfuerzo, demostrando las propiedades de los polímeros de tensión en función de
la deformación.
FIGURA 14. TENSIÓN PELÍCULA SOLA
37
Película Adhesión
FIGURA 15. TEST DE TENSIÓN DE LAS PELÍCULAS OBTENIDAS
38
FIGURA 16. TEST DE ADHESIÓN
Película Tensión (N) Adhesión (N.seg)
P.Sola 0,4307 ± 0,01 0,052 ± 0,01
P.Protamina 0,4492 ± 0,01 0,057 ± 0,01
P. 2075 0,4928 ± 0,01 0,076 ± 0,01
P.2077 0,5201 ± 0,01 0,084 ± 0,01
P.38611 0,5321 ± 0,01 0,074 ± 0,01
P.38620 0,6062 ± 0,01 0,060 ± 0,01
P.38621 0,6215 ± 0,01 0,043 ± 0,01
P.Adhesión 12,2501 ± 0,01 0,305 ± 0,01
TABLA 5. DETERMINACIÓN DE TENSIÓN Y ADHESIÓN DE LAS PELÍCULAS POLIMÉRICAS
39
En cuanto al comportamiento adhesivo, como se muestra en la (Tabla 5),
soportado con la (Figura. 16) las películas se comportaron de una forma similar
presentando todas un comportamiento de adhesión, indicando que su
permanencia y unión a la superficie lesionada será más firme. Esto siendo
complementado con la acción de la película realizada especialmente para
adhesión, la cual va a ir sobre la película con el principio activo dando soporte a
las mismas, manteniendo la liberación de fármaco por más tiempo.
Adicionalmente a esto se realizó un ensayo in vivo donde se evaluó la
funcionalidad de la membrana de Adhesión sobre la mucosa oral y la epidermis
(Figura. 17). Se evidencia que las películas toman la forma de la mucosa sobre las
que fueron puestas, gracias a su biocompatibilidad y estabilidad las películas se
mantuvieron adheridas hasta su desintegración total, mostrando las propiedades
del Pullulan.
Mucosa Piel Piel
FIGURA 17. ENSAYO EX VIVO FUNCIONALIDAD MUCOADHESIVA
4.3 Determinación morfológica por microscopía electrónica de barrido (SEM)
Se evaluó cada una de las películas obtenidas y gracias a la microscopía
electrónica se pudo observar que hubo un perfecto acople en los componentes de
las películas poliméricas, que presentan una morfología uniforme, (Figura. 18),
además su estructura no se ve porosa sugiriendo que hay una perfecta
compatibilidad. Característica plana y homogénea
40
FIGURA 18. CARACTERIZACIÓN DE FORMULACIONES DE PÉPTIDOS EN PELÍCULAS POR MICROCOPIA ELECTRÓNICA DE BARRIDO
4.4 Cuantificación de proteínas totales mediante BCA
Pasados 9 días del ensayo piloto de liberación se realizó un ensayo de
cuantificación de proteínas totales usando como método el ácido bicinconínico
(BCA) realizando lecturas de absorbancia o densidad óptica (DO) a 570 nm,
siendo este un reactivo cromogénico nos permite detectar un cambio de color por
efecto de reducción del ion cobre del reactivo y así la absorbancia será
proporcional a la concentración de proteína presente en la muestra, como se
41
muestra en la (Figura. 19) evaluando la membrana polimérica sin principio activo y
la membrana que contiene protamina.
FIGURA 19. ENSAYO CUANTIFICACIÓN POR BCA
En la (Grafica. 1) y soportada con la (Figura. 20) se puede evidenciar que la
película que contenía el péptido presenta un pico el día 7, sugiriendo que al día
séptimo del ensayo es donde hubo una mayor liberación del principio activo,
comparado con la película sin principio activo presentando un comportamiento
uniforme en el transcurso de los 9 días del ensayo, dándonos un indicativo de que
la película evaluada es apropiado para el transporte de los péptidos
antimicrobianos, permitiendo su perfecta liberación.
GRAFICA 1. ENSAYO DE LIBERACIÓN DEL PÉPTIDO (PROTAMINA) DE LA PELÍCULA POLIMÉRICA
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1 2 3 4 5 6 7 8 9
D.O
Lectura 30' Incubación
P.Sola 1
P.Peptido 1
42
A partir de los datos promisorios anteriormente obtenidos, se decidió llevar a cabo
el ensayo de liberación de los diferentes péptidos y sus análogos formulados en la
biopelículas poliméricas mediante experimentos de diálisis en equilibrio durante 20
días, para lo cual se tomaron muestras del dializado cada día y se almacenaron a
4°C para su conservación. Pasado este tiempo se cuantificaron las proteínas
totales usando el método de BCA (cuantificación y detección colorimétrica). En la
(Grafica. 2) se puede observar que todas las películas presentaron un
comportamiento similar liberando el péptido antimicrobiano entre los días 6 y 8 del
ensayo.
GRAFICA 2. LIBERACIÓN DE PÉPTIDOS Y ANÁLOGOS DE LAS PELÍCULAS POLIMÉRICA
Con los datos reportados en la (Grafica. 2) podemos observar la reproducibilidad
en los resultados de las películas poliméricas evaluadas, teniendo una liberación
controlada de los péptidos antimicrobianos, dando excelentes indicios de que la
película polimérica con la formulación indicada es un buen medio de sistema de
entrega para los péptidos, logrando un mecanismo efectivo para los daños
causados en la piel.
43
4.5 Actividad antibacteriana in vitro
Se evaluó la capacidad de controlar las cepas bacterianas en medio in vitro, en un
ambiente controlado, usando los dializados obtenidos de las películas poliméricas
en los días donde hubo una mayor liberación del péptido antimicrobiano, también
se retaron con cada uno de los péptidos evaluados y con antibióticos de alto
espectro. Se realizaron mediciones de densidad óptica (DO) a 620 nm durante
24h, permitiendo evaluar el comportamiento de cada una de las cepas frente a
cada uno de los compuestos a los cuales fueron expuestas.
GRAFICA 3. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 12228
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 2 4 5 18 20 24
DO 6
20 n
m
TIEMPO (h)
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
BK
AMPICILINA
TETRACICLINA
KANAMICINA
BACTERIAS
PROTAMINA
2075
2076
2077
38611
38620
38621
P-GELATINA
P-ADHESION
P. SOLA
P-PROTAMINA
44
GRAFICA 4 ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 27853
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 2 4 5 18 20 24
DO 6
20 n
m
TIEMPO (h)
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
BK
AMPICILINA
TETRACICLINA
KANAMICINA
BACTERIAS
PROTAMINA
2075
2076
2077
38611
38620
38621
P-GELATINA
P-ADHESION
P. SOLA
P-PROTAMINA
45
GRAFICA 5. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS ATCC 35983
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
1,000
0 2 4 5 18 20 24
DO 6
20 n
m
TIEMPO (h)
Staphylococcus epidermidis ATCC 35983
BK
AMPICILINA
TETRACICLINA
KANAMICINA
BACTERIAS
PROTAMINA
2075
2076
2077
38611
38620
38621
P-GELATINA
P-ADHESION
P. SOLA
P-PROTAMINA
46
GRAFICA 6. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 2 4 5 18 20 24
DO 6
20 n
m
TIEMPO (h)
Staphylococcus aureus ATCC 6538
BK
AMPICILINA
TETRACICLINA
KANAMICINA
BACTERIAS
PROTAMINA
2075
2076
2077
38611
38620
38621
P-GELATINA
P-ADHESION
P. SOLA
P-PROTAMINA
47
GRAFICA 7. ENSAYO IN VITRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA FRENTE A LA CEPA SALMONELLA TYPHIMURIUM ATCC 7953
En todos los ensayos realizados se puedo observar que hubo una reducción del
crecimiento bacteriano a las 18 horas del ensayo, en los pozos donde se
evaluaron los dializados se evidencia que se presentó un mayor control de las
cepas ATCC complementándose la acción antibacteriana de los péptidos con las
propiedades de los polímeros usados para el desarrollo de las membranas
poliméricas, confirmando la liberación del principio activo de los sistemas de
entrega y la efectividad antimicrobiana.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,700
0,800
0,900
0 2 4 5 18 20 24
DO 6
20 n
m
TIEMPO (h)
Salmonella typhimurium ATCC 7953
BK
AMPICILINA
TETRACICLINA
KANAMICINA
BACTERIAS
PROTAMINA
2075
2076
2077
38611
38620
38621
P-GELATINA
P-ADHESION
P. SOLA
P-PROTAMINA
48
Los péptidos antimicrobianos junto con el sistema de liberación sugerido muestran
ser un candidato promisorio para el tratamiento de infecciones en la piel causadas
por diferentes factores actuando como protector y antimicrobiano.
Conclusiones
La importancia de este proyecto radica en la incorporación de péptidos
antibacterianos a un sistema de entrega compuesto por polímeros naturales, lo
que evidencia potencializar la actividad de los péptidos antibacterianos y esta
evidencia puede contribuir al desarrollo de sistemas novedosos con potencial
aplicación en pacientes con infecciones bacterianas a nivel cutáneo y dérmico.
Los polímeros estandarizados empleados para el diseño de estas formulaciones
presentan características físicas y fisicoquímicas adecuadas para ser empleadas
en futuros sistemas de entrega de péptidos antibacterianos.
Las formulaciones de sistemas película-péptidos obtenidas presentaron
propiedades mecánicas deseables de tal manera que evidencian un perfil de
fijación y adherencia a la superficie de diferentes mucosas.
El incluir en estos sistemas una película adicional de adhesión evidencia ser un
elemento necesario para proteger al sistema película de entrega-péptido para
permitir una mejor adherencia a las mucosas de diferentes sitios anatómicos.
49
Recomendaciones
Emplear otras técnicas que me permitan cuantificar el principio activo obtenido de
una manera más precisa.
En posteriores ensayos evaluar la actividad antimicrobiana en un modelo animal,
que permita un acercamiento a la evolución de las heridas cutáneas, cicatrización
y demás factores involucrados en el proceso infeccioso en la piel.
50
Anexos Anexo A. Curvas de crecimiento bacteriano
00,10,20,30,40,50,60,70,80,9
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
D.O
Tiempo (h)
Staphylococcus epidermidis
0,000,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
D.O
Tiempo(h)
Staphylococcus aureus
51
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
O.D
Tiempo (h)
Salmonella typhimurium
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
D.O
Tiempo (h)
Staphylococcus epidermidis
52
Anexo B. Cuantificación por BCA ensayo piloto de liberación
Diseño del ensayo
1 2 3 4 5 6
A BK BK PS 2 PS 2 PS 6 PS 6
B 2 ul 2 ul PP 2 PP 2 PP 6 PP 6
C 3 ul 3 ul PS 3 PS 3 PS 7 PS 7
D 4 ul 4 ul PP 3 PP 3 PP 7 PP 7
E 5 ul 5 ul PS 4 PS 4 PS 8 PS 8
F PS 1 PS 1 PP 4 PP 4 PP 8 PP 8
G PP1 PP1 PS 5 PS 5 PS 9 PS 9
H BK BK PP 5 PP 5 PP 9 PP 9
- Lectura 30 min de incubación
1 2 3 4 5 6
A 0,137 0,132 0,211 0,202 0,277 0,272 B 0,426 0,41 0,197 0,191 0,346 0,35 C 0,537 0,516 0,192 0,186 0,254 0,255 D 0,647 0,622 0,243 0,235 0,847 0,881 E 0,777 0,732 0,239 0,237 0,186 0,19 F 0,216 0,207 0,274 0,276 0,5 0,537 G 0,227 0,222 0,244 0,235 0,145 0,143 H 0,125 0,125 0,257 0,258 0,233 0,239
- Lectura 60 min de incubación
1 2 3 4 5 6
A 0,168 0,158 0,436 0,427 0,693 0,707 B 0,699 0,677 0,363 0,373 0,659 0,671 C 0,899 0,904 0,335 0,362 0,934 0,959
53
D 1,102 1,078 0,37 0,395 2,882 2,95 E 1,339 1,2 0,36 0,385 0,647 0,685 F 0,746 0,683 0,401 0,424 2,48 2,567 G 0,807 0,738 0,345 0,346 0,373 0,403 H 0,167 0,165 0,33 0,341 0,939 0,956
Anexo C. Cuantificación por BCA ensayo de liberación péptido-película
Diseño del ensayo.
P1 Pelicula de Adhesion P2 Pelicula Sola P3 Pelicula + Protamina P4 Pelicula + 2075 P5 Pelicula + 2077 P6 Pelicula + 38611 P7 Pelicula + 38620 P8 Pelicula + 38621 P9 Pelicula + Gelatina
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A BK BKB 2 ul 2 ulC 4 ul 4 ulD 6 ul 6 ulE 8 ul 8 ulFGH
P3 Dia 2P4 Dia 2P5 Dia 2P6 Dia 2
P9 Dia 2P1 Dia 3
P8 Dia 3P7 Dia 3P6 Dia 3
P2 Dia 3 P1 Dia 4
P1 Dia 1P2 Dia 1P3 Dia 1
P4 Dia 1P5 Dia 1P6 Dia 1P7 Dia 1P8 Dia 1P9 Dia 1P1 Dia 2P2 Dia 2
P7 Dia 2P8 Dia 2
P8 Dia 4
P5 Dia 4P6 Dia 4P7 Dia 4
P3 Dia 3
P9 Dia 3
P2 Dia 4P3 Dia 4
P5 Dia 3P4 Dia 3
P4 Dia 4
P7 Dia 5
P5 Dia 5P6 Dia 5
P9 Dia 4P1 Dia 5P2 Dia 5P3 Dia 5P4 Dia 5
54
Lectura 30 min de incubación
Ensayo- Caja 1.
Promedio 0,133 0,140 0,310 0,250 0,138 0,145 0,308 0,168 0,158 0,289 0,207 0,130 0,493 0,155 0,164 0,129 0,278 0,190 0,652 0,182 0,138 0,147 0,142 0,253 0,808 0,166 0,167 0,128 0,155 0,139 0,169 0,157 0,139 0,134 0,133 0,139 0,260 0,136 0,136 0,140 0,130 0,136 0,318 0,256 0,127 0,144 0,140 0,134
Caja.2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGH BK BK
P8 Dia 5P9 Dia 5
P2 Dia 6P1 Dia 6
P3 Dia 6P4 Dia 6P5 Dia 6P6 Dia 6 P5 Dia 7
P6 Dia 7P7 Dia 7P8 Dia 7P9 Dia 7P1 Dia 8P2 Dia 8P3 Dia 8P4 Dia 8
P7 Dia 6P8 Dia 6P9 Dia 6P1 Dia 7P2 Dia 7
P3 Dia 9
P4 Dia 9P5 Dia 9P6 Dia 9P7 Dia 9P8 Dia 9P9 Dia 9
P1 Dia 10P2 Dia 10
P1 Dia 9P2 Dia 9
P5 Dia 8P6 Dia 8P7 Dia 8P8 Dia 8P9 Dia 8
P8 Dia 10P9 Dia 10
P3 Dia 10P4 Dia 10P5 Dia 10P6 Dia 10P7 Dia 10
P3 Dia 7P4 Dia 7
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0,135 0,131 0,140 0,140 0,309 0,310 0,249 0,251 0,138 0,137 0,143 0,147B 0,340 0,276 0,177 0,158 0,162 0,154 0,287 0,290 0,208 0,205 0,128 0,131C 0,498 0,488 0,162 0,147 0,164 0,164 0,129 0,128 0,273 0,282 0,185 0,195D 0,659 0,644 0,182 0,181 0,138 0,137 0,147 0,146 0,137 0,146 0,251 0,255E 0,805 0,810 0,166 0,166 0,166 0,167 0,130 0,125 0,157 0,153 0,135 0,142F 0,163 0,175 0,158 0,156 0,135 0,142 0,134 0,133 0,133 0,133 0,136 0,141G 0,264 0,256 0,132 0,139 0,136 0,135 0,141 0,138 0,129 0,130 0,141 0,130H 0,326 0,310 0,254 0,257 0,125 0,129 0,139 0,148 0,132 0,147 0,128 0,140
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A 0,190 0,232 0,287 0,252 0,173 0,163 0,152 0,157 0,154 0,161 0,207 0,226B 0,267 0,310 0,226 0,143 0,140 0,133 0,149 0,285 0,135 0,150 0,178 0,160C 0,294 0,136 0,188 0,199 0,272 0,138 0,140 0,188 0,150 0,149 0,143 0,148D 0,385 0,385 0,142 0,140 0,174 0,165 0,148 0,313 0,222 0,144 0,147 0,143E 0,620 0,584 0,348 0,396 0,145 0,145 0,156 0,159 0,148 0,148 0,142 0,142F 0,317 0,309 0,676 0,700 0,299 0,173 0,236 0,141 0,136 0,138 0,187 0,187G 0,261 0,283 0,293 0,342 0,501 0,341 0,158 0,104 0,142 0,142 0,194 0,205H 0,188 0,288 0,343 0,162 0,160 0,254 0,365 0,349 0,308 0,246 0,265 0,155
55
Promedio 0,211 0,270 0,168 0,155 0,158 0,217 0,289 0,185 0,137 0,217 0,143 0,169 0,215 0,194 0,205 0,164 0,150 0,146 0,385 0,141 0,170 0,231 0,183 0,145 0,602 0,372 0,145 0,158 0,148 0,142 0,313 0,688 0,236 0,189 0,137 0,187 0,272 0,318 0,421 0,131 0,142 0,200 0,238 0,253 0,207 0,357 0,277 0,210
Consolidado
Anexo D. Estadística ensayo in vitro de actividad antibacteriana (D.O) vs tiempo (t) frente a la cepa Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 9.772 6.0 1.629 54.29 0.001
Intra grupos 2.245 20.0 0.1123
Interacción 2.586 120 0.02155
Total (Corr.) 14.66
Dias P. Adhesión P. Sola P. Protamina P. 2075 P. 2077 P. 38611 P. 38620 P. 38621 P. Gelatina1 0,169 0,260 0,318 0,140 0,168 0,155 0,182 0,166 0,1572 0,136 0,256 0,310 0,158 0,164 0,138 0,167 0,139 0,1363 0,127 0,250 0,289 0,129 0,147 0,128 0,134 0,140 0,1444 0,138 0,207 0,278 0,142 0,155 0,133 0,130 0,140 0,1455 0,130 0,190 0,253 0,139 0,139 0,136 0,134 0,211 0,2896 0,215 0,385 0,602 0,313 0,272 0,238 0,270 0,185 0,1947 0,141 0,372 0,688 0,318 0,253 0,168 0,137 0,205 0,1708 0,145 0,236 0,421 0,207 0,155 0,217 0,164 0,231 0,1589 0,189 0,131 0,357 0,158 0,143 0,150 0,183 0,148 0,13710 0,142 0,277 0,217 0,169 0,146 0,145 0,142 0,187 0,200
56
Anexo E. Estadística ensayo in vitro de actividad antibacteriana (D.O) vs tiempo (h) frente a la cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 8.428 6.0 1.405 41.99 0.001
Intra grupos 2.563 20.0 0,1282
Interacción 2.470 120 0.02059
Total (Corr.) 13.53 Anexo F. Estadística ensayo in vitro de actividad antibacteriana (D.O) vs tiempo (h) frente a la cepa Staphylococcus epidermidis ATCC 35983
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 10.94 6.0 1.824 35.74 0.001
Intra grupos 2.251 20.0 0.1126
Interacción 2.698 120 0.0248
Total (Corr.) 15.98
Anexo G. Estadística ensayo in vitro de actividad antibacteriana (D.O) vs tiempo (h) frente a la cepa Staphylococcus aureus ATCC 6538
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 9.022 6.0 1.504 37.94 0.001
Intra grupos 2.5 20.0 0.1252
Interacción 2.335 120 0.075
Total (Corr.) 13.94
57
Anexo H. Estadística ensayo in vitro de actividad antibacteriana (D.O) vs tiempo (h) frente a la cepa Salmonella typhimurium ATCC 7953
Fuente Suma de Cuadrados
Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
Entre grupos 6.422 6.0 1.070 60.21 0.001
Intra grupos 2.575 20.0 0.1287
Interacción 2.322 120 0.01935
Total (Corr.) 11.37
58
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