diseño y optimización de medios de cultivo nutriciÓn microbiana alejandra bosch
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Diseño y optimización de medios de cultivo
NUTRICIÓN MICROBIANA
ALEJANDRA BOSCH
Optimización de la expresión celular
Producción de algún producto Aumento de producción de biomasa Mejorar la velocidad o rendimiento de algún
producto
Efectores que intervienen en el crecimiento y formación de productos
Efectores intracelulares se refiere a la información genética que posee el microorganismo. La misma puede ser modificada por el agregado o extracción de genes.
Efectores extracelulares son los factores del entorno que pueden modificar la expresión:
físicos y químicos
Efectores extracelulares
Fisicoquímicos
son los relacionados con las características del sistema de cultivo
agitación, aeración, formación de espuma, nutrientes del medio de cultivo, pH, presión osmótica, estado redox, los
parámetros físicos como T y P.
Clasificación de medios
Por naturaleza química de los componentes Medios sintéticosMedios sintéticos o medios químicamente definidos Medios complejosMedios complejos en cuya composición intervienen
sustancias de origen animal o vegetal suero de leche, hidrolizados de proteínas como peptonas, extracto de levadura, macerado de maíz, harina de soja
Químicamente indefinidos y de composición variable
Clasificación de medios
Por los requerimientos nutricionales Medios mínimosMedios mínimos contienen unicamente los nutrientes
esenciales para el crecimiento Medios ricos Medios ricos son suplementados con nutrientes que
por lo general son intermediarios en la síntesis de componentes celulares: amino ácidos, vitaminas precursores de la síntesis de ácidos nucleicos.
Aumentan la velocidad de crecimiento,Reducen la fase lag
Tipos de nutrientes
MacronutrientesMacronutrientes [ g/l ] > 10-4 M
Tipo I: C H O N (10-2 y 10-3 M)
Tipo II: S, P, K y Mg (10-3 y 10-4 M) Micronutrientes o elementos trazasMicronutrientes o elementos trazas [mg/l o µg/l]
Tipo III: Elementos trazas: (metálicos)
Fe, Mn, Mo, Ca, Zn y Co
Tipo IV: Factores de crecimiento
Componentes orgánicos que no son sintetizados ni metabolizados por las células
vitaminas, aminoácidos ácidos grasos no sat.
Requerimientos nutricionales
Macronutrientes Tipo IMacronutrientes Tipo I
Fuentes C (Fuentes C (Fuente de C y energía)
Hidratos de Carbono (glucosa o dextrosa, sacarosa, lactosa)
Lípidos hidrocarburos (alcanos: hexadecano, octadecano) Alcoholes (glicerol y manitol) Melaza Harina de arroz Almidón Suero de quesos
Requerimientos nutricionales
Fuentes NFuentes N El nitrógeno es utilizado para la biosíntesis de proteínas,
ácidos nucleicos y polímeros de la pared celular.
Puede ser de naturaleza inorgánica u orgánica
NH4 (NH42SO4). Acidificación durante el crecimiento Urea, NO3, N2 AminoácidosAminoácidos dan mayores rendimientos Peptonas.Peptonas. Son hidrolizados parciales de proteínas ( H o OH)
Carne, pescado, gelatina, caseína. Extracto de levadura,Extracto de levadura, en forma de pasta o polvo, y puede ser
obtenida mediante autólisis de la levadura Extracto de malta,Extracto de malta, que es el extracto soluble en H2O de la
malta de la cebada Cornsteep Cornsteep maceración de la industria del maíz
Requerimientos nutricionales
Macronutrientes Tipo II
PP y el S S son suministrados en forma de P04H y S04 (o aminoácidos azufrados) El P se incorpora en ácidos nucleicos, y
polímeros celulares. El S es asimilado para la síntesis de
aminoácidos azufrados, y además se necesita para la biotina y otros componentes.
Requerimientos nutricionales
Macronutrientes Tipo II
KK y el Mg Mg son suministrados en forma de P04 y S04 (o aminoácidos azufrados)
El K es un componente intracelular importante,
principal catión inorgánico. El Mg asociado a la función ribosómica, cofactor de
enzimas y componente de pared celular.
Requerimientos nutricionales
Micronutrientes (Tipo III)Micronutrientes (Tipo III)Esenciales para el crecimiento
Fe, Mn, y ZnEsenciales en condiciones particulares
Co, Cu, Mo, CaRaramente esenciales B, Na, Al, Si, Cl, V, Cr, Ni, As, Se generalmente están presente en suficiente cantidad
como impureza de los componentes principales. Se agregan como sales solubles de Cl-, SO4=, NO3,
MoO4
Requerimientos nutricionales
Factores de crecimiento (Micronutrientes Tipo IV)Factores de crecimiento (Micronutrientes Tipo IV)Se agregan en el orden de 10-6 a 10-12 M
Coenzimas: colina Acido oleico ( lactobacilos) Ácidos grasos BiotinaVitaminas B1,2,3,5,6
LOS MICROORGANISMOS NO CRECEN SIN ELLOSLOS MICROORGANISMOS NO CRECEN SIN ELLOS
AminoácidosPrecursores de ácidos nucleicos u otros intermediarios
INCREMENTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO INCREMENTAN LA VELOCIDAD DE CRECIMIENTO DISMINUYEN LA FASE LAGDISMINUYEN LA FASE LAG
Disponibilidad de los nutrientes
Los nutrientes además de estar presentes en el medio de de cultivo, deben estar disueltos disueltos para estar disponiblesdisponibles para ser usados por la célula.
¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR ¿POR QUÉ PUEDEN NO ESTAR DISPONIBLES?DISPONIBLES?
la esterilización por calor. Se debe tener en cuenta la temperatura, tiempo de calentamiento, pH del medio
reacciones entre componentes antes, durante o después de la esterilización
Disponibilidad de los nutrientes
Los HPO4 utilizados como fuente de P y buffer deben esterilizarse separados de las sales de Mg, con Na, K y NH4
NaMgPO4NH4MgPO4 poseen baja solubilidad
KMgPO4
Los PO4 deben esterilizarse separadamenteLos PO4 deben esterilizarse separadamente de las sales de Mg y NH4de las sales de Mg y NH4
Disponibilidad de los nutrientes
Los azúcaresazúcares pueden descomponersedescomponerse por la acción del calor en presencia de sales inorgánicas y compuestos amínicos.
sales, H+sacarosa hidroliza
Los grupos carbonilos de los azúcarescarbonilos de los azúcares con los grupos amino grupos amino de las proteínasde las proteínas, aminoácidos, etc., dan productos de condensación (reacción de Maillard), los cuales disminuyen significativamente las cantidades de carbohidratos y N amínico disponible.
azúcares reductores + -NH2 condensación
Los carbohidratos se deben esterilizar por separado de los compuestos nitrogenados orgánicos.
Disponibilidad de los nutrientes
Aminoácido,Factores de crecimiento son lábiles al calorVitaminas
Se los prepara disolviéndolos separadamente en pequeños volúmenes de agua, en soluciones muy concentradas.
Se los esteriliza por filtración. Se los incorpora a los medios de cultivo ya esterilizados (en general 1ml de solución
por cada litro de medio) en condiciones de asepsia.
Fuente de N
Fuente de N utilizada son sales de NH4+ sales de NH4+ Esterilizar a un pH < 7 para evitar su volatilización como NH3.
Si ésta es urea urea debe esterilizarse por filtración Al del calor se descompone en NH3 y CO2,
Disponibilidad de los nutrientes
Es aconsejable entonces, esterilizar los componentes de los medios de cultivo en fracciones separadasfracciones separadas:
Fracción 1Fracción 1: Fte. de C, micronutrientes, sales de Mg, Ca, etc.
Fracción 2:Fracción 2: Fte. de N en caso que se descomponga por calor (urea) debe esterilizarse por filtración, o en caso de que reaccione con la fuente de C puede esterilizarse por calor pero separadamente.
Fracción 3:Fracción 3: Vitaminas y factores de crecimiento. Se preparan soluciones 1000 veces mas concentradas y se esterilizan por filtración.
Fracción 4Fracción 4: Fosfatos, se esterilizan por calor.
Diseño, Formulación, Optimización de medios de cultivo
DiseñoDiseño: Elección de los componentes necesarios para lograr el crecimiento y la formación de productos
FormulaciónFormulación: Proporciones, concentraciones de cada componente.
OptimizaciónOptimización: Encontrar la mejor formulación para lograr el objetivo (máx biomasa, producto, etc.)
Optimización
Para organismos aerobios generalmente se utiliza como sistema de cultivo erlenmeyers agitados
Realizar experimentos, en los cuales se varía la concentración de 1 componente manteniendo constante las concentraciones de los demás ingredientes
Se varían más de un componente empelando un diseño factorial
Se analiza el efecto de la/ las variable escogida sobre la velocidad de crecimiento, rendimientos yxs, yps, etc.
Problelma
Tiempo
Lo
g X
CB
E
D
A