Diapositiva 1

Reaccin en Cadena de la PolimerasaMtodo de amplificacin in vitro que permite la generacin de una gran cantidad de copias (105 copias).Kary Mullis, 1985. Componentes de la Reaccin:

NobelPrize Chemistry (1993).OligonucletidosSolucin Amortiguadora (Mg2+)DNA Polimerasa TermoestabledNTPs DNA Templado1Reaccin en Cadena de la PolimerasaProtocolo General:

DesnaturalizacinDesnaturalizacinAlineamientoAmplificacinMeltingEnfriamiento1 Ciclo2

Reaccin en Cadena de la PolimerasaOligonucletidosSecuencias que flanquean el fragmento a amplificar.Actan como cebadoresTamao de 18-27 nucletidosDiseo 3-OH.Producto Amplificado: 100-300 pbContenido de GC 40-45%

3Diseo de OligonucletidosArabidopsis thalianaEscherichia coliPneumocystis cariniiBos taurusHepatitis C virusRattus norvegicusCaenorhabditis elegansHomo sapiensSaccharomyces cerevisiaeChlamydomonas reinhardtiiMus musculusSchizosaccharomyces pombeDanio rerio (zebrafish)Mycoplasma pneumoniaeTakifugu rubripesDictyostelium discoideumOryza sativaXenopus laevisDrosophila melanogasterPlasmodium falciparumZea mays

Seleccionar organismo.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/4

En dnde puedo buscar?http://www.genecards.org/5

Buscar la secuencia de nucletidos. NCBI Reference SequenceNombre mRNAOrganismo

NM_013693.2tumor necrosis factor (Tnf), mRNAMus musculushttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed

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Seleccionar formato FASTA7

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OligonucletidosTamao de 18-27 nucletidosDiseo 3-OH.Producto Amplificado: 100-300 pbContenido de GC 40-45%

http://frodo.wi.mit.edu/9

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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Database: Refseq (Refseq_rna)Oligonucletidos11

Verificar Complementariedad12

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/Database: Refseq (Refseq_rna)NM_013693.2Oligonucletidos13Diseo de Oligonucletidos

14http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

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Verificar Especificidad17