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Fernndez N., Eutimio Gustavo;Fernndez C., Mirna;Prez S., Irela;Morn G., Yohandro;Garca M., Viviana;Perdomo L., Iraelio;Prez S., Nstor Diseos de experimentos en tecnologa y control de los medicamentos Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas, Vol. 39, Nm. 2, abril-junio, 2008, pp. 28 -40 Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. MxicoDisponible en: http://redalyc.uaemex.mx/src/inicio/ArtPdfRed.jsp?iCve=57939206

Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas ISSN (Versin impresa): 1870-0195 rmcf@afmac.org.mx Asociacin Farmacutica Mexicana, A.C. Mxico

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008

Revisin Bibliogrca

Diseos de experimentos en tecnologa y control de los medicamentosExperimental designs in pharmaceutical technology and control of medicamentsEutimio Gustavo Fernndez N.1, Mirna Fernndez C.2*, Irela Prez S.2, Yohandro Morn G.1, Viviana Garca M.2, Iraelio Perdomo L.1, Nstor Prez S.1. 1 Centro de Ingeniera e Investigaciones Qumica. Laboratorio de Qumica Inorgnica 2 Instituto de Farmacia y Alimentos (IFAL). Universidad de La HabanaRESUMEN: en la presente revisin bibliogrca se esbozan los principales diseos de experimentos que encuentran aplicacin en el campo de la tecnologa y control de los medicamentos. Se muestran ejemplos de la literatura especializada donde se evidencian las posibilidades que brindan los mismos en el hallazgo de condiciones ptimas de operacin de un proceso tecnolgico o una tcnica analtica as como en encontrar las proporciones idneas de excipientes en una formulacin farmacutica, entre otras aplicaciones. El nmero de recursos utilizados en la experimentacin ser mnimo, si estas herramientas estadsticas son empleadas correctamente. En este trabajo se puntualiza en la idea que los diseos de experimentos se vuelven inecientes cuando no se conjugan bien con los conocimientos previos sobre los sistemas en estudio. ABSTRACT: in this bibliographic review the majority of the experimental designs that have been used in technology and control of medicaments are discussed. Many examples extracted form specialized literature are shown in order to demonstrate the possibilities of them for nding the optimal values of the independent variables in a pharmaceutical process or an analytical technique as well as the suitable excipient proportions in some of the dosages forms. The amount of resources during experimentation will be minimum if these statistical tools are correctly applied. In this work is remarked the idea: the experimental designs are not ecient when they are not well combined with previous knowledge about the systems under study.Palabras clave: diseos de experimentos, tecnologa y control de medicamentos, mtodos multivariados. Keywords: experimental designs, technology and control of medicaments, multivariate methods.

Correspondencia: Dra C. Mirna Fernndez Cervera Dpto. Tecnologa y Control de los Medicamentos. IFAL. Calle 23 No. 21425 e7 214 y 222, La Coronela, La Lisa, Ciudad de La Habana. Cuba. e-mail: mirnafc@yahoo.com Fecha de recepcin: 09 de mayo de 2006 Fecha de recepcin de modicacin: 03 de abril de 2007 Fecha de aceptacin: 18 de abril de 2008

IntroduccinLos diseos de experimentos, como parte de la estadstica impartida en los centros universitarios, han recibido el rechazo por parte de los estudiantes que slo sienten o recuerdan el peso de su complejidad matemtica. Su utilidad es reconocida en el trabajo prctico cuando se necesita demostrar, con cierto grado de conabilidad, un resultado cientco. El modo de resolver el problema de la enseanza de la estadstica en especialidades donde sta se aplica ha sido entrenar a los alumnos en saber qu herramienta emplear y cmo analizar los resultados que de sta se generen. 1 Cabe sealar que el diseo de experimentos se encarga de asegurar que los datos experimentales contengan el mximo de informacin2. Es considerado una de las dos ramas de la Quimiometra, disciplina dentro de las ciencias qumicas que tiene como objeto la aplicacin de los mtodos estadsticos y matemticos, as como aquellos mtodos basados en la lgica matemtica, a la qumica3.

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Una denicin similar presenta la Biometra para las ciencias biolgicas, por lo que todo parece indicar que cuando una ciencia toma las herramientas estadstico-matemticas que requiere para resolver sus problemas cientcos le adosa el sujo -metra, as nos pudiramos tomar la libertad de denir el trmino Farmametra para las Ciencias Farmacuticas, sin necesidad de explicacin. La otra rama de la Farmametra por analoga con la Quimiometra es el anlisis de datos, ramas cada vez ms relacionadas entre s, por lo que el estudio de una conlleva a la otra. Los diseos de experimentos no deben ser usados irracionalmente, estos deben emplearse cuando no existan modelos tericos que describan los procesos o formulaciones en estudio, como mtodo emprico para poder describir el sistema en estudio con el menor nmero de experimentos posibles. En algunas ocasiones los modelos tericos son empleados como punto de partida para los diseos de experimentos.4 El personal vinculado con la tecnologa y control de los medicamentos debe conocer el gran nmero de diseos de experimentos que existen y sus utilidades. Muchos de ellos han sido desarrollados por los matemticos hace varias dcadas pero en el mbito internacional an son pobremente empleados y muchas veces desconocidos. Conjuntamente con los diseos de experimentos resulta hoy imprescindible el conocimiento y la utilizacin de las tcnicas multivariadas de anlisis de datos. El objetivo de esta revisin bibliogrca es mostrar una breve panormica terica de los distintos tipos de diseos de experimentos que pueden emplearse, y se han empleado, en la tecnologa y control de los medicamentos (TCM) as como comentar el estado actual de los diseos de experimentos, ventajas y utilidad prctica a travs de ejemplos publicados en la literatura especializada. Generalidades Antes de adentrarnos en la panormica terica de los diferentes diseos de experimentos que han sido o pueden ser utilizados en la tecnologa y control de los medicamentos, es necesario denir una serie de conceptos bsicos que permitirn un mejor entendimiento de los mismos. Factor: una variable experimental que puede ser cambiada por el investigador (temperatura, tiempo de incubacin, pH, etc.) Niveles: valores especcos de los factores para un experimento dado. Respuesta: variable que es medida, la cual depende principalmente de los factores en estudio. Efecto: magnitud del cambio en la respuesta al variar los factores.

Corrida: un experimento llevado a cabo en valores especcos para cada factor. Modelo: es una ecuacin matemtica que dene la respuesta en funcin de los factores estudiados.5 Para su estudio, los diseos de experimentos han sido agrupados en tres categoras, atendiendo al tipo de problema que se pretende resolver con los mismos. En la gura 1 se observa que la primera categora incluye los diseos basados en el anlisis de varianza, la segunda incluye aquellos en los que se pretende encontrar un modelo matemtico, por lo general polinomial, que conecte los factores con las respuestas, y la tercera categora incluye solamente a los diseos multivariados, los cuales permiten denir un modelo matemtico similar al descrito para la segunda categora. Adems, en este pueden incluirse variables cualitativas siendo llevadas a numricas empleando la tcnica de anlisis de componentes principales.6

Figura 1. Categoras de los diseos de experimentos para su estudio

La anterior clasicacin cubana de los diseos de experimentos7 fue realizada teniendo en cuenta las ramas de la ciencia donde estos se aplicaban con mayor frecuencia, es por eso que en nuestra primera categora coinciden los diseos utilizados en Biologa y Agronoma, mientras que en nuestra segunda categora aparecen los de mayor utilizacin en las ciencias Qumicas, Fsicas y Farmacuticas. Debido al estado del conocimiento en la fecha de publicacin de la mencionada referencia slo aparecan incluidos los dos primeros tipos de diseos en dicha categora, aunque ya existan los restantes an no estaban incorporados a muchos trabajos de la comunidad cientca internacional. La ltima categora no encuentra equivalente en la anterior clasicacin ya que su primera aplicacin en las ciencias Qumicas fue en 1985.6

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008 Este cambio en la clasicacin se ha realizado teniendo en cuenta que la pretensin del experimento es ms abarcadora que el campo de la ciencia donde es mayoritaria su aplicacin. Es importante sealar que la estadstica no podr sustituir jams los conocimientos de la rama de la ciencia donde sta se aplica y que el xito o fallo de un estudio experimental depende, en ltima instancia, de la habilidad y la experiencia del investigador responsable.8 Especialistas en diseos de experimentos han denido 8 reglas para el desarrollo exitoso de estos. A continuacin se listan las mismas: 9 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Denir buenos objetivos Medir respuestas cuantitativamente Replicar para amortiguar la variacin incontrolable (ruido) Aleatorizar el orden de las corridas Bloquear las fuentes de variacin conocidas Conocer cules efectos pueden estar confundidos Realizar una secuencia de diseos de experimentos Conrmar siempre los resultados crticos jetivo, y en dependencia del nmero de causas conocidas de variacin bloqueadas, pueden ser clasicados en: completamente aleatorizados (ninguna), bloques al azar (una) y cuadrados latinos (dos).10 Sobre estos diseos es necesario comentar con ms detenimiento los diseos completamente aleatorizados. Los mismos deben ser aplicados a unidades experimentales homogneas, los tratamientos se realizan aleatoriamente a las unidades experimentales y el anlisis estadstico de los resultados se hace por el llamado mtodo de anlisis de varianza de clasicacin simple. Debe demostrarse que los valores observados en las unidades experimentales, correspondientes a un mismo tratamiento, presentan una distribucin normal y que las varianzas de los mismos son estadsticamente similares (homogeneidad de varianza). Estos dos requisitos deben cumplirse ya que los mtodos de clculo para demostrar las diferencias o no de los distintos tratamientos asume como cierto estas dos condiciones.11 Aunque estos diseos no fueron objeto de una bsqueda bibliogrca sobre sus aplicaciones en la tecnologa y control de los medicamentos se inere que han sido ampliamente utilizados primeramente por ser los ms antiguos. Adems, de tener potencialidades para demostrar si existen diferencias entre alguna propiedad, de al menos dos excipientes que ejercen la misma funcin, estudiar varios tipos de fases mviles en cromatografa para encontrar diferencias entre los parmetros que describen la resolucin de los analitos, entre muchos otros casos. Si existen diferencias entre los tratamientos se debe realizar alguna prueba estadstica que muestre cules son los que se diferencian y en que orden se encuentran estos. La prueba ms comn es la prueba de Duncan.7 Diseos factoriales Antes de comenzar a discutir las generalidades de estos diseos es necesario hacer un anlisis crtico del modo de experimentar, que constituy la antesala de los diseos factoriales pero que an contina siendo empleado por investigadores poco entrenados en los diseos de experimentos. La experimentacin que se ejecuta estudiando cada factor a varios niveles para optimizar el mismo manteniendo constante los restantes, para as progresivamente continuar estudiando los dems y hallar las mejores condiciones para desarrollar un proceso tiene las siguientes limitaciones: 1. 2. 3. 4. 5. No conduce al ptimo real Ineciente, muchas corridas innecesarias Ignora las interacciones12 Experimentos sin conexin Lento crecimiento del conocimiento, no se realiza un correcto mapeo del espacio experimental.

La primera regla est relacionada con denir si en el diseo se pretende tamizar variables u optimizar las que se estudian. Se recomienda siempre tamizar para luego optimizar los factores que ms inuyen sobre la respuesta. En esta regla se considera tambin el buen uso del conocimiento previo para denir mejor el problema cientco y no arribar a conclusiones ya conocidas, lo que desmotiva mucho al personal vinculado a la investigacin. Este modo de proceder ahorrar tiempo y dinero. La segunda est relacionada con aquellas variables respuestas denominadas Si o No las cuales al ser empleadas disminuyen grandemente la precisin de los resultados de un diseo de experimentos, por lo que se sugiere utilizar sistemas de escalas. Las reglas 3, 4 y 5 estn muy relacionadas ya que stas garantizan realizar las experiencias en condiciones controladas, sin que las causas de variacin, conocidas o desconocidas, inuyan en las inferencias que se realizan a partir de los datos recogidos en la experimentacin. La regla 6 se adecua a los diseos fraccionarios, PlacettBurman y Taguchi que sern explicados posteriormente. La sptima regla est estrechamente vinculada con la primera. Por ltimo se plantea que ningn resultado dado como apropiado u ptimo, proveniente de un diseo de experimentos, debe ser considerado como cierto y ser llevado a escalas superiores de produccin sin antes conrmar experimentalmente el mismo. Se debe recordar que en la estadstica jams se trabaja con absolutos, siempre existe incertidumbre en los resultados9. Estas reglas son aplicables principalmente a las dos ltimas categoras de diseos denidas en este trabajo. Diseos basados en el anlisis de varianza Los diseos basados en el anlisis de varianza son utilizados para encontrar diferencias entre varios tratamientos con un mismo ob-

En la gura 2 se ilustra mejor las anteriores limitaciones para una reaccin qumica donde primeramente se estudia la temperatura y posteriormente se analiza el pH. La echa sealiza las condiciones

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ptimas encontradas por el mtodo de disear un experimento slo para un factor manteniendo constante los dems. La zona ms oscura simboliza la regin donde se encuentra realmente el ptimo, como se puede apreciar estn distantes.13var 1 (temp)

La literatura cientca relacionada con TCM reporta un gran nmero de aplicaciones de estos planes experimentales4. Su amplio uso se debe a que fueron los primeros diseos creados para encontrar relaciones funcionales entre los factores y la variable respuesta. Adems, el nmero de experimentos es relativamente pequeo y el anlisis de los resultados no es complejo. A modo de ejemplo comentaremos una aplicacin de un plan factorial 23 que se emple para evaluar la permeabilidad aparente de la glucosa (Pag) en una emulsin de aceite en agua. Los factores incluidos en el estudio y sus niveles fueron: dimetro medio de las gotas (210 - 560 nm), gradiente osmtico (0 - 1250 mOsm/kg) y porciento de fase acuosa (30 - 50 % m/m). A los ocho puntos correspondientes al diseo se le adicion un punto extra para validar estadsticamente el modelo polinomial para la Pag (significacin de los trminos del modelo as como comprobar la bondad y prdida de ajuste del mismo) y los nueve puntos fueron replicados por lo que el nmero total de experimentos fue 18. Tantos los factores independientes as como las interacciones resultaron significativas, excepto la interaccin dimetro medio de las gotas - porciento de fase acuosa.14 Otras aplicaciones de estos diseos han sido referidas en las etapas iniciales de la experimentacin cuando se desean optimizar las condiciones de operacin de diferentes procesos tecnolgicos farmacuticos tales como: fabricacin de pellets 15, microencapsulacin16, entre otros. Los planes factoriales 2k aunque han solucionado muchos problemas en las diferentes ramas de la investigacin cientca tienen la limitacin de ser perifricos. El trmino perifrico debe entenderse como que los puntos experimentales estn situados en los lmites de la zona de muestreo. De este modo el mapeo de la regin de estudio resulta ineciente. Estos diseos gradualmente irn desapareciendo debido a esta limitacin, e irn cubriendo su espacio los que no incurran en la misma, con un nmero relativamente pequeo de experimentos. Diseos factoriales fraccionarios Cuando el nmero de factores en un diseo con variables de procesos a dos niveles es mayor de 5, se suelen reducir los diseos factoriales. Los nuevos diseos que se originan se conocen como diseos factoriales fraccionarios, de modo que el nmero de corridas experimentales haga posible la realizacin de las mismas. La limitacin fundamental de estos diseos es la prdida de informacin debido a la confusin de los efectos principales con las interacciones en dependencia de la resolucin del diseo.4 Sin entrar en denicin alguna del concepto de resolucin, explicaremos que grado de confusin existe en los tres tipos de resolucin ms empleados.

var 2 pH

Figura 2. Representacin grca del modo de experimentar, un factor por cada diseo

Las variables independientes con las cuales se trabaja en estos diseos son denominadas de procesos y son independientes entre s. Estos factores pueden ser cuantitativos (pH, temperatura, velocidad de agitacin, tiempo, etc.) o cualitativos (tipos de catalizador, tipos de proveedores, tipos de materia prima con igual n). Dentro de los diseos factoriales los ms empleados son los factoriales completos a 2 niveles. En ellos todas las combinaciones de los niveles, de cada uno de los factores, son incluidas en el plan experimental. Si se estn estudiando k factores el nmero de experimentos se dene como 2k. Para la validacin estadstica se realiza usualmente un experimento en el centro del rea de muestreo, el cual se replica al menos tres veces. 4 Estos diseos permiten el ajuste de modelos polinomiales que incluyen la contribucin de los factores de modo individual as como las diferentes combinaciones de los factores. En la gura 3 se muestran dos ejemplos de diseos factoriales a dos niveles con sus modelos correspondientes. El empleo de estos planes experimentales es adecuado para el tamizado de variables, jams deben ser empleados en la optimizacin. Se recomienda su uso hasta problemas de 5 factores, ya que a partir de este nmero de variables independientes la cantidad de experimentos se puede volver econmicamente prohibitiva.

Figura 3. Diseos 22 y 23

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008 1. Resolucin III. Ningn factor individual, se confunde con otro factor individual. Por lo menos un factor individual se confunde con una interaccin de dos factores. 2. Resolucin IV. Ningn factor individual, se confunde con otro factor individual o con una interaccin de 2 factores. Por lo menos una interaccin de 2 variables se confunde con otra interaccin de dos variables. 3. Resolucin V. Ningn factor individual, se confunde con otro factor individual o con una interaccin de 2 factores. Ninguna interaccin de 2 variables se confunde con otra interaccin de dos variables. Por lo menos una interaccin de dos factores est confundida con una de tres.17 Estos diseos aprovechan que raras veces las interacciones de tres o ms factores son signicativas. Son igualmente utilizados para el tamizado de variables. Los mismos han sido aplicados con mucha frecuencia en la tecnologa farmacutica ya que muchos de los procesos de esta rama de lasCiencias Farmacuticas dependen de un nmero de factores relativamente elevado (mayor que 5). Entre los problemas resueltos con esta clase de diseos se encuentra el tamizado de cinco variables que inuyen en diferentes parmetros de calidad del recubrimiento de pellets con una pelcula entrica. Las variables estudiadas fueron: temperatura del aire, presin de atomizacin, velocidad de ujo de la solucin de recubrimiento, velocidad de ujo de entrada de aire y altura de la boquilla de atomizacin. En esta situacin se aplic un diseo factorial fraccional de resolucin V (25-1). Con solo 19 experimentos en los cuales se incluyen tres puntos centrales adicionales se puede ajustar a cada variable respuesta analizada un modelo como el siguiente: De igual forma se han aplicado en el diseo del ensayo de disolucin para una formulacin de liberacin controlada de paracetamol.20 Existen otros diseos que han sido empleados, los cuales tienen una denicin diferente a los fraccionarios, pero que pueden ser utilizados con el mismo objetivo que estos, denominados como diseos Plackett - Burman4. Estos han sido empleados fundamentalmente para demostrar la robustez de diferentes mtodos analticos.21 Arreglos ortogonales de Taguchi Los arreglos ortogonales de Taguchi son una alternativa a los diseos factoriales clsicos. En ellos el experimentador puede conocer el efecto individual de los factores en estudio as como el de algunas interacciones de dos factores que l reconoce de antemano que pueden ser signicativos sin que entre ellos existan confusiones, con un nmero reducido de experiencias.22 Estos diseos se denen del siguiente modo Ln (qs), donde n es el nmero de experimentos, q es el nmero de niveles de cada variable y s, el nmero mximo de factores que se pueden estudiar en este arreglo L.23 Los arreglos ortogonales de Taguchi han sido aplicados fundamentalmente en la seleccin de las condiciones experimentales de diferentes tcnicas analticas en el control de medicamentos. Una tcnica fosforimtrica para la determinacin de naproxeno en preparaciones farmacuticas fue optimizada empleando un arreglo de Taguchi L25 (56). Se estudiaron cinco factores, dentro de los que resultaron signicativos el pH de la solucin, la concentracin del tomo pesado (I -) y el tiempo de exposicin en el papel que contiene el substrato slido despus de ser secado. En las condiciones ptimas el naproxeno puede ser determinado en un rango lineal de 10 a 400 ng mL -1 con un lmite de cuanticacin de 2,7 ng mL -1 a 3. El mtodo ha sido aplicado

La temperatura de ujo de aire, la presin de atomizacin y la velocidad de ujo de la solucin de recubrimiento resultaron los factores signicativos. Estos despus fueron optimizados empleando un diseo compuesto central centrado en las caras .18 Otro problema resuelto con un diseo fraccionario, en este caso de resolucin IV fue el empleado para tamizar cuatro factores (24-1) que inuyen en un proceso de granulacin hmeda donde modelan tres respuestas. Este diseo corresponde a la etapa inicial en una secuencia de diseos que naliz con la optimizacin de los factores empleando un diseo compuesto central.19

satisfactoriamente en la determinacin de naproxeno en un producto comercial.24 Por otra parte se emple un diseo de Taguchi, en este caso a 2 y 4 niveles, fue empleado en el desarrollo de un mtodo para la cuanticacin de oxprenolol. El mtodo est basado en la oxidacin del oxprenolol con Ce(IV) en cido sulfrico y el posterior monitoreo de la absorbancia de la droga oxidada a 480 nm. Los factores incluidos en la optimizacin fueron la concentracin de Ce(IV), la concentracin de cido sulfrico y el tiempo de reaccin. La tcnica optimizada result lineal en un rango de

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50 a 400 ppm, til para los ensayos de oxprenolol en productos farmacuticos.25 Antes de nalizar los comentarios sobre los diseos de Taguchi se debe aclarar que cuando se ha mencionado la optimizacin de las condiciones experimentales en las referencias anteriores, ha sido porque se han considerado ms de dos niveles para la mayora de los factores por lo que se puede observar curvatura en la inuencia de los factores. Generalmente estos diseos se utilizan para tamizar variables, emplendolos a 2 niveles para cada factor. Diseos tiles para optimizar variables de procesos Dentro de los diseos que deben ser empleados en la tecnologa y control de procesos para optimizar variables de procesos se encuentran: 1. Diferentes variantes de los diseos compuestos centrales: centrados en las caras, circunscritos e inscritos (NIST/SEMATECH e-Handbook of Statistical Methods). 2. Los diseos factoriales completos a 3 niveles.17 3. Los planes experimentales de Box - Behnken.17 4. Diseos Doehler .4 Estos diseos deben ser empleados en la fase nal de una secuencia de experimentos, o de lo contrario si el conocimiento del sistema por parte del investigador es excelente puede atreverse a realizarlo desde un principio. A continuacin mostraremos aplicaciones de algunos de estos diseos en la tecnologa y control de los medicamentos. Un diseo Doehler ha sido empleado en la optimizacin de una tcnica analtica para la cuanticacin de la nimesulida, donde el nmero de factores incluidos fueron cuatro y se realizaron 24 experimentos despus de haber utilizado un Plackett - Burman para tamizar siete variables.26 La robustez y optimizacin de un mtodo de electroforesis capilar, para el anlisis del etambutol, fueron realizadas a travs de dos diseos Box - Behnken. Se estudiaron tres factores: pH del buer, concentracin del buer (mM) y el voltaje de la corrida (kV) y se analizaron tres respuestas: tiempo de retencin, nmero de platos tericos y factor de resolucin. Se aplic un mtodo de optimizacin mltiple para determinar las condiciones experimentales ptimas.27 Un diseo compuesto central centrado en las caras fue empleado en la etapa de optimizacin del trabajo comentado con anterioridad sobre el recubrimiento entrico de pellets.18 Los planes experimentales referidos, tiles para optimizar variables de procesos presentan la misma limitacin de los diseos 2k, son perifricos. El aumento del nmero de niveles de cada

variable permite apreciar curvatura en los factores, pero esta se estima con puntos que en su mayora estn en el permetro de la zona de muestreo. Diseos uniformes La uniformidad en la distribucin de los puntos experimentales en la zona de estudio es la caracterstica ms importante y esencial de los diseos uniformes (DU). Debido a esta caracterstica, la eciencia en el costo de la experimentacin, su robustez y exibilidad lo hacen muy til en los diferentes campos de la qumica y la ingeniera qumica. Ejemplos de aplicaciones exitosas de los DU en el mejoramiento de tecnologas se han logrado en la industria textil, farmacutica, de la fermentacin y otras. Estos resultados han sido consistentemente reportados en China desde la dcada de los 80.23 Los DU fueron motivados por una necesidad en la ingeniera de sistemas. En 1978, una agencia industrial china propuso un problema sobre diseos de experimentos, en el cual seis factores, con al menos 12 niveles cada uno, deban ser considerados. El nmero de experiencias no deban exceder de 50 porque las mismas eran muy costosas. Era imposible solucionar el problema con un diseo factorial fraccionario. En estas circunstancias surgen los DU, y en esta primera aplicacin fue necesario efectuar 31 experimentos, estudiando cada factor a 31 niveles y se logr un resultado satisfactorio.23 Dentro de los mritos fundamentales que se le atribuyen a estos diseos estn: 1. El modo de explorar la zona experimental. Es capaz de ubicar las muestras con una alta representatividad en el dominio de experimentacin. 2. Robustez: este diseo no impone asumir un modelo predenido que vincule a los factores con la respuesta. 3. Mltiples niveles: es el diseo que mejor acomoda a un nmero grande de niveles para cada factor entre todos los diseos experimentales conocidos. Para encontrar un arreglo de puntos que estn homogneamente espaciados existen varios mtodos entre los que se encuentran: El grupo de buenos arreglos de puntos. Un algoritmo de optimizacin global basado en el umbral de aceptacin.23 Las tablas de los puntos experimentales para los diseos ms comunes empleando el ltimo de los mtodos se pueden encontrar en el sitio web: http://www.math.hkbu.edu.hk/UniformDesign. Este tipo de diseo en el campo de la tecnologa y control de los medicamentos, no ha sido muy empleado pero todo parece indicar que la limitacin fundamental para su utilizacin ha sido su desconocimiento. Casi todas las publicaciones encontradas son de colectivos de investigacin chinos, pues all surgieron los mismos.

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008 En 1997 fue publicado un interesante trabajo sobre como emplear una secuencia de DU para optimizar las condiciones operacin de una electroforesis capilar para separar cinco ditiocarbamatos (DTC). Estos no pudieron ser separados empleando la antigua tcnica experimental de slo cambiar una variable en un grupo de experimentos. Como el conjunto de factores estudiados en la electroforesis capilar rara vez responde a un modelo de regresin lineal, incluso incorporando algunos trminos de interacciones de variables, el procedimiento se hace complejo. Los autores propusieron una estrategia que inclua la utilizacin de dos DU de modo secuencial, aprovechando el modo de explorar la zona de estudio de estos diseos.28 El primer DU se realiz para estudiar la temperatura (15 - 35 o C), el pH del buer (8,41 - 11,49) y el voltaje de corrida (10 - 30 kV). Hallndose que altos valores de pH son adecuados para la separacin as como bajos valores de temperatura. Bajos voltajes de corrida garantizan las mejores separaciones aunque esta ltima condicin aumenta el tiempo empleado para ejecutar una corrida electrofortica. En el segundo diseo uniforme se estudiaron la inuencia del porciento de un modicador orgnico (metanol), el efecto de la concentracin del buer y el voltaje de corrida en un rango que incluye del valor medio al menor del anterior diseo (10 - 15 kV). La temperatura se mantuvo a 15 oC y el pH a 11,4. En la tabla 1 se observa la matriz experimental del segundo diseo. Tabla 1. Matriz experimental para el segundo DU en el estudio de la separacin en una EC 28Nmero del experimento Concentracin de metanol (%) Concentracin del Buer (mM) Voltaje de Corrida (kV)

sulacin, ejemplos de frmacos trabajados son la melatonina empleando la tcnica de emulsicacin - entrecruzamiento29 y cisplatina utilizando la tcnica de evaporacin disolvente.30 Antes de nalizar nuestros comentarios sobre las bases tericas de los DUs as como sus aplicaciones, debemos resaltar que por el uniforme mapeo de la zona de muestreo posibilita el empleo de una modalidad de la inteligencia articial denominada redes neuronales articiales (RNA). Estos diseos solucionan la principal limitacin de los diseos factoriales y los tiles para optimizar variables de procesos (perifricos). Ellos irn ganado espacio en la comunidad cientca a medida que el personal de investigacin se familiarice con las RNA. Algunos tipos de RNA constituyen una alternativa a los mtodos de supercie respuesta, en estas no se prueban modelos lineales preconcebidos, ya que las RNA permiten encontrar relaciones ms complejas entre los factores y la respuesta.23,31 Diseos con mezclas Antes de adentrarnos en las generalidades de los diseos con mezclas es preciso aclarar que estos diseos de experimentos no son una nueva alternativa a los clsicos planes factoriales a dos niveles32. Estos ltimos trabajan con variables que son totalmente independientes (variables de proceso), mientras los primeros estn denidos para problemas de mezclas fsicas de componentes donde no existe total independencia entre las variables, que en este caso son las proporciones de los ingredientes de una formulacin dada. La dependencia entre las variables est condicionada por la restriccin de unicidad, su representacin matemtica es la siguiente:

Donde q es el nmero efectivo de variables y xi son los componentes de la mezcla fsica. La restriccin de unicidad impone que el nmero efectivo de variables es q-1 por lo que las reas de muestreo dieren para un problema con mezclas a uno con variables de proceso (ver gura 4).

1 2 3 4 5 6

2 2 4 4 6 6

5

15 20 10 20 10 15

10 15 5 10 15

Los mejores resultados fueron alcanzados en el experimento 2 ya que se obtuvo una excelente separacin de los 5 compuestos con un menor tiempo de anlisis.28 Este ejemplo puede servir de base para la aplicacin de los DUs a muchos problemas analticos similares dentro del control qumico de los medicamentos. En la tecnologa farmacutica los DUs han sido empleados principalmente en la optimizacin de los procesos de microencap-

Figura 4. reas de experimentacin para un mismo nmero de variables en un problema con variables de mezclas y otro con variables de proceso.

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Los diseos con mezclas se emplean para explorar cmo los cambios en la composicin de la mezcla pueden afectar las propiedades de estas33, hablando en trminos de la tecnologa farmacutica, cmo la variacin de las proporciones de los excipientes inciden sobre los ndices de calidad de las formas terminadas o las variables de control, en procesos de ms de una etapa. Estos diseos son muy tiles para cualquier tecnlogo de la industria farmacutica ya que este debe enfrentarse usualmente a la optimizacin de la composicin de una mezcla de excipientes con el objetivo de preparar un medicamento con caractersticas requeridas.34 Los mismos se subdividen en dos grandes grupos. El primero de estos incluyen los diseos aplicables a problemas sin restricciones, los cuales deben entenderse como aquellos donde los ingredientes en la formulacin pueden aparecer en un rango que va desde no aparecer hasta ocupar la totalidad de la mezcla estudiada. Los diseos incluidos en este grupo son el simplex-lattice, simplex centroide y axiales, los ltimos encuentran poca aplicabilidad en la industria farmacutica ya que se emplean para tamizar variables. El segundo grupo incluye los diseos que resuelven problemas con restricciones, en estos los ingredientes estn acotados entre valores de mximo y mnimo diferentes de 1 y 0 respectivamente, el diseo mayoritariamente empleado es el D-Optimal. Los diseos D-Optimal se basan en un criterio de optimalidad, el cual garantiza que los puntos experimentales minimicen la varianza de los parmetros estimados para un modelo predenido. Estos se pueden emplear en el estudio de espacios restringidos donde son imposibles utilizar los arreglos de puntos correspondientes a diseos para reas regulares.17 En los diseos con mezclas se distribuyen los puntos experimentales en el rea de muestreo de modo que principalmente se puedan ajustar modelos polinomiales lineales, cuadrticos y especiales cbicos35. A continuacin se muestran sus ecuaciones matemticas para un sistema de tres componentes.(Lineal) (Cuadrtico) (Especial cbico)

la composicin de la fase oleosa de emulsiones parenterales, una vez denida el porciento de esta en la emulsin inuye sobre las propiedades de la emulsin. Se estudian dos mezclas ternarias de aceites, una compuesta por cido oleico, aceite de castor y medio de cadenas de triglicridos, la otra presenta alcohol oleico, aceite de castor y medio de cadenas de triglicridos. Entre las propiedades modeladas a partir de los componentes de la fase oleosa se encuentran la viscosidad, el tamao de gotcula medio y la tensin interfacial.37 Los diseos con restricciones son los que ms aplicacin encuentran en la tecnologa farmacutica, ya que son los que permiten encontrar las proporciones idneas de los excipientes que se emplean en una forma galnica determinada. Como ejemplo de los diseos con restricciones en la tecnologa farmacutica se presenta un trabajo de preformulacin donde se emplea un diseo D-Optimal, conjuntamente con la calorimetra diferencial de barrido, para optimizar la composicin de una tableta de glibenclamida. Se model la variacin de entalpa en funcin de cuatro excipientes, los cuales fueron estudiados en los siguientes rangos: X1: Natrasol (aglutinante) X2: Sorbitol (relleno) X3: cido esterico (lubricante) X4: PVPXL (desintegrante) 42.19x146.87 36.57x246.87 0.94x32.81 3.75x47.50

Como el objetivo era la minimizacin de la variacin de entalpa para garantizar la mayor estabilidad del principio activo en las tabletas, se optimiz bajo este criterio. La mezcla que result idnea fue ensayada para validar el resultado obtenido por los mtodos estadsticos empleados demostrndose que no existan diferencias signicativas para un 95 % de conabilidad.38 Otra aplicacin de los diseos con mezclas sin restricciones en la tecnologa farmacutica ha sido la optimizacin de un sistema matricial de liberacin controlada de hidrocloruro de nicardipino (20 mg). En este las variables estudiadas fueron las proporciones de hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) (0.1 - 0.15 % m/m), Avicel (0.65 - 90 % m/m) y alginato sdico (0.0 - 0.20 % m/m), manteniendo constante en la formulacin la proporcin de estearato de magnesio (1 %). Las variables analizadas en este caso fueron los porcientos de frmaco liberado a las 3, 6 y 12 horas. Los modelos de mejor ajuste fueron los cuadrticos para cada una de las respuestas. En este ejemplo se buscaba una liberacin controlada del nicardipino por lo que los criterios de optimizacin fueron que la liberacin del frmaco se encontrase en determinados rangos para cada uno de los tres tiempos muestreados, los cuales se muestran a continuacin. Y1: liberacin del frmaco (3h) Y2: liberacin del frmaco (6h) Y3: liberacin del frmaco (12h) 10%Y130% 40%Y265% 80%Y3

En la tecnologa farmacutica los diseos con mezclas sin restricciones han sido empleados para estudiar y optimizar mezclas de excipientes con una misma funcin. Como ejemplos podemos citar dos trabajos, uno de ellos realizado por investigadores del Departamento de Farmacia de la Universidad de Helsinki, donde se estudia el comportamiento de las propiedades de las mezclas de polvos de tres tipos de celulosa microcristalina, Avicel PH - 101, PH - 102 y PH - 20036. El otro trabajo tomado de la literatura para ejemplicar este subgrupo de diseos es el que utiliza un diseo simplex-lattice para conocer cuantitativamente cmo

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008 La mezcla ptima resultante aplicando el mtodo de supercie respuesta fue validada experimentalmente encontrndose que no existan diferencias signicativas al realizar una prueba tStudent para un 95 % de conabilidad.35 Antes de nalizar los comentarios sobre las aplicaciones farmacuticas de los diseos con mezclas, es necesario aclarar que cuando se aplican todas las condiciones de operacin estas deben permanecer constantes para que la estimacin de los efectos de los factores se corresponda, inconfundiblemente, con la contribucin de las proporciones de los componentes en estudio de la mezcla. Para que resulte ms clara esta explicacin pondremos el ejemplo de una limonada. De nada vale que ofertemos una mezcla con las proporciones de jugo de limn, agua y azcar si la ofertamos caliente, otras combinaciones peores sern mejor aceptadas si estn fras, esto se debe a que el sabor de una limonada est inuenciada por las proporciones de sus ingredientes as como de su temperatura. Diseos mixtos Hasta ahora los diseos de experimentos discutidos emplean variables de procesos o variables de mezclas, sin embargo muchos procesos son dependientes de ambos tipos de variables. Para solucionar este problema surgieron los diseos mixtos39. Estos diseos permiten tener modelos que describen mejor los procesos. Quizs su aparicin en la literatura relacionada con la tecnologa y control de medicamentos este limitada por dos factores fundamentales: una es el alto costo de la experimentacin y la otra puede ser que mostrar los resultados de este tipo de diseo implique develar aspectos de propiedad intelectual relacionada con la elaboracin de medicamentos. En la gura 5 se muestra la representacin grca de los puntos experimentales para dos problemas que pueden ser resueltos con diseos mixtos. de proceso. Si se desea saber si alguna variable de proceso afecta del mismo modo a todas las mezclas estudiadas se debe realizar una transformacin a los trminos que incluyen a la variable de proceso y las variables de mezcla, la cual consiste en hacer desaparecer una variable de mezcla en virtud de la restriccin de unicidad (x1 + x2 + x3 = 1). Para que se cumpla nuestra hiptesis el trmino que incluye la variable de proceso debe ser signicativo, mientras las restantes asociadas a la transformacin realizada no deben ser signicativas. Estos diseos pueden ser potencialmente empleados en la elaboracin de distintas formas farmacuticas. Como ejemplo podemos citar la optimizacin del proceso de fabricacin de una tableta por compresin directa, donde se pueden determinar las proporciones ptimas de los excipientes de la formulacin as como los valores idneos de la velocidad de rotacin de la mquina compresora, as como la fuerza de compresin. Dentro de esta categora se incluyen los diseos con mezclas y cantidades, estos constituyen una variante simple de los diseos mixtos ya que slo se estudia una variable de proceso, la cantidad de la mezcla. En el campo de investigacin que nos ocupa se sugieren por ejemplo para la optimizacin de la composicin de un sistema de recubrimiento as como de la cantidad idnea de este para garantizar un perl de liberacin dado y un razonable tiempo de estabilidad. A continuacin se muestra el modelo general para este tipo de diseo.

En la anterior ecuacin A representa la variable cantidad y los niveles en los que se decide experimentar dicha variable. Quizs muchos diseos mixtos hallan sido realizados pero los mismos se encuentran en el know - how de diferentes variantes de la propiedad intelectual. Estos planes experimentales deben ser considerados por el investigador en TCM siempre y cuando la economa de la experimentacin lo permita. A medida que la miniaturizacin tecnolgica avance, ellos irn ocupando ms espacio entre los diseos de eleccin en TCM. Mtodos multivariados Aunque los mtodos multivariados no constituyen un tipo de diseo de experimentos, deben ser incorporados en este trabajo para poder comprender los diseos multivariados y a la vez mostrar, al menos una de las posibilidades que estos ofrecen al personal que est vinculado a la tecnologa y control de los medicamentos. Estos mtodos son necesarios conocerlos ya que el avance tecnolgico actual ha generado grandes estructuras de datos mientras que los profesionales no han sido entrenados en los mtodos que permiten una adecuada interpretacin de las mismas. Los mtodos multivariados

Figura 5. Representacin grca de dos diseos mixtos. (a) Tres variables de mezcla y una variable de proceso a dos niveles. (b) Tres variables de mezcla y dos variables de proceso a dos niveles.

En los modelos polinomiales de Sche asociados a estos diseos se tienen en cuenta las interacciones de las variables de proceso con las variables de mezcla, as como la contribucin de cada trmino de los modelos denidos para las mezclas como promedio de todas las condiciones exploradas para las variables

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constituyen los espejuelos a travs de los cuales podemos ver mejor un gran volumen de datos. Los mtodos que sern abordados son los que permiten trabajar con grupos de datos de agrupacin tabular o planares. El primer mtodo que abordaremos es el anlisis de componentes principales (ACP). Este mtodo vectorial permite reducir las dimensiones de una tabla donde las columnas se corresponden con las variables descriptoras y las las con las muestras caracterizadas, de modo que cada componente principal est formado por dos vectores: uno de marcas y otro de cargas. El primero correlaciona las muestras y el segundo las variables descriptoras. Pueden existir un nmero de componentes principales que sea igual al mnimo nmero de las o columnas de la tabla, pero generalmente con dos o tres componentes principales se explica un alto porciento de la variabilidad de una tabla de datos. El primer componente principal explica el mayor porciento de la variabilidad y as sucesivamente los restantes van decreciendo. De modo grco (gura 6) se muestra lo antes expresado.40Figura 7. Mtodo de PEL. Un ACP es realizado para las variables descriptoras y respuesta, representadas por la lnea slida. La mejor correlacin posible entre X y Y es calculada usando la tcnica de los mnimos cuadrados. El modelo resultante de PEL no es siempre el que mejor describe a X y Y pero si el mejor que los correlaciona.

Figura 6. Descomposicin en componentes principales de una tabla de datos

donde se emplean estas herramientas an es relativamente bajo se debe al desconocimiento de las potencialidades de stas. Diseos multivariados En los diseos multivariados convergen los mtodos multivariados de anlisis de datos (ACP, PEL) y los clsicos diseos de experimentos donde se buscan relaciones funcionales entre los factores y la respuesta. El modo de proceder es el siguiente: 1. Formulacin del problema (especicar el objetivo y el modelo, realizar una divisin conceptual del sistema estudiado en subsistemas). 2. Coleccin de la data multivariada en un grupo de subsistemas. 3. Estimacin de la dimensionalidad prctica de la data para cada tipo de subsistema empleando ACP o PEL. 4. Uso de las marcas en CP o PLS como variables de diseo en la combinacin de subsistemas en el grupo de entrenamiento. 5. Medicin de las respuestas. 6. Anlisis de la data por ACP o PEL. 7. Interpretacin de los resultados con posible retroalimentacin a los pasos 1, 2 3. 6 La primera aplicacin de este tipo de diseo en las ciencias qumicas fue en la optimizacin de la reaccin de WillgerodtKindler. sta es una reaccin heterognea compleja, al menos hasta la fecha de publicacin del trabajo, con un mecanismo no bien establecido donde una acetona aromtica, en la presencia

El ACP ha sido aplicado, conjuntamente con la regresin lineal mltiple, en una tcnica denominada regresin en componentes principales (RCP) para cuanticar compuestos que tienen una misma zona de absorcin en el espectro ultravioleta. Dentro de estas aplicaciones est la validacin de un mtodo analtico para cuanticar cido saliclico y acido acetilsaliclico41, los cuales requieren ser analizados por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (CLAR) segn la Farmacopea estadounidense.42 El ltimo mtodo multivariado que comentaremos es la proyeccin en estructuras latentes (PEL). Este se aplica cuando existe una tabla cuyas columnas estn divididas en variables descriptoras (X) y variables respuestas o dependientes (Y). El objetivo de este mtodo es relacionar la data X con la Y garantizando una buena correlacin y a la vez hacer una buena descripcin de X y Y. En la gura 7 se ilustra una representacin grca del mtodo de PEL. Los mtodos multivariados en el contexto de esta revisin bibliogrca solo son tratados como elementos fundamentales para el entendimiento de los diseos multivariados. Ellos por si solos son de gran utilidad para los investigadores que se enfrentan a inmensas estructuras de datos. Si el nmero de publicaciones

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Volumen 39 Nmero 2 Abril - Junio 2008 de azufre, reacciona con una amina y se convierte en una tioamida de cido carboxlico. La reaccin est inuenciada por la temperatura, la cantidad de azufre y la relacin amina/cetona. En este ejemplo los subsistemas establecidos fueron solvente, amina y substrato aplicando una caracterizacin de estos empleando ACP para luego trabajar con las marcas como variables de un diseo 26-3. Las seis variables son las marcas en los dos componentes principales de los tres subsistemas y en cada punto experimental se optimizaron las condiciones de temperatura, cantidad de azufre y relacin amino-cetona, empleando un diseo compuesto central.6 Es importante resaltar que los diseos multivariados son la mejor opcin para trabajar con las denominadas variables cualitativas o categricas ya que hasta el momento en que surgen estos el trabajo con estas variables se solucionaba de dos modos: uno era trabajando con varios niveles de estas, si fuese un solvente se ensayaba con varios de estos, la otra opcin fue asignndole un valor numrico a la variable empleando para esto los valores de alguna propiedad fsica. Pero esta ltima variante limita a una variable lo que en realidad es un conjunto de stas, cuando se vara una factor cualitativo se cambian a la vez muchas propiedades que tienen diferentes inuencias sobre el sistema en estudio. Como se conoce las variables cualitativas encierran dentro de s un conjunto de variables numricas o medibles y estas pueden ser mejor interpretadas empleando ACP y expresando la misma de forma numrica a partir de sus marcas. Un ejemplo de la vida cotidiana, la belleza femenina de una muestra de mujeres puede ser medida con diferentes variables numricas descriptivas: largo del cabello, simetra de la cara, relaciones ergonomtricas, etc, y empleando PCA podemos reducir racionalmente la cantidad de variables numricas que describen la belleza. Estos diseos en la industria farmacutica han encontrado dos aplicaciones fundamentales. Una en la formulacin de tabletas por compresin directa donde en un diseo de mezcla multivariado se optimizan las proporciones de los excipientes, as como el tipo de excipiente de acuerdo a su funcin en la formulacin (relleno, aglutinante, etc.). Los excipientes correspondientes a cada funcin se describieron a partir de sus caractersticas fsicas y espectrales (FT - IR), y se aplic ACP para reducir las dimensiones y as tomar las marcas como variables numricas o de proceso para un diseo mixto: variables latentes o de marcas con las variables de mezclas y as optimizar las tabletas por esta va.43 La otra aplicacin fue la desarrollada por especialistas de la Empresa Pharmacia - Upjohn. Estos haban propuesto una metodologa para el uso de estos diseos en la optimizacin de procesos bietpicos.44 Tres aos despus publicaron la aplicacin de su estrategia a un problema farmacutico. La optimizacin de un proceso bietpico de granulacin-compresin. La idea fundamental en esta estrategia es aplicar un anlisis de CP a todas las variables dependientes e independientes de las corridas experimentales correspondientes al proceso de granulacin, para que las marcas de las muestras ms representativas de este experimento sean empleadas como factores de estudio en el proceso de compresin conjuntamente con aquellos que estn vinculados de modo directo con esta etapa. As se logra tener un modelo con una apreciacin ms sistmica del proceso de elaboracin de la tableta.45 Como se puede apreciar los diseos multivariados actualmente apenas encuentran aplicacin en la TCM. Su suerte es similar a la de otros planes experimentales, el desconocimiento por parte de una comunidad cientca que an contina pobremente entrenada en las tcnicas ms recientes de experimentacin. Corresponde principalmente a los centros universitarios actualizar la enseanza de estas materias para lograr una formacin ms slida de sus profesionales. En un tiempo quizs no muy lejano, con el desarrollo de la informtica, los profesionales quedarn slo para resolver problemas cientcos. Es decir todo lo conocido ser programable. Por tal motivo experimentar de un modo correcto y ptimo ser un requisito indispensable para un profesional competente ante situaciones desconocidas.

ConclusionesEn este trabajo se demuestra que existe un gran nmero de diseos de experimentos que el farmacutico dedicado a la tecnologa y control de los medicamentos debe conocer sus bondades y limitaciones para realizar un uso correcto de los mismos, a la vez que le permita optimizar los recursos de los cuales dispone para experimentar. Conjuntamente con los diseos de experimentos, los mtodos multivariados son una herramienta estadstica que debe diseminarse en el campo de las Ciencias Farmacuticas, para el procesamiento de los grandes volmenes de datos que generan las nuevas tecnologas.

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