Diseño de bacterias para inmobilización de metales:

Bio-remediación de suelos

Marc Valls y Víctor de Lorenzo

Ca, Mg, Fe

Mn, Cu, Co, Zn

Pb, Cd, Ni, Ag, Hg

Abundancia

Toxicidad

Mecanismos de toxicidad de los metales pesados

- Permeabilización de membranas.

- Interferencia en la homeóstasis del Ca.

- Efectos sobre la estructura del DNA.

- Alteración de las funciones de los metales esenciales.

Río Guadiamar el día después del accidente de Aznalcóllar

Bacterias para la bioremediación

de metales pesados?

NANO MICRO MILI MOLAR

1 10 100 1 10 100 1 10 100 1 10

ME

TA

LE

SO

RG

AN

ISM

OS

EucariotasCianobacterias

Metalotioneínas

Metalotioneína-2 de rata

MDPNCSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKGAADKCTCCA

SGKGKGEKCTSACRSEPCQCGSKCQCGEGCTCAACKTCNCTSDGCKCGKECTGPDSCKCGSSCSCK

MPGPCCNDKCVCQEGGCKAGCQCTSCRCSPCQKCTSGCKCATKEECSKTCTKPCSCCPK

MPDVKCVCCKEGKECACFGQDCCKTGECCKDGTCCGICTNAACKCANGCKCGSGCSCTEGNCAC

MPCPCGSGCKCASQATKGSCNCGSDCKCGGDKKSACGCSE

VCKCDCKNQNCSCNTGTKDCDCSDAKCCEQYCCPTASEKKCCKSGCAGGCKCANCECAQAAH

KVNNNCCCGENAKPCCTDPNSGCCCVSETNNCCKSDKKECCTGTGEGCKCTGCKCCQPAKSGCCCGDKAKACCTDPNSGCCCSSKTNKCCDSTNKTECKTCECCK

GDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK

ANDCKCPNGCSCPNCANGGCQCGDKCECKKQSCHGCGEQCKCGSHGSSCHGSCGCGDKCECK

PEQVNCQYDCHCSNCACENTCNCCAKPACACTNSASNECSCQTCKCQTCKC

MEFTTAMFGTSLIFTTSTQSKHNLVNNCCCSSSTSESSMPASCACTKCGCKTCKC

MFSELINFQNEGHECQCQCGSCKNNEQCQKSCSCPTGCNSDDKCPCGNKSEETKKSCCSGK

MTVKICDCEGECCKDSCHCGSTCLPSCSGGEKCKCDHSTGSPQCKSCGEKCKCETTCTCEKSKCNCEKC

TSTTLVKCACEPCLCNVDPSKAIDRNGLYYCSEACADGHTGGSKGCGHTGCNCHG

MSGCGCGSSCNCGDSCKCNKRSSGLSYSEMETTETVILGVGPAKIQFEGAEMSAASEDGGCKCGDNCTCDPCNCK

1- Mouse

2- Snail

3- Crab

5- Drosophila

4- Sea urchin

9- Candida

6- C. elegans

7- Tetrahymena

8- Neurospora

15- Pea

11- Yarrowia

12- Saccharomyces

14- Cianobacteria

10- Candida

13- Saccharomyces

MTMT

CdCdMTMT

Cd2+

CdMT

MTMT

CdCdMTMTCdAlb.

Alb.

Cd2+

CdMT

Cd2+

Hígado

Intestino, pulmones

Riñón

NANO MICRO MILI MOLAR

1 10 100 1 10 100 1 10 100 1 10

ME

TA

LE

SO

RG

AN

ISM

OS

EucariotasCianobacterias

Metalotioneínas

Gram-positivas

Quimiolitótrofos

E. coli Alcaligenes sp.

Exportación, reducción

Gram-negativas

Sistemas de expresión de metalotioneínas en la superficie de E. coli

Envuelta de gram-negativas

Membrana externa

Membrana interna

Peptidoglicano

Espacio periplásmico

1.

OM

1. Lpp-OmpA-MT

OM

2.

2. LamB-MTOM

Peptidoglicano

4.

4. MT-PAL

3. MT-IgAb

3.

IgA proteasa de Neisseria

Periplasma

Citoplasma

ME

MI

E-TagMT IgALeaderPlac

Periplasma

medio

C

M2+

Fraccionamiento de E. coli pMt

wtwt

MI ME

wt Dsba-

Soluble

KDa

97.4200

66.2

45.0

31.0

Dsba- Dsba-

Localización de MT-IgAen E. coli

MI MESolubleKDa

97.4

200

66.2

45.0

31.0

wtwtwt Dsba- Dsba- Dsba-

ELISA sobre células 1

Intacta3

Lisada2

Choque osmótico

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

YY

Superficie Superficie + periplasma Proteína total

Exposición en la superficie

3

0

1

2

DO492

Estirpe WT Dsba-WT+pMt +

2- Superficie + periplasma

3- Proteína total

1- Superficie

-

Bioacumulación de Cd2+ en E.

coli

nmoles Cd2+/mg

0

5

10

15

+Estirpe

pMtWT Dsba-WT

+-

Problemas

- Las cepas de laboratorio son inadecuadas.

- Se requiere selección para mantener los genes

- E. coli es sensible a los metales.

- Inducción con IPTG

Soluciones

- Usar bacterias resistentes a metales.

- Usar estirpes del suelo.

- Integrar los genes en el cromosoma.

- Inducir con aromáticos.

Expresión de metalotioneínas en bacterias del suelo

(Ralstonia eutropha)

Estructura del transposón Tn5-MT

I O

XylSKm Pm MT

1 Kb

Transposición de TnMT

Escherichia coli Ralstonia sp. Pseudomonas sp.

Ralstonia sp.Pseudomonas sp.

Transposición de TnMT

Expresión de MT-IgAen R. eutropha

KDa

55.0

66.2

40.042.7

30.1

TnMT

3-MB ++

- ++

- ++

-+--

Localización de MT-IgA en R. eutropha

KDa

97.4

55.0

66.2

42.740.0

+ +MI MESol.

TnMTMI MESol. MI MESol.

-

30 M

0

15

30

+

nmoles Cd2+/mg

0

15

30

+

E. coli

MT

R. eutropha

300 M

0

15

30

45

+-- -

Ralstonia eutropha MT

Nice but…does

it work in polluted

soil?

Inmobilización de Cd2+ en el suelo

Suelo estéril +Ralstonia wt +Ralstonia MT

321

321

Suelo estéril +Ralstonia wt +Ralstonia MT

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Estéril+Cd2+

WT+Cd2+

MT+Cd2+

Control(sin Cd2+)

15

Peso seco (g)

Clorofila (mg/g)

Efecto de R. eutropha

sobre el crecimiento

vegetal

Inmobilización de Cd2+

en suelo

1- Suelo estéril

2- + Ralstonia wt 3- + Ralstonia MT

321