dinámica de la materia orgánica y de los elementos traza...
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Dinámica de la materia orgánica y de los elementos
traza en suelos contaminados reforestados con
Salicáceas.
Memoria que presenta
Lisa Ciadamidaro
Para optar al título de Doctor por la
Universidad de Sevilla.
Sevilla, 23 de Octubre de 2013.
Dinámica de la materia orgánica y de los elementos
traza en suelos contaminados reforestados con
Salicáceas.
Visado en Sevilla, a 23 de Octubre de 2013.
LOS DIRECTORES
Dra. Engracia Madejón Rodríguez Dra. Paula Madejón Rodríguez
Investigador Científico del CSIC Científico Titular del CSIC
IRNAS-CSIC IRNAS-CSIC
EL TUTOR
Prof. María Elena Fernández Boy
Profesor Titular de la Universidad de Sevilla
Memoria que presenta
Lisa Ciadamidaro
Para optar al título de Doctor por la
Universidad de Sevilla.
DOCTOR D. JOSÉ MANUEL PARDO PRIETO, DIRECTOR DEL
INSTITUTO DE RECURSOS NATURALES Y AGROBIOLOGIA DE
SEVILLA DEL CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES
CIENTÍFICAS
CERTIFICA: Que la presente Memoria de Investigación titulada “Dinámica de la
materia orgánica y de los elementos traza en suelos contaminados reforestados
con Salicáceas”, presentada por Lisa Ciadamidaro para optar al grado de Doctor,
ha sido realizada en el Departamento Protección del Sistema Suelo, Planta, Agua,
bajo la dirección de las Drs. Engracia Madejón Rodríguez y Paula Madejón
Rodríguez, reuniendo todas las condiciones exigidas a los trabajos de Tesis
Doctorales.
En Sevilla, a 23 de Octubre de 2013.
El presente trabajo de investigación se ha realizado gracias a
una beca predoctoral JAE-PREDOC de la Junta de
Ampliación de Estudios del Consejo Superior de
Investigaciónes Cientificas-CSIC, adscrita al Proyecto
AGL2008-00985
Agradecimientos
A las Drs. Engracia Madejón y Paula Madejón, directoras de este trabajo, por su
interés, implicación y conocimientos transmitidos, sin su ayuda no estaría aquí hoy.
Al Dr. Francisco Cabrera, Investigador Responsable del grupo AGR 108 del PAIDI,
en el que estoy integrada, por haberme acogido y por ser siempre un punto de
referencia.
Al Dr. José Manuel Murillo por su supervisión general del trabajo realizado y por
su presencia constante.
Al Dr. Rafael López Núñez por acogerme en el IRNAS la primera vez en el año
2008.
A la Dra. Elena Fernández, tutora de este trabajo, por haber aceptado la tutoría del
mismo, así como por su amabilidad y disponibilidad para cualquier consulta.
Al Dr. Pedro Soler, del Centro de Ciencias Medioambientales de Madrid (CSIC),
por su colaboración en el trabajo de laboratorio y de monitorización de datos.
I would like to thank Dr. Brett Robinson and Dr. Walter Wenzel to accept me in
their group during my research fellowships in New Zealand and Austria and to give
me the opportunity to improve my knowledge in this area.
A special thank to Dr. Markus Puschenreiter and Dr. Jakob Santner for their help
and their time spent working with me during my research fellowship in Austria and
during my last PhD year in Seville. I’ve learnt a lot from them.
A la dirección del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla IRNAS-
CSIC, por haber permitido el desarrollo de este trabajo en sus instalaciones.
A todo el personal del Departamento “Protección del sistema suelo, planta, agua” a
Rosa por su compañía, por las charlas y las risas que me han entretenido estos años
y especialmente a Iván y Patri por ayudarme siempre en mi trabajo y por hacer más
agradables los días pasados en el Instituto, no habrá mejores compañeros. A Jian y
todos los alumnos de prácticas que han pasado por el departamento,
especialmente a Francisco Camacho.
A la Dra. Pilar Burgos, Chona, Cristina, Alvaro, Rocio y todo el laboratorio de
análisis por el interés y la disponibilidad mostrada hacia mi trabajo y por tratarme
siempre tan bien.
A Ignacio Girón por ayudarme en todos mis experimentos y por todos los favores
realizados que han facilitado muchísimo el desarollo de los mismos.
A José Antonio y Fernando por toda la ayuda prestada en el mantenimiento del
ensayo en Coria y sin la cual hubiera sido muy difícil llevar a cabo la parte
experimental del trabajo.
A mis amigas del trabajo, Marian, Carmen y María del Mar (la mallorquina, la
rubia y la pipi) por haber estado alli cuando más lo necesitaba, por las risas, los
desayunos y los buenos momentos dentro y fuera del IRNAS.
A todos los “Pepjines”, mi segunda casa en el IRNAS, todos los becarios (antiguos
y nuevos), Jorge (mi guru), Jose Carlos y Ana, para acojerme siempre en su
departamento, especialmente en su terraza.
A todos mis amigos, sevillanos o no, que aunque no hayan participado en mi trabajo
me han hecho pasar buenos ratos y por todas las risas compartidas cuando más lo
necesitaba.
A mia madre e i miei fratelli per il loro appoggio costante, per la loro incitazione
nei buoni e nei cattivi momenti e per stimolarmi sempre a dare il meglio di me,
incluso nella distanza.
A Marco, por su gran paciencia y aunque solo sea por su presencia. Ha sido mi
fuerza durante todos estos años.
A mio padre, tutto questo è grazie a te.
Abreviaturas en orden alfabetico
Se remite al texto de las publicaciones para las abreviaturas incluidas en los artículos.
β-gluc Actividad β-glucosidasa
AC Acid contaminated soil (Publicación científica
V.5)
AZ Suelo de Aznalcázar
AZ-L Suelo de Aznalcázar con hojarasca
AZ-P Suelo de Aznalcázar con planta
CBM Carbono de la biomasa microbiana
CH Carbono hidrosoluble
CO Suelo de Coria del Río
CO-L Suelo de Coria del Río con hojarasca
CO-P Suelo de Coria del Río con planta
Control Control soil (Publicación científica V.5)
COT Carbono orgánico total
DO Suelo de Las Doblas
DO-L Suelo de Las Doblas con hojarasca
DO-P Suelo de Las Doblas con planta
ET Elementos traza
LIG Lignina Klason
MO Materia orgánica
NBM Nitrógeno de la biomasa microbiana
NC Neutral contaminated soil (Publicación científica
V.5)
N-Kjel N-Kjeldahl
NP Non-polluted soil (Publicación científica V.1)
NP-L Non-polluted soil with litter (Publicación
científica V.1)
PA Polluted acid soil (Publicación científica V.1)
PA-L Polluted acid soil with litter (Publicación
científica V.1)
PN Polluted neutral soil (Publicación científica V.1)
PN-L Polluted neutral soil with litter (Publicación
científica V.1)
PNG p-nitrofenil-β-glucopiranósido
PNP p-nitrofenol
PNR Potencial de nitrificación del suelo
RHU Suelo de la Rivera de Huelva
RHU-L Suelo de la Rivera de Huelva con hojarasca
RHU-P Suelo de la Rivera de Huelva con planta
TM Tasas de mineralización de la materia orgánica
TRIS Tris(hidroximetil)aminometano
SIR Respiración inducida por sustrato
SPW Soil pore water
ÍNDICE DE CONTENIDOS
I
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Resumen / Summary
I. INTRODUCCIÓN 1
I.1. DINÁMINCA DE LOS ELEMENTOS TRAZA (ET) EN EL SUELO 3
I.2. BIODISPONIBILIDAD DE ELEMENTOS TRAZA (ET) 6
I.2.1. Métodos experimentales de estimación de la biodisponibilidad de
contaminantes 7
I.3. ELEMENTOS TRAZA (ET) EN PLANTAS 10
I.4. RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR ELEMENTOS
TRAZA (ET) 11
I.4.1. Fitoestabilización 12
I.4.2. Fitoinmovilización 13
I.4.3. Fitoextracción 13
I.4.4. Fitovolatilización 15
I.4.5. Fitodegradación 15
I.5. RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON ELEMENTOS
TRAZA (ET) UTILIZANDO ÁRBOLES DE CRECIMIENTO RÁPIDO 15
I.6. CICLO DEL C Y N EN ZONAS FORESTALES 16
I.7. EFECTOS DE LA HOJARASCA Y DE LA RIZOSFERA EN LA
DINÁMICA DE ELEMENTOS TRAZA (ET) 19
I.8. CONCEPTO DE “CALIDAD DEL SUELO” 22
I.8.1. Indicadores de calidad del suelo 22
I.8.2. Importancia de los microorganismos en la calidad del suelo 23
I.8.3. Bioindicadores microbianos 24
I.8.3.1. Biomasa microbiana 24
I.8.3.2. Respiración microbiana 25
I.8.3.3. Actividades enzimáticas 26
II. OBJETIVOS 29
ÍNDICE DE CONTENIDOS
II
II.1. OBJETIVOS 31
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA 33
III.1. ÁREA DE ESTUDIO 35
III.2. MATERIALES 37
III.2.1. Suelos 37
III.2.2. Material Vegetal. Álamo blanco 39
III.2.2.1. Hojarasca 40
III.3. DISEÑO DE LOS EXPERIMENTOS 41
III.3.1. Experimento de Incubación en microcosmos 41
III.3.2. Experimento en Contenedores 42
III.3.3. Experimento de Campo 45
III.3.4. Preparación de muestras de suelos y plantas 45
III.4. DETERMINACIONES QUÍMICAS EN LOS SUELOS 46
III.4.1. Determinación del pH 46
III.4.2. Determinación del carbono orgánico total (COT) 46
III.4.3. Determinación del carbono hidrosoluble (CH) 46
III.4.4. Determinación del nitrato (NO3-N-) 46
III.4.5. Determinación del amonio (NH4-N+) 47
III.4.6. Determinación del nitrógeno Kjeldahl (N-Kjel) 47
III.4.7. Determinación de los elementos traza (ET) solubles en CaCl2 0,01M 47
III.4.8. Determinación de los elementos traza (ET) pseudototales 47
III.5. DETERMINACIONES BIOLÓGICAS EN EL SUELO 48
III.5.1. Determinación del carbono de la biomasa microbiana (CBM) 48
III.5.2. Determinación del nitrógeno de la biomasa microbiana (NBM) 49
III.5.3. Determinación de la actividad β-glucosidasa (β-gluc) 49
III.5.4. Determinación de la actividad proteasa 49
III.5.5. Determinación del potencial de nitrificación del suelo (Potencial
nitrification rate / PNR) 49
III.5.6. Determinación de la respiración microbiana 50
III.6. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL MATERIAL VEGETAL
(hojarasca y hojas) 51
III.6.1. Determinación del pH 51
ÍNDICE DE CONTENIDOS
III
III.6.2. Determinación del carbono orgánico total (COT) 51
III.6.3. Determinación de la lignina Klason (LIG) 51
III.6.4. Determinación del N-Kjeldahl (N-Kjel) 52
III.6.5. Determinación de nutrientes y elementos traza (ET) 52
III.7. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS 53
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS 55
IV.1. EVOLUCIÓN DEL pH 57
IV.2. EVOLUCIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE LOS ELEMENTOS
TRAZA (ET) 57
IV.3. PARÁMETROS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS 59
IV.3.1. Ciclo del C 59
IV.3.1.1. Carbono orgánico total (COT) y tasas de mineralización
de la materia orgánica (TM) 60
IV.3.1.2. Carbono hidrosoluble (CH) 61
IV.3.1.3. Carbono de la biomasa microbiana (CBM) 62
IV.3.1.4. Actividad β-glucosidasa (β-gluc) 63
IV.3.1.5. Respiración microbiana 63
IV.3.2. Ciclo del N 65
IV.3.2.1. Mineralización del nitrógeno orgánico 65
IV.3.2.2. Potencial de nitrificación del suelo (PNR) 69
IV.3.2.3. Actividad proteasa 70
IV.3. NUTRIENTES Y ELEMENTOS TRAZA (ET) EN ÁLAMO BLANCO 71
IV.4. SEGUIMIENTO DEL DESARROLLO DEL ÁLAMO BLANCO 74
V. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS 75
V.1. TRACE ELEMENT RICH LITTER IN SOILS. INFLUENCE ON
BIOCHEMICAL PROPERTIES RELATED TO CARCBON CYCLE
Madejón, P., Soler-Rovira, P., Ciadamidaro, L., Cabrera, F., Madejón, E., 2012.
Journal of Soils and Sediments 12: 663-673 77
ÍNDICE DE CONTENIDOS
IV
V.2. WHITE POPLAR (Populus alba L.) LITTER IMPACT ON CHEMICAL
AND BIOCHEMICAL PARAMETERS RELATED TO NITROGEN CYCLE
IN CONTAMINATED SOILS
Ciadamidaro, L., Madejón, P., Cabrera, F., Madejón, E. Forest Systems (En
prensa) 91
V.3. GROWTH OF POPULUS ALBA AND ITS INFLUENCE ON SOIL
TRACE ELEMENT AVAIALABILITY
Ciadamidaro, L., Madejón, P., Puschenreiter, M., Madejón, E., 2013. Science of the
Total Environment 454-455: 337-347 107
V.4. SOIL CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES UNDER
POPULUS ALBA GROWING: THREE YEARS STUDY IN TRACE
ELEMENT CONTAMINATED SOILS
Ciadamidaro, L., Madejón, P., Madejón, E., 2014. Applied Soil Ecology 73: 26-33 121
V.5. SOIL PLANT INTERACTION OF POPULUS ALBA IN
CONTRASTING ENVIRONMENTS
Ciadamidaro, L., Madejón, E., Robinson, B., Madejón, P., 2014. Journal of
Environmental Management 132: 329-337 131
VI. DISCUSIÓN GENERAL 143
VI.1. EVOLUCIÓN DEL pH 145
VI.2. EVOLUCIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE ELEMENTOS TRAZA
(ET) 146
VI.3. ESTADO NUTRICIONAL DE LAS PLANTAS DE ÁLAMO BLANCO 151
VI.4. MATERIA ORGÁNICA Y PROPIEDADES RELACIONADAS CON
EL CICLO DEL C EN EL SUELO 153
VI.4.1. Carbono orgánico total (COT) y tasas de mineralización (TM) 153
VI.4.2. Carbono hidrosoluble (CH) 154
VI.4.3. Carbono de la biomasa microbiana (CBM) 156
VI.4.4. Actividad enzimática β-glucosidasa (β-gluc) 157
VI.4.5. Respiración microbiana 158
ÍNDICE DE CONTENIDOS
V
VI.5. NITRÓGENO Y PROPIEDADES RELACIONADAS CON EL CICLO
DEL N EN EL SUELO 160
VI.5.1. Mineralización del N orgánico 160
VI.5.2. Potencial de nitrificación (PNR) 161
VI.5.3. Actividad enzimática proteasa 163
CONCLUSIONES 165
CONCLUSIONES 167
CONCLUSIONS 169
BIBLIOGRAFÍA 171
Resumen
La utilización de plantas en la recuperación de suelos contaminados por ET
tiene como finalidad estabilizar el suelo para evitar una dispersión física de
contaminantes y mejorar la calidad del mismo. Los árboles de la familia de las
Salicáceas se han usado como opción para la fitorrecuperación de suelos
contaminados con ET. Estas plantas tienen gran capacidad para acumular ET
(especialmente Cd y Zn) en su parte aérea y al ser plantas caducifolias, la caída
estacional de sus hojas da lugar a una alfombra de hojarasca rica en Cd y Zn.
La presente Tesis Doctoral está centrada en estudiar la influencia de un árbol
de la familia de las Salicáceas (Populus alba L., álamo blanco) sobre las propiedades
del suelo, en especial sobre las propiedades bioquímicas, que participan activamente
en la dinámica de la materia orgánica y de nutrientes del mismo. Con el fin de
evaluar los efectos de la hojarasca y del crecimiento de las plantas se han planteado
tres estudios: un experimento de incubación en condiciones controladas, un
experimento en contenedores en condiciones semi controladas y un estudio de
monitorización en condiciones de campo. Los tres experimentos se llevaron a cabo
en suelos procedentes de la Cuenca del río Guadiamar (Sevilla), zona contaminada
por un vertido minero en 1998, tras el cual se implementó un proyecto de
restauración a gran escala.
Los resultados conseguidos en estos tres ensayos han dado lugar cinco
publicaciones científicas que constituyen el núcleo de esta Tesis. En ellas se
describen los efectos de la hojarasca y de la rizosfera del Populus alba sobre la
dinámica de los ET en el suelo y sobre los parámetros relacionados con el ciclo del
carbono y del nitrógeno del suelo.
En las primeras dos publicaciones se presentan los resultados obtenidos en el
experimento de incubación en microcosmos y se profundiza en los efectos de la
hojarasca en los ciclos del carbono y del nitrógeno en suelos, prestando especial
atención a las propiedades bioquímicas del mismo como posibles indicadores de
estrés. Los principales resultados de este experimento demostraron que algunos
parámetros relacionados con los ciclos del C y del N (particularmente el carbono de
la biomasa, la respiración del suelo y el proceso de nitrificación) se vieron afectados
por la acidez y la disponibilidad de ET en suelos, evidenciando diferencias con los
suelos neutros contaminados o no. Los resultados también indicaron que la presencia
de hojarasca, incluso contaminada con ET, juega un papel fundamental en su
dinámica y en el ciclo de la materia orgánica.
Las publicaciones 3ª y 4ª presentan los resultados de la influencia del sistema
radical del álamo blanco y en menor medida de la materia orgánica procedente de la
hojarasca en la dinámica y biodisponibilidad de elementos traza en los suelos, así
como en la calidad del mismo, en un el experimento en contenedores. Para este
ensayo, aparte de llevar a cabo analísis químicos y bioquímicos del suelo (al igual
que en el experimento en microcosmos) se midieron parámetros relacionados con el
desarrollo de las plantas. Además, en los contenedores se instalaron “Rhizon
Samplers” (muestreadores de agua de poro) que permitieron la obtención de
muestras de solución del suelo (SPW) en la zona cercana a la rizosfera y conocer la
concentración de contaminantes en dicha zona. La biodisponibilidad de ET en dos
suelos contaminados también se midió mediante extracción con 0,01 M CaCl2.
Ambos métodos (concentración en SPW y extracción con la sal diluida) mostraron
resultados comparables y se correlacionaron con la respuesta de la planta. El pH del
suelo demostró ser el factor de mayor influencia en la biodisponibilidad de los ET
estudiados.
Los resultados demostraron que la rizosfera y la presencia de hojarasca
aumentaron el pH y estimularon las propiedades bioquímicas del suelo. Este efecto
fue especialmente notable en el caso del suelo ácido.
En la última publicación, se describe la monitorización de suelos y álamos
blancos en la zona de la Cuenca del río Guadiamar. Durante dos años, además de
evaluar los parametros químicos y bioquímicos del suelo como en los otros dos
ensayos, se estudiaron también los efectos de los ET en el estado nutricional de
álamos blancos en condiciones de campo. La experimentación de campo se centró
en esta especie arbórea que se viene muestreando desde 1999 en diversos puntos de
la Cuenca del Guadiamar. En las zonas de muestreo, las mismas donde se han
cogido los suelos para los otros dos experimentos, se han muestreado los suelos a
dos profundidades (0-20 cm y 20-40 cm), las hojas y la hojarasca. La influencia de
la contaminación del suelo en el estado nutricional de las plantas produjo ligeras
deficiencias nutricionales, sobre todo de potasio y fósforo, que estuvieron
acentuadas bajo condiciones de acidez, frecuentes en algunas zonas de estudio. A
pesar de la contaminación propia de los suelos analizados, sobre todo del suelo
ácido, en las hojas de álamo blanco se encontraron contenidos considerados
normales en plantas para todos los metales, excepto Cd y Zn. En los suelos
contaminados, a pesar del aporte de Cd y Zn por la hojarasca, las concentraciones
totales de ambos elementos no se vieron aumentadas.
En este seguimiento, se comprobó también como la adición de materia
orgánica, a través de los exudados de las raíces y de la hojarasca, contribuyó a la
mejora de la calidad del suelo. En general, este trabajo permitió a comprobar que
todos los resultados obtenidos en condiciones de incubación y de semicampo
presentaron el mismo comportamiento que en condiciones reales de campo.
Summary
The use of plants in the recovery of trace elements in contaminated soils has
been shown to stabilize the soil and prevent physical dispersion of pollutants,
improving soil quality. Trees in the family Salicaceae are often used in
phytoremediation because they have the capacity to accumulate trace elements
(especially Cd and Zn) in their above-ground biomass. Moreover, seasonal litter fall
from these deciduous species enriches the organic layer with Cd and Zn.
This Thesis focuses on the influence of white poplar (Populus alba) on soil
processes and the biochemical properties that influence organic matter content and
nutrient dynamics in these contaminated systems. In order to evaluate the effects of
litter decomposition and plant growth, three studies were performed: an incubation
experiment in controlled conditions, an experiment in containers in semi-field
conditions and a monitoring study in field conditions. All experiments were carried
out with soils from “ribera del río Guadiamar,” near Seville. This region was
contaminated by a mine spill in 1998, and a large-scale restoration project has since
been established.
The central body of the Thesis consists of five peer-reviewed publications
that investigated the effects of litter addition and root exudates in the rhizosphere of
P. alba and the parameters related to carbon and nitrogen cycles in soil.
The first two peer-reviewed publications used an incubation experiment to
examine litter effects on the carbon and nitrogen cycles. The results suggest that
biochemical properties are potential stress indicators in contaminated soils. Most
importantly, some parameters related with the C and N cycles (especially microbial
biomass, soil respiration and the nitrification process) were strongly affected by soil
acidity and trace element availability, underlining the differences between neutral
contaminated and neutral uncontaminated soils. Lastly, litter presence, even trace
element rich litter, played an important positive role in trace element dynamics and
organic matter cycling.
The third and fourth peer-reviewed publications examined the influence of
the poplar root sytem and, to a lesser extent, the influence of litter on the dynamics
and availability of trace elements, as well as the overall effect on soil quality. In this
container experiment, chemical and biochemical analyses were performed and plant
development was measured. “Rhizon Samplers” were installed in containers to
obtain samples from the soil solution (soil pore water, SPW) in the area close to the
rhizosphere to determine contaminant concentrations.
The availability of trace elements was also measured by extraction with 0.01
M CaCl2. The methods (SPW concentration and salt extraction) showed comparable
results that might be related with plant response. Soil pH was the main factor
influencing the trace element availability. The results underlined that root sytem and
litter presence increase pH and stimulate biochemical properties. This effect was
more appreciable in acidic soils.
The last peer-reviewed publication described the monitoring of soils and fast
growing trees in the “río Guadiamar” basin area. This two-year experiment
evaluated soil chemical and biochemical parameters, as the previous experiments, as
well as the effects of trace elements on poplar nutrition status in field conditions. P.
alba has been monitored in the basin since 1999. In the sampling points, as with the
previous experiments, soil samples were taken at two depths (0-20 cm and 20-40
cm), as well as leaves and litter samples. Soil contamination produced a slightly
nutritional deficiency, specifically in potasium and phosphorus and most
pronounced in acidic conditions. Despite heavy soil contamination, trace element
concentrations in poplar leaves were normal for all studied metals except for Cd and
Zn. In contaminated soils, despite the addition of high concentrations of Cd and Zn
by litter, the total concentrations of both elements were not increased. Lastly, this
monitoring study verified that the addition of organic matter via poplar root exudates
contributes to improve soil quality. In general, this study demostrated that all the
results obtained in the incubation and semifield experiments showed the same
behaviour than in field conditions.
I. INTRODUCCIÓN
I. INTRODUCCIÓN
3
I.1. DINÁMICA DE LOS ELEMENTOS TRAZA (ET) EN EL SUELO
El término “elemento traza” en el suelo se refiere a cualquier elemento
diferente de los ocho elementos básicos que constituyen las rocas de la biosfera (O,
Si, Al, Fe, Ca, Na, K y Mg) o también son aquellos componentes de la litosfera cuya
concentración es inferior a 0,1%, límite que puede variar en el caso de materiales
orgánicos (Adriano, 1986).
Los procesos de edafización “in situ” de los materiales geológicos, las
fuentes antropogénicas “ex situ” (actividades humanas: industrias, minería,
agricultura, transporte) y los procesos naturales (deposición aérea procedentes de
erupciones volcánicas, fuegos, tormentas de polvo y otros fenómenos) constituyen
las principales vías de entrada de ET en los ecosistemas terrestres. De ellas las que
tienen más peso en los “inputs” de entrada de ET a los suelos son sin duda las
fuentes antropogénicas (Campbell y col., 1983).
La figura I.1 ilustra el ciclo biogeoquímico de los ET en el suelo. Se destacan
una serie de procesos en los que profundizar:
Figura I.1. Ciclo biogeoquímico de los ET (adaptado de Alloway 1999).
a) Adsorción-desorción. En el suelo existen dos tipos de adsorción: la adsorción
electrostática o cambio iónico y la adsorción específica, también denominada
adsorción química o quimioadsorción. Las cargas se originan en los bordes de
fractura de los minerales de la arcilla, en la superficie de los óxidos de Fe y Al y en
I. INTRODUCCIÓN
4
la de la materia orgánica (humus).
El pH es uno de los principales factores que afecta a los procesos de
adsorción/desorción ya que existe un alto número de cargas dependientes del pH en
el suelo. Los ET en forma de especies catiónicas se adsorben normalmente con
mayor facilidad a medida que aumenta el pH, mientras que lo contrario sucede con
las especies aniónicas (Naidu y col., 2001). No obstante, a pH muy alcalino se
favorece la formación de complejos organo-metálicos solubles que pueden aumentar
la solubilidad de algunos ET como el Cu (Al-Wabel y col., 2002).
La textura del suelo también es importante, pues en aquellos suelos en los
que la fracción arcilla domina sobre las fracciones limo y arena, la adsorción es
mayor gracias a la mayor reactividad (mayor carga y superficie específica) que
presenta esta fracción (Porta y col., 1999). Según la composición del suelo existen
partículas con mayor número de cargas que otras, p.ej., las vermiculitas presentan
una carga neta mayor que las cloritas (Brady y Weil, 2002).
La competencia entre especies distintas de un mismo elemento y entre
elementos diferentes también desempeña un papel decisivo en las reacciones de
adsorción-desorción. Los cationes mayoritarios del suelo (Ca2+
, Mg2+
, Na+ y K
+,
junto con H+ y Al
3+ y demás especies protonadas del Al en suelos ácidos) compiten
con los ET catiónicos (Cd, Cu, Mn, Ni, Zn etc.) por los mismos sitios de adsorción
en el complejo de cambio (Brady y Weil, 2002). Al mismo tiempo, los propios ET
compiten entre sí por los sitios del complejo de cambio. Por otra parte, aquellos ET
que habitualmente se encuentran en forma de especies aniónicas como el As
(H2AsO4-
o H2AsO3) o el Se (SeO42-
), también pueden competir con otros aniones
como HPO42-
, PO43-
y SO42-
respectivamente (Reynolds y col., 1999).
b) Precipitación-disolución. Los mecanismos de precipitación-disolución
tienen lugar cuando se alcanza el producto de solubilidad de un determinado
compuesto y están principalmente influenciados por el pH y el potencial redox del
suelo (Ross, 1994a). La precipitación es el principal proceso de inmovilización de
ET catiónicos (Cd, Cu, Pb, Zn) debido a la presencia de aniones como sulfatos,
carbonatos, hidróxidos y fosfatos, especialmente cuando la concentración del
elemento en disolución es alta (Adriano, 2001). Por el contrario, otros elementos
como el As, Mo, Se, V y Cr que se encuentran mayoritariamente en forma de
aniones, aumentan su solubilidad al incrementar el pH (Adriano, 2001). Los
I. INTRODUCCIÓN
5
mecanismos de precipitación-disolución pueden verse también muy afectados por el
potencial redox del suelo ya que elementos como Fe, Mn, Cr, Cu, As, Ag, Hg y Pb
presentan diferentes estados de oxidación. Cuando las condiciones redox del suelo
cambian, la relación especies oxidadas/especies reducidas puede variar. La
movilidad de distintas especies de un mismo elemento puede cambiar
considerablemente, p.ej., el Cr (III) es menos móvil que el Cr (VI), mientras que el
As (III) es más móvil que el As (V). Bajo condiciones reductoras se favorece la
precipitación de determinados elementos, como el Cd, en forma de sulfuros
insolubles, en cambio, en condiciones oxidantes ocurre el proceso inverso y tiene
lugar la disolución de estos minerales y la consiguiente liberación de los ET (Ross,
1994b).
c) Complejación-quelatación. La formación de complejos orgánicos es uno
de los factores más importantes en el control de la solubilidad y la disponibilidad de
los ET en el sistema suelo-planta. Senesi (1992) considera 3 tipos de moléculas
orgánicas que pueden formar complejos con los ET:
Moléculas orgánicas de origen natural y de estructura y propiedades
químicas conocidas: los ácidos alifáticos, los polisacáridos, los aminoácidos y los
polifenoles.
Moléculas orgánicas de origen antropogénico derivadas de las actividades
agrícolas, industriales y urbanas.
Ácidos húmicos y fúlvicos que se acumulan en el suelo y cuyas estructuras se
desconocen con detalle.
La alta afinidad que presentan los constituyentes orgánicos del suelo para
formar complejos con los ET se debe a la elevada presencia de ligandos o grupos
funcionales que pueden formar enlaces con estos elementos (Harter y Naidu, 1995).
Los grupos funcionales más importantes son aquellos ligandos que contienen
oxígeno, es decir, los grupos carboxilo, fenol, alcohol y carbonilo. A la vez, la
configuración espacial de estos grupos también es importante, p.ej., dos grupos
carboxilos adyacentes en una cadena alifática, o configuraciones de tipo ftalato o
salicilato en anillos aromáticos, pueden aumentar la capacidad de complejación. La
facilidad para formar complejos es mayor a pH neutro o alcalino debido a la mayor
disociación de los grupos funcionales a ese pH. Según Adriano (2001), el orden de
afinidad de los ligandos por los metales es:
I. INTRODUCCIÓN
6
Cu2+
>Cd2+
>Fe2+
>Pb2+
>Ni2+
>Co2+
>Mn2+
>Zn2+
.
La formación de complejos organo-metálicos solubles tiene especial interés,
ya que permite mantener en disolución metales que serían insolubles a ese pH (Ross,
1994b) aumentando la biodisponibilidad. Sin embargo, a la vez, la formación de
estos complejos puede disminuir la biodisponibilidad de los metales para la planta,
dado que estos últimos se asimilan en forma de iones libres. Por el contrario, los
complejos organo-metálicos que forman los ET con los ácidos fúlvicos y húmicos
pueden disminuir la disponibilidad de los ET. Estos compuestos presentan altos
tiempos de permanencia en el suelo debido a una mayor resistencia a la degradación
microbiológica (Piccolo, 1989).
d) Procesos biológicos. La dinámica de los ET en el suelo no sólo depende
de las interacciones físico-químicas de los constituyentes inorgánicos y orgánicos,
sino también de la actividad microbiana asociada al sistema suelo-planta y de la
acción de las raíces (Adriano, 2001).
Los procesos biológicos, especialmente la contribución de la rizosfera, se
comentarán más adelante en la introducción de esta memoria.
I.2. BIODISPONIBILIDAD DE ELEMENTOS TRAZA (ET)
Un suelo se considera contaminado cuando la concentración de una
determinada sustancia sobrepasa los valores normales o de fondo que existen en esa
zona. Sin embargo, la presencia de un contaminante no implica necesariamente el
daño a un organismo o a la funcionalidad del propio suelo como sistema.
En principio, los ET externos al organismo no son perjudiciales para éste, sin
embargo, cuando un organismo los absorbe o asimila por encima de un nivel crítico,
los ET pueden ocasionarle efectos adversos. Para que un ET pueda ser asimilado por
un determinado organismo es necesario que dicho elemento se encuentre en forma
“biodisponible”. El concepto de “biodisponibilidad” puede variar de unas disciplinas
a otras, aunque puede definirse de forma genérica como la parte de aquel elemento o
especie química que es biológicamente accesible y que puede ser asimilado por un
organismo y reaccionar con su maquinaria metabólica (Campbell, 1995).
Vangronsveld y Cunningham (1998) consideran que la biodisponibilidad se refiere a
I. INTRODUCCIÓN
7
aquella fracción de la concentración total de un elemento que interacciona con un
determinado organismo.
En el suelo los metales pueden presentarse en distintas fracciones: (1) en
solución, como iones de metales libres y complejos metálicos solubles, (2)
adsorbidos en los sitios de intercambio de los constituyentes inorgánicos del suelo,
(3) ligados a la materia orgánica, (4) precipitados como óxidos, hidróxidos y
carbonatos, y (5) en formas residuales en las estructuras de los minerales silicatados
(Rieuwerts y col., 1998; Lasat, 2001; Reichman, 2002; Basta, 2004).
La biodisponibilidad de los ET es crucial en la ruta suelo-planta-animal. Sólo
los metales asociados con las fracciones 1 y 2 están realmente disponibles para que
los organismos vivos los extraigan, por ello, la concentración total de los metales en
el suelo no refleja necesariamente los niveles de metales biodisponibles (Elliot y
Shields, 1988; Sims y Kline, 1991; Ma y Rao, 1997; Rieuwerts y col., 1998; Lasat,
2001; Silveira y col., 2003).
Además de los factores citados anteriormente, la biodisponibilidad depende
también de la naturaleza del metal, su interacción con los coloides del suelo, las
propiedades del suelo y el tiempo de contacto del suelo con el metal (Naidu y col.,
2003).
I.2.1. Métodos experimentales de estimación de la biodisponibilidad de
contaminantes
Los métodos para la estimación de la biodisponibilidad de los contaminantes
en el suelo están principalmente basados en procedimientos especiales de extracción
físicos y químicos. El poder y la calidad de la evaluación dependen de las
condiciones experimentales y la plausibilidad de los procedimientos de extracción
usados (comparabilidad con la verdadera situación de exposición para el organismo
en el estudio).
Se pueden utilizar diferentes extractantes, algunos de ellos son:
a) Agua. Se determina así la fracción de contaminante soluble en agua. Los
extractos pueden usarse en test biológicos o simplemente se mide la concentración
en la solución. En el caso de la transferencia a la planta será una medida potencial de
la concentración de contaminante que puede ser absorbida por las raíces. Hay que
tener en cuenta que el agua con la que se realiza la extracción no es exactamente el
agua de la solución del suelo (esta habría que obtenerla mediante cápsulas porosas,
I. INTRODUCCIÓN
8
centrifugación o usando “muestreadores de agua de poro” o “rhizon samplers”) y
que puede subestimar alguna cantidad de contaminante potencialmente soluble o
intercambiable.
b) Sales neutras (CaCl2, MgCl2, NH4NO3). Numerosos estudios han probado
la adecuación de estas sales sobre todo cuando se trata de ET y plantas.
Recientemente se ha comprobado que esta extracción refleja con bastante exactitud
la transferencia potencial de ET desde el suelo hasta la planta (McLaughlin y col.,
2000; Pérez-de-Mora y col., 2006a; Madejón y col., 2006b).
c) Ácidos diluidos (HCl, H2SO4 + HCl, HNO3). Especialmente utilizados en
el caso de contaminación con ET. Se han usado con distinto éxito (Pérez-de-Mora y
col., 2007).
d) Disolventes orgánicos. Para la determinación de la biodisponibilidad de
contaminantes orgánicos se han empleado numerosos solventes (alcoholes, ácidos
orgánicos, detergentes, tetrahidrofurano, etc.). Muchos estudios han demostrado la
adecuación de los mismos para evaluar la biodisponiblidad de numerosos
contaminantes orgánicos para diferentes organismos (Krauss y col., 2000; Liste y
Alexander, 2002).
e) Agentes quelantes (EDTA, DTPA). Fundamentalmente para la estimación
de la biodisponibilidad de ET. Son capaces de extraer del suelo los ET disueltos y
los débilmente adsorbidos o intercambiables. Se ha encontrado que en ocasiones
sobrestiman la biodisponibilidad de ET en suelos (Pérez-de-Mora y col., 2006a).
f) Extracción de agua de poro (del inglés “soil pore water, SPW”). Se lleva a
cabo mediante muestreadores de humedad de la rizosfera (Rhizon samplers). Extrae
el agua de poro sin alterar el suelo y permite tomar la fase acuosa a la que está
expuesta la rizosfera (Beesley y col., 2010; Clemente y col., 2008).
g) Gradientes de difusión de membrana (“Diffusive gradients in thin-films,
DGT”). Es una técnica bastante novedosa y proporciona información sobre la
cinética de intercambio entre fase sólida y fase líquida. El flujo de ET a través de las
capas de DGT se mueve según el gradiente de concentración y se mantiene hasta
que la capa de resina se haya saturado. Al final la resina de gel se disuelve en una
disolución adecuada (1 mol/L HNO3 para los metales) y se analiza (Zang and
Davison, 1995).
h) Extracciones secuenciales. Los procedimientos de extracción secuencial
han sido ampliamente utilizados en la determinación de las diferentes formas de ET
I. INTRODUCCIÓN
9
en suelos, sedimentos (Khalid y col., 1981) y residuos (McGrath y Cegarra, 1992;
Tsadilas y col., 1995). Estos métodos emplean disoluciones y reactivos diferentes
para disolver los distintos componentes del suelo. El número de fracciones puede
variar según el método, aunque tradicionalmente se han distinguido las siguientes: a)
elementos fácilmente intercambiables o disponibles, b) elementos unidos a
carbonatos, c) elementos unidos a los óxidos de Fe y Mn, d) elementos unidos a la
materia orgánica y a los sulfuros y e) elementos en la fracción residual (Tessier y
col., 1979; Salomons y Förstner, 1980; Pickering, 1986). En la primera fracción se
encuentran las formas químicas más lábiles, mientras que en la fracción residual se
encuentran aquellas más fuertemente retenidas. En el resto de fracciones los ET
muestran un grado de retención variable en función de algunos factores, como el pH
y el potencial redox del suelo.
i) Otros métodos. Recientemente, se han propuesto otros tipos de test para
comprobar la biodisponibilidad de los contaminantes en el suelo, como los test
microbiológicos, los test con invertebrados y los test con plantas terrestres (Kamnev
y van der Lelie, 2000). La SETAC (Society of Environmental Toxicology and
Chemistry; 1999) sugiere que los biotest microbiológicos son los que ofrecen una
mejor perspectiva de la biodisponibilidad.
A pesar de su amplia utilización, las fracciones definidas en estos
procedimientos son completamente operacionales, por lo que la información que
proporcionan es básicamente cualitativa y los datos obtenidos deben considerarse
como orientativos. También es importante tener en cuenta que la utilización de
diferentes metodologías puede dar lugar a resultados muy distintos (Ramos y col.,
1994). Algunos problemas que surgen en este tipo de procedimientos,
independientemente del protocolo empleado se deben a: a) la selectividad limitada
de los extractantes empleados, b) la redistribución de los ET durante el proceso de
extracción o c) una sobrecarga del sistema químico si la concentración del elemento
es demasiado alta (Shuman, 1985; Pickering, 1986; Rauret y col., 1989). Al final los
propios organismos y, en nuestro caso, las plantas son las que proporcionan una
mayor información de la biodisponibilidad de los ET contenidos en el suelo.
I. INTRODUCCIÓN
10
I.3. ELEMENTOS TRAZA (ET) EN PLANTAS
Los nutrientes vegetales son aquellos elementos químicos que son necesarios
para el crecimiento y el desarrollo normal de las plantas. Estos nutrientes se toman
del suelo a través de las raíces o del aire a través de las hojas. Carbono, oxígeno e
hidrógeno, constituyen la mayor parte del peso seco de las plantas. Estos elementos
provienen del CO2 atmosférico y del agua. Les siguen en importancia cuantitativa el
N, K, Ca, Mg, P y S los cuales se absorben desde el suelo. Los elementos más
importantes para el crecimiento de las plantas se clasifican de la siguiente manera:
los macronutrientes como C, H, O, N, P, K, S, Ca y Mg aparecen en las plantas en
concentraciones superiores a lo 0,1% y los micronutrientes como Fe, Mn, B, Zn, Cu,
Co, Mo y Cl que están generalmente presentes en el suelo en cantidades suficientes
y las plantas los necesitan en dosis menores, con una concentración inferior a 0,1%
(Bargagli, 1998).
En general un elemento se considera esencial cuando tiene influencia directa
sobre el metabolismo de la planta y no puede ser reemplazado por otro en esa
función bioquímica específica. Los ET esenciales son B, Co, Cu, Fe, Mn, Mo y Zn y
son considerados oligoelementos o micronutrientes porque se requieren en pequeñas
cantidades, necesarias para que los organismos completen su ciclo vital (aunque a
concentraciones elevadas pueden resultar tóxicas para las plantas). Sin embargo,
concentraciones elevadas de elementos como Cd, Pb, Tl, Ga, Sb, Bi y Hg (elementos
sin función biológica conocida) son siempre tóxicas para las plantas (Adriano, 1986;
Kabata-Pendias y Pendias, 1992; Markert, 1992).
Para superar el problema de los ET existen diferentes mecanismos de
resistencia o tolerancia que pueden variar en función de la especie vegetal, de la fase
de crecimiento en que se encuentre, órgano o tejido, elemento traza, tiempo de
acción, concentración y muchos otros factores exógenos y endogénos (Siedlack y
col., 2001).
Según Baker (1981) las plantas superiores se clasifican en tres grandes
grupos, dependiendo de los mecanismos de resistencia a los ET:
a) Plantas exclusoras: mantienen una baja concentración de metales en su parte
aérea (relación metal en la parte áerea: metal en la raíz <1).
I. INTRODUCCIÓN
11
b) Plantas acumuladoras: acumulan los ET en su parte aérea incluso a bajas
concentraciones, gracias a un trasporte eficaz desde la raíz (relación metal en
la parte áerea: metal en la raíz >1).
c) Plantas indicadoras: la concentración interna del metal refleja su
concentración externa, mediante la regulación de la absorción y transporte a
la parte aérea (relación metal en la parte áerea: metal en la raíz = 1).
Asimismo, existen plantas denominadas hiperacumuladoras, que son capaces
de acumular ET a concentraciones extremadamente elevadas: más del 1% para Mn y
Zn, 0,1% para Cu, Co, Cr, Ni y Pb, 0,01% para Cd, y 0,0001% para el Au (Baker y
Brooks, 1989). En general este tipo de plantas pueden acumular un determinado
metal y no varios.
I.4. RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS POR ELEMENTOS
TRAZA (ET)
La recuperación de suelos contaminados con ET supone una difícil tarea por
varias razones: a) la toxicidad de los mismos, b) su resistencia (no pueden ser
degradados por los microorganismos al contrario que los contaminantes orgánicos) y
c) su relativa inmovilidad en el suelo (Kabata-Pendias, 2001). Por tanto, la
contaminación con metales pesados y metaloides es permanente y la completa
remoción de estos elementos del suelo es prácticamente imposible.
La selección de la técnica o conjunto de técnicas a aplicar para recuperar un
suelo contaminado, depende fundamentalmente del nivel de limpieza deseado, del
plazo de duración de las tareas de limpieza, de la cantidad y de la forma de los
contaminantes, de las características de la zona afectada y del coste (Adriano, 2001).
Entre las estrategias para la recuperación de suelos contaminados con ET cabe
destacar: la remoción o retirada, la contención, la descontaminación (ex situ o in
situ) y la estabilización (in situ). Por otro lado se pueden considerar tres grupos de
técnicas distintas para la recuperación de un suelo contaminados con ET: físicas,
químicas y biológicas.
Las técnicas biológicas consisten en potenciar el desarrollo de los
microorganismos con capacidad para la degradación de contaminantes (en caso de
contaminantes orgánicos), biorrecuperacion, o están basadas en el uso de plantas
I. INTRODUCCIÓN
12
que favorecen los procesos de retención, extracción o degradación de los
contaminantes en el suelo, restaurando su estructura y funciones, fitorrecuperación
(Chaney y col., 1997; Salt y col., 1998). Esta técnica también se puede usar para
descontaminar aguas subterráneas poco profundas (rizofiltración). Dentro de los
procesos biológicos, la fitorrecuperación ha adquirido una gran relevancia en la
última década debido a su bajo coste, escasos requerimientos técnicos y a su
potencial para llevarse a cabo “in situ” (Baker y Brooks, 1989; Cunningham y col.,
1995). Baker y col. (1991) definen las técnicas de fitorrecuperación como el uso de
plantas para el tratamiento de suelos contaminados química o radioactivamente.
Fundamentalmente existen 5 procesos por los que las plantas pueden ser empleadas
para la recuperación de suelos y sedimentos contaminados (Cunningham y col.,
1995; Salt y col., 1995; Ali y col., 2013): fitoestabilización, fitoinmovilización,
fitoextracción, fitodegradación y fitovolatilización. Los dos primeros son técnicas de
estabilización o retención, mientras que las tres últimas se pueden considerar
técnicas de extracción (Figura I.2).
Figura I.2. Procesos de fitorremediación. Imagen tomada desde
http://www.hemp.com/2012/06/soil-contamination-phytoremediation-with-hemp/.
I.4.1. Fitoestabilización
La fitoestabilización consiste en el uso de plantas tolerantes a los elementos
contaminantes para estabilizar mecánicamente el suelo y prevenir el transporte de
los contaminantes a zonas no contaminadas, ya sea suelo, aguas subterráneas o
superficiales. Las raíces estabilizan mecánicamente el suelo, mientras que la parte
aérea de la planta disminuye la erosión de la superficie por la acción del agua y del
viento (Bolan y col., 2011). La transpiración de las plantas puede reducir además el
I. INTRODUCCIÓN
13
riesgo de infiltración hacia las aguas subterráneas. El requisito fundamental de las
plantas fitoestabilizadoras es que sean tolerantes a concentraciones elevadas de ET
en los suelos y que no los acumulen en su parte aérea (Dickinson y col., 2009). El
desarrollo de una cubierta vegetal junto con el crecimiento radical resultante y el
suministro de materia orgánica a través de los distintos restos vegetales pueden
producir cambios beneficiosos, como la agregación del suelo y además la propia
materia orgánica puede formar compuestos estables con los contaminantes
reduciendo su solubilidad (Pulford y Watson, 2003). La fitoestabilización es una
técnica reconocida para la recuperación de suelos contaminados pero aún requiere
ulteriores estudios. Además, en la selección de las especies vegetales para
fitoestabilización, hay que elegir especies autóctonas que sean capaces de sobrevivir
a largo plazo (Bolan y col, 2011).
I.4.2. Fitoinmovilización
Consiste en la inmovilización de los contaminantes en la zona de las raíces
mediante procesos de adsorción/absorción, precipitación/formación de compuestos
insolubles y/o la alteración de las características del suelo que afectan a la movilidad
de los contaminantes. Esta técnica se aplica generalmente a contaminantes (p.ej., Pb
e hidrocarburos poliaromáticos) que forman compuestos insolubles y/o son
fuertemente adsorbidos, en situaciones que a priori favorecen la inmovilización,
como un alto contenido en arcilla o materia orgánica en el suelo (Cunningham y
col., 1995).
I.4.3. Fitoextracción
Se basa en la utilización de plantas capaces de tolerar y acumular ET a altas
concentraciones en la parte aérea de manera que la biomasa se pueda cortar y
eliminar o tratar para recuperar si el elemento acumulado es de interés (Brown y
col., 1994). Para que este tipo de técnicas sean eficaces las plantas extractoras deben
ser capaces de crecer en suelos contaminados, acumular ET y ser resistentes a plagas
y enfermedades (Salt y col., 1998; Bhargava y col., 2012).
La mayor parte de los estudios de fitoextracción hasta la fecha se han basado
en la identificación y en el uso de plantas hiperacumuladoras. Estas plantas tienen la
habilidad natural de acumular ET como Ni, Zn, Cu y Mn a elevadas concentraciones
en su parte aérea (0,1-5 % de la masa foliar) (Chaney y col., 1997). A pesar de que
I. INTRODUCCIÓN
14
algunos trabajos han demostrado la eficacia acumuladora de algunas especies, este
tipo de técnicas presenta múltiples inconvenientes para constituir una verdadera
alternativa a los métodos de recuperación existentes: a) generalmente las plantas
hiperacumuladoras desarrollan poca biomasa, b) sólo son capaces de acumular uno o
dos elementos, por lo que no son eficaces en suelos contaminados con varios
elementos, c) la eficacia de la extracción disminuye tras cada cosecha ya que, con el
tiempo, los elementos se reponen en la disolución del suelo con mayor lentitud y d)
esta técnica implica un alto riesgo de entrada de los contaminantes en la cadena
trófica si no se controla la herbivoría (Clemente y col., 2005; Bhargava y col.,
2012). En cualquier caso y a pesar de estas desventajas existen varias estrategias
para hacer más viables los procesos de fitoextracción (Vangronsveld y col., 2009).
Introducir agentes quelantes. Una de las tendencias actuales en fitoextracción
es el uso de agentes quelantes como el AEDT o ácidos orgánicos que
favorecen la absorción de ET por la planta (fitoextracción asistida) (Leštan y
col., 2008). Los quelatos formados suelen ser estables y no liberan los
elementos a su estado libre, salvo que ocurra un cambio brusco del pH. No
obstante, esta “fitoextracción asistida” parece poco viable, puesto que es
necesario que el metal se acumule a altas concentraciones en la planta, y por
otra parte, al aumentar la movilidad de los ET para facilitar la absorción por
la planta, puede incrementar la infiltración de éstos hacia horizontes del suelo
más profundos y, en consecuencia, provocar la contaminación de las aguas
subterráneas (Kahn y col., 2000).
Árboles de crecimiento rápido y producción de biomasa. La implantación de
plantas arbóreas y arbustivas en zonas deterioradas y contaminadas, tiene
beneficios en la calidad del suelo, pero también se puede obtener un valor
industrial: ya sea obtención de energía u obtención de otros recursos. Esta
estrategia combina técnicas de fitorecuperación y obtención de bioenergía,
evitando la degradación del suelo por acción hídrica o eólica y es igual de
válida en cualquier tipo de suelo degradado. La obtención de energía
mediante el uso de árboles de crecimiento rápido como los árboles de la
familia de las Salicáceas, que son capaces de acumular Cd y Zn está siendo
muy estudiada (Robinson y col., 2000; Madejón y col., 2004; Lepp y
Madejón, 2007).
I. INTRODUCCIÓN
15
I.4.4. Fitovolatilización
Consiste en el uso de plantas que absorben los contaminantes del suelo y los
transforman en especies volátiles (Wenzel y col., 1999). Esta técnica se puede
emplear en la descontaminación de suelos contaminados con algunos ET (volátiles),
haluros y compuestos orgánicos.
I.4.5. Fitodegradación
Los contaminantes son absorbidos y transportados a la parte aérea de la
planta donde se degradan a metabolitos no tóxicos, o rizodegradación si se degradan
a nivel de la raíz. Esta técnica se aplica para contaminantes orgánicos ya que los ET
no se pueden degradar.
I.5. RECUPERACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON ELEMENTOS
TRAZA (ET) UTILIZANDO ÁRBOLES DE CRECIMIENTO RÁPIDO
La implantación de plantas arbóreas y arbustivas de crecimiento rápido en
zonas deterioradas y/o contaminadas es importante por los beneficios que se
obtienen sobre la calidad del suelo, prevención de la erosión del mismo, adición de
materia orgánica con la caída estacional de hojas y enriquecimiento y diversidad de
los microorganismos del suelo (Azzarello y col., 2011; Mertens y col., 2007).
Además de los efectos beneficiosos para el suelo, la biomasa de estos árboles
(tronco y ramas) podría ser usada como una posible fuente de energía (ej. extracción
de biocombustibles) (Pérez y col., 2014).
Existen árboles de crecimiento rápido, como por ejemplo los de la familia de
las Salicáceas, que tienen cierta capacidad para acumular ET (especialmente Cd y
Zn) sin llegar a ser consideradas plantas hiperacumuladoras. Este tipo de árboles
como el álamo y el sauce podrían ser, y de hecho están siendo ya implantados en
numerosas partes del mundo afectadas por la contaminación de ET (Robinson y col.,
2000; Vandecasteele y col., 2002; Mertens y col., 2004; Meers y col., 2005; Lepp y
Madejón, 2007; Madejón y col., 2013).
Para los árboles de hoja caduca, como el álamo blanco, la caída estacional de
las hojas es un factor importante una vez que han alcanzado un mínimo desarrollo.
La hojarasca o “litter” constituye la vía de entrada principal de los nutrientes en el
suelo y es uno de los puntos claves del reciclado de la materia orgánica y de los
I. INTRODUCCIÓN
16
nutrientes. La materia orgánica procedente de la descomposición de la hojarasca
mejora la capacidad de infiltración e incrementa la capacidad de retención de agua
del suelo. Además constituye una fuente de C, de otros nutrientes y de energía para
los microorganismos (Tate, 1987) y puede llegar a cubrir entre un 60 y 80% de los
requerimientos nutricionales de la planta para el siguiente año.
I.6. CICLOS DEL C Y N EN SUELOS EN ZONAS FORESTALES
El carbono es un elemento fundamental para la vida y su ciclo está
relacionado con todos los sistemas, estando implicado en la actividad del suelo, de
las plantas y con la vida de todos los animales, incluyendo los humanos (Figura I.3).
La reserva fundamental de carbono, en moléculas de CO2 que los seres vivos
puedan asimilar, es la atmósfera y la hidrosfera. En la atmósfera existe una
concentración de más del 0,03% y cada año aproximadamente un 5% de estas
reservas de CO2 se consumen en los procesos de fotosíntesis, es decir que todo el
anhídrido carbónico se renueva en la atmósfera cada 20 años (Sedjo, 1993).
Figura I.3. Ciclo del Carbono en suelos en zonas forestales. Imagen tomada desde
http://www.rsc.org/Education/Teachers/Resources/jesei/oceans/home.htm
I. INTRODUCCIÓN
17
Las plantas asimilan CO2 de la atmósfera y, mediante el proceso de
fotosíntesis, la energía generada del sol es capturada a través del enlace C-C de
moléculas orgánicas. Algunas de estas moléculas orgánicas se utilizan como fuente
de energía (respiración) por las mismas plantas (sobre todo de las raíces) y por los
microorganismos y así el carbono vuelve a la atmósfera como CO2. El material
orgánico restante se utiliza como reserva temporal constituyente de la vegetación.
La mayor parte de este material volverá al suelo como hojarasca de la planta, como
raíces descompuestas, o será aprovechado por el hombre cuando se trata de
explotaciones agrícolas o forestales.
El equilibrio en la producción (respiración) y consumo de CO2 por medio de
la fotosíntesis hace posible la vida (Janzen, 2004). Sin embargo, las actividades
antropogénicas como labores agrícolas intensivas, la deforestación y cambios de uso
del suelo y otras acciones pueden alterar este equilibrio.
El N del suelo deriva originalmente del gas N atmosférico (N2). Los
microorganismos del suelo, sean libres o asociados simbióticamente con plantas,
fijan N2 produciendo N orgánico en forma de grupos aminos (-NH2) en las proteínas,
formando parte de la materia orgánica del suelo. Una de las características
principales del ciclo del N es su transformación continua desde la fase orgánica (N
insoluble) a la fase inorgánica o mineral (N soluble) a través de los procesos de
mineralización e inmovilización respectivamente, realizados por la biomasa
microbiana. Ambos procesos ocurren simultáneamente en el suelo; si el efecto neto
es un incremento o disminución del N mineral disponible para las plantas depende
principalmente de la relación carbono C/N en los residuos orgánicos que se
degradan o descomponen en el suelo. Además, las transformaciones (‘turnover’) de
otros nutrientes, especialmente el fósforo (P) y el azufre (S), están estrechamente
asociadas a las transformaciones bioquímicas del N (Stevenson y Cole, 1999).
Los procesos principales que componen el ciclo del nitrógeno son cinco: la
fijación, la mineralización, la toma de nitrógeno (crecimiento de organismos), la
nitrificación y la desnitrificación (Figura I.4). Al igual que el ciclo del carbono, el
ciclo del nitrógeno consiste en varios compartimentos de almacenamiento de
nitrógeno y de procesos en los que se intercambia nitrógeno. En particular, la
descomposición de la materia orgánica convierte parte del N orgánico en N-mineral,
I. INTRODUCCIÓN
18
de ahí el término mineralización, denominación que se aplica a los iones amonio,
NH4+, nitrito, NO2
- y nitrato, NO3
- (Patrick, 1982).
El N mineral es absorbido por las plantas, principalmente en forma NO3- e
iones NH4+, o asimilado por los microorganismos y convertido a N orgánico. El
suministro de nitrógeno estimula el crecimiento y desarrollo de la raíz, así como la
absorción de otros nutrientes. Además, los efectos de los iones nitrato y amonio en
el pH del entorno de las raíces influyen en la absorción de los otros nutrientes, tales
como fosfatos (Mekonnen y col., 1997).
Los microorganismos, particularmente las bacterias, juegan un importante
papel en las principales transformaciones del nitrógeno. Estas transformaciones
ocurren generalmente más rápidamente que los procesos geológicos y la velocidad
del proceso puede estar afectada por factores ambientales como la temperatura, la
humedad y la disponibilidad de recursos para la actividad microbiana o por factores
como las propias características del suelo (pH, contaminación, textura...) (Prasad y
Power, 1995).
Figura I.4. Ciclo del Nitrógeno en suelos en zonas reforestadas. Imagen tomada desde
http://www.monografias.com/trabajos82/procesos-microbiologicos-actividad-
agropecuaria/procesos-microbiologicos-actividad-agropecuaria5.shtml
I. INTRODUCCIÓN
19
I.7. EFECTOS DE LA HOJARASCA Y DE LA RIZOSFERA EN LA
DINÁMICA DE ELEMENTOS TRAZA (ET)
Como ya se ha comentado, la descomposición de la hojarasca es un proceso
muy importante en el ciclo de nutrientes de los ecosistemas forestales, ya que es la
vía principal de restitución natural de estos elementos al suelo (Graça y col., 2005).
Como se ha indicado en el caso de las Salicáceas, tratándose también de árboles de
hoja caduca, su implantación en zonas contaminadas con ET daría paso, tras la caída
otoñal, a la presencia de una extensa ‘alfombra’ de hojarasca que en este caso estaría
cargada además de los nutrientes fundamentales para las plantas, de ET. La retirada
total de esta ‘alfombra’ de hojarasca no siempre es viable en zonas amplias. Bajo
estas circunstancias, es normal que se acumulen grandes cantidades de hojas bajo la
copa del árbol, aspecto que sería interesante controlar (Mertens y col., 2007),
especialmente cuando se deposita en suelos de zonas contaminadas. Habría que
tener en cuenta y estudiar en profundidad dos procesos distintos pero a la vez
íntimamente relacionados:
1) La descomposición de la hojarasca, que puede reducirse drásticamente,
limitando así el curso normal del ciclo de nutrientes (Bååth y col., 1998).
Como se ha comentado, la descomposición de la hojarasca es un proceso
clave y está influenciado fundamentalmente por las características del suelo
(Heal y col., 1997), las características ambientales dominantes y por la
actividad de los microorganismos (Jenkinson y col., 1991; Berg y Matzner,
1997; Gillon y col., 1999). Los procesos de degradación y transformación de
la hojarasca en el suelo pueden verse fuertemente afectados por la
contaminación de ET (Kandeler y col., 1996). Existen fundamentalmente dos
hipótesis por las que explicar esta ralentización del proceso de degradación.
Por una parte la toxicidad de la solución de suelo para la microflora de suelo
(Bååth y col., 1998) y por otra parte la propia naturaleza de la materia
orgánica, rica en metales pesados más resistente a la biodegradación
(Boucher y col., 2005). A determinadas concentraciones, los ET pueden
constituir un riesgo para el funcionamiento de los ecosistemas (Majer y col.,
2002), alterando negativamente los procesos biológicos de los mismos (Lee y
col., 2002). La acumulación de ET en el suelo puede reducir la biomasa
microbiana (Chander y col., 1995) y varias actividades enzimáticas dando
I. INTRODUCCIÓN
20
lugar a una disminución de la diversidad funcional (Kandeler y col., 1996), y
a cambios en la estructura de la comunidad microbiana (Pennanen y col.,
1998). No obstante, la presencia de ET en el suelo, también puede propiciar
el desarrollo de poblaciones tolerantes a los mismos (Ellis y col., 2003).
2) La dinámica de los contaminantes puede verse muy influenciada por la
materia orgánica. Los efectos a medio y largo plazo de la hojarasca sobre la
dinámica de los contaminantes no se conocen con precisión. En principio, la
materia orgánica favorece la precipitación de los ET reduciendo su
biodisponibilidad. Esto es aplicable también a aquellas otras que favorecen la
formación de complejos organo-metálicos insolubles (Li y col., 2001;
Adriano y col., 2004). Sin embargo, la mineralización de la materia orgánica
puede liberar también ET en formas biodisponibles (Azevedo Silveira y col.,
2003) y podría actuar como una “bomba química de relojería”. Por esta
razón, es necesario un seguimiento del estado de los ET en el suelo, así como
de su biodisponibilidad.
Por consiguiente, los estudios de la dinámica de metales y de degradación de
la materia orgánica de la hojarasca han de ir unidos cuando se estudian especies de
crecimiento rápido y hoja caduca en suelos contaminados.
Además de la importancia de la hojarasca, hay que tener en cuenta en los
procesos de recuperación de suelos contaminados con ET, la acción de la rizosfera, o
sea la zona del suelo que está significativamente influenciada por el sistema radical
de las plantas y que suele extenderse unos 2 mm desde la superficie de las raíces. En
esta zona tan particular del suelo tienen lugar muchos procesos que nos ayudan a
explicar los mecanismos de defensa de las plantas (Figura I.5). Por ejemplo, algunas
plantas tienen la capacidad de modificar el pH y condiciones redox dando lugar a
procesos de precipitación de algunos ET (Hinsinger, 1998). En residuos mineros
contaminados se ha comprobado que en la rizosfera de especies tolerantes a Pb y Zn
como Agrostis capillaris L., pueden precipitar metales como Pb en forma de
piromorfita (fosfato insoluble) (Cotter-Howells y Caporn, 1996). Los procesos redox
son también muy importantes en las estrategias de fitorecuperación. Según Salt y
col. (1995), algunas variedades de Brassica pueden reducir el Cr (VI) a Cr (III) que
es menos móvil y tóxico a nivel de la rizosfera. Además, estas plantas pueden
excretar sustancias orgánicas a la rizosfera y limitar la movilidad de ET mediante la
formación de complejos insolubles (Marschner, 1995; Greger, 1999). El mucílago
I. INTRODUCCIÓN
21
excretado por células epidérmicas y del extremo de la raíz para proteger la zona
apical de la desecación, entre otras funciones, puede limitar la entrada de ET debido
a su elevada capacidad de cambio y a su gran capacidad para formar complejos
insolubles con metales pesados como Cd, Cu y especialmente Pb (Marschner, 1995).
También hay que tener en cuenta que los exudados radicales pueden potenciar la
absorción de determinados elementos y su movilidad en el suelo (Siedlecka y col.,
2001; Teuchies y col., 2013; Tiwari y col., 2013).
Además de todos los cambios físico-químicos que se producen en la rizosfera
existen también una serie de cambios en las propiedades biológicas y bioquímicas de
suelo (Cesarz y col., 2013; Li y col., 2013). Esta zona es el ambiente preferido por
muchos microorganismos del suelo, en la que viven aproximadamente 1,2 * 1011
células por cm3. Las poblaciones microbianas rizosféricas parecen tener un
importante impacto en la fitorecuperación de suelos contaminados por metales
pesados y metaloides. Estas poblaciones afectan la movilidad y captación del metal
en la planta por liberación de agentes quelantes, acidificación del suelo,
solubilización de fosfatos y reacciones redox, además de producir fitohormonas que
promueven el crecimiento vegetal.
Figura I.5. Procesos a nivel de la rizosfera (adaptado de Rajkumar y col., 2012).
I. INTRODUCCIÓN
22
I.8. CONCEPTO DE “CALIDAD DEL SUELO”
El suelo cumple un papel fundamental en el equilibrio global de la tierra, ya
que representa la interfase entre la litosfera, la atmósfera, la hidrosfera y la biosfera,
haciendo posible el crecimiento de las plantas suministrándoles anclaje, agua y
nutrientes, y por ello la vida en el planeta en su forma actual.
El concepto de “calidad del suelo” ha adquirido un gran interés, debido al
papel crucial que desempeña el suelo, no sólo en la producción vegetal y animal,
sino también en la calidad medioambiental. La “calidad del suelo” hace referencia a
la capacidad que tiene el propio suelo para funcionar dentro de los límites del
ecosistema y sustentar la productividad biológica, para mantener la calidad
medioambiental y promover la salud de las plantas y los animales (Doran y Safley,
1997).
Para establecer la “calidad de un suelo” hay que tener en cuenta propiedades
biológicas, físicas y químicas mientras que la salud de suelo depende principalmente
de sus características ecológicas (Papendick y col., 1992; García y col., 1994). Un
ecosistema saludable está definido por la integración de los ciclos de los nutrientes y
flujos de energía, y por la estabilidad y elasticidad frente a una alteración o estrés
(Bone y col., 2010).
I.8.1. Indicadores de calidad del suelo
La identificación de indicadores que permitan monitorizar o predecir el efecto
de los contaminantes o la toxicidad de los mismos en la calidad del suelo resulta
fundamental. La dificultad de esta tarea radica en que el suelo es una entidad
dinámica con multitud de procesos biológicos y geoquímicos que muestran una
elevada heterogeneidad espacial y temporal, y con mecanismos de control que
cambian según la escala espacio-temporal (NRCS, 2004).
Según la NRCS (2004) los indicadores de la calidad del suelo deben cumplir
las siguientes condiciones:
ser fáciles de medir
ser sensibles al estrés
responder de forma predecible
tener capacidad de anticipación, es decir, adelantarse al cambio más o
menos reversible
I. INTRODUCCIÓN
23
tener una baja variabilidad “natural” en su respuesta.
Los indicadores pueden dividirse en:
Físicos: las características físicas del suelo son una parte necesaria en la
evaluación de la calidad de este recurso porque no se pueden mejorar
fácilmente (Singer y Ewing, 2000). Existen distintos indicadores físicos de la
calidad del suelo que varían de acuerdo a las características predominantes
en el lugar de estudio. Doran y Parkin (1994) seleccionaron como
indicadores la textura, profundidad, tasa de infiltración de agua del suelo,
densidad aparente y capacidad de retención agua.
Químicos: los indicadores químicos se refieren a condiciones que afectan las
relaciones suelo-planta, la calidad del agua, la capacidad amortiguadora del
suelo y la disponibilidad de agua y nutrientes para las plantas y
microorganismos (SQI, 1996). Algunos indicadores son el pH y la
conductividad eléctrica, el carbono orgánico total y lábil, el nitrógeno
mineralizable, la disponibilidad de nutrientes y capacidad de intercambio
catiónico.
Biológicos: los indicadores biológicos integran los diferentes factores que
afectan la calidad del suelo. Generalmente se refieren a la abundancia y
actividad de los organismos, incluidos bacterias, hongos, nematodos,
lombrices, anélidos y artrópodos (Bautista y col., 2004).
I.8.2. Importancia de los microorganismos en la calidad del suelo
La diversidad microbiana del suelo recibe mayor atención que el resto de
parámetros, especialmente en la monitorización de los cambios del medio-ambiente
(Brookes, 1995; Demoling y Bååth, 2008). A diferencia de otros seres vivos, los
microorganismos tienen la capacidad de adaptarse rápidamente en caso de estrés
ambiental (Schimel y col., 2007) y eso podría reflejarse, contemporáneamente, en un
cambio de las condiciones del suelo. La importancia de los microorganismos en
ambientes naturales deriva de su cantidad, diversidad y, sobre todo, de su gran
espectro de actividades.
Debido a su importancia en la funcionalidad del suelo, la actividad y la
población microbiana se han considerado como indicadores útiles para evaluar tanto
I. INTRODUCCIÓN
24
la mejora como la degradación del mismo (Pankhurst y col., 1995; Dick y col.,
1996).
Los microorganismos son vitales para mantener la “calidad del suelo”, ya
que tienen un papel destacado en la fertilidad y producción primaria del suelo y por
sus funciones relacionadas con la descomposición de la materia orgánica y el ciclo
de nutrientes (Alexander, 1977).
Asimismo, los microorganismos pueden verse afectados por cambios en las
propiedades físico-químicas (pH, potencial redox, materia orgánica, textura,
estructura etc.), biológicas (poblaciones, interacciones entre organismos) y/o por la
presencia de contaminantes (metales pesados y metaloides, xenobióticos), por lo que
han sido frecuentemente empleados como “bioindicadores” de la calidad del suelo
en programas de monitorización medioambiental (Nielsen y Winding, 2002).
Son muchos los estudios centrados en los comportamientos de las
poblaciones microbianas bajo condiciones de estrés debido a metales pesados,
destacando a aquellos que ponen de manifiesto el potencial de los parámetros
microbianos para monitorizar la contaminación por metales pesados (Brookes, 1995;
Pérez-de-Mora y col., 2006b; Liao y Xie, 2007; Wang y col., 2007).
I.8.3. Bioindicadores microbianos
El “bioindicador” ideal debería ser fácil de medir, servir para todo tipo de
ecosistemas y ser capaz de revelar cuál es el posible problema que ocurre en un
determinado suelo. Sin embargo, parece ser que no existe un único bioindicador o
bioindicador universal, debido a la multitud de componentes microbiológicos y a las
numerosas rutas bioquímicas existentes. Generalmente, son varios los parámetros
biológicos que se tienen en cuenta para evaluar la calidad del suelo (Carter y col.,
1999), aunque no existe un consenso acerca de cuáles son los mejores (Gil-Sostrés y
col., 2005).
Algunos bioindicadores relacionados con la microflora del suelo se detallan a
continuación.
I.8.3.1 Biomasa microbiana
La biomasa microbiana es el componente más activo del suelo, forma parte
del “pool” de la materia orgánica y cumple una importante función en la
descomposición del humus, ya que interviene en los procesos de mineralización de
I. INTRODUCCIÓN
25
nutrientes (Duchaufour, 1984), y una vez muertos ponen a disposición de otros
microorganismos y de las plantas los nutrientes contenidos en los restos microbianos
(Jenkinson y Ladd, 1981). Por otro lado, también participan en la inmovilización de
los contaminantes. Así, los ciclos de algunos nutrientes mayoritarios, como el
carbono, demuestran que la biomasa microbiana es clave en la dinámica de los
nutrientes esenciales en el sistema edáfico; por ello, algunos autores afirman que la
biomasa microbiana y su actividad en el suelo puede ser empleada como índice de
comparación entre sistemas naturales o como indicador de las variaciones sufridas
en el equilibrio de un suelo debido a la presencia de agentes nocivos o a su manejo
(Doran y col., 1994). De las distintas poblaciones microbianas las bacterias son las
más abundantes en el suelo. Su número, es muy variable pero se ha calculado que,
en un gramo de suelo, pueden vivir desde unos pocos centenares de millares a
algunas decenas de millones de unidades. Además su actividad metabólica es tan
grande que pueden desprender en una hora, a través del proceso respiratorio, varios
kilos de dióxido de carbono por hectárea. Gracias a su amplia diversidad las
bacterias juegan un papel fundamental y, muchas veces, único en el ecosistema
(Zhou y col., 2003). Dentro de las propiedades químicas que favorecen la actividad
bacteriana se encuentra un pH cercano a la neutralidad, altos contenidos de materia
orgánica y alta disponibilidad de los elementos necesarios para su metabolismo.
I.8.3.2 Respiración microbiana
La respiración del suelo es un proceso que refleja la actividad biológica del
mismo y se determina a través del desprendimiento de CO2 o el consumo de O2
resultante del metabolismo de los organismos vivos existentes en el suelo
(Nannipieri y col., 1990).
Se puede decir que con la medida de la respiración microbiana se analiza la
evolución del contenido de CO2 proveniente de la mineralización del sustrato
orgánico del suelo. El flujo de CO2 teóricamente representa una medida integrada de
la respiración de raíces, respiración de los microorganismos y la fauna del suelo y la
mineralización del carbono de las diferentes fracciones de la materia orgánica del
suelo. Las mediciones también proporcionan un índice sensible de la respuesta de la
actividad microbiana a variaciones de temperatura y humedad, la aplicación de
agroquímicos o elementos contaminantes, la exudación de sustancias inhibidora y el
manejo del medio, entre otros (García y col., 2003; Peña, 2004). Por tanto la
I. INTRODUCCIÓN
26
respiración es un indicador de la actividad microbiana y de la descomposición de
sustratos específicos del suelo.
I.8.3.3 Actividades enzimáticas
Las actividades enzimáticas del suelo han sido sugeridas dentro del conjunto
de indicadores debido a su relación con la biología del suelo, ya que su presencia
depende directamente de su continua liberación al ambiente llevada a cabo por los
organismos que habitan en el ecosistema (Burns, 1982). Las actividades enzimáticas
pueden ser usadas como parte del conjunto de herramientas necesarias para
determinar la calidad de un suelo (Dick y Tabatabai, 1992).
Las enzimas son proteínas cuyo papel es catalizar las reacciones químicas en
los sistemas vivos, actúan sobre sustratos específicos transformándolos en productos
necesarios para los ciclos biológicos. Los organismos y las plantas liberan enzimas
al suelo por secreción y por lisis celular después de su muerte; un bajo porcentaje de
estas proteínas quedan inmovilizadas y estabilizadas interaccionando con los
diferentes componentes de la fase sólida del suelo, como las arcillas, moléculas
orgánicas y complejos organominerales (Joinville y col., 2004).
El funcionamiento de los ecosistemas no puede entenderse correctamente sin
los procesos enzimáticos (Overbeck, 1991), ya que están directamente implicados en
la transformación de las formas complejas de carbono de la materia orgánica a
nutrientes fácilmente disponibles para las plantas, determinando así la pauta de gran
parte de las transformaciones químicas que se producen en el suelo (Stryer, 1995).
Al igual que en los otros sistemas vivos, la velocidad de la reacción
catalizada por una enzima es dependiente del pH, de la fuerza iónica, de la
temperatura y de la presencia o ausencia de inhibidores (Burns, 1982; Sarkar y col.,
1989). Existen enzimas intracelulares, que dependerán de la cantidad y calidad de la
población microbiana, y enzimas extracelulares. La mayor producción de enzimas
extracelulares se le atribuye a microorganismos por su biomasa, su alta actividad
metabólica y su corto ciclo de vida, en contraste con otros organismos que también
las pueden liberar como plantas y animales (Dick y Tabatabai, 1992).
En general, las actividades enzimáticas pueden indicarnos cambios en el
suelo debidos a su manejo (Panettieri y col., 2013), la aplicación de pesticidas y
enmiendas orgánicas (Lakhdar y col., 2011) y presencia de contaminantes (Burgos y
col., 2010). En el caso de los contaminantes pueden producirse adaptaciones
I. INTRODUCCIÓN
27
fisiológicas por ejemplo en presencia de metales pesados, estas adaptaciones
conllevan una demanda de energía adicional que podría explicar la reducción en las
actividades enzimáticas y el aumento de actividad (Renella y col., 2005).
Por todo lo señalado, en la presente memoria se proponen como indicadores
algunas de las propiedades más dinámicas del suelo, tales como la biomasa
microbiana, las actividades enzimáticas y la respiración microbiana porque
responden más rápidamente a los cambios occurridos que otros parámetros como la
materia orgánica total del suelo (Dick, 1994; Fauci y Dick, 1994). De hecho, en la
actualidad, son las propiedades bioquímicas y biológicas las candidatas a ofrecer una
mejor herramienta para medir calidad del suelo al ser indicadores tempranos de
estrés y por eso idóneas para su uso en los diferentes programas de monitorización
(Dick, 1994; Dick y Tabatabai, 1992). En particular según Giller y col. (1998), las
actividades enzimáticas y el estudio de la biomasa microbiana pueden servir como
estimadores de las alteraciones tanto naturales como antropogénicas que tienen lugar
en los suelos. Además, la respiración microbiana permite evaluar la calidad de la
materia orgánica y su determinación, a pesar de sus limitaciones, es un marcador de
la contaminación que permite evaluar los daños causados por los contaminantes
sobre las funciones fisiológicas de los suelos (Nanniperi y col., 1990).
II. OBJETIVOS
II. OBJETIVOS
31
II.1. OBJETIVOS
En este trabajo se evalúa la utilización de árboles de crecimiento rápido para
la recuperación de suelos contaminados con ET. Los árboles de la familia Salicáceas
tienen gran capacidad para acumular ET (especialmente Cd y Zn) sin llegar a ser
considerados como plantas hiperacumuladoras. Este tipo de árboles como el álamo y
el sauce están siendo implantados en numerosas partes del mundo afectadas por la
contaminación de ET. Estos árboles ayudarían por una parte a la estabilización del
suelo evitando la dispersión de la contaminación y, por otra, se podría estudiar su
eficacia como extractores de algunos contaminantes y posterior aprovechamiento de
su biomasa. En este tipo de experimentación hay que tener en cuenta que la caída
estacional de hojas es un factor importante para árboles que han alcanzado un
mínimo desarrollo y su retirada no siempre es posible. Esta hojarasca rica en ET se
deposita además en suelos de zonas contaminadas por lo que hay que tener en cuenta
y estudiar en profundidad dos procesos distintos pero a la vez íntimamente
relacionados: la influencia de la contaminación por ET en el ciclo de la materia
orgánica del suelo y la influencia de la materia orgánica en la dinámica de
contaminantes.
El presente estudio propone evaluar el efecto de la hojarasca y la rizosfera
del álamo blanco en el ciclo de la materia orgánica y la dinámica de los ET en suelos
contaminados de la ribera del río Guadiamar, por medio de estudios de
mineralización del carbono y del nitrógeno y propiedades químicas y bioquímicas
como posibles indicadores del estrés del suelo mediante tres experimentos:
experimento de incubación en condicciones controladas, experimento en
contenedores y experimento de campo.
1) Experimento de incubación en microcosmos. Efecto de la hojarasca.
Estudio de los posibles efectos de la contaminación con ET en los ciclos
del carbono y del nitrógeno en el suelo, prestando especial atención a las
propiedades bioquímicas (respiración, C y N de la biomasa, β-
glucosidasa y proteasa).
Estudio de la influencia de la MO procedente de la descomposición y
transformación de la hojarasca en la dinámica de ET en los suelos y
biodisponibilidad de los mismos.
II. OBJETIVOS
32
2) Experimento en contenedores. Papel de la rizosfera del álamo blanco
Comparación de dos técnicas de estimación de la biodisponibilidad de
ET para el álamo blanco: extracción con CaCl2 0,01M y la extracción en
agua de poro (SPW).
Estudio de la influencia de las plantas y, en particular, de la rizosfera
sobre las propiedades químicas y bioquímicas del suelo relacionadas con
los ciclos del C y del N.
Evaluación del efecto de la contaminación en las plantas mediante el
estudio de parámetros de desarrollo y crecimiento, de estado nutricional
y contenido en ET de la planta.
3) Experimentos de campo. Estudio conjunto del papel de la rizosfera y la
hojarasca
Estudio del efecto de los ET en el estado nutricional de árboles de
crecimiento rápido (nutrientes y ET).
Estudio del efecto conjunto de la rizosfera y de la hojarasca en las
propiedades químicas y bioquímicas del suelo.
Estudio de la utilización del álamo blanco como especie mejoradora de
la calidad del suelo de la ribera del río Guadiamar.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
35
III.1. ÁREA DE ESTUDIO
El complejo minero de Aznalcóllar está situado en el Cinturón Pirítico
Ibérico, que constituye la más vasta e importante provincia vulcanogénica de
sulfuros masivos (depósitos polimetálicos) del oeste de Europa, e incluye a Río
Tinto, Aljustrel, Neves Corvo, Tharsis, Sotiel y Aznalcóllar. Se extiende a través de
200 km (unos 8000 km2 de superficie) desde el suroeste de Portugal hasta Sevilla
(Alastuey y col., 1999; López-Pamo y col., 1999).
El 25 de abril de 1998, el dique de contención de la balsa minera de
decantación de la mina de los Frailes se desplazó produciéndose una rotura del muro
vertiendo su contenido al río Agrio, afluente del Guadiamar. La balsa, antes de ser
utilizada para la mina de los Frailes, fue utilizada durante 16 años para la mina de
Aznalcóllar (1979-1995), período en el que se trataron unos 43 millones de
toneladas de sulfuros polimetálicos (López-Pamo y col., 1999). A través de la
brecha de la balsa se vertieron unos 2 hm3 de lodos y 3-4 hm
3 de aguas ácidas, que
inundaron las cuencas de los ríos Agrio y Guadiamar, llegando, hasta la zona de
Entremuros, límite del Parque Nacional de Doñana. El espesor de la capa de lodos
depositada en el terreno dependió de la distancia a la balsa y de la elevación con
respecto al nivel del río, oscilando entre menos de 2 cm y más de 1,5 m. En total, se
afectaron 4.286 ha, 2.710 de ellas cubiertas por lodos y el resto afectadas por las
aguas ácidas, comprendiendo, en su mayoría, zonas agrícolas y pastizales.
El yacimiento de los Frailes, situado en el Cinturón Pirítico Ibérico, estaba
formado fundamentalmente por sulfuros polimetálicos de Fe, Cu, Pb, Zn y As
(pirita, calcopirita, galena, esfalerita y arsenopitita). Los lodos tenían, por tanto, una
composición muy parecida a la del yacimiento, y presentaban arsenopirita, esfalerita,
galena, silicatos, cuarzo y yeso.
Durante los primeros meses posteriores al accidente tuvo lugar la retirada de
los lodos depositados y la capa superficial de suelo contaminada. El análisis de los
suelos contaminados, realizados incluso antes de la retirada de los lodos, pusieron en
evidencia que los niveles de numerosos ET de los horizontes superficiales (0-15 cm)
estaban muy por encima de los rangos normales de suelos no contaminados de la
cuenca, en particular As, Cd, Cu, Pb, Sb, Tl y Zn (Cabrera y col., 1999; López-Pamo
y col., 1999).
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
36
Una vez concluidas las tareas de limpieza, y paralelamente a la adquisición
de los terrenos afectados por la Junta de Andalucía, se procedió a la adición de
enmiendas al suelo. Se añadieron enmiendas orgánicas y productos ricos en
carbonatos, para inmovilizar los ET y mejorar la fertilidad del suelo.
Finalizado el plan de medidas puesto en marcha por la administración para
controlar el impacto ambiental del accidente minero, se dio paso al denominado
Proyecto del Corredor Verde del Guadiamar, cuyos objetivos fundamentales fueron:
Controlar y remediar la contaminación generada por el vertido de las minas
de Aznalcóllar;
Recuperar una de las funciones que ejercía el río Guadiamar y su cuenca en
el territorio que ya había perdido con anterioridad a la catástrofe minera: esto
es su papel como corredor de especies y procesos naturales entre los arenales
del litoral de Doñana y Sierra Morena Occidental;
Mejorar la calidad de vida de los habitantes de la cuenca (CMA, 2001).
Inmediatamente se procedió a la revegetación de los terrenos con especies
leñosas mediterráneas. Las especies arbóreas se disponían de forma regular en
distintas líneas, y se iban alternando distintas manchas monoespecíficas de arbustos.
En total, se emplearon 26 especies leñosas autóctonas.
Las especies de árboles más abundantes fueron la encina (Quercus ilex subp.
ballota), el acebuche (Olea europaea var. sylvestris) y el algarrobo (Ceratonia
siliqua), en las zonas más alejadas del río, y el álamo blanco (Populus alba), el
sauce (Salix atrocinerea) y el fresno (Fraxinus angustifolia) en la ribera del
Guadiamar. Hacia las marismas se utilizó también el taraje (Tamarix africana).
Actualmente, casi 16 años después de haber sido plantadas, las especies
arbustivas son las que presentan mayor porte en las terrazas aluviales. Las especies
de ribera alcanzaron porcentajes de supervivencia y crecimiento razonablemente
altos, sobre todo el álamo blanco. Los ejemplares de esta especie alcanzaron en
algunas zonas de ribera alturas superiores a los 3 metros, con diámetros de tronco en
torno a los 15 cm y una superficie de copa superior a los 20 m2, cinco años después
de ser plantados (Domínguez y col., 2009).
Durante todo el proceso de configuración del Corredor Verde, desde el
accidente minero hasta la actualidad, se ha desarrollado una intensa actividad
científica en torno a la dinámica de la contaminación del suelo y sus efectos sobre
los ecosistemas de la zona. Durante los primeros años, esta actividad se centró en la
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
37
monitorización de los ET en los suelos, aguas superficiales y subterráneas, y en
distintos grupos de seres vivos (programas PICOVER I y II; CMA, 2003).
Posteriores programas de investigación han profundizado en el seguimiento
de la restauración de la zona, incluyendo la recuperación de los procesos
biogeoquímicos del suelo, el estudio de la diversidad de distintos grupos funcionales
de seres vivos y la funcionalidad como corredor ecológico para distintas especies
animales (programa SECOVER; CMA, 2008). Asimismo, el Corredor Verde ha
servido como zona de experimentación en multitud de trabajos sobre técnicas de
recuperación de suelos contaminados por ET (Walker y col., 2004; Clemente y col.,
2006; Madejón y col., 2006a; Vázquez y col., 2006; Pérez-de-Mora y col., 2007;
Madejón y col., 2010).
III.2. MATERIALES
III.2.1. Suelos
Los experimentos se han realizado en cuatro suelos diferentes. El suelo CO,
procedente de la finca experimental “La Hampa” perteneciente al Consejo Superior
de Investigaciones Cientificas (CSIC) situada en el término municipal de Coria del
Río (Sevilla), y el suelo RHU, procedente de la Rivera de Huelva en el término
municipal de La Algaba, son suelos no contaminados utilizados como controles. Los
otros dos son suelos de ribera afectados por el vertido tóxico de Anzalcóllar con un
alto contenido en ET: AZ procedente de la zona de Aznalcázar y DO procedente de
la zona del puente de las Doblas. A ambos suelos se les había retirado la capa de
lodo y la capa de suelo superficial, de 10-15 cm, en las labores de remoción
efectuadas justo después del accidente minero (Cabrera y col., 1999). Las
características texturales de los cuatro suelos de estudio y la localización geográfica
de los mismos se muestran en Tabla III.1. Tanto los suelos CO y RHU como el DO
presentan textura arenoso-franca, mientras que el suelo AZ presenta una textura
franca.
Los valores de pH de los suelos y su contenido en ET se muestran en la
Tabla III.2.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
38
Tabla III.1. Características texturales de los suelos.
Suelo
Textura
Tipo de
suelo Latitud Longitud
Arena
gruesa
(%)
Arena
fina
(%)
Limo
(%)
Arcilla
(%)
RHU 33,3 27,9 21,4 17,4 Arenoso-
franco 37º 29' 10'' 06º 1' 31,5''
CO 80 6,9 1,6 11,5 Arenoso-
franco 37º 17' 8,0'' 06º 04' 1,5''
AZ 8,4 30,7 34,6 26,3 Franco 37º 18' 4,7'' 06º 15' 39,1''
DO 43,4 35,6 6,0 15,0 Arenoso-
franco 37º 18' 3,0'' 06º 15' 37,0''
Los suelos RHU, CO y AZ presentan pH cercanos a la neutralidad o
ligeramente alcalinos, mientras que el suelo DO muestra un pH muy ácido.
Tabla III.2. Valores medios del pH del suelo y contenido pseudototal de los ET (mg kg-1
) en los
suelos de estudio (entre paréntesis desviación estándar; n=3)
Suelo pH As Cd Cu Pb Zn
RHU 7,19
(0,02)
9,18
(0,81) < 0,01
2,58
(2,72)
17,9
(0,93)
69,1
(6,30)
CO 7,50
(0,07)
8,4
(1,90)
0,59
(0,05)
19,4
(2,0)
15,7
(0,40)
52,0
(3,30)
AZ 7,20
(0,19)
112
(5,30)
3,82
(0,15)
166
(6,20)
236
(13,5)
506
(15,0)
DO 2,70
(0,21)
290
(14,8)
3,53
(0,10)
193
(10,4)
391
(25,0)
227
(9,30)
Concentraciones
normales en
suelos*
0,1 - 40 0,01 - 2 2 - 25 2 - 300 1 - 900
Valores de
fondo en la
zona del
Guadiamar**
9,8 0,18 15,7 23,1 63,4
*Bowen, (1979), ** Cabrera y col., (1999)
Los contenidos pseudototales de ET mostrados en la Tabla III.2 reflejan el
nivel de contaminación de los suelos utilizados. Los suelos CO y RHU (suelos no
contaminados, controles) presentan contenidos de ET bajos y dentro de los
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
39
intervalos normales en suelos (Bowen, 1979). Sin embargo, la concentración de ET
en los suelos AZ y DO fue en general más alta que los límites máximos de los
intervalos considerados para concentraciones normales en suelos y que los valores
de fondo encontrados para estos elementos en los suelos de la zona del Guadiamar
no afectados por el vertido (Cabrera y col., 1999). Los contenidos de ET en nuestros
suelos (AZ y DO) muestran que la contaminación residual persiste incluso 16 años
después del accidente.
III.2.2. Material vegetal. Álamo blanco
Para los tres ensayos se utilizó la planta y/o la hojarasca del álamo blanco
(Populus alba L.) especie arbórea perteneciente a la familia de las Salicáceas.
El álamo blanco es un árbol caducifolio, de hasta 30-35 m de altura y 3 m de
diámetro en la base del tronco. Posee un sistema radical fuerte, muy ramificado. Su
foliación ocurre entre febrero - abril. Las hojas caen de noviembre a enero. Se define
como una especie de luz, que vive con bajo espaciamiento, sin formar extensos
rodales y proporciona poca sombra, por la disposición de sus hojas. Es una especie
de crecimiento rápido, pero poco longevo, a partir de los 60-70 años el tronco se
ahueca, iniciándose la decrepitud, y no suele alcanzar el siglo. Posee un gran valor
ornamental, tanto por el aspecto de troncos y tallos como por lo cambiante de su
follaje. Se puede emplear en jardines y parques, teniendo en cuenta que hay que
prevenir, o evitar, el efecto de la elevada propagación de sus raíces, por lo que se
debe estudiar bien el lugar de implantación. Hibrida bien con otros congéneres,
especialmente con P. tremula (Ruiz de la Torre, 2001).
Este árbol de ribera, indiferente al pH, crece sobre suelos frescos y arenosos
de valles húmedos y bajos, márgenes de grandes ríos y sotos abrigados; prefiere
terrenos ricos, depósitos recientes, fértiles e incluso arcillosos o arcilloso-calcáreos
húmedos, mientras que los suelos silíceos compactos o calcáreos secos no son
adecuados. Puede soportar temperaturas mínimas de -15º, mientras que en verano
resiste bien máximas entre 40º y 50º con tal de tener asegurado el aprovisionamiento
de agua (Ruiz de la Torre, 2001). Puede desarrollarse en ambientes marinos, con
cierta salinidad en el suelo y agua, así como cierto nivel de contaminación residual
en el substrato (por ejemplo, por metales pesados y contaminantes orgánicos). En
ríos de poca corriente y aguas eutróficas, calientes, con poco oxígeno y mucha
arcilla en suspensión, en suma características menos favorables, sustituye a otras
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
40
especies por lo que está indicado para la repoblación o defensa de tales sitios (Ruiz
de la Torre, 2001). Además, el álamo blanco forma parte de la vegetación natural del
bosque de ribera de la cuenca del río Guadiamar (Cabezudo y col., 2003).
III.2.2.1. Hojarasca
Las muestras de hojarasca se tomaron en las 2 zonas contaminadas (AZ y
DO) y se utilizaron en los experimentos en condiciones controladas. En estos
mismos ensayos para los suelos no contaminados (CO y RHU) se utilizó hojarasca
de álamo blanco procedente de la zona de Rivera de Huelva no afectada por el
vertido (RHU). Las características más relevantes de las tres hojarascas utilizadas se
muestran en las Tablas III.3 y III.4.
Tabla III.3. Valores medios de pH y contenido en carbono orgánico total (COT), lignina (LIG)
de la hojarasca utilizada (entre paréntesis desviación estándar; n=3)
Hojarasca pH COT (mg kg-1
) LIG (%)
RHU 5,20 (0,21) 85,8 (0,46) 32,4
AZ 5,25 (0,12) 83,1 (4,36) 33,9
DO 5,53 (0,25) 79,3 (0,68) 35,3
Los valores de pH, fueron muy similares en las tres muestras de hojarasca.
También en el caso del COT, los valores fueron bastante similares aunque cabe
destacar que los contenidos en la hojarasca procedente de las zonas contaminadas
fueron ligeramente inferiores a los de RHU. Los contenidos de lignina fueron
similares para las tres muestras de hojarasca aunque ligeramente superiores en los
procedentes de las zonas contaminadas.
Tabla III.4. Valores medios del contenido de ET totales (entre paréntesis desviación estándar;
n=3) y de ET solubles en CaCl2 en hojarasca utilizada
Hojarasca As Cd Cu Pb Mn Zn Cd Cu Zn
mg kg-1
pseudototales (aqua regia) mg kg-1
(solubles CaCl2)
RHU 2,61
(0,31)
0,74
(0,10)
13,9
(1,59)
2,74
(0,23)
102
(6,36)
163
(8,74)
0,46
(0,09)
4,61
(0,25)
32,5
(6,52)
AZ 2,68
(0,21)
3,20
(0,91)
17,9
(3,64)
4,05
(2,00)
231
(48,3)
289
(69,2)
1,31
(0,22)
7,11
(0,35)
69,3
(9,36)
DO 22,4
(9,31)
5,26
(0,97)
82,0
(25,0)
49,4
(11,2)
84,3
(10,2)
647
(117)
1,92
(0,45)
51,2
(1,58)
364
(51,2)
Los contenidos en ET de las tres hojarascas fueron sin embargo muy
diferentes (Tabla III.4.). Excepto para el Mn, los contenidos de ET totales y solubles
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
41
en la hojarasca RHU fueron mucho más bajos que los encontrados en las hojarascas
de las zonas contaminadas AZ y DO.
III.3. DISEÑO DE LOS EXPERIMENTOS
Para llevar a cabo los dos experimentos “ex situ” se tomaron cantidades
suficientes de suelo en distintos puntos de las zonas mencionadas anteriormente.
Figura III.1. Imagen de la zona de uno de los suelos (DO).
III.3.1. Experimento de incubación en microcosmos
Para el experimento de incubación se recogieron muestras de suelo
procedentes de los primeros 30 cm (suelos RHU, CO, AZ y DO), se transportaron a
las instalaciones del IRNAS, se extendieron en bandejas y se dejaron secar al aire
durante varios días. A continuación se molieron y se tamizaron hasta tamaño de
partícula 2 mm.
Para cada tipo de suelo se pusieron 6 bandejas con 1,5 kg de suelo (Figura
III.2). De estas 6 bandejas, a la mitad se les añadió la hojarasca correspondiente a
cada suelo (tratamientos RHU-L, CO-L, AZ-L, DO-L) y a las otras tres no se les
añadió (RHU, CO, AZ y DO) (en el capítulo V.1 se utilizó una nomenclatura
diferente para cada tratamiento). La cantidad de hojarasca que se añadió a cada una
de las bandejas se estimó de acuerdo a la cantidad obtenida en condiciones reales de
campo en cada uno de los puntos estudiados.
Para estimar la cantidad de hojarasca presente en condiciones de campo se
tomó la hojarasca (3 replicados por punto) correspondiente a un cuadrante de 30 x
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
42
30 cm. Posteriormente la hojarasca se secó al aire y se pesó la cantidad
correspondiente. La cantidad añadida a cada bandeja (~ 85 g) se obtuvo interpolando
a la superficie de las bandejas (30 x 20 cm).
Figura III.2. Imagen del experimento de incubación.
Una vez añadida la hojarasca a cada bandeja, se mezcló ligeramente con el
suelo y las mezclas se humedecieron hasta el 70% de la capacidad de campo,
añadiendo agua destilada. En el caso de las bandejas sin adición de hojarasca
(tratamientos RHU, CO, AZ y DO) se humedecieron del mismo modo.
Las 24 bandejas se dejaron durante 40 semanas en una cámara de ambiente
controlado (Figura III.2) a una temperatura constante de 28ºC y en oscuridad.
Durante el periodo de incubación se mantuvo esa humedad inicial en las muestras
reponiendo periódicamente las pérdidas de agua por evaporación.
A las muestras de suelo tomadas las semanas 0, 2, 4, 8, 16, 24, 32 y 40, se les
determinó el contenido de humedad una vez homogeneizadas.
III.3.2. Experimento en contenedores
Para el experimento en contenedores, las muestras de suelo procedentes de
los primeros 50 cm de suelo (AZ y DO) se transportaron a la finca experimental “La
Hampa” (IRNAS/CSIC) en Coria del Río (Sevilla) y se utilizaron para llenar los
contenedores. Como control se utilizó un suelo procedente de esta misma finca
(CO).
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
43
El experimento se llevó a cabo en 18 contenedores (95 l de volumen y 1 m de
altura) que se colocaron al aire libre en la finca experimental “La Hampa”
(IRNAS/CSIC) de Coria del Río (Sevilla). Los contenedores se llenaron con los
diferentes suelos (Figura III.3). En 3 contenedores de cada suelo se plantaron árboles
de la especie Populus alba provenientes de un vivero (seis meses de edad):
tratamientos AZ-P, DO-P, y CO-P. En los otros 3 contenedores de cada suelo, no se
establecieron plantas (AZ, DO, CO).
Figura III.3. Imagen del experimento en contenedores.
La capa más profunda de los contenedores DO-P (últimos 25 cm) se llenó
con suelo no contaminado, para reproducir las condiciones naturales de la zona de
DO, en la que encontramos alta contaminación y pH ácido en la capa superficial
(unos 70 cm) y menor contaminación y pH neutro en las capas más profundas.
Los contenedores se regaron diariamente durante la fase de crecimiento (de
Abril a Noviembre), a través de un riego por goteo con dos emisores de 4 L/h por
contenedor. La dosis media de agua durante el periodo del experimento fue de 4 mm
por contenedor y día. Este valor se calculó en función de la demanda de
evapotranspiración con el fin de mantener la humedad adecuada.
El agua de poro del suelo se muestreó mediante “Rhizon samplers”
(Eijkelkamp Agrisearch Equipos, Países Bajos), insertados lateralmente en los
contenedores a 20 cm de profundidad (Figura III.4).
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
44
Figura III.4. Imagen del muestreo mediante “Rhizon samplers”.
Se tomaron muestras de agua de poro cada mes, (excepto cuando no fue
posible la extracción debido a la alta evapotranspiración) durante todo el período
experimental utilizando jeringas desmontables unidas por una conexión Luer-Lock
al muestreador y a los tubos de vacío para extraer las aguas de poro.
Las muestras de suelo a 0-15 cm de profundidad (Figura III.5) se tomaron en
primavera y otoño de cada año desde 2009 hasta 2011 (seis muestreos).
Figura III.5. Imagen del muestreo de suelo en experimento en contenedores.
Los parámetros relacionados con el desarrollo de la planta (altura y diámetro
del tronco) se midieron cada mes. Al final del experimento se determinó la biomasa
total de la planta (incluyendo hojas y tronco).
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
45
III.3.3. Experimento de campo
En las zonas RHU, AZ y DO se tomaron muestras de suelo y hojas de álamos
blancos en octubre de 2009 (muestreo 1), abril de 2010 (muestreo 2), octubre de
2010 (muestreo 3), abril de 2011 (muestreo 4) y octubre de 2011 (muestreo 5). En
cada zona se tomaron tres muestras de suelo alrededor de seis árboles seleccionados
a dos profundidades (0-20 cm y 20-40 cm) para hacer una muestra compuesta por
árbol y profundidad (en el capítulo V.5 se utilizó una nomenclatura diferente para
cada tratamiento).
Figura III.6. Imagen experimento de campo (suelos de Las Doblas – DO).
En cada sitio de muestreo se seleccionaron 6 árboles de álamo blanco para su
seguimiento a los que se les muestrearon sus hojas (tomadas a una altura media de 5
m) en el otoño de 2011 y otoño 2012.
En el otoño de 2010 y 2011, la cantidad de hojarasca (kg (peso seco) m-2
) en
cada sitio se calculó pesando la cobertura de hojarasca en un área de 30 cm × 30 cm.
III.3.4. Preparación de muestras de suelos y plantas
Para todos los experimentos, el suelo húmedo se pasó a través de un tamiz de
2 mm, se homogeneizó y luego se dividió en dos submuestras: una seca en estufa a
40 º C, durante al menos 48 h para los análisis químicos; una segunda submuestra se
almacenó a 4 º C en bolsas de plástico para las determinaciones bioquímicas. Las
muestras secas se molieron a tamaño de partícula <60 m para el análisis de ET
pseudo-totales.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
46
En el caso de material vegetal, muestras de hojas se lavaron durante 15 s con
una solución 0,1 N de HCl y sucesivamente con agua destilada. A continuación, se
secaron a 70 º C durante 48 h y se molieron.
III.4. DETERMINACIONES QUÍMICAS DE LOS SUELOS
III.4.1. Determinación del pH
La determinación del pH se realizó pesando 10 g de suelo (< 2 mm) en tubos
de centrífuga y se añadieron 25 ml de una solución 1 M de KCl, (relación 1:2,5
suelo:KCl) (Métodos Oficiales de Análisis del Ministerio de Agricultura, 1986).
Posteriormente se agitaron los tubos (140 agitaciones min-1
) durante media hora a
temperatura constante (22±1ºC). Se dejaron decantar las muestras y se midió el pH
en el sobrenadante mediante un pH-metro CRISON micro pH 2002 con
compensación automática de la temperatura.
III.4.2. Determinación del carbono orgánico total (COT)
Para la determinación del carbono orgánico oxidable se utilizó el método
clásico de Walkley y Black (1934) consistente en la oxidación de la materia orgánica
presente en la muestra de suelo con dicromato potásico (K2CrO7) 1N en medio ácido
(H2SO4 concentrado), valorándose el exceso de dicromato con sal de Mohr (solución
0,5 N de sulfato ferroso-amónico) y empleando difenilamina como indicador. El
contenido de C orgánico total se expresó en g kg-1
de C en muestra seca.
III.4.3. Determinación del carbono hidrosoluble (CH)
La extracción del carbono hidrosoluble del suelo se hizo con agua destilada
utilizando una la relación 1:10 (suelo:agua). Se pesaron 2,5 g de muestra seca y se
agitó durante 1 hora en tubos de centrífuga. Después se centrifugó 10 minutos a
15.000 rev. min-1
y se filtró en filtros Whatman 2. La determinación de C en el
extracto se realizó en un analizador de Carbono TOC-VCSH Shimadzu.
III.4.4. Determinación del nitrato (NO3-N-)
El nitrato de las muestras de suelo se extrajo agitando con agua destilada
(relación suelo:agua 1:2) durante 30 minutos (Keeney y Nelson, 1982). La medida
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
47
del contenido de nitrato en los extractos acuosos se realizó en un auto-analizador de
flujo continuo (Norderstedt, Alemania), +Luebbe GmbH AA3 de doble canal.
III.4.5. Determinación del amonio (NH4-N+)
El amonio de las muestras de suelo se extrajo agitando con KCl 2 M
(relación suelo:KCl 1:2) durante 1 hora (Banwart y col., 1972). La medida del
contenido de amonio en los extractos acuosos se realizó en un auto-analizador de
flujo continuo (Norderstedt, Alemania), +Luebbe GmbH AA3 de doble canal.
III.4.6. Determinación de N-Kjeldahl (N-Kjel)
La determinación de Nitrógeno Kjeldahl se llevó a cabo tratando las
muestras de suelo (2 mm) con ácido sulfúrico concentrado en presencia de
catalizador de Se (mezcla K2SO4 y Se) a 420º, en un bloque digestor TECATOR.
Después de la digestión, las muestras se trataron con sosa al 40% y se destilaron en
un sistema de destilación (KJELTEC). El destilado se recogió sobre una disolución
de ácido bórico al 4% y posteriormente se valoró con ácido clorhídrico de
normalidad conocida en presencia de rojo de metilo y verde de bromocresol. El
contenido de N orgánico total se expresó como g 100 g-1
·de N sobre muestra seca.
III.4.7. Determinación de los elementos traza (ET) solubles en CaCl2-0,01M
Se pesaron 2,5 g de muestra seca en tubos de centrífuga y se añadieron 25 ml
de solución de CaCl2 0,01 M (relación 1:10). Las muestras se agitaron durante tres
horas (140 agitaciones min-1
) en un agitador automático de vaivén (Selecta) a
temperatura constante (22±1ºC). A continuación, se centrifugaron a 10000 rev min-1
durante 10 minutos, filtrándose el sobrenadante por papel de filtro Whatman 2
(Houba y col., 2000). El filtrado se recogió y guardó en botes de PVC hasta su
análisis. La determinación de los ET en la disolución se realizó por ICP-OES
(plasma de acoplamiento inductivo / espectroscopia de emisión óptica) (Varian ICP
720-ES).
III.4.8. Determinación de elementos traza (ET) pseudototales
El ataque de las muestras de suelo se llevó a cabo en vasos de teflón,
herméticamente cerrados, en horno microondas (MILESTONE ETHOS 900,
Milestone s.r.l., Sorisole, Italia). Para ello se pesaron 0,5 g de muestra (<60 μm) a
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
48
los que se añadieron 3 ml de HCl concentrado y 1 ml de HNO3 concentrado (agua
regia). Tras la digestión y enfriamiento de los extractos, estos se diluyeron
añadiendo agua destilada hasta completar 50 ml. Finalmente, los extractos diluidos
se filtraron por papel de filtro WHATMAN 2 y se conservaron en botes de PVC
hasta su análisis. Las concentraciones de los distintos elementos se midieron por
espectrofotometría de emisión de plasma, ICP-OES. Para controlar la eficacia del
ataque y de la determinación, se analizaron muestras del material de referencia BCR
320 (Tabla III.5.). Las concentraciones de ET se expresaron en mg kg-1
.
TablaIII.5. Valores certificados y obtenidos en el laboratorio
del IRNAS (extraídos con aqua regia; media de tres
repeticiones: mg kg-1
sobre muestra seca) de la muestra de
referencia BCR320 (sedimento de canal)
Elemento Valor certificado
(concentración total)
Valor obtenido
(agua regia)
As 21,7 17,7
Cd 2,64 2,42
Cu 46,3 47,6
Pb - 75,9
Zn 297 273
III.5. DETERMINACIONES BIOLÓGICAS EN EL SUELO
III.5.1. Determinación del carbono de la biomasa microbiana (CBM)
La determinación del carbono de la biomasa microbiana se realizó según el
método de la fumigación-extracción con CHCl3, modificado por Gregorich y col.
(1990). Se pesaron 3 g de muestra y se añadieron 0,5 ml de CHCl3, excepto a los
controles. Se dejaron reaccionar durante 5 minutos y a continuación se añadió
K2SO4, 0,5 M, tanto a las muestras como a los controles, para extraer el C.
Posteriormente se agitaron, centrifugaron y filtraron por un filtro Whatman 2 y
finalmente se burbujeó con aire libre de CO2 en el extracto para eliminar el exceso
de CHCl3. El contenido de C del extracto obtenido se midió inmediatamente en un
analizador de Carbono TOC-VCSH Shimadzu, restando el valor de los controles a
las muestras fumigadas.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
49
III.5.2. Determinación del nitrógeno de la biomasa microbiana (NBM)
El NBM fue determinado según el mismo método utilizado para el CBM
(Gregorich y col., 1990). La medida del contenido en N del extracto se efectuó
utilizando el módulo de nitrógeno del analizador de Carbono TOC-VCSH
Shimadzu, restando el valor de los controles a las muestras fumigadas.
III.5.3. Determinación de la actividad β-glucosidasa (β-gluc)
La determinación de la actividad β-glucosidasa se realizó según el método
descrito por Tabatabai (1994). Se incubó 1 g de muestra fresca, durante una hora a
37ºC, en presencia de p-nitrofenil-β-glucopiranósido (PNG) 0,05 M. Los controles
se prepararon añadiendo PNG después de la incubación. El extracto se analizó
espectrofotométricamente (espectofotómetro PERKIN ELMER, Lambda EZ210)
para medir el p-nitrofenol (PNF) liberado en la reacción a 400 nm. La actividad de la
enzima se expresó en mg PNP kg-1
h-1
.
III.5.4. Determinación de la actividad proteasa
Para la determinación de la proteasa se utilizó el método de Ladd y Butler
(1972), en el que el suelo se incuba a 54º C durante 2 horas con caseína. El extracto
se analizó espectrofotométricamente (espectofotómetro PERKIN ELMER, Lambda
EZ210) a 700 nm. La actividad proteasa se expresa en mg de tirosina kg-1
2h-1
.
III.5.5. Determinación del potencial de nitrificación del suelo (Potencial
Nitrification Rate / PNR )
El potencial de nitrificación (PNR) del suelo se determinó según el método
propuesto por Kandeler (1996) y modificado por Hoffmann y col. (2007). Las
muestras de suelo húmedo (5 g) se incubaron durante 5 horas a 25 º C y se les
añadió sulfato de amonio, como sustrato, y clorato de sodio para evitar la oxidación
a nitrato. Posteriormente el nitrito acumulado durante el período de incubación se
extrajo con KCl 2 M y se determinó colorimétricamente por el método de Griess-
Ilosvay (Keeney y Nelson, 1982). Las concentraciones de nitrito obtenido se
expresan como mg N kg-1
d-1
.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
50
III.5.6. Determinación de la respiración microbiana
En los tiempos más representativos de la incubación (0, 24, 40 semanas) se
determinó la respiración microbiana mediante el método del sensor de presión
(OxiTop, WTW, Weiheim, Germany) de acuerdo con el Estándar Internacional ISO
17155 (2002).
Se pesaron 25 g de muestra y se incubaron en botellas de cristal en cámara
termostática durante 3 días a temperatura de 20 ± 1ºC. Se adjustaron los valores de
presión en el cabezal de las botellas y el consumo de O2 se midió en intervalos
regulares (cada 30 min) hasta llegar a una tasa constante de respiración
determinando la respiración basal (RB). Posteriormente a la medida de la respiración
basal, se determinó la respiración inducida por sustrato después de la adición de 0,25
g de sustrato (80 g glucosa, 13 g (NH4)2SO4 y 2 g de KH2PO4) y se midió a
intervalos regulares (30 min) el consumo de O2 hasta el descenso de la tasa de
respiración. De los resultados del SIR (Respiración Inducida por Sustrato), se
obtuvieron los siguientes parametros: respiración inducida por sustrato (RS), tasa
máxima de crecimiento (µ), tiempo de desfase (tlag), tiempo desde la adición de
sustrato hasta el pico máximo (tpeakmax) y cociente de activación respiratoria (QR). El
cociente de activación respiratoria (QR) es la tasa de respiración basal (RB) dividida
por la tasa de respiración inducida por sustrato (Rs). Se establecieron 3 replicados
por cada tratamiento.
Figura III.7. Imagen de los “Oxitops”.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
51
III.6. DETERMINACIONES ANALÍTICAS EN EL MATERIAL VEGETAL
(hojarasca y hojas)
III.6.1. Determinación del pH
La determinación del pH en la hojarasca se realizó pesando 2 g de material
molido (< 2 mm) en tubos de centrífuga a los que añadieron 5 ml de una solución 1
M de KCl (relación 1:2,5 suelo:KCl). Posteriormente se agitaron los tubos (140
agitaciones min-1
) durante media hora a temperatura constante (22±1ºC). Se dejaron
decantar las muestras y se midió el pH en el sobrenadante mediante un pH-metro
CRISON micro pH 2002 con compensación automática de la temperatura.
III.6.2. Determinación del carbono orgánico total (COT)
La materia orgánica (MO) total en la hojarasca se determinó por la pérdida
de peso de las muestras calcinadas en cápsula de porcelana a 550 ºC hasta cenizas
blancas (Ministerio de Agricultura, 1986). El contenido de carbono total (C) se
calculó mediante la siguiente expresión (Iglesias Jimenez y Pérez García, 1992):
en la que los valores de MO y C se expresan en g kg-1
del producto seco inicial.
III.6.3. Determinación de la lignina Klason (LIG)
La lignina Klason en la hojarasca se determinó según la norma Tappi T222
om-88 con algunas modificaciones. En este método, la muestra de hojarasca,
previamente molida, libre de compuestos extraíbles e hidrosolubles se sometieron a
una hidrólisis con H2SO4. Para ello, aproximadamente 0,6 g de cada muestra se
colocaron en frascos pirex con 6 ml de H2SO4 al 72% y se mantuvieron en un baño
de agua a 30 ºC durante 1 hora. Posteriormente se diluyó con 168 ml de agua para
obtener la concentración de ácido de 4% y se colocó en una autoclave durante 1 hora
a 120 ºC. La lignina Klason se retuvo por filtración en filtros de vidrio poroso
(previamente tarados tras 4 horas a 100 ºC). El residuo insoluble (lignina Klason) se
lavó con agua destilada hasta pH neutro y se secó para cuantificación gravimétrica.
84 , 1 C
MO
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
52
III.6.4. Determinación del Nitrógeno Kjeldahl (N-Kjel)
Las muestras de hoja molidas y secas se atacaron con ácido sulfúrico
concentrado en presencia de un catalizador elaborado a base de Se (mezcla de Se y
sulfato potásico) a 380ºC durante 2h. El nitrógeno amoniacal se determinó por el
método del indofenol en un autoanalizador Autoanalizer II Technicon. Los
resultados se expresaron como g 100 g-1
N sobre muestra seca.
III.6.5. Determinación de nutrientes y elementos traza (ET)
El análisis de nutrientes y ET tanto en las hojas muestreadas cada otoño
como en la hojarasca se realizó mediante extracción total por vía húmeda, bajo
presión en horno microondas. Para ello, se pesaron 0,5 g de muestra molida y seca
en vasos de teflón, añadiéndose 4 ml de HNO3 suprapur y agitándose suavemente
para mojar la muestra por completo. Las muestras se dejaron reposar durante toda la
noche procediendo a la digestión al día siguiente. Tras la digestión y enfriamiento,
los extractos se diluyeron con agua desionizada hasta completar 50 ml. A
continuación, se filtraron los extractos por papel de filtro Whatman 2 y se recogieron
y preservaron en botes de vidrio hasta su análisis. La determinación de ET en las
disoluciones se realizó mediante ICP-OES.
Paralelamente, se analizó una muestra de referencia para contrastar la
exactitud y precisión de la metodología empleada (INCT-TL-1 (Hojas de Te))
(Tabla III.6).
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
53
TablaIII.6. Valores certificados y obtenidos en el laboratorio
del IRNAS (extraídos con aqua regia; media de cinco
repeticiones: mg kg-1
sobre muestra seca) de la muestra de
referencia INCT-TL-1 (hojas de te)
Elemento Valor certificado
(concentración total) Valor obtenido
As 0,106 0,115
Cd 0,03 0,03
Cu 20,4 21,0
Fe 432 429
Mn 1570 1536
Pb 1,78 1,48
Zn 34,7 37,3
Ca (%) 0,58 0,59
K (%) 1,70 1,538
Mg (%) 0,224 0,230
P (%) 0,181 0,198
III.7. TRATAMIENTO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS
El análisis estadístico de los resultados se llevó a cabo mediante el paquete
estadístico IBM-SPSS 19.0 para Windows (©SPSS Inc., 1989-2010, Chicago,
Illinois).
Los resultados se presentan como los valores medios de los replicados
acompañados por las correspondientes desviaciones típicas (standard) (DS) o los
errores típicos (standard) (ES).
Para cada pareja de tratamientos (tratamientos con y sin hojarasca en el
experimento de microcosmos, tratamientos con y sin plantas en el experimento de
los contenedores) la comparación de medias se hizo mediante el test de la T-Student,
adaptándose niveles de significación p<0,05.
Los resultados de nutrientes y ET en las hojas de las plantas en la
monitorización en campo se analizaron con un ANOVA y utilizando el test de
Tukey para la comparación de los valores medios y un nivel de significación p<0,05
teniendo en cuenta el lugar de muestreo como la variable independiente.
III. MATERIALES Y METODOLOGÍA
54
Previamente, los datos se sometieron al test de Shapiro-Wilk para conocer si
las variables de estudio seguían una distribución normal. Las variables que no
presentaron esta distribución (test de Kolmogorov-Smirnov) fueron transformadas
logarítmicamente antes de su tratamiento estadístico.
Las correlaciones entre las distintas variables se realizaron mediante
coeficiente de Pearson o Spearman dependiendo de los datos analizados,
considerando niveles de significación p<0,05 y p<0,01.
Para los experimentos en contenedores se utilizaron los “sun-ray plot” para
comparar gráficamente los valores medios de diferentes parámetros estudiados en
cada suelo y tratamiento. La forma y el área integrada de cada gráfico para cada
tratamiento permiten una comparación de las presentaciones visuales y estadísticos
de datos multivariantes. La propiedades químicas y bioquímicas de los tres tipos de
suelos y la contaminación del suelo en el caso del suelo DO se representaron
mediante la grafica “sun-ray plot”; el área integrada para cada tratamiento se midió
usando las herramientas de medición de Adobe Acrobat ® 9 (Adobe Systems
Incorporated, CA, EE.UU.).
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS
RESULTADOS
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
57
IV.1. EVOLUCIÓN DEL pH
En el experimento de incubación en microcosmos la presencia de hojarasca
parece influenciar ligeramente la evolución del pH en los 4 suelos estudiados
(Capítulos V.1, Figura 1 y Capítulo V.2, Tabla 3). De hecho, las diferencias entre
tratamientos (con y sin hojarasca) se mantuvieron siempre por debajo de las 0,5
unidades en todos los muestreos. Estas diferencias parecen más evidentes en el caso
del suelo ácido, DO (Capítulo V.1, Figura 1c), en el que la hojarasca incrementó
significativamente el pH en todos los muestreos.
En el caso del ensayo en contenedores se utilizaron dos métodos para la
medida del pH: la extracción con KCl y la medida del pH en agua de poro (SPW).
En los valores obtenidos con ambos métodos, no se observaron efectos en el pH
debido a la presencia de plantas en los suelos neutros (CO y AZ) (Capítulo V.3,
Figura 1). En estos suelos se apreció un ligero descenso del pH en el tiempo seguido
de un incremento final para ambos suelos y tratamientos (con y sin plantas). En el
caso del suelo ácido, los valores de pH tendieron a aumentar en el tiempo en ambos
tratamientos (DO/DO-P), especialmente en el tratamiento con presencia de planta
(DO-P).
En la monitorización de campo, se observó un ligero descenso en los valores
de pH en el tiempo para los suelos neutros (RHU y AZ) (Capítulo V.5, Figura 1). En
general, los valores más altos de pH se encontraron en la capa más superficial (0-20
cm) en todos los suelos. En el caso del suelo ácido (DO) los valores de pH tendieron
a aumentar ligeramente en el tiempo y no se apreciaron diferencias significativas
entre las dos profundidades estudiadas (Capítulo V.5, Figura 1).
IV.2. EVOLUCIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE LOS ELEMENTOS
TRAZA (ET)
El contenido de ET disponibles en el suelo no se vió afectado ni por el aporte
de MO en forma de hojarasca ni por la presencia de plantas. En general, para los tres
ensayos, los valores de metales solubles encontrados en los suelos neutros (CO,
RHU y AZ) fueron muy bajos (Capítulo V.1, Tabla 3 y Capítulo V.2, Tabla 3),
independientemente de los contenidos de ET pseudototales iniciales. En estos
suelos, las concentraciones de As y Pb se encontraron por debajo del límite de
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
58
detección del aparato (0,01 mg kg-1
para ambos elementos) tanto en el experimento
de incubación como en la monitorización de campo. Sin embargo, en el ensayo en
contenedores los valores de Pb se encontraron dentro de los valores de detección del
aparato y por lo tanto se estudiaron con los otros elementos traza.
En el caso del suelo ácido (DO), los contenidos de ET fueron siempre más
altos que los encontrados en los suelos neutros y presentaron una evolución
constante, caracterizada por concentraciones iniciales altas y un descenso marcado
en el tiempo.
En particular, en el experimento en microcosmos, en el suelo neutro
contaminado (AZ-L), la presencia de hojarasca produjo un ligero incremento en las
concentraciones de Cu en el muestreo inicial (T=0) y de Cu, Cd y Zn en el tiempo
T=24 semanas con respecto al suelo sin hojarasca (AZ). En el caso del suelo ácido
contaminado con hojarasca (DO-L) el contenido de Cd y Zn resultó mucho más alto
que en el suelo sin hojarasca mientras que el aporte de la misma redujo el contenido
de Cu en el suelo (Capítulo V.1, Tabla 3 y Capítulo V.2, Tabla 3).
En el ensayo en contenedores las concentraciones de ET disponibles en los
suelos se determinaron mediante dos métodos: la extracción con CaCl2 0,01 M y la
medida en agua de poro (SPW). Los valores de Cu, Mn y Zn obtenidos con ambas
técnicas presentaron fluctuaciones durante todo el experimento en los suelos neutros.
La presencia de la planta pareció aumentar las concentraciones de estos tres
micronutrientes en suelo no contaminado (CO) (Capítulo V.3, Figuras 2, 3 y 4). Sin
embargo, para el Cd y Pb se encontraron valores muy bajos en ambos suelos neutros
(AZ y CO) (Capítulo V.3, Figuras 5 y 6). Los contenidos de Cd extraídos con CaCl2
se mantuvieron por debajo de 0,02 mg kg-1
en CO y de 0,03 mg kg-1
en AZ. Las
concentraciones de Cd en SPW no superaron los 0,001 mg L-1
en CO y 0,01 mg L-1
en AZ. La concentración más alta de Pb se encontró en los muestreos iniciales y se
redujo drásticamente durante la fase final del experimento. La evolución de la
concentración de ET solubles en el suelo ácido (DO) fue diferente respecto a la
observada en los suelos neutros (CO y AZ), mostrando concentraciones más altas al
principio del experimento con tendencia a bajar en el tiempo. Se observaron
diferencias significativas entre el primer muestreo y los siguientes.
Durante la monitorización del experimento de campo, las concentraciones
más altas de ET disponibles correspondieron al Cd y Zn (Capítulo V.5, Figura 2) en
el suelo DO, probablemente debido a un mayor contenido de estos dos metales en la
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
59
hojarasca y al pH ácido. Sin embargo, no se observaron diferencias importantes en
los valores de Cd y Zn entre los dos suelos neutros (RHU y AZ) en ninguno de los
muestreos realizados ni comparando profundidades. En general, tan sólo en el caso
del suelo ácido (DO), las concentraciones de estos dos elementos resultaron mayores
en la capa más profunda del suelo (20-40 cm).
En el experimento de microcosmos, cabe destacar que aunque los productos
resultantes en la descomposición de la hojarasca podrían influir en la
biodisponibilidad de ET, después de 40 semanas de incubación no se encontraron
aumentos en su concentración ni variaciones en el tiempo en ninguno de los suelos
contaminados. De la misma forma, en los experimentos en contenedores y de campo
ni la presencia de las plantas ni de hojarasca produjeron aumentos en la
disponibilidad de ET en el tiempo.
IV.3. PARÁMETROS QUÍMICOS Y BIOQUÍMICOS
Con el fin de evaluar los efectos de la hojarasca y de las plantas en la calidad
de los suelos se estudiaron algunos parámetros químicos y bioquímicos relacionados
con el ciclo del carbono y del nitrógeno.
IV.3.1. Ciclo del C
Los parámetros relacionados con el ciclo del C se vieron afectados por la
presencia de hojarasca y/o plantas en todos los suelos estudiados. En general,
excepto en algunos casos puntuales, los valores más altos de todos estos parámetros
se encontraron siempre en los suelos neutros (RHU, CO y AZ) respecto al suelo
ácido (DO). Además, en los suelos neutros, se obtuvieron diferencias significativas
entre tratamientos con hojarasca y/o con presencia de planta.
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
60
CH
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32
mg
kg
-1
0
100
200
300
400
500
600
700
RHU-L
RHU
MBC
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32
0
100
200
300
400
500
600
700
-glucosidasa
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
PN
F k
g-1
su
elo
h-1
0
100
200
300
400
500
600
700
mg
kg
-1
*
**
* *
** *
** *
*
*
*
**
*
*
* *
Figura IV.1. Valores de Carbono Hidrosoluble (CH), Carbono de la biomasa microbiana
(CBM) y actividad β-glucosidasa (β-glucosidasa) del suelo RHU en el experimento de
incubación. * Indica diferencias significativas entre valores correspondientes al mismo tiempo
(p<0,01).
IV.3.1.1. Carbono orgánico total (COT) y tasas de mineralización de la materia
orgánica (TM)
En el ensayo en microcosmos, el aporte de hojarasca incrementó de forma
similar los valores de COT en todos los suelos (Capítulo V.1, Tabla 6; Tabla IV.1).
Tabla IV.1. Carbono orgánico total (g kg-1
) y tasa de mineralización de la MO (TM) en el suelo
RHU a diferentes tiempos de incubación (T=0, 24 y 40 semanas) (entre paréntesis desviación
estándar; n=3).
SUELO
T=0 T=24 T=40
C (g kg-1
) C (g kg-1
) TMR C (g kg-1
) TMR
RHU 15,7 (0,12) 15,3 (0,13) 2,70 (0,82) 14,2 (0,05) 10,4 (4,72)
RHU-L 31,5 (0,10) 29,1 (0,10) 8,30 (0,11) 27,5 (0,15) 14,8 (2,44)
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
61
Durante el experimento de incubación en microcosmos se observó un
descenso del contenido en COT y un correspondiente aumento de la tasa de
mineralización (Capítulo V.1, Tabla 6; Tabla IV.1). Las mayores tasas de
mineralización después de las 40 semanas se observaron en los suelos neutros (CO,
AZ y RHU) especialmente con adición de hojarasca. Sin embargo, en el suelo ácido
las tasas de mineralización de C fueron mucho más bajas en los suelos con y sin
adicción de hojarasca.
En general, en el ensayo en contenedores, los contenidos de COT en los
suelos con plantas fueron siempre más altos comparados con sus respectivos
tratamientos sin plantas para todos los suelos (CO, AZ y DO), independientemente
de la contaminación, mostrando mayores diferencias al final del experimento
(Capítulo V.4, Tabla 3). Los valores más bajos de COT correspondieron al suelo
control (CO) durante los 3 años de estudio.
Durante la monitorización de campo, las concentraciones de COT se
mantuvieron siempre y en todos los suelos por debajo del 2%. Se apreciaron
cambios en este parámetro a lo largo del experimento: los valores iniciales de COT
fueron más altos en los suelos neutros (RHU y AZ), sufriendo un importante
descenso en el muestreo final en el caso de RHU, mientras que en los suelos
contaminados (AZ y DO) se mantuvieron constantes o incluso aumentaron
ligeramente. En las capas más superficiales (0-20 cm) se encontraron contenidos de
COT más altos respecto a las capas más profundas (20-40 cm) (Capítulo V.5, Tabla
1).
IV.3.1.2. Carbono hidrosoluble (CH)
En el experimento en microcosmos, los contenidos más altos de CH se
observaron para suelos con hojarasca, en particular para suelos neutros, siguiendo el
orden RHU ˃ AZ ˃ CO ˃ DO (Capítulo V.1, Figura 2; Figura IV.1.). La evolución
fue similar para todos los suelos y se caracterizó por el descenso de estos valores en
el tiempo.
La presencia de plantas, en el ensayo en contenedores, aumentó los valores
de CH en todos los suelos, aunque sólo se encontraron diferencias significativas para
los suelos AZ y DO entre los tratamientos con y sin plantas (Capítulo V.4, Figura 1).
Al igual que en el experimento en microcosmos, la evolución fue similar para los 3
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
62
suelos. Los valores más altos de este parámetro correspondieron a AZ-P mientras los
más bajos se encontraron en DO (Capítulo V.4, Figura 1).
En la monitorización de campo, durante los 2 años de estudio las
concentraciones de CH resultaron siempre más altas para los suelos neutros (RHU y
AZ) como se observó en los otros dos ensayos, y para la capa más superficial de los
mismos (0-20 cm) (Capítulo V.5, Figura 3). Por el contrario, en el suelo ácido (DO)
no se apreciaron diferencias entre las dos profundidades y los contenidos se
mantuvieron constantes durante todo el experimento.
IV.3.1.3. Carbono de la biomasa microbiana (CBM)
Como ocurría para el CH en el experimento de microcosmos, la presencia de
hojarasca produjo un incremento en CBM en los suelos neutros, aunque la evolución
de este parámetro en los tres suelos siguió un comportamiento diferente. Para los
suelos control (RHU y CO), con y sin hojarasca, se observó un aumento las primeras
semanas seguido de una estabilización y de un ligero descenso (Capítulo V.1, Figura
3; Figura IV.1). Para el suelo neutro contaminado (AZ) la tendencia fue diferente
dependiendo de la presencia o no de hojarasca. En el suelo sin hojarasca (AZ) los
valores se mantuvieron constantes durante todo el experimento mientras que en AZ-
L los contenidos iniciales muy altos de CBM bajaron en el tiempo. Por otro lado, el
CBM en el suelo ácido (DO) no se vio afectado por la presencia de hojarasca. De
hecho, sólo se observaron algunos aumentos significativos en momentos puntuales
para el tratamiento DO-L.
En el experimento en contenedores, los suelos neutros con presencia de
planta alcanzaron valores más altos de CBM que en el suelo sin planta, en particular,
CO-P en el segundo muestreo. Los contenidos más bajos se observaron en DO en
abril de 2011. En este ensayo la planta no produjo un claro efecto sobre los
contenidos de CBM en el suelo ácido excepto en el último de los muestreos
realizados (Capítulo V.3, Figura 2).
Para el ensayo de campo, los valores más altos se encontraron en la capa más
superficial y en el suelo neutro no contaminado (RHU), que alcanzó concentraciones
mayores de 500 mg kg-1
mientras que en el suelo AZ no superaron los 350 mg kg-1
.
Por el contrario, valores más bajos de CBM se encontraron en el suelo ácido
contaminado (DO) que se mantuvieron siempre por debajo de los 250 mg kg-1
(Capítulo V.5, Figura 4) y no se observaron apenas diferencias entre las dos
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
63
profundidades estudiadas. Comparando estos resultados con los obtenidos en el
experimento en microcosmos y en contenedores, resulta evidente que los valores
más altos se encuentran siempre en los suelos neutros (RHU y AZ) con respecto al
suelo ácido (DO).
IV.3.1.4. Actividad β-glucosidasa (β-gluc)
En el ensayo de microcosmos, la evolución de la actividad β-glucosidasa fue
similar para todos los suelos y, en general, se observaron aumentos significativos en
todos los suelos en los que se añadió hojarasca (Capítulo V.1, Figura 4). Los valores
de esta actividad en los suelos sin hojarasca se mantuvieron estables en el tiempo,
siendo los más altos aquellos encontrados en el suelo AZ. Para los suelos con
hojarasca se observó una disminución a lo largo del período de incubación.
En el experimento en contenedores, como ocurre para los otros parámetros
relacionados con el ciclo del C, los valores más altos de β-glucosidasa se
encontraron en los suelos con presencia de planta y especialmente en el suelo neutro
contaminado (AZ) (Capítulo V.4, Figura 3).
En general, durante los 2 años de monitorización del suelo en las zonas de
campo, los valores más altos se encontraron en los suelos neutros (RHU y AZ),
sobre todo el suelo contaminado (AZ) (Capítulo V.5, Figura 5), respecto al suelo
ácido contaminado (DO). Para los tres suelos, se observaron siempre diferencias
significativas entre las dos profundidades, con valores más altos en la capa más
superficial del suelo (0-20 cm). De nuevo, los resultados encontrados en la
monitorización de campo siguen la misma tendencia de los observados en los otros
dos ensayos.
IV.3.1.5. Respiración microbiana
Los parámetros relacionados con la respiración en los tres suelos estudiados
a tres tiempos de incubación (0, 24 y 40 semanas) se muestran en la Tabla 5
(Capítulo V.1.).
Los valores de la tasa máxima de crecimiento, µ, presentaron, en general,
una evolución similar en los tres tipos de suelo, con valores de µ mayores al final
que al comienzo del experimento. Sin embargo los valores del suelo control (CO)
fueron más altos que los obtenidos en los suelos contaminados (AZ y DO) en los
tiempos 24 y 40. Por otro lado, la presencia de hojarasca en los suelos redujo
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
64
significativamente la µ en la mayoría de los suelos y tiempos de incubación
estudiados.
Los valores del tiempo de desfase, tlag y del tiempo en alcanzar el valor
máximo, tpeak fueron más altos en el suelo ácido contaminado (DO) que en los suelos
neutros. Además, la presencia de hojarasca redujo significativamente estos tiempos
en la mayoría de suelos y tiempos (Capítulo V.1, Tabla 5). La Tabla 5 (Capítulo
V.1) muestra también cómo la evolución de estos dos parámetros se mantuvo similar
y constante durante todo el proceso de incubación.
En nuestro estudio, en la mayoría de los casos, los valores de RB fueron
similares en todos los suelos y para los distintos tiempos de incubación. La presencia
de hojarasca incrementó significativamente los valores de respiración basal
(Capítulo V.1, Tabla 5). Por otra parte, los valores de la respiración inducida por
sustrato (RS) fueron, en general, más altos en el suelo no contaminado con ET,
especialmente al comienzo de la incubación. En el caso de la respiración inducida
por sustrato (RS), la presencia de hojarasca sólo tuvo efectos en la fase inicial del
proceso de incubación. Sin embargo, a partir de la semana 24 ya no se observó una
variación relevante entre los valores obtenidos en los suelos con hojarasca y sin ella.
Según Stenström y col. (1998) la respiración inducida por sustrato se puede
dividir en la tasa de respiración de los organismos r (que comienzan a crecer en
respuesta a la adición de sustrato) y de los organismos K (que aumentan sus tasas de
producción de CO2 a un nivel constante). En el primer muestreo, los suelos sin
hojarasca presentaron una mayor proporción de organismos K (Capítulo V.1, Figura
5b) en comparación con los suelos con hojarasca (Capítulo V.1, Figura 5a). En el
muestreo intermedio, para los suelos con hojarascas, la actividad de los organismos r
disminuyó mientras que la actividad de la población K aumentó. Tendencia opuesta
se observó en los suelos sin hojarasca en el mismo muestreo.
De entre todos los parámetros estudiados relacionados con la respiración del
suelo, el tlag y tpeak parecen ser los que mejor reflejan el efecto de los metales en la
respuesta a los microorganismos del suelo. La correlación significativa entre los
metales, tlag y tpeak (Capítulo V.1, Tabla 4) evidenció el efecto tóxico de los
contaminantes sobre los microorganismos especialmente para alcanzar la tasa
máxima de respiración inducida.
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
65
IV.3.2. Ciclo del N
Los valores más altos de los distintos parámetros relacionados con el ciclo
del N, como ocurrió para el ciclo del C, se encontraron principalmente en los suelos
neutros (CO, RHU y AZ) en todos los ensayos.
Destacar que en el caso del suelo ácido contaminado (DO), en general, ni la
adición de hojarasca ni la presencia de las plantas produjeron diferencias
significativas en el suelo en los distintos experimentos en los parámetros
relacionados con el ciclo del N.
NO3-N-
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
kg
-1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
NH4-N+
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
kg
-1
0
1
2
3
4
5
6
CO-L
CO
Proteasa
Tiempo de incubación (semanas)
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
Tyr
kg
-1
-50
0
50
100
150
200
250
PNR
Tiempo de incubación (semanas)
0 4 8 16 24 32 40 57
mg
N k
g-1
d-1
0
2
4
6
8
10
12
14
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Figura IV.2. Valores de amonio (NH4-N+), nitrato (NO3-N
-), potencial de nitrificación (PNR) y
actividad proteasa (Proteasa) del suelo CO en el experimento de incubación. * Indica
diferencias significativas entre valores correspondientes al mismo tiempo (p<0,01).
IV.3.2.1. Mineralización del nitrógeno orgánico
En el ensayo de incubación en microcosmos, el contenido de N-Kjeldahl (N-
Kjel) de todos los suelos estudiados (RHU, CO, AZ y DO) aumentó por la adición
de hojarasca mostrando valores iniciales muy altos, sobre todo en el caso de RHU,
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
66
presentando diferencias significativas entre los dos tratamientos (con y sin
hojarasca) en todos los muestreos (Capítulo V.2, Tabla 3; Tabla IV.2).
Tabla IV.2. N-Kjeldhal (g 100 g-1
) en el suelo CO a diferentes tiempos de incubación (T=0, 24 y
40 semanas) (entre paréntesis desviación estándar; n=3). * Indica diferencias significativas
entre valores correspondientes al mismo tiempo (p<0,01).
SUELO T=0 semana T=24 semanas T=40 semanas
CO 0,05 (0,00) 0,04 (0,00) 0,04 (0,00)
CO-L 0,09* (0,01) 0,12* (0,01) 0,11* (0,00)
Sin embargo, estos valores tendieron a disminuir ligeramente a lo largo del
experimento en todos los suelos, excepto para CO donde los valores se mantuvieron
generalmente constantes a lo largo del tiempo (Tabla IV.2).
Los valores de amonio (NH4-N+) se mantuvieron por debajo de 6 mg kg
-1
para RHU, CO y AZ (Capítulo V.2, Figura 1; Figura IV.3) mientras que en el suelo
DO alcanzaron los valores más altos entre las 8 y 24 semanas, sobre todo en el
tratamiento con presencia de hojarasca, alcanzando valores alrededor de 12 mg kg-1
en la semana 16.
En suelos neutros (RHU, CO y AZ), especialmente en aquellos con la
adición de hojarasca, después de un período de inmovilización inicial, se observó un
aumento de NO3-N- (Capítulo V.2, Figura 2). En el suelo AZ-L, el incremento del
contenido de NO3-N- continuó incluso después de 40 semanas de incubación. Es
probable que el tiempo de incubación no fuera suficiente para completar la
mineralización del N en estos suelos. Para probar la existencia de la estabilización
final en el proceso de mineralización del N el experimento de incubación se
prolongó hasta la semana 57, tiempo en el que se observa la estabilización (Capítulo
V.2, Figura 2; Figura IV.2). Sin embargo, los valores NO3-N- para el suelo ácido
contaminado fueron siempre más bajos, se mantuvieron constantes en el tiempo y no
presentaron diferencias entre tratamientos (Capítulo V.2, Tabla 3 y Figura 2,
respectivamente).
Con el fin de interpretar de manera más directa los datos obtenidos para la
mineralización del nitrógeno en el experimento en microcosmos, los valores de
nitrato obtenidos en cada tiempo se modelizaron ajustándose a una ecuación de
cinética de primer orden.
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
67
La mineralización del N de los suelos control (RHU) sin hojarasca se ajustó
al modelo de la ecuación de cinética de primer orden durante todo el experimento,
mientras que en el suelo neutro contaminado (AZ) solo pudo realizarse el ajuste
hasta la semana 24 (Capítulo V.2, Figura 4 y Tabla 4). No se encontraron diferencias
significativas para los valores de N0 (N potencialmente mineralizable) entre los
suelos sin adición de hojarasca. En el caso de suelos neutros con adición de
hojarasca (RHU-L, CO-L y AZ-L) el ajuste se realizó a partir de la cuarta semana de
incubación. Los valores de N0 para estos suelos oscilaron entre 203 y 285 mg kg-1
aunque no se apreciaron diferencias significativas.
En general, los valores de k (velocidad de mineralización) fueron similares
para los suelos neutros sin hojarasca. Por otro lado, los valores de k de suelos
neutros con hojarasca fueron siempre más bajos en comparación con el tratamiento
sin hojarasca.
Para el suelo ácido contaminado con hojarasca (DO-L), se observaron
valores de mineralización del N mucho más bajos que en los otros suelos (Capítulo
V.2, Tabla 4) y no pudieron ajustarse a ningún modelo de ecuación.
La tasa potencial de mineralización (N0*k) para todos los suelos varió de
1,31 a 3,02 mg kg-1
semana-1
para suelos sin hojarasca y de 3,00 a 6,13 mg kg-1
semana-1
para suelos con adición de hojarasca, pero las diferencias no fueron
significativas entre suelos con y sin hojarasca.
En el experimento en contenedores, el contenido de N-Kjel, en la fase inicial
del experimento, fue, en general, más alto en los suelos contaminados (AZ y DO)
que en el suelo control (CO). Estos valores (con y sin planta) fueron similares
durante todo el experimento y, ligeramente más bajos en los suelos sin plantas. En el
suelo ácido contaminado (DO) se observó un leve incremento en ambos tratamientos
en el último muestreo, sobre todo en el suelo sin planta (Capítulo V.4, Tabla 3).
La evolución del NH4-N+ fue parecida para los suelos neutros (CO y AZ) con
tendencia a bajar en el tiempo, sin diferencias relevantes entre tratamientos (con y
sin plantas). En el suelo ácido (DO) se observaron altos contenidos de NH4-N+ al
principio del experimento, mayores que los suelos neutros, alcanzando su máximo
en los primeros dos muestreos y seguido de un descenso en el tiempo (Capítulo V.4,
Figura 4).
Los valores más altos de NO3-N- se encontraron en los suelos contaminados
sin planta (AZ y DO), sobre todo en Octubre 2010 (Capítulo V.4, Figura 4). En los
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
68
suelos con planta, las concentraciones de NO3-N- se mantuvieron por debajo de 20
mg kg-1
, excepto en el suelo ácido contaminado (DO) donde los valores alcanzaron
los 60 mg kg-1
. En los tratamientos sin plantas los contenidos más altos fueron de 60
mg kg-1
para AZ y de 80 mg kg-1
para DO. En el caso del suelo control (CO), los
valores de NO3-N- generalmente fueron más bajos que los de los suelos
contaminados, sobre todo para el tratamiento sin planta. Además, excepto unas
fluctuaciones puntuales, los contenidos de nitrato de este suelo se mantuvieron
constantes.
A diferencia de lo encontrado en el experimento en contenedores, los
resultados obtenidos en la monitorización de las zonas de campo mostraron, en
general, valores más altos de NO3-N- para el suelo suelo control (RHU). La
evolución del nitrato para el suelo RHU presentó bastantes fluctuaciones. Los suelos
contaminados (AZ y DO) presentaron valores muchos más bajos de NO3-N- y
similares en las dos profundidades estudiadas. En el suelo neutro contaminado (AZ)
el contenido de NO3-N- se mantuvo constante en el tiempo mientras que en el suelo
ácido contaminado (DO) se observó una tendencia a la disminución a lo largo del
experimento.
Por otra parte, los valores de NH4-N+ fueron similares en los suelos neutros
(RHU y AZ), independientemente de la contaminación propia del suelo, en las dos
profundidades (0-20 cm y 20-40 cm). Las concentraciones de NH4-N+ en el suelo
ácido (DO) fueron más altas que las de los suelos neutros aunque también tendieron
a bajar en el tiempo (Figura IV.3).
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
69
NH4-N
+
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
1
mg
kg
-1
0
5
10
15
20
0-20
20-40
RHU
AZ
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
10
5
10
15
20
mg
kg
-1
DO
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
10
5
10
15
20
mg
kg
-1RHU
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
10
2
4
6
8
10
12
14
16
NO3-N
-
AZ
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
10
2
4
6
8
10
12
14
16
DO
Oct
200
9
Abri
l 201
0
Oct
201
0
Abri
l 201
1
Oct
201
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16*
*
*
*
*
Figura IV.3. Valores de amonio (NH4-N+) y nitrato (NO3-N
-) en el experimento de campo.
* Indica diferencias significativas entre valores correspondientes al mismo tiempo (p<0,01).
IV.3.2.2. Potencial de nitrificación del suelo (PNR)
En general la presencia de hojarasca y planta aumentó los valores de PRN en
los suelos neutros.
En particular, en el experimento de microcosmos los valores de PNR
aumentaron hasta la semana 24 en el suelo RHU mientras que los de CO y AZ
siguieron subiendo hasta la semana 40 (Capítulo V.2, Figura 3; Figura IV.2). En el
suelo ácido (DO) se encontraron valores mucho más bajos, cercanos a 0 (incluso
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
70
negativos), durante todo el período de incubación (Capítulo V.2, Figura 3; Figura
IV.2).
En los ensayos en contenedores y en campo la evolución del PNR para
suelos neutros fue parecida durante todo el experimento. Los valores más altos en el
experimento en contenedores se observaron para los tratamientos con plantas para
todos los suelos, aunque sin presentar diferencias significativas entre tratamientos en
la mayoría de los casos. En la monitorización de campo los valores más altos se
encontraron en la capa más superficial del suelo (0-20 cm) en los suelos neutros. De
nuevo los valores de PRN en ambos experimentos fueron muy bajos en el suelo
ácido, (Tabla IV.3), confirmando lo obtenido en los experimentos de microcosmos.
Tabla IV.3. Valores medios del potencial de nitrificación (mg N kg-1
d-1
) en los tres suelos
estudiados en el experimento en contenedores y de campo en dos años consecutivos (Oct 2010 y
Oct 2011) (entre paréntesis desviación estándar; n=3). Experimento en contenedores: * Indica
para cada año diferencias significativas entre tratamientos (p<0,01). Experimento de campo: *
Indica para cada año diferencias significativas entre profundidades (p<0,01).
Experimento Año CO CO-P AZ AZ-P DO DO-P
Contenedores 2010
2,03
(0,82)
2,05
(0,47)
1,91
(0,12)
2,56
(0,51)
0,52
(0,82)
1,12
(0,65)
2011
3,18
(1,44)
3,41
(1,22)
2,84
(1,03)
3,11
(0,28)
0,01
(0,11)
0,31
(0,57)
Campo
RHU
(0-20 cm)
RHU
(20-40 cm)
AZ
(0-20 cm)
AZ
(20-40 cm)
DO
(0-20 cm)
DO
(20-40 cm)
2010
10,2
(1,72)
2,00*
(0,66)
7,88
(0,57)
2,03*
(0,20)
0,17
(0,06)
0,10
(0,03)
2011
5,85
(0,95)
3,44
(0,69)
2,67
(0,23)
2,44
(0,24)
0,15
(0,04)
0,00*
(0,00)
IV.3.2.3. Actividad proteasa
La actividad proteasa se vio positivamente estimulada por la adición de
hojarasca y/o la presencia de plantas, aunque con efectos diferentes dependiendo del
tipo de ensayo.
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
71
En el experimento de microcosmos se apreció la influencia de la hojarasca en
esta actividad sobre todo en los suelos neutros (CO, RHU y AZ). La evolución
general fue similar para todos los suelos, caracterizada por un marcado aumento en
las primeras 2 semanas de incubación y seguida de una disminución en el tiempo
(Capítulo V.2, Figura 6; Figura IV.2).
En el ensayo en contenedores, las plantas estimularon la actividad proteasa
principalmente en los suelos contaminados (AZ-P y DO-P), alcanzando valores
máximos de 120 mg kg-1
para AZ-P y 100 mg kg-1
para DO-P (Capítulo V.4, Figura
5).
Durante la monitorización en campo, de acuerdo con los resultados
observados para los otros dos experimentos, parece que la presencia de la planta y de
hojarasca fue capaz de estimular la actividad proteasa en todos los suelos en el
tiempo, independientemente del valor de pH y de la contaminación del suelo, y en
ambas profundidades (0-20 cm y 20-40 cm) (Capítulo V.5, Figura 6).
IV.4. NUTRIENTES Y ELEMENTOS TRAZA (ET) EN ÁLAMO BLANCO
En los experimentos en contenedores y en campo se evaluó el estado
nutricional y el contenido de ET de las plantas.
Para ambos ensayos la evolución de las concentraciones de los nutrientes en
hojas fue muy parecida. En particular, los valores de N, K y P fueron más altos en el
suelo control (CO en experimento en contenedores y RHU en experimento de
campo) que en los suelos contaminados (AZ y DO) (Tabla IV.4; Capítulo V.5, Tabla
2). Cabe destacar, que en el experimento en contenedores en el año 2010 (Tabla
IV.2) las concentraciones de estos nutrientes fueron ligeramente más altas o
parecidas en suelos contaminados (AZ y DO) respecto al suelo control (CO). Aun
así, los valores de N, K y P en el suelo control de los contenedores (CO) fueron
mucho más bajos que los propuestos por Reuter y Robinson (1997) para las hojas de
Populus deltoides.
Para otros elementos mayoritarios como Ca, Mg y S, en el experimento en
contenedores se observó un comportamiento distinto a lo encontrado para N, K y P.
Las concentraciones iniciales de estos nutrientes fueron similares en el suelo control
(CO) que en los suelos contaminados (AZ y DO). Con el tiempo, los contenidos de
Ca tienden a subir en los suelos contaminados (AZ y DO), alcanzando valores
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
72
mucho más altos que en el suelo control (CO). Por otro lado, los valores de Mg y S
bajaron ligeramente a lo largo del experimento aunque se mantuvieron más o menos
parecidos entre los diferentes suelos (Tabla IV.4).
En la monitorización de campo los valores de Ca, Mg y S también
presentaron comportamiento opuesto respecto a los de N, K y P, y sus
concentraciones fueron en general más altas en suelos contaminados (AZ y DO) que
en el suelo control (RHU) (Capítulo V.5, Tabla 2) durante los 2 años de
seguimiento.
En ambos ensayos la evolución de los metales en las hojas de álamos blancos
sufrió variaciones dependiendo del elemento estudiado.
Para el experimento en contenedores, en los suelos neutros las
concentraciones de Cu, Mn y Pb se mantuvieron en los intervales normales para
plantas superiores (Kabata-Pendias y Pendias, 1992) durante toda la
experimentación (excepto los valores de Pb en el primer muestreo que fueron más
altos, pero bajaron drásticamente a partir del segundo muestreo) (Capítulo V.3,
Figura 7).
Por otro lado, los valores de Cd y Zn estuvieron estrechamente relacionados
con sus concentraciones en el suelo. En el suelo neutro contaminado (AZ) los
valores de Cd y Zn se mantuvieron por encima de los niveles considerados normales
en planta durante todo el experimento (entre 5,70 y 7,94 mg kg-1
para Cd y entre 260
y 290 mg kg-1
para Zn) mientras que los valores de Cd y Zn en el suelo control (CO)
fueron siempre mucho más bajos (entre 0,10 y 0,58 mg kg-1
para Cd y entre 35,0 y
123 mg kg-1
para Zn) (Capítulo V.3, Figura 7).
En las hojas provenientes de los álamos de los contenedores que crecieron en
suelo ácido contaminado (DO) las concentraciones de ET fueron siempre más altas
que en ambos suelos neutros (CO y AZ), con diferencias significativas en varios
muestreos. En general, se apreció un fuerte incremento para Cd, Mn y Zn en el
segundo muestreo, alcanzando sus máximos (17,0 mg kg-1
para Cd, 480 mg kg-1
para Mn y 650 mg kg-1
para Zn). A partir de ese momento se observó un descenso
en la concentración de estos elementos. La evolución de Cu y Pb en este suelo
mostró una tendencia parecida a la encontrada en los suelos neutros. De hecho, se
notó una fuerte disminución a partir del principio del experimento y las
concentraciones se mantuvieron más bajas en el tiempo (entre 7,00 y 17,0 mg kg-1
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
73
para el Cu y entre 0,01 y 0,85 mg kg-1
para el Pb, excluyendo los valores del primer
muestreo) (Capítulo V.3, Figura 7).
Tabla IV.4. Concentraciones de nutrientes (g 100g-1
) en hojas de los tres suelos estudiados en el
experimento en contenedores en dos años consecutivos (Oct 2010 y Oct 2011) (entre paréntesis
error estándar; n=3). Para cada año valores seguidos de la misma letra en la misma columna
para suelos diferentes no difieren estádisticamente (p<0,01).
Hoja Año N K P Ca Mg S
CO 2010
1,90 a
(0,12)
0,66 a
(0,04)
0,14 a
(0,01)
2,69 a
(0,09)
1,12 a
(0,17)
0,27 a
(0,02)
AZ
2,04 a
(0,25)
0,67 a
(0,05)
0,15 a
(0,02)
2,41 a
(0,31)
0,96 b
(0,20)
0,26 a
(0,02)
DO
2,16 a
(0,24)
0,62 a
(0,02)
0,13 a
(0,00)
2,60 a
(0,21)
0,98 b
(0,24)
0,28 a
(0,01)
CO 2011
1,87 a
(0,59)
0,82 a
(0,27)
0,18 a
(0,09)
1,76 a
(0,47)
0,80 a
(0,20)
0,23 a
(0,03)
AZ
1,45 a
(0,07)
0,42 a
(0,06)
0,10 a
(0,01)
2,21 a
(0,05)
0,75 a
(0,05)
0,22 a
(0,02)
DO
1,58 a
(0,06)
0,41 a
(0,02)
0,11 a
(0,01)
2,29 a
(0,09)
0,66 a
(0,06)
0,23 a
(0,00)
Las concentraciones de ET en las hojas de álamo, durante los dos años de
monitorización en el campo, se mantuvieron constantes en el tiempo, excepto para
los contenidos de Cd y Zn. En general, los valores de Cu, Mn y Pb fueron parecidos
o hasta mayores en el suelo control (RHU) que en suelo neutro contaminado (AZ),
siempre dentro de los niveles considerados normales para plantas, pero más bajos de
los valores encontrados en el suelo ácido contaminado (DO). Sin embargo y como
ocurría en el ensayo en contenedores, las concentraciones de Cd y Zn en los suelos
contaminados (AZ y DO) fueron significativamente más altas que las de los otros
metales y por encima de los valores considerados normales, alcanzando hasta 5,54
mg kg-1
para el Cd y 860 mg kg-1
para el Zn en el suelo DO (Capítulo V.5, Tabla 3).
IV. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS
74
El Cd y Zn en las plantas de los suelos neutros (RHU y AZ) mostraron contenidos
más bajos respecto a las plantas del suelo ácido (DO).
IV.5. SEGUIMIENTO DEL DESARROLLO DEL ÁLAMO BLANCO
Además de todos los análisis químicos y bioquímicos efectuados en los
suelos y en las plantas, durante los 3 años de estudio en el experimento en
contenedores se llevó a cabo la monitorización de los parámetros de crecimiento de
las plantas de álamo blanco para determinar la respuesta de las mismas a la
contaminación del suelo.
Se registró la altura y el diámetro del tronco de los álamos mensualmente
durante los 3 años de estudio. La altura de las plantas en suelos neutros (CO y AZ)
fue superior (hasta 150 cm para CO y 138 cm para AZ en el otoño de 2010) que en
el suelo ácido durante el primer año de estudio (Capítulo V.3, Tabla 3). Una
tendencia similar se observó para el diámetro del tronco que se caracterizó por
valores siempre más altos en los suelos neutros (Capítulo V.3, Tabla 3).
En general, las plantas que crecieron en el suelo ácido (DO) necesitaron más
tiempo para su desarrollo y se encontró un fuerte incremento sólo durante el último
año del experimento, llegando a valores de altura superiores a los obtenidos en los
suelos neutros, hasta alcanzar los 167 cm durante la primavera del 2011. En el suelo
ácido el diámetro del tronco de los álamos aumentó lentamente y alcanzó 31,8 mm
en el último muestreo, lo que demuestra una fuerte conexión con los valores de
altura (Capítulo V.3, Tabla 3).
La biomasa total de los árboles (sin raíces), después de tres años de
crecimiento, fue de 770 ± 18 g en el suelo control (CO), 910 ± 20 g en el suelo
neutro contaminado (AZ) y 920 ± 80 g en el suelo ácido contaminado (DO).
V. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
V.1. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
77
V.1. TRACE ELEMENT RICH LITTER IN SOILS. INFLUENCE ON
BIOCHEMICAL PROPERTIES RELATED WITH CARBON CYCLE.
RESUMEN
Hojarasca rica en elementos traza en suelos. Influencia sobre las propiedades
bioquímicas relacionadas con el ciclo del carbono.
El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la "hojarasca rica en
elementos traza" en las propiedades de dos suelos contaminados reforestados, con
diferentes valores de pH (ácido y neutro) evaluando: i) la disponibilidad de los
elementos traza y ii) propiedades químicas y bioquímicas de los suelos con
diferentes pH. Se hipotetizó que esta hojarasca podría afectar a varios parámetros
relacionados con el ciclo del C en el suelo, en función del pH inicial del mismo.
El experimento se llevó a cabo en tres suelos diferentes: un suelo no
contaminado (NP / CO en la memoria) y dos suelos contaminados con elementos
traza (PN / AZ en la memoria, suelo neutro, y PA / DO en la memoria, suelo ácido) .
Las muestras de suelo se colocaron en microcosmos de 2.000 cm3 y se incubaron
durante 40 semanas en condiciones controladas. Cada suelo se mezcló con su
correspondiente hojarasca, NP-L (CO-L en la memoria), PN-L (AZ-L en la
memoria), PA-L (DO-L en la memoria), y se prepararon suelos sin adición de
hojarasca como comparación. Se midieron las propiedades bioquímicas, el carbono
de la biomasa microbiana (CBM), la actividad β-glucosidasa, y las propiedades
químicas, el pH, la concentración de elementos traza extraíbles con CaCl2, el
carbono orgánico total (COT) y el carbono hidrosoluble (CH) después de 0, 2, 4, 8,
16, 24, 32 y 40 semanas de incubación. Los parámetros relacionados con la
respiración del suelo (respiración basal (RB), la respiración inducida por sustrato
(Rs), la tasa de crecimiento (μ), el tiempo de desfase (tlag) y el tiempo de adición del
sustrato hasta el pico de la tasa de respiración máxima (tpeakmax), se midieron después
de 0, 24 y 40 semanas de incubación.
Los contenidos de elementos traza disponibles no aumentaron durante la
incubación y fueron siempre mayores en el suelo con pH ácido. La hojarasca
aumentó los valores de CH, CBM y β-glucosidasa, así como los valores de RB y RS,
especialmente al comienzo de la incubación. Las tasas de mineralización de materia
V.1. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
78
orgánica, CBM y algunos parámetros relacionados con la respiración del suelo (tlag y
tpeak) se vieron fuertemente afectados por el pH ácido y la contaminación del suelo
con y sin hojarasca. Todas estas propiedades se relacionaron significativamente con
el pH y, en menor medida, con la biodisponibilidad de elementos traza.
La acidez y la disponibilidad de elementos traza afectan a la descomposición
de la materia orgánica y los parámetros relacionados con el ciclo del C, como el
CBM y la respiración del suelo. Sin embargo, a pesar de la adición de metales
pesados a través de la hojarasca en el suelo contaminado, la entrada de materia
orgánica proveniente de la hojarasca es más beneficiosa que la eliminación de la
misma, debido a los efectos positivos que esta provoca en todos los parámetros
relacionados con el ciclo del C.
SOILS, SEC 1 • SOIL ORGANIC MATTER DYNAMICS AND NUTRIENT CYCLING • RESEARCH ARTICLE
Trace element-rich litter in soils: influence on biochemicalproperties related to the carbon cycle
Paula Madejón & Pedro Soler-Rovira &
Lisa Ciadamidaro & Francisco Cabrera &
Engracia Madejón
Received: 12 May 2011 /Accepted: 21 February 2012 /Published online: 7 March 2012# Springer-Verlag 2012
AbstractPurpose The aim of this work was to study the effect of ‘traceelement-rich litter’ on the properties of two reforested pollutedsoils of different pH values (acidic and neutral) in terms of (1)availability of trace elements and (2) chemical and biochemicalproperties of the soil at different pH. We hypothesized that thislitter would affect several parameters related to the organicmatter cycle in soils, depending on initial soil pH.Materials and methods The experiment was carried out inthree different soils: a non-polluted soil (NP) and two traceelement-polluted soils (PN, neutral soil, and PA, acidic soil).Soil samples were placed in 2,000-cm3 microcosms and wereincubated for 40 weeks in controlled conditions. Each soil wasmixed with its corresponding litter, NP-L, PN-L and PA-L, andsoils without litter were also tested for comparison. Microbialproperties such as microbial biomass carbon (MBC),β-glucosidase activity and chemical properties such as pH,CaCl2-soluble heavy metal concentrations, total organic car-bon and water-soluble carbon (WSC) were measured after 0, 2,4, 8, 16, 24, 32 and 40 weeks of incubation. Parameters relatedto soil respiration (basal respiration (RB), substrate-inducedrespiration (Rs), growth rate (μ), lag time (tlag) and time fromsubstrate addition until peak of maximum respiration rate(tpeakmax)) were measured after 0, 24 and 40 weeks ofincubation.
Results and discussion Available trace elements did not in-crease during the incubation and were always higher in soilwith acid pH. Litter increased values of WSC, MBC andβ-glucosidase as well as RB andRS, especially at the beginningof the incubation. Organic matter mineralization rates, MBCand some parameters related to soil respiration (tlag and tpeak)were strongly affected by soil pollution with and without litter.All these properties were strongly related with pH and, to alesser extent, with a higher trace element bioavailability in soils.Conclusions Acidity and trace element availability stronglyaffect organic matter decomposition and parameters relatedwith the C cycle, such as MBC and soil respiration. However,despite heavy metal addition through the litter in polluted soil,organic matter input from litter is more beneficial than theremoval of leaves from the soil, due to the positive effects thatthis causes in all parameters related to the C cycle.
Keywords Carbon cycle . Microbial biomass carbon . Soilcontamination . Soil respiration
1 Introduction
In forest ecosystems, litter fall is the main source of organicmatter and nutrients for the humus layer (Kuzyakov andDomanski 2000). The quality and quantity of litter fall influ-ence the nature of the microbial community, including its size,composition and function (Kooijman andMartinez-Hernández2009). Decomposition of organic matter is a key process in thecycling of essential elements within ecosystems (Aber andMelillo 2001). Low decomposition, resulting from harsh cli-mate, acidic conditions, limited supply of essential nutrientsand the presence of organic or inorganic pollutants, can lead toan accumulation of organic matter in soil and to immobiliza-tion of essential nutrients (Swift et al. 1979).
Responsible editor: Caixian Tang
P. Madejón (*) : L. Ciadamidaro : F. Cabrera : E. MadejónInstituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla(IRNAS), CSIC,Avenida Reina Mercedes 10, P.O. Box 1052, 41080 Seville, Spaine-mail: [email protected]
P. Soler-RoviraInstituto de Ciencias Agrarias, Consejo Superior deInvestigaciones Científicas,Serrano 115 dpdo.,28006 Madrid, Spain
J Soils Sediments (2012) 12:663–673DOI 10.1007/s11368-012-0493-1
Soil pollution by trace elements is a potential cause ofdisturbance of organic matter cycling in terrestrial ecosystems.Several authors have reported that free heavy metal and metal-loids present in the ionic form at elevated concentrations in thesoil solution may be toxic to the soil microflora (Bååth 1989;Pérez-de-Mora et al. 2008). Moreover these metals in the soilsolution may inactivate extracellular enzymes responsible forthe cycling of many nutrients (Kandeler et al. 1996). Theymay thus limit the biodegradation of the organic matter andcause nutrient deficiency. In fact, many authors have observedan increase of litter accumulation near the sources of pollutantemission (Cotrufo et al. 1995; Lomander and Johanson 2001).Processes by which trace elements may slow down the de-composition of organic matter in soils are numerous, but theirrespective contribution to the overall observed effect remainsinsufficiently documented.
The use of fast-growing trees that are well adapted todifferent edapho-climatic conditions is an increasingly com-mon practice in many regions of the world. Many of thetrees with rapid growth such as those of the Salicaceaefamily accumulate trace elements in their leaves. These aredeciduous trees that lose all of their leaves for part of theyear. Their plantation in wide areas would cause, after theautumnal fall, the presence of an extensive ‘carpet’ of litterloaded with heavy metals, which is not always viable toremove entirely. There is little information regarding theinfluence of this heavy metal-rich litter on the propertiesof the reforested soils (Scheid et al. 2009), especially thebiochemical properties involved in the dynamics ofnutrients and organic matter under semi-arid conditions.
The aim of this study was to determine the effect of this‘trace element-rich litter’ on (1) availability of trace elementsand (2) chemical and biochemical properties of soils of differ-ent pH. We hypothesized that this litter would influenceseveral parameters related to the organic matter cycle in soilsand consequently soil health. We want also to assess anybenefit, if any, of removing the contaminated litter from thesoil. To test these hypotheses, microcosm studies were carriedout.We studied the dynamics of various chemical (pH, solubletrace element concentrations, total organic C, water-soluble C)and microbiological properties (microbial biomass C,β-glucosidase activity, soil respiration parameters) as a tool
to evaluate the effects of the litter on two trace element-polluted soils with different pH.
2 Materials and methods
2.1 Experimental design
The experiment was carried out using three different soils: anon-polluted soil (NP) and two trace element-polluted soils(PN, neutral soil, and PA, acidic soil). Soil NP was sampledin an experimental farm of the Instituto de Recursos Natu-rales y Agrobiología de Sevilla located in Coria del Rio,Seville (37°17′08″ N, 6°04′1.5″ W) (Table 1). Both traceelement-polluted soils, PN and PA, were collected in thearea affected by a mine spill (southwest of Spain, Grimalt etal. 1999) in spots where Populus alba trees were growing(37°18′4.7″ N, 6°15′39.1″ W, PN, and 37°23′42.5″ PA,6°13′36.4″ W, DO) (see Table 1). Soils were collected fromthe upper (0–25-cm) soil. Values of pH in PA soils wereextremely acid due to the acidic origin of the soil and theeffect of this mine spill (very acidic). Soils from PA are in ariparian area where the remove of sludge from the soil wasvery difficult. All this caused this low pH. Similar pH valuesin the area have been reported by Domínguez et al. (2008).
Litter samples were also collected in these two pollutedareas. For the NP, litter from a non-polluted riparian forestwas collected. Table 2 shows the most relevant character-istics of the litter samples.
The soil samples were placed in microcosms of2,000 cm3 (1,500 g per microcosm). Each soil was mixedwith its corresponding litter (NP-L, PN-L, PA-L). The doserate of the litter was calculated according to the litter dryweight at field conditions in PN and PA in an area of 25×25 cm. This weight was extrapolated to the microcosm area(85 g per microcosm). Soils without litter addition were alsotested (NP, PN, PA). A randomised complete block designwith three replicates per treatment and soil was used. Dis-tilled water was added to bring the soil moisture to 70% ofits water-holding capacity. The incubation was performed ina growth chamber at 28°C. Water losses were compensatedby adding distilled water during the experiment. Samples
Table 1 Soil pH, texture and total concentrations of heavy metals of the studied soils
Soil pH Sand Silt Clay As Cd Cu Pb Zng kg−1 mg kg−1
NP 7.50 (0.07) 869 15 115 8.4 (1.90) 0.59 (0.05) 19.4 (2.0) 15.7 (0.40) 52.0 (3.30)
PN 7.20 (0.19) 393 346 263 112 (5.30) 3.82 (0.15) 166 (6.20) 236 (13.5) 506 (15.0)
PA 2.70 (0.21) 790 60 150 290 (14.8) 3.53 (0.10) 193 (10.4) 391 (25.0) 227 (9.30)
Standard deviations are in brackets (n06)
664 J Soils Sediments (2012) 12:663–673
were taken after 0, 2, 4, 8, 16, 32 and 40 weeks ofincubation.
2.2 Litter analysis
Litter material was oven-dried at 70°C to constant weightand then sieved. Total organic matter was determined by theweight loss after dry combustion at 540°C, and organiccarbon was estimated by multiplying organic matter by0.58 (Commission of the European Communities 2006).The pH was measured using a pH meter (CRISON micropH 2002) in a 1/2.5 sample/1 M KCl extract after shakingfor 1 h. Klason lignin content was determined according toTappi T222 om-88 regulation, with some modifications.
Litter was digested by wet oxidation with concentratedHNO3 under pressure in a microwave digester. Analysis oftrace elements (As, Cd, Cu, Pb and Zn) in the extracts wasperformed by inductively coupled plasma optical emissionspectrometry (ICP-OES). Available trace element contentfrom the litter was carried out with 0.01 M CaCl2 extractionusing a sample extraction ratio of 1:10. Analysis of traceelements was performed by ICP-OES.
2.3 Soil chemical properties determination
Soil pH in the 1/2.5 sample/1 M KCl extract and the 0.01 MCaCl2 extractable trace element concentrations were deter-mined following the methods described above for litter.Pseudo-total trace element concentrations in soil (<60 μm)were determined by ICP-OES following aqua regia digestionin a microwave oven (ISO 1995). Total organic carbon (TOC)in soil was analysed by dichromate oxidation and titrationwith ferrous ammonium sulphate (Walkley and Black 1934).Water-soluble carbon (WSC) content was determined on us-ing a TOC-VE Shimadzu analyser after extraction with waterusing a sample-to-extractant ratio of 1:10.
2.4 Soil microbiological properties determination
Due to their relation to soil functionality, the soil microbialpopulation and activity have been proposed as useful indica-tors of soil improvement and soil degradation. Microbialbiomass carbon (MBC) content was determined by the chlo-roform fumigation–extraction method modified by Gregorichet al. (1990). Concentration of C in the extract was measuredby a TOC-VE Shimadzu analyser. An extraction efficiencycoefficient of 0.38 was used to convert the difference insoluble C between the fumigated and the unfumigated soil toMBC (Vance et al. 1987). β-Glucosidase activity was mea-sured as described by Tabatabai (1982) after incubation of soilwith p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside and measurement ofPNP absorbance at 400 nm.T
able
2Total
organiccarbon
,lig
ninandtraceelem
entcontent(inmilligramsperkilogram
)of
each
used
litter
Litter
CpH
Lig
As
Cd
Cu
Pb
Zn
Cd
Cu
Zn
gkg
−1
gkg
−1
mgkg
−1
mgkg
−1
(Total
content)
(CaC
l 2-solub
lecontent)
NP
85.8
(0.46)
5.20
(0.21)
32.4
(0.09)
2.61
(0.31)
0.74
(0.10)
13.9
(1.59)
2.74
(0.23)
163(8.74)
0.46
(0.09)
4.61
(0.25)
32.5
(6.52)
PN
83.1
(4.36)
5.25
(0.12)
33.9
(1.66)
2.68
(0.21)
3.20
(0.91)
17.9
(3.64)
4.05
(2.00)
289(69.2)
1.31
(0.22)
7.11
(0.35)
69.3
(9.36)
PA79
.3(0.68)
5.53
(0.25)
35.3
(0.35)
22.4
(9.31)
5.26
(0.97)
82.0
(25.0)
49.4
(11.2)
647(117
)1.92
(0.45)
51.2
(1.58)
364(51.2)
Stand
arddeviations
arein
brackets(n06)
J Soils Sediments (2012) 12:663–673 665
2.5 Soil respiration
Soil respiration was measured by a pressure sensor method(OxiTop, WTW, Weiheim, Germany) and according to theInternational Standard ISO 17155 (ISO 2002). Moist soilsamples (40–60%WHC)were pre-incubated for 3 days insidea thermostatic chamber (20±1°C). Then O2 consumption wasmeasured at 1-h intervals until constant respiration rates wereattained to determine basal respiration (RB). The substrate-induced respiration (Rs) was determined on each soil sampleby adding 0.2 g of a substrate mixture (80 g glucose, 13 g(NH4)2SO4 and 2 g KH2PO4) per gram of organic matter, andthen, O2 consumption was measured hourly until the respira-tion rate declined. The substrate-induced respiration (RS) wascalculated shortly after substrate addition and before the ex-ponential growth of the respiration rate. The data from theexponential phase were fitted with the Statgraphics 5.1. soft-ware by a non-linear regression using the Marquardt estima-tion procedure with iterative process to determine the equationparameters that minimize the residual sum of squares. Thefollowing parameters were obtained: growth rate (μ), lag time(tlag) and time from substrate addition until peak of maximumrespiration rate (tpeakmax). The respiratory activation quotient(QR) was calculated as RB/Rs. According to Stenström et al.(1998), the substrate-induced respiration (SIR) at the time ofsubstrate addition is SIR0r+K, from where the initial respi-ration rates of growing (r) and non-growing (K) microorgan-isms were calculated. Parameters related with soil respirationwere only determined at the most representative times (0, 24,40 weeks) of incubation.
2.6 Statistical analyses
All statistical analyses were carried out with SPSS 15.0 forWindows. Student's t test (p≤0.05) was used to assessdifferences between the same soil with and without litteraddition. Normality of the data was tested prior to analysis,and when necessary, variables were transformed logarithmi-cally. To test for the effects of soil type and litter incorpora-tion, a multifactor analysis of variance (MANOVA) wasperformed to obtain the F value and significance (p≤0.05)on each studied variable. A correlation matrix for all chem-ical and biochemical parameters was calculated.
3 Results
3.1 pH and trace element extractability
In general, litter presence slightly increased pH values in allsoils, although these increases were more noticeable in theacid soil, PA, in which differences with and without litterwere significant in all the samplings (Fig. 1c). In PN soil,
litter addition significantly increased pH values until the 24thweek of incubation (see Fig. 1b). Nevertheless, significant ornot, differences caused by the presence of litter were alwaysless than 0.5 units of pH. As a rule, comparing the initial andfinal pH values, a slight acidification was observed in all soils(except for NP) during the incubation period (see Fig. 1).
Trace elements extracted with CaCl2 at the most represen-tative weeks of incubation (beginning, middle and end; T00,T024 and T040 weeks) are shown in Table 3. Arsenic and Pbcontents were below detection limit (0.01 mg kg−1 for bothelements). In NP, concentrations of available heavy metalswere very low, and the presence of litter did not alter theiravailability. Neutral contaminated soil (PN) also presented avery low concentration of heavy metals during the wholeincubation period. In this soil, litter addition significantly
Fig. 1 Changes in pH values in: a NP soils, b PN soils and c PA soils.Black dots correspond to soils without litter, and white dots correspondto soils with litter addition. Significant differences due to litter additionfor each soil and time are marked with an asterisk
666 J Soils Sediments (2012) 12:663–673
increased Cu concentration in PN-L compared to PN atthe initial time (T00) and Cd, Cu and Zn at T024. Thebehaviour of the acid soil (PA) differed from the neutralsoils: first of all, concentrations of available Cd, Cu andZn were much higher in this soil than in the other twosoils. Moreover, litter addition significantly increasedextractable Cd and Zn contents in PA-L compared withPA. In general, concentrations of soluble metals in soils(with and without litter) tended to decrease slightly ormaintain similar concentrations over time.
3.2 Water-soluble carbon, microbial biomass and βglucosidase
In general, WSC decreased during the incubation, but thisdecrease was sharper in PN soil (Fig. 2). The MANOVAanalyses (Table 4) showed that litter addition (L) was themain factor affecting WSC concentrations. However, PNsoils maintained WSC concentrations significantly higherthan NP and PA soils during the incubation.
In non-polluted soil (NP and NP-L) the MBC increaseduntil the 8th to 16th week of incubation (Fig. 3a). After thistime, stabilization or a slight decrease was observed. In soilPN, without litter MBC showed few changes during theincubation (see Fig. 3b) whereas in PN-L, litter addition
caused a fast growth of the microbial biomass at the begin-ning of the incubation (T00) followed by a decrease andstabilization during the rest of the incubation period (seeFig. 3b). In both neutral soils, the addition of litter (NP-Land PN-L) caused higher values of MBC than thecorresponding treatments without litter (NP and PN). Valuesof MBC in PA were lower than in the other two soils, andthe addition of litter did not cause a significant effect on thisparameter (see Fig. 3c). The main factors with higher influ-ence in MBC were soil type (S) and litter addition (L), andthese factors (S×L) also had a significant interaction (seeTable 4).
β-Glucosidase activity followed a very similar evolutionin the three soils (Fig. 4). In soils without litter addition,β-glucosidase activity values remained quite stable during
Table 3 Changes in 0.01 M CaCl2-extractable trace element concen-trations during the study (in milligrams per kilogram) at three differentincubation times
Soil Week Cd Cu Zn
NP 0 0.001 0.06 0.25
24 0.008 0.09 0.02
40 0.001 0.03 0.04
NP-L 0 0.002 0.12 0.11
24 0.003 0.09 0.005
40 0.001 0.05 0.02
PN 0 0.025 0.22 0.16
24 0.001 0.14 0.01*
40 0.004 0.08 0.05
PN-L 0 0.003 0.51* 0.16
24 0.008* 0.27* 0.002
40 0.002 0.13 0.08
PA 0 0.28 31.5 78.4
24 0.22 32.3 60.5
40 0.18 23.6 46.4
PA-L 0 0.49* 16.1 103*
24 0.48* 28.3 109*
40 0.50* 21.0 104*
*p<0.05; significant differences for pairs between the same soils andtime with and without litter addition
Fig. 2 Changes in WSC values in: a NP soils, b PN soils and c PAsoils. Black dots correspond to soils without litter, and white dotscorrespond to soils with litter addition. Significant differences due tolitter addition for each soil and time are marked with an asterisk
J Soils Sediments (2012) 12:663–673 667
the incubation, and these values were in general higherin PN soil. The presence of litter significantly increasedβ-glucosidase values in all soils and in all the sam-plings performed. In general, a decrease was observed
Table 4 MANOVA on the effect of soil type and litter addition on parameters related with C cycle in soils
Factor WSC MBC β-Gluc RB μ tlag tpeak RS SIR24 SIR48 r K
Soil (S) F 6.7 22.1 20.4 NS 5.6 206.6 158.2 5.1 NS 14.8 NS 3.9
p * ** ** * ** ** * ** ***
Litter (L) F 47.0 27.8 44.7 11.2 NS 127.2 84.3 3.8 NS 9.2 14.9 12.8
p ** ** ** ** ** ** *** * ** **
S×L F NS 8.75 NS NS NS 51.3 48.4 NS NS NS NS NS
p ** ** **
n054
WSC water-soluble carbon, MBC microbial biomass carbon, β-Gluc β-glucosidase activity, RB basal respiration, μ maximum growth rate, tlag lagtime, tpeakmax time to reach the maximum respiration rate, RS substrate-induced respiration before exponential growth, QR respiratory-activationquotient, NS not significant
*p≤0.01; **p≤0.001; ***p≤0.05
Fig. 3 Changes in MBC values in: a NP soils, b PN soils and c PAsoils. Black dots correspond to soils without litter, and white dotscorrespond to soils with litter addition. Significant differences due tolitter addition for each soil and time are marked with an asterisk
Fig. 4 Changes in β-glucosidase activity values in: a NP soils, b PNsoils and c PA soils. Black dots correspond to soils without litter, andwhite dots correspond to soils with litter addition. Significant differ-ences due to litter addition for each soil and time are marked with anasterisk
668 J Soils Sediments (2012) 12:663–673
in β-glucosidase activity in the soils with litter duringthe incubation. The main factor on β-glucosidase activ-ity was litter addition (L) (see Table 4).
3.3 Soil respiration
In soils without litter, values of RB were very similar (Table 5)in all soils. The presence of litter increased significantly thevalues of RB in the three soils at the beginning of the incuba-tion (T00); however, values ofRB strongly decreased betweenthe initial time (T00) and final time (T040). In fact, the mainfactor influencing the variability of RB was litter addition (L).
Parameters related to substrate-induced respiration arealso shown in Table 5. Values of μ were similar for thethree soils at the initial sampling (T00); however, afterlonger times of incubation (T024 and 40), values werehigher in NP than in the acid contaminated soil (PA). Ingeneral, μ values were significantly lower in soils with litteraddition until the 24th week of incubation. After that time,an opposite trend was observed until the end of the incuba-tion period.
Values of tlag and tpeak were much higher in soil PA thanin the other two soils. In general, litter addition significantlydecreased values of these two parameters in all soils. Theevolution was similar for tlag and tpeak, and their valuesremained almost constant during the incubation period.
The results from MANOVA analyses (see Table 4) showinteractions between soil type and litter addition (S×L).
Substrate-induced respiration (RS) was in general higherin non-polluted soil (NP and NP-L) than in contaminatedsoils, especially at the beginning of the incubation. After thistime (T00), values of RS decreased in NP soils (especially atthe end of the incubation) and remained constant (even aslight increase was observed between week 0 and 24) in thecontaminated soils (PN and PA). Except for the first sam-pling (T00), litter did not cause any noticeable effect in RS.Values of respiration rate after 24 h (SIR 24) and after 48 h(SIR 48) followed similar behaviour to the RS values.
According to Stenström et al. (1998), the substrate-induced respiration can be divided into the respiration rateof the r organisms (which immediately start to grow as aresponse to the substrate addition) and the K organisms(which just increase their CO2 production rate to a constantlevel). In the first sampling, soils without litter presented ahigher proportion of K organisms (Fig. 5b) compared to thesoils with litter (see Fig. 5a). In intermediate sampling time,for soils with litter, the activity of r microorganisms de-creased whereas that of the K population increased; mean-while, in soils without litter, the opposite trend wasobserved.
The proportion of both microorganism populations de-creased at the end of the experiment. The MANOVA analyses
Table 5 Parameters related with soil respiration
Soil Week RB
(μg O2 g−1 h−1)
μ (h−1) tlag (h) tpeak (h) RS (μg O2
g−1 h−1)QR SIR 24
(μg O2 g−1)
SIR 48(μg O2 g
−1)r (% SIR)
NP 0 2.28 0.058* 27.7* 50.7* 46.4 0.05 1,299 2,390 10.7
NP-L 0 12.0* 0.038 14.3 32.7 88.3* 0.11 1,830 3,641* 87.5
PN 0 2.53 0.057* 24.0* 52.6* 12.8 0.20 280 1,092 22.2
PN-L 0 14.2* 0.032 16.8 43.2 39.4* 0.20 1,000 2,642 100
PA 0 1.90 0.059* 62.2* 95.6* 12.4 0.15 513 656 0.90
PA-L 0 7.84* 0.038 19.9 58.2 37.5* 0.21 901 2,058 100
NP 24 0.88 0.064* 17.1 48.9 50.6 0.02 1,012 2,280 15.5
NP-L 24 2.11* 0.053 19.1 47.9 47.9 0.04 1,075 2,332 25.4
PN 24 1.82 0.044* 20.5* 53.8 47.1 0.02 1,034 2,079 32.7
PN-L 24 2.62* 0.037 18.3 52.6 52.1 0.04 1,146 2,358 61.1
PA 24 0.79 0.029 55.4* 105* 26.2 0.01 1,156 1,372 6.50
PA-L 24 1.88* 0.040 34.2 63.8 32.4 0.05 916 1,427 14.3
NP 40 2.23* 0.082 22.1* 56.3* 12.7 0.18 290 1,165 13.8
NP-L 40 0.80 0.134 14.6 44.8 5.02 0.16 296 1,535 44.5
PN 40 0.91 0.093 20.2 45.7 7.38 0.12 290 1,394 74.9
PN-L 40 1.40* 0.073 18.4 59.4 9.60 0.15 286 1,185 96.2
PA 40 0.86 0.049 64.4* 114* 2.04 0.42 55.3 77.3 14.8
PA-L 40 1.22 0.059* 35.8 66.9 6.40* 0.20 150 413 22.9
*p<0.05; significant differences for pairs between the same soils and time with and without litter addition
RB basal respiration, μ maximum growth rate, tlag lag time, tpeakmax time to reach the maximum respiration rate, RS substrate-induced respirationbefore exponential growth, QR respiratory-activation quotient
J Soils Sediments (2012) 12:663–673 669
(see Table 4) show that the main factor influencing both r andK organisms was litter addition (L).
3.4 Total organic carbon mineralization
Values of TOC in soil and the calculated total mineralizationrate (TMR) are in Table 6. The increase of organic C due tolitter addition was very similar in all soils: 13.3 gkg−1 NP,10.8 gkg−1 PN and 13.1 gkg−1 PA. In case of PA soils, TMRin the 40th week was similar in soil with and without litter; thiscould indicate that even the most available C from litter wasnot mineralized at the end of the incubation (see Table 6). Ingeneral, values of TMR were higher in soils with litter addi-tion. Comparing the three soils, TMR followed this trendNP>PN>PA.
4 Discussion
The addition of organic matter to soil is normally accompaniedby increases of pH values (Brady and Weil 2002). Although inall soils a slight increase was observed due to litter addition, themoderately acidic nature of the litter (see Table 2) minimizedthe alkalinizing effect in the soils. Similar results were observedby Pérez-de-Mora et al. (2006) in an acid trace element-contaminated soil amended with litter from a deciduous forest.
Solubility and bioavailability of trace elements can bemoreimportant than the total or pseudo-total concentrations of theseelements in the contaminated soil, because they represent themost labile fractions subject to leaching and uptake by plantsand microorganisms (Adriano 2001). In previous studies, we
found that using 0.01 M CaCl2 for trace element extractiongave a good estimation of plant and microorganism availabletrace element concentrations in contaminated soil (Burgos etal. 2008). Although total concentrations of trace elements inthe two contaminated soils (PN and PA)were very similar (seeTable 1), extractable concentrations were much higher in PAsoil. This behaviour was related to pH values. It is well knownthat an increase in pH values in soil leads to a decrease in thedissolved concentrations of cationic trace elements, since bothprecipitation as hydroxides, carbonates, etc. and adsorptionincrease (Brallier et al. 1996). There were high and significantnegative correlations between pH and CaCl2-extractable con-centrations (r0−0.884 for Cd, r0−0.966 for Cu and r0−0.931for Zn, p<0.001 in all cases). Other authors have found thesame behaviour in neutral or alkaline contaminated soils inwhich, despite the high total concentration of trace elements,their availability and extractable concentrations were very low(De la Fuente et al. 2008). The increase of available heavymetals found in PA-L compared to PA and in a lesser extent inthe case of PN-L compared to PN was due to the amount ofsoluble trace elements added through the litter (see Tables 2and 3). Although the time-related decomposition of littercould lead to an increase of trace element bioavailability, inthis experiment and after 40 weeks of incubation, we did notfind such an increase in trace element concentration with timein any of the contaminated soils (see Table 3). Moreover,correlations between WSC contents and extractable trace ele-ments were not significant during the whole incubation pro-cess (data not shown).
WSC can be used as an indicator of early change in soilorganic matter (Bolinder et al. 1999). The decrease of WSC
Fig. 5 Changes at the time ofsubstrate addition in the initialrespiration rate of a growing (r)and b non-growing (K) micro-organisms at three differenttimes of incubation: 0, 24 and40 weeks. Black dots corre-spond to soils without litter, andwhite dots correspond to soilswith litter addition
Table 6 Total organic carboncontent and TMR in soils at dif-ferent times of incubation
Standard deviations are inbrackets (n03)
*p<0.05; significant differencesfor pairs between the same soilsand time with and without litteraddition
Soil T00 week T024 weeks T040 weeks
C (g kg−1) C (g kg−1) TMR C (g kg−1) TMR
NP 5.10 (0.15)* 4.60 (0.28)* 10.5 (4.77)* 4.70 (0.21)* 8.45 (4.99)*
NP-L 18.7 (1.15) 14.8 (0.42) 20.4 (7.38) 12.6 (1.24) 32.9 (2.59)
PN 14.7 (0.84)* 14.4 (0.71)* 2.12 (1.19)* 13.3 (0.60)* 9.00 (4.71)*
PN-L 25.5 (2.52) 22.4 (2.22) 12.3 (0.69) 21.9 (1.98) 13.9 (1.42)
PA 8.90 (0.55)* 8.60 (0.42)* 3.39 (1.44)* 8.50 (0.33)* 3.72 (2.27)*
PA-L 22.0 (0.22) 20.5 (1.04) 6.97 (3.91) 21.3 (0.62) 3.25 (1.92)
670 J Soils Sediments (2012) 12:663–673
in the soils could be related to the consumption of labile Cby the microorganisms and the mineralization process. Ob-viously, this decrease was more noticeable in soils with litterpresence, in which a higher microbial population is expectedas the MBC values indicated. In fact, the litter addition wasthe factor that caused higher changes in WSC and MBCthan soil (see Table 4). A greater quantity of availablecarbon should increase the growth of soil microorganisms,and thus, greater MBC values should be found. Deng andTabatabai (1996, 1997) found increases in WSC and MBCdue to the organic soluble carbon derived from the applica-tion of sewage sludge and compost. Besides the WSC effect,litter provided exogenous microbiota that was responsible ofthe high values of MBC found at the beginning of theincubation in soil receiving litter addition. Microbial bio-mass was affected by the soil conditions and was correlatedpositively with pH (r00.503, p≤0.001), suggesting the re-lation of the pH on the soil microbial biomass (Andersonand Joergensen 1997). At the same time, higher solubletrace element concentrations could have hindered microbialgrowth. In fact, MBC was negatively correlated with ex-tractable Cd (r0−0.395), Cu (r0−0.465) and Zn (r0−0.428)concentrations (always p≤0.001), which were in turn higherin PA and PA-L soils. These results are in concordance withthe fact that trace elements could be toxic to microorganisms(Kandeler et al. 1996) and could reduce the microbial bio-mass in soils (Chander et al. 1995).
β-Glucosidase activity is an enzyme involved in themicrobial degradation of cellulose to glucose and plays acrucial role in the C cycle in soils. Kuperman and Carreiro(1997) found that this activity was markedly reduced at highheavy metal concentrations, while Aoyama et al. (1993)reported that β-glucosidase activity was little affected byhigh Cu and Zn concentrations. In our study, it appears thatthe nature of the organic input was the major cause ofincrease of β-glucosidase activity levels. In this activity,the availability of organic C due to litter addition seemedto be more important than soil contamination, as shown alsoin Table 4. The β-glucosidase activity was strongly corre-lated with TOC (r00.762, p≤0.001) and WSC (r00.769,p≤0.001). Moreover, weak and non-significant correlationswere found between the β-glucosidase activity and theconcentration of soluble trace elements (data not shown).
In concordance with the results of β-glucosidase, values ofbasal respiration (RB) and substrate-induced respiration (RS)were not correlated with parameters that indicated soil con-tamination either. As occurred with the β-glucosidase activity,these parameters seemed to be more affected by the C avail-ability. However, values of substrate-induced respiration after48 h (SIR48) were negative and significantly correlated withtotal (As r0−0.602, Cu0−0.484 and Pb r0−0.577, p≤0.001)and soluble (Cd r0−0.393, p≤0.01; Cu r0−0.532 and Znr0−0.436, p≤0.001) trace element concentrations.
Among all the studied parameters associated with soilrespiration, tlag and tpeak were the parameters that best indi-cated the soil microbial response to trace element toxicity.The strong correlation found between available trace ele-ments and tlag (r00.473 for Cd, r00.844 for Cu, r00.557for Zn, p≤0.001 in all cases) and tpeak (r00.453 for Cd,r00.817 for Cu, r00.530 for Zn, p≤0.001 in all cases) couldshow the importance of toxicity for soil microorganismactivity (time to start exponential growth and time to reachthe maximum respiration rate due to substrate addition,respectively). Moreover, total concentrations of As, Cuand Pb were positively and highly correlated (p≤0.001) withtlag and tpeak.
Several authors and guidelines have attempted to discussthe potential of using microbial parameters to monitor soilheavymetal pollution (Giller et al. 1998). The threshold valuesfor the respiration parameters proposed in the ISO 17155guideline that are indicative of contamination are: QR>0.3,tlag>20 h, tpeak>50 h. Brookes (1995) predicted the limitationsof such applications. Giller et al. (1998) summarized the diffi-culties in extrapolating meaningful toxic effects from short-term to long-term in the field, and this drove the attention to insitu studies. In recent decades, a number of microbial param-eters have been applied to monitor environmental changes, andthe results were not completely consistent with each other indifferent investigations. Many studies have shown the suppres-sive effect of heavy metals on microbes (Giller et al. 1998;Liao and Xie 2007), but there were also some studies thatpointed out the specific effects on their activity (Ellis et al.2003; Sandaa et al. 2001). In this case, we pointed out thatcertain parameters related with microbial activity suchβ-glucosidase activity and basal respiration seem to be morerelated with carbon availability than with the potential toxicityof the soil due to trace elements.
In this study, we introduced other important parametersrelated with the microbial growth (SIR48, tlag and tpeak) aspotential indicators of the possible toxicity of trace elementespecially in soil C cycle. Among all these indicators, tlag,tpeak and SIR 48 were the variables that showed the highestvariation due to the ‘soil’ factor and were therefore affectedby pollution and acidity of the soil (see Table 4). When weconsider the interactions between experimental factors, bothtlag and tpeak were highly influenced by the combination of‘soil type’ and ‘litter addition’.
The calculation of substrate-induced respiration alsoshowed the distinction between the activity of growing (r)and non-growing (K) microorganisms. The proportion of rmicroorganisms was generally small in soils with no recentaddition of substrates but can be significantly increased insoils with high substrate availability (Stenström et al. 2001).This agreed with the results obtained in this study that ahigher population of r microorganisms in soils with litterand substrate addition tended to decrease in time (see
J Soils Sediments (2012) 12:663–673 671
Fig. 5). In fact, the factor that caused the highest variabilityfor r and K microorganisms was litter addition (see Table 4).This suggested that substrate availability (higher WSC insoils) determines the proportion of biomass between thesegroups and also that in soils already polluted with heavymetals, the microbial population is adapted to these soilconditions (Chander and Joergensen 2008).
The effect of soil contamination on soil organic mattercycle was also clear according to the results of TOC andmineralization rate in soils (see Table 6). Although texturalcomposition is a key factor in organic matter decomposition,the differences between PA and NP (soil with similar tex-ture) made clear the effect of the pH and trace elementpollution. In highly polluted soil with low pH, the totalorganic matter mineralization rate was very low.
Some authors have indicated that the accessibility oforganic materials to enzymatic attacks may be limited dueto the adsorption on organic matter (Hattori 1996a, b; Morelet al. 1991) as well as in the case of complex organo-metallic structures (Juste et al. 1975). Their resistance tobiodegradation may be increased by this way. This lastprocess was hypothesized to be responsible for an importantlitter accumulation in a highly heavy metal-polluted soilbearing metallophytes (Balabane et al. 1999). These authorssuggested a selective decomposition of portions ofmetallophyte-derived debris with initially low heavy metalconcentrations and resistance to biodegradation of portionswith initially high heavy metal concentrations. In the case ofPN, apart from the possible effects of the contamination, thehigher clay content of the soil should also have contributedto the decrease of the organic matter mineralization rate.
5 Conclusions
Microcosm experiments have demonstrated that acidity andtrace element availability strongly affect organic matter de-composition and several parameters related with the C cycle,such as microbial biomass carbon and soil respiration. How-ever, long-term effects of contaminated litter should be alsoevaluated under field conditions to check that the microbialpopulation could be adapted to the acidic condition at a longterm in this area. Nevertheless, despite heavy metal additionthrough the litter in polluted soil reforested with Salicaceas,this organic matter input is more beneficial than the removalof leaves from the soil due to the positive effects that thiscauses in all parameters related with the C cycle. Moreover,the removal of the ‘carpet of litter’ from the soil would be veryunrealistic from the economic point of view.
Acknowledgments AGL2008-00985 is supported by the CICYT ofthe Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain and FEDER (EU). P.Soler-Rovira is a recipient of a JAE-Doc Contract from the CSIC
program ‘Junta para la Ampliacion de Estudios’. L. Ciadamidarothanks to CSIC for funding her grant (JAE-PreDOC).
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V.2. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
91
V.2. WHITE POPLAR (POPULUS ALBA L.) LITTER IMPACT ON
CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PARAMETERS RELATED TO
NITROGEN CYCLE IN CONTAMINATED SOILS.
RESUMEN
Impacto de la hojarasca del álamos blanco (Populus alba L.) en los parametros
químicos y bioquímicos relacionados con el ciclo del nitrógeno en suelos
contaminados.
La transformación del nitrógeno en el suelo es un indicador importante en la
evaluación de la calidad y de los efectos de los contaminantes del suelo. El objetivo
de este estudio fue determinar el efecto de la hojarasca de Populus alba sobre las
propiedades químicas y bioquímicas relacionadas con el ciclo del N en suelos con
diferentes valores de pH y de contenido en elementos traza.
Se formuló la hipótesis que esta hojarasca puede influir en varios parámetros
relacionados con el ciclo N y, en consecuencia, en la calidad del suelo. Con este fin
se tomaron dos suelos contaminados reforestados con diferentes valores de pH (AZ
pH = 7.23 y DO pH = 2,66) y un suelo no contaminado (RHU pH = 7,19). Las
muestras de suelo se colocaron en microcosmos de 2.000 cm3 y se incubaron durante
40 semanas en condiciones controladas. Cada suelo se mezcló con su
correspondiente hojarasca, y los suelos sin hojarasca se establecieron como
comparación. Se midió: el contenido de nitrato (NO3-N-) y de amonio (NH4-N
+), la
tasa de potencial de nitrificación (PNR), el nitrógeno de la biomasa microbiana
(NBM), la actividad proteasa, y varias propiedades químicas, tales como el pH y las
concentraciones de elementos traza extraíbles con CaCl2, a los diferentes tiempos de
incubación. Los valores de los elementos traza disponibles no variaron durante la
incubación y fueron siempre mayores en el suelo ácido. En los suelos neutros la
presencia de hojarasca aumentó los valores de N-Kjeldahl, NO3-N-, PNR, NBM y la
actividad proteasa. La presencia de elementos traza en el suelo neutro no alteró los
parámetros estudiados. Sin embargo, el pH ácido y el alto contenido de elementos
traza disponibles afectaron fuertemente el contenido de amonio, nitrato, potencial de
nitrificación, nitrógeno de la biomasa microbiana y actividad proteasa.
93
White poplar (Populus alba L.) Litter Impact on Chemical and Biochemical
Parameters Related to Nitrogen Cycle in Contaminated Soils
L. Ciadamidaro, P. Madejón*, F. Cabrera and E. Madejón
Institute of Natural Resources an Agrobiology of Seville (IRNAS), CSIC. Avenida Reina Mercedes,
10.P.O. Box 1052, Seville 41080 (Spain).
Abstract
Nitrogen transformations in soils have become a major indicator in assessing soil
quality and effects of contaminants. The aim of this study was to determine the effect of
litter from Populus alba on chemical and biochemical properties related to the N cycle in
soils with different pH values and trace element contents. We hypothesized that this litter
would influence several parameters related to the N cycle and consequently to soil health.
For this purpose we collected two reforested contaminated soils of different pH values (AZ
pH 7.23 and DO pH= 2.66) and a non-contaminated soil (RHU pH 7.19). Soil samples were
placed in 2000 cm3 microcosms and were incubated for 40 weeks in controlled conditions.
Each soil was mixed with its corresponding litter, and soils without litter were also tested for
comparison. Ammonium (NH4+-N) and nitrate (NO3
‒-N) content, potential nitrification rate
(PNR), microbial biomass nitrogen (MBN), protease activity, and several chemical
properties such as pH, available trace element concentrations (extracted with CaCl2 0.01 M)
were determined at different times of incubation. Values of available trace elements did not
vary during the incubation and were always higher in acid soil. In neutral soils litter
presence increased values of Kjeldahl-N, NO3‒-N content, potential nitrification rate (PNR),
microbial biomass nitrogen (MBN) and protease activity. Presence of trace elements in
neutral soils did not alter the parameters studied. However, acidic pH and high content of
available trace elements strongly affected NH4+-N and NO3
‒-N, microbial biomass N and
protease activity.
Keywords: microbial biomass N, protease activity, soil pH, N mineralization,
nitrification, phytoremediation.
Introduction
Nitrogen occupies a unique position among
the soil-derived elements essential for plant
growth because of the large amounts required by
plants in comparison to other elements. In most
terrestrial ecosystems N is the limiting nutrient
for plant growth (Robertson and Groffman
2007).
Humans are altering the global cycle of N
via combustion of fossil fuels, production of N
fertilizers, cultivation of N–fixing legumes and
other actions (Vitousek et al. 1997). Among
anthropogenic activities, industrial countries
have been increasingly contaminating soil with
inorganic pollutants. Some authors have shown
the adverse effects of these pollutants on
microbial processes in soils (Babich and Stotzky
1980; Tyler 1981) that can affect some steps of
the N cycle. In this regard it has been evidenced
that high levels of trace elements in soils can
affect the number, diversity and activity of soil
organisms, affecting enzyme activities and
Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)
Available online at www.inia.es/forestsystems
Forest Systems 2014
* Corresponding author. pmadejó[email protected] Received February 2013. Accepted November 2013
94
nitrogen mineralization processes (Gil-Sotres et
al. 2005). Several researchers have investigated
the influence of inorganic pollutants, mainly
heavy metals, on N mineralization and
nitrification and have reported somewhat mixed
results (Wilke 1989).
Litter decomposition is a key process that
facilitates the cycling of nitrogen in terrestrial
ecosystems. Litter decomposition is largely
controlled by litter quality, dominant weather
features and composition and activity of
microorganisms in the soil and forest floor
(Berg and Matzner 1997, Heal et al. 1997; Fierer
and Schimel 2002; Borken et al. 2003).
Therefore, biodegradation of organic residues
rich in metals might be influenced by the
presence of metals, producing indirectly
negative effects on N cycle.
Soil pH is another important factor
regulating N transformation in soil. According
to Zhang et al. (2011), in many ecosystems soil
pH is the major factor controlling nitrification.
Some authors suggest that nitrification activity
in soil declines markedly below pH 6.0 (Aciego
Pietri and Brookes 2008). Watson and Watson
(1989) reported that nitrification does not occur
at pH < 6.5. However, some studies have shown
the adaptation of the autotrophic bacteria to low
pH in soils (Islam et al. 2006).
Contaminated soils are in most of the cases
unsuitable for the production of conventional
crops or grasslands but they have the potential to
be used for energy crops such as willow or
poplar (Mertens et al. 2004; Robinson et al.
2000). These are deciduous trees and their
development in trace elements contaminated
areas would cause, after the autumnal fall, the
presence of an extensive 'carpet' of litter loaded
with trace elements, whose entire removal is not
always viable. There is little information
regarding the influence of this heavy metal rich
litter on the properties of the reforested soils
(Sheid et al. 2009), especially on the chemical
and biochemical properties related to the N-
cycle. Short-rotation forest plantations have
been introduced with the aim of producing
biomass for energy and industry over the past
two decades (Lucas-Borja et al. 2011). In this
respect, poplars are largely used, as they are
known to be fast-growing trees, producing large
yields and having a high energy potential
(Calfapietra et al. 2010).
The aim of this study was to determine the
effect of Populus alba L. litter on chemical and
biochemical properties related to the N cycle in
soils with different pH values and trace element
(As, Cd, Cu and Zn) contents. We hypothesized
that this litter would influence several
parameters related to the N cycle. To test this
hypothesis microcosm studies were carried out.
We studied the evolution of various parameters:
pH, available trace element concentrations,
nitrogen mineralization by the analysis of NH4+-
N and NO3‒-N contents and microbiological
properties (PNR, potential nitrification rate,
MBN, microbial biomass N and protease
activity) as a tool to evaluate the effects of the
litter on trace element-polluted soils with
different pH.
Materials and methods
Soil and litter collection
The experiment was carried out using three
different soils collected in January 2009. The
soil RHU (pH 7.19) was collected in a non-
contaminated riparian forest in La Algaba,
Seville (37º 29’ 4.8’’N, 6º01’ 34’’ W) where
Populus alba was growing. Two trace element
polluted soils, AZ (pH 7.23) and DO (pH 2.66)
were collected in the area affected by a mine
spill in 1998 (South West of Spain, Grimalt et
al. 1999) in spots where Populus alba trees were
growing (37º18’4.7” N, 6º15’39.1’’ W, AZ and
37º23’42.5’’ N, 6º13’36.4’’ W, DO) (see Table
1). Soils were collected from the first 0-25 cm
soil. Values of pH in DO soils were extremely
acidic due both to the acidic origin of the soil
and to the effect of the mine spill (very acidic)
(Cabrera et al. 1987, 1999). Moreover, soil from
DO is located in a riparian area where the
removal of sludge from soil was very difficult,
and remains of sludge were left on the soil
surface. Similar pH values of the soils in the
area have been reported by Domínguez et al.
(2008). The most relevant characteristics of the
soils are shown in Table 1).
.
95
Table 1. Some characteristics of the studied soils. Standard deviations are in brackets (n=3).
Soil OM Sand Silt Clay As Cd Cu Pb Zn
% g kg-1 mg kg-1
RHU 1.57 612 214 174 9.18
(0.81)
<0.01 25.8
(2.72)
17.9
(0.93)
69.1
(6.30)
AZ 2.42 393 346 263 112
(5.30)
3.82
(0.15)
166
(6.20)
236
(13.5)
506
(15.0)
DO 1.51 790 60 150 290
(14.8)
3.53
(0.10)
193
(10.4)
391
(25.0)
227
(9.30)
Afforestation in the study area started in
1999, after the purchase of affected lands by the
regional administration. Depending on the local
habitat conditions, the target tree and shrub
species to afforest were those typical of riparian
forests, such as Populus alba, Fraxinus
angustifolia and Salix atrocinerea or those
typical of drier upland forests, such as Quercus
ilex subsp. ballota, Olea europaea var.
sylvestris, Ceratonia siliqua, Phillyrea
angustifolia, Pistacia lentiscus, Rosmarinus
offcinalis and Retama sphaerocarpa
(Domínguez et al. 2010).
Litter samples of Populus alba were
collected at each sampling site (RHU, AZ and
DO) in January 2009. This material was brought
to the laboratory for its characterization and for
its use in the microcosm studies. Table 2 shows
the most relevant characteristics of the litter
samples.
Table 2. Some characteristics of litter samples. Standard deviations are in brackets (n=6). Kjel-N, Kjeldahl-N;
Lig, lignin.
Litter pH Kjel-N Lig As Cd Cu Pb Zn Cd Cu Zn
(g 100g-1) (g kg-1) Total content (mg kg-1) CaCl2 soluble (mg kg-1)
RHU 5.20
(0.21)
2.73
(0.02)
32.4
(0.09)
2.61
(0.31)
0.74
(0.10)
13.9
(1.59)
2.74
(0.23)
163
(8.74)
0.46
(0.09)
4.61
(0.25)
32.5
(6.52)
AZ 5.25
(0.12)
1.10
(0.02)
33.9
(1.66)
2.68
(0.21)
3.20
(0.91)
17.9
(3.64)
4.05
(2.00)
289
(69.2)
1.31
(0.22)
7.11
(0.35)
69.3
(9.36)
DO 5.53 (0.25)
1.37 (0.02)
35.3 (0.35)
22.4 (9.31)
5.26 (0.97)
82.0 (25.0)
49.4 (11.2)
647 (117)
1.92 (0.45)
51.2 (1.58)
364 (51.2)
Experimental design
Each soil sample (1500 g; crushed and
sieved < 2 mm) was placed in a container of
2000 cm3 (30 × 30 cm). Each soil was mixed
with its corresponding litter (RHU-L, AZ-L,
DO-L). The doses of litter were calculated
according to the litter wet weight at field
conditions in RHU, AZ and DO in an area of 25
× 25 cm. This weight was extrapolated to the
microcosm area, resulting in a mean weight of
85 g of wet litter per container. Soils without
litter addition were also tested. A randomised
complete block design with three replicates per
treatment and soil was used. Deionized water
was added to bring the soil moisture to 70% of
its water holding capacity. The incubation was
performed in a growth chamber at 28 ºC. Water
losses were compensated by adding deionized
water during the experiment. A subsample of
soil (100 g per sampling time) from each
container was taken after 0, 2, 4, 8, 16, 24, 32
and 40 weeks of incubation.
Soil and litter analysis
For the initial characterization, soil
samples were oven-dried (40 ºC) after removing
plant material and stones, crushed and sieved
through a 2-mm sieve, then ground to < 60 μm.
96
For initial analysis litter material was oven-dried
(70 ºC) to constant weight, and sieved and
ground to pieces of around 2-5 cm. Soil and
litter pH were measured in a 1/2.5 sample/1 M
KCl extract after shaking for one hour (Hesse
1971) using a pH meter (CRISON micro pH
2002). Soil organic carbon content was
determined by the method of Walkley and Black
(1934). Kjeldahl Nitrogen of soil and litter was
determined after digesting the soil and litter
samples by the method described by Hesse
(1971). Klason lignin content was determined
according to Tappi T222 om-88 regulation, with
some modifications (Tappi Standard 2004): final
concentration of H2SO4, 4%, and final extraction
in the autoclave (121 ºC) for 1 h. Pseudo-total
trace element concentrations in soil samples (<
60 μm) were obtained by digestion with aqua
regia (1:3 v:v conc. HNO3:HCl) in a microwave
oven (Microwave Laboratory Station Mileston
ETHOS 900, Milestone s.r.l., Sorisole, Italy).
The term pseudo-total accounts for the aqua-
regia digestion, because it does not completely
destroy silicates. Recovery of pseudo-total
elements was assessed against total elements in
a BCR reference sample (CRN 277). Recovery
rates were: As 83%, Cd 66%, Cu 103%, Pb 72%
and Zn 93%. Total trace elements were
calculated on a dry weight basis using the above
recovery factors. The total of trace elements in
litter was determined after digesting by wet
oxidation with concentrated HNO3 under
pressure in a microwave digester. Recovery
rates for plant material (litter) were assessed
against the poplar leaves reference material (CS
DC73350) and were between 90 and 110%.
Availability of trace elements in soils and
litter were determined in 1/10 sample/0.01 M
CaCl2 extracts after shaking for three hours
(Houba et al. 1996). Following Kabata-Pendias
(2004) trace elements extracted with 0.01 M
CaCl2 is the most labile fraction subject to
leaching and uptake of plants and
microorganisms. Trace elements (As, Cd, Cu,
Pb and Zn) in all the extracts were determined
by ICP-OES (inductively coupled plasma-
optical emission spectrometry) using an IRIS
Advantage spectrometer (Thermo Jarrel Ash
Corporation, MA USA). The detection limit for
the method was 0.1 mg kg-1
for As, 0.03 mg kg-1
for Cd, 0. 3 mg kg-1
for Pb and 0.03 mg kg-1
for
Zn. Ammonium in soil was extracted by shaking
a fresh sub-sample (2.5 g on an oven-dry basis)
in 25 ml of 1 M KCl for 1 hour. Nitrate in soil
was extracted by shaking a fresh sub-sample (5
g on an oven-dry basis) in 25 ml of distilled
water for 1 hour. Determination of NH4+-N and
NO3‒-N in the extracts were carried out in a
Bran + Luebbe GmbH AA3 dual-channel,
continuous-flow auto-analyser (Norderstedt,
Germany). Potential nitrification rate (PNR) was
measured by method of Kandeler (1996) and
modified by Hoffmann et al. (2007). Moist soil
samples (5 g) were incubated for 5 h at 25ºC,
using ammonium sulfate as substrate, and
adding sodium chlorate to repress the oxidation
to nitrate. Subsequently accumulated nitrite
during incubation period was extracted with 2M
KCl, determined colorimetrically by the method
Griess-Ilosvay (Keeney and Nelson 1982), and
expressed as NO2‒-N
μg g
-1 (dm) d
-1.
Microbial Biomass Nitrogen (MBN)
content was determined in moist subsamples by
the chloroform fumigation-extraction method
modified by Gregorich et al. (1990).
Concentration of N in the extract was measured
by a TOC-VE Shimadzu analyser. A KEN
(measure of the efficiency of the extraction
procedure) of 0.54 was used to calculate MBN.
Protease activity was measured after incubation
of soil with casein and measurement of the
absorbance of the extracted tyrosine at 700 nm
(Ladd and Butler 1972). Protease activity is
expressed as mg of tyrosine kg-1
2h-1
.
Nitrogen Mineralization Simulation Model
The N mineralization process was adjusted
to a one-pool model proposed by Stanford and
Smith (1972), in which the process follows the
first order kinetic (Equation 1)
Nm = N0 × (1 – e –kt
) + Ni (1)
Where Nm is the cumulative amount of N
mineralized at a specific time t, N0 is the
potentially mineralizable N (representing the
pool of the organic N that might be
mineralized), k is the mineralization rate
coefficient and Ni is the mineral N at time 0.
This equation has been widely used to describe
N mineralization (Cabrera et al. 2005; Madrid et
97
al. 2011). The equation was fitted to data using
the Marquardt iteration method in order to
obtain the No and k.
The rate of mineralization which is the first
derivative of Eq. 1 is:
ktm ekNdt
dN 0 (2)
The rate of mineralization decreases with
time and at t = 0 is equal to No k, that is called
‘the initial potential rate of N-mineralization’.
Statistical analyses
All statistical analyses were carried out
with the program SPSS 15.0 for Windows. A
Student’s t-test (p 0.05) was used to assess
differences between the same soil with and
without litter addition.
Results
Evolution of pH, Kjeldahl-N and CaCl2
extractable trace elements
Soil pH values, Kjeldahl-N and available
trace element concentrations in soils at three
representative times of incubation (0, 24 and 40
weeks) are shown in Table 3. Generally, in RHU
and AZ litter presence did not affect pH values,
however values of DO-L were always
significantly higher than those of DO, although
values were still very acidic. As a rule,
comparing the initial and final pH values during
the incubation period, a little acidification was
observed in all soils.
Kjeldahl-N concentrations were
significantly higher (around 0.50-1.00 g kg-1
)
due to litter addition, especially in RHU soil,
and tended to decrease throughout the
incubation (Table 3).
Table 3. Changes in pH values, Kjeldahl-N (Kjel-N) and 0.01M CaCl2-extractable trace element concentrations
at three different incubations times.
Soil Week pH Kjel-N
(g 100 g-1) Cd mg kg-1
Cu mg kg-1
Zn mg kg-1
RHU 0 7.19 0.090 <0.001 0.010 0.068
24 6.54 0.090 <0.001 0.006 0.421
40 6.99 0.087 <0.001 0.033 0.179
RHU-L 0 7.18 0.231* <0.001 0.010 0.028
24 6.72 0.171* <0.001 0.005 0.774
40 6.97 0.163* 0.002 0.048 0.084
AZ 0 7.23 0.126 0.025 0.22 0.16
24 7.22 0.118 0.001 0.14 0.01*
40 7.14 0.102 0.004 0.08 0.05
AZ-L 0 7.21 0.174* 0.003 0.51* 0.16
24 7.43* 0.168* 0.008* 0.27* 0.002
40 7.16 0.158* 0.002 0.13 0.08
DO 0 2.66 0.097 0.28 31.5 78.4
24 2.24 0.089 0.22 32.3 60.5
40 2.40 0.081 0.18 23.6 46.4
DO-L 0 3.07* 0.154* 0.49* 16.1 * 103*
24 2.56* 0.151* 0.48* 28.3 109*
40 2.73* 0.151* 0.50* 21.0 104*
* (p<0.05) Significant differences between same soils and time with and without litter addition
In non-contaminated soil (RHU) available
Cd and Cu elements were very low (below the
detection limit of the used method) (Table 3).
The presence of litter did not significantly alter
the concentration of available Cd, Cu and Zn in
this soil. Neutral contaminated soil (AZ) also
presented low concentrations of available Cd,
Cu and Zn during the whole incubation period.
Litter addition to AZ had little effect on
available trace elements, although a significant
increase of the concentration of available Cu in
AZ-L compared to AZ was observed at the
98
initial time (T = 0) and after 24 weeks of
incubation (T = 24) (Table 3). The behavior of
the acid contaminated soil (DO) differed from
that of the neutral soils. Concentrations of
available Cd, Cu, and Zn were much higher in
this soil than in the other two soils. In this acid
soil, litter addition increased available Cd and
Zn from the beginning of the experiment (T=0),
but it did not increase over time (from T=0 to
T= 40) (Table 3). In DO available Cu decreased
after the addition of litter, but only at the
beginning of the experiment (T=0) the
differences between DO and DO-L were
significant. In general, concentrations of
available trace elements in soils (with and
without litter) tended to decrease slightly or
remain constant over time (Table 3). Available
As and Pb in the three soils were below the
detection limit for these elements of the used
method 0.01 mg l-1
; 0.1 mg kg-1
.
Evolution of NH4-N+, NO3-N
- and potential
nitrification rates (PNR)
The evolution of NH4+-N, NO3
‒-N
concentrations and the potential nitrification
rates (PNR) values are shown in Figures 1, 2
and 3, respectively. In the neutral soils (RHU
and AZ), NH4+-N concentration did not change
by the litter addition. In these soils,
concentrations of NH4+-N were generally lower
than 4 mg kg- 1
(Figure 1). In the acid soil (DO)
NH4+-N concentrations were higher than those
found in neutral soils. Concentrations of NH4+-N
increased significantly with the addition of litter
during the period between 2 and 32 weeks of
incubation. Both DO and DO-L showed a
maximum in that period.
0 2 4 8 16 24 32 40
NH
4-N
(m
g k
g-1
)
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
RHU-L
RHU
Incubation time (weeks)
0 2 4 8 16 24 32 40
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
AZ-L
AZ
0 2 4 8 16 24 32 40
-2
0
2
4
6
8
10
12
14DO-L
DO
a) b)c)
Fig. 1. Evolution of NH4-N concentration in the different soils with and without litter addition.
In neutral soils (RHU and AZ), especially
in those with litter application, after an initial
immobilization period an increase of NO3--N
was observed (Figure 2). In AZ-L, NO3--N
concentrations continued increasing up to 46
weeks of incubation. In the acid soil (DO) no
significant differences in NO3--N concentrations
were found with addition of litter, whose values
were similar over time (Figure 2).
In general, litter addition increased the
potential nitrification rate (PNR) during the
whole incubation period in the neutral soils
(RHU and AZ) (Figure 3). Values of PNR went
on increasing up to 24 weeks of incubation for
RHU (15 μg N g-1
dry matter day-1
) and 40
weeks for AZ (25 μg N g-1
dry matter day-1
),
remaining approximately constant and at very
low values for DO.
99
0 2 4 8 16 24 32 40
NO
3-N
(m
g k
g-1)
0
50
100
150
200
250RHU-L
RHU
024 8 16 24 32 40 46 57
0
50
100
150
200
250 AZ-L
AZ
Incubation time (weeks)
a) b)
0 2 4 8 16 24 32 40
0
2
4
6
8
10
200
250DO-L
DO
c)
Fig. 2. Evolution of NO3-N concentration in the different soils with and without litter addition.
0 4 8 16 24 32 40 46 57
0
5
10
15
20
25
30AZ-L
AZ
Incubation time (weeks)
0 4 8 16 24 32 40
-10
0
10
20
30
DO-L
DO
b) c)
0 4 8 16 24 32 40 46
0
5
10
15
20
25
30
RHU-L
RHU
mg
N k
g-1
d-1
a)
Fig. 3. Potential Nitrification Rate (PNR) evolution in the different soils with and without litter addition.
N-Mineralization model
N mineralization for RHU without litter
addition fit to the first kinetic equation model
throughout the entire experimental time,
however for AZ the model was only fitted
during 24 weeks of incubation (Figure 4 and
Table 4). No significant differences were found
for the values of potentially mineralizable N
(No) for these soils (mean value ± SE; 38.0 ±
10.5 and 16.6 ± 6.4 mg N kg-1
, for RHU and AZ
respectively).
Incubation time, week
0 10 20 30 40 50 60
Nm,
mg
kg
-1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
RHU Litter
RHU
RHU Litter predicted
RHU predicted
Incubation time, week
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
AZ Litter
AZ N
AZ Litter Predicted
Az Predicted
incubation time, week
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
DO Litter
DO N
DO Litter Predicted
SE
SE
Fig. 4. Experimental and predicted values of net mineralized N in the different soils.
For both soils with litter addition, Eq. 1
could be also applied from the first 4 weeks of
incubation. Differences between No (203 ± 85
and 285 ± 82 mg N kg-1
for RHU-L and AZ-L
respectively) were not significant.
100
Table 4. Net mineral nitrogen at time 0 (Ni), potentially mineralizable nitrogen (N0), rate constant of
mineralization (k), potential rate of mineralization (N0*k), half-time for mineralization (t1/2) and the coefficient of
determination (r2).
Ni Ni SE No No SE k k SE No x k No x k SE t 1/2 r2
RHU 18.33 8.52 37.95 10.47 0.0796 0.0704 3.02 2.80 8.71 0.7025
RHU-L -25.25 24 203 85 0.0284 0.0269 5.68 2.38 24.75 0.9238
AZ 24.66 2.19 16.59 6.4 0.0788 0.0742 1.31 0.50 8.79 0.8839
AZ-L -27.59 17.71 285.18 82.05 0.0215 0.0126 6.13 1.76 32.23 0.9637
DO 3.83 0.78 4.63 0.51 0.0997 0.0459 0.46 0.10 6.95 0.9889
DO-L 1.98 2.94 12.83 2.52 0.234 0.102 3.00 1.44 2.96 0.9799
Values of k were similar for the both soils
without litter addition (RHU and AZ; ca. 0.08
week-1
), while for soils with litter addition
(RHU-L and AZ-L) values of k were smaller
(0.02 – 0.03 week-1
). The potential rate of N
mineralization (No k) increased with the litter:
from 3.02 ± 2.80 to 5.68 ± 2.38 mg kg-1
week-1
for RHU and RH-L, and from 1.31 ± 0.50 to
6.13 ± 1.76 mg kg-1
week-1
for AZ and AZ-L.
Differences between No k values of RHU and
AZ, and between values of RH-L and AZ-L
were not significant. For DO-L, net N
mineralization values were much smaller than
for the other soils and did not fit any equation
model (Figure 4).
Evolution of the biochemical properties:
Microbial Biomass Nitrogen (MBN) and
protease activity
Evolution of the values of MBN was
similar in all the soils, tending to decrease
throughout the incubation period (Figure 5).
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
N k
g-1
-40
-20
0
20
40
60
80RHU-L
RHU
0 2 4 8 16 24 32 40
-40
-20
0
20
40
60
80AZ-L
AZ
Incubation time (weeks)
0 2 4 8 16 24 32 40
-40
-20
0
20
40
60
80
DO-L
DO
a) b)c)
Fig. 5. Evolution of Microbial Biomass Nitrogen (MBN) contents in the different soils with and without litter
addition.
In general, litter presence increased MBN
of neutral soils, especially during the first 24
weeks of incubation. Lower values of MBN
were found for the acid soil (DO), the
application of litter only caused a rise of MBN
in the first very early stage of the incubation.
The evolution of the soil protease activity
values during the incubation period in AZ and
DO shows a rapid and significant increase
during the first two weeks of incubation (Figure
6), decreasing to an approximately constant
value afterwards. Evolution of protease values
in RHU shows instead a decrease up to the week
8 and a maximum at 24 weeks. Protease values
in the acid soil (DO) were lower compared with
those for the other soils. Litter addition only
caused increases of the protease activity in
neutral soils: during all incubation period in AZ-
L soil and only during the 16 first weeks in
RHU-L. Protease activity values in RHU-L and
AZ-L tend to decrease to values close to those
of the soils without the addition of litter.
101
0 2 4 8 16 24 32 40
mg
Tyr
kg
-1
0
100
200
300
400
RHU-L
RHU
0 2 4 8 16 24 32 40
0
100
200
300
400AZ-L
AZ
0 2 4 8 16 24 32 40
-30
0
30
60
90
120
400DO-L
DO
a) c)b)
Fig. 6. Evolution of protease activity in the different studied soils with and without litter.
Discussion
The addition of litter did not cause
alkalinisation in neutral soils (RHU and AZ) due
to the moderately acidic nature of the litter
(Table 2), but produce a slight increase of pH
values in the acid soil DO (Table 3). Similar
results were observed by Pérez de Mora et al.
(2006) in an acid trace element contaminated
soil amended with litter from a deciduous forest.
The available fraction of Cd, Cu and Zn
measured using 0.01 M CaCl2, following
Kabata-Pendias (2004) was higher in DO soil
than in the other two soils due to its low pH.
This hypothesis was supported by previous
studies by Brallier et al. (1996) and Ciadamidaro
et al. (2013) among others, who reported that the
availability of cationic trace elements increases
as acidity increases. The increase of available
Cd and Zn found in DO-L compared to DO, and
in some instances the increase of available Cd,
Cu and Zn in the case of AZ-L compared to AZ,
can be explained by the relative high
concentrations of available trace elements added
through the litter (Table 2 and 3). On the other
hand, time-related decomposition of litter in the
soil could lead to the solubilisation of trace
elements, increasing their bioavailability (Table
2). Generally, in this experiment we did not find
significant increases of the concentrations of
available trace elements between T = 0 to T = 40
in the litter treated soils (Table 3), therefore it
seems that the changes on the soil trace elements
due to the addition of litter happened in the first
stage of the incubation. Afterwards trace
elements in the litter are stabilized.
The rate-limiting step in nitrification is the
oxidation of ammonia to nitrite, with nitrite
typically being rapidly oxidized to nitrate by
nitrite-oxidizing organisms (Mertens et al.
2009). Soil pH is the major factor regulating the
nitrification process in soil. Nitrification takes
place in soil at pH ranging 5.5 to about 10.0
with optimum around 8.5. However, some
authors have reported the occurrence of
nitrification at pH as low as 3.8 (Sahrawat
2008). The low values of NH4+-N in neutral
soils (RHU and AZ) demonstrated its rapid
transformation into NO2--N and NO3
--N during
the whole incubation period (Figure 1). In
neutral soils, after an initial phase of N
immobilization, NO3--N concentrations
increased exponentially (Figure 2), indicating
that NH4+-N was oxidized to NO3
--N (He et al.
2000). Other authors found the same results in
aerobic incubation experiments (Cabrera et al.
2005; Madrid et al. 2011). According to
Nannipieri and Eldor (2009) most mineral soils
are affected by immobilization during early
incubation, thus longer term incubations
describe more realistically the release of soil N.
Nitrate immobilization period of N coincides
with the observed increase of MBN at initial
times of incubation (Figure 2 and 5). The N
cycle in soil involves immobilization of
inorganic N with the synthesis of protein by
micro-organisms (Brady 1990).
Nitrification in neutral soils with litter
(RHU-L and AZ-L) was higher than that
observed for soils without litter because the
nitrogen provided by litter (Figure 2). Despite
the trace element contents in AZ soil, the
nitrification process of AZ-L soil not only was
not affected, but it was observed that the
concentrations of NO3--N during incubation
were higher than in RHU-L. Differences can be
102
explained in base on their different texture and
organic matter (OM) contents, because
nitrification proceeds most rapidly where there
is abundance of exchangeable bases, and
exchangeable bases generally increases with
OM and clay contents (Brady 1990).
In the acid soil (DO) higher concentrations
of ammonia and lower concentrations of NO3--N
were observed during the incubation compared
to the neutral soils (Figure 1), revealing a
blockage in the nitrification reaction.
Application of litter had no effect on
nitrification in this soil. There are two main
differences between DO and neutral soil (RHU
and AZ) soil pH and concentrations of available
trace elements. Both soil pH and concentrations
of available trace elements are known to affect
the nitrification process in soils (Smolder et al.
2004), but it is not possible to determine which
of these two factors is most important in this
case. On the other hand, denitrification and
ammonia volatilization losses could also have
resulted in an underestimation in net
mineralization in this soil (Premi and Cornfield
1969; Stevens et al. 1998). At low pH the ability
of nitrifiers to absorb N is very limited and this
could also explain the absence of response of net
nitrification in acidic soils (Ste-Marie and Paré
1999).
Nitrogen mineralization was analyses by
the model of Stanford and Smith (1972) that
provide interesting conclusions about the
behaviour of the native soil N and litter N. First
of all, the value of No of RHU (potentially
mineralization N) representing the pool of
organic N that might be mineralized, was higher
though not significantly than that of AZ despite
the OM and Kjeldhal-N content were higher in
AZ (Table 4; Figure 4). Probably the greater
content of clay of AZ account for that
difference, so that clays confer some degree of
“protection” through their association with
native soil organic matter (Hassink et al., 1993).
The addition of litter increases the values of No
in both soils (Table 4). Despite the lower N
content of the litter of AZ compared to that of
RHU, values of No for AZ-L was some higher
than for RHU-L although differences were not
significant. In this case MO of the litter is not
protected by the clay and the mineralization of
its nitrogen is supposed to be higher in AZ a
loam soil more fertile than RHU a sandy loam
soil. Values of MBN higher in AZ-L than in
RHU-L confirm this hypothesis (Figure 5).
Mineralization rates (k) were similar for both
soils (RHU and AZ) and higher for soils with
allochthonous MO (RHU-L and AZ-L) (Table
2).
Campbell et al. (1991) defined No k as the
initial potential rate of the N mineralization
process and an excellent index of the N-
availability of the soil. As for No values of No k
were higher in RHU than in AZ due to the
different nature of the soils. Litter addition
increased the values of this parameter. Values of
No k for the original neutral soils were similar
to that reported by Cabrera et al. (2005) for a
sandy and a sandy-clay-loam soil; litter
application increased No k to similar values to
those reported by the same authors for soil
amended with olive mill wastewater compost.
Nevertheless, values of No k were lower than
the range of values obtained for several soils by
Simard and N'Dayegamiye (1993) (7.4-37.3 mg
kg-1
week-1
), Hernández et al. (2002) (70-198
mg kg-1
week-1
).
The potential nitrification rate (PNR) was
clearly affected by soil pH ‒ revealing that
nitrifying organisms are acid-sensitive in these
soils (Dancer et al. 1973) ‒ and by the litter
addition. However effect of trace element on the
soil cannot be inferred from this figure.
Smolders et al. (2001) concluded that the effect
of metals on PNR rate is smaller than the effect
of soil properties, mainly pH. Moreover, they
concluded that the PNR assay should be
considered as a test that indicates the existence
of a stress factor in soil. However, these results
could also related with the fact that soluble trace
elements in soils were also inhibitory factors on
some steps involved in the N cycle, probably
because toxic metals cause protein denaturation
or damage the integrity of microbial cell
membranes, which consequently influences their
growth, morphology and metabolism (Leita et
al. 1995).
Different aspects of abiotic toxicity
towards microorganisms and microbial process
in forest soils have been reviewed by Baath
(1989). The adverse effects of acidity and heavy
metal on soil biological properties are well
known (Yang et al. 2006); such studies have
103
focused mainly in establishing the influence of
the total concentrations of trace metals (Papa et
al. 2010). Soil functional quality, however, is
more dependent on bio-available trace metal
concentration since this is the only fraction that
affects soil-quality-related parameters such as
enzyme activities or microbial related processes
(Speir et al. 1995). In fact, in this study, the two
contaminated soils showed very different
behaviours: in the case of AZ soil with neutral
pH and low trace element availability, MBN and
protease activity values were similar or even
higher than those observed for non-
contaminated soil, whereas DO soil with acid
pH and high metal availability presented a poor
microbiological status (Figures 5 and 6).
Even though the pH was the most
determinant soil property, the role of the litter
input in microbiological properties was also
noticeable. Neutral soils with litter addition
presented higher values of MBN at the initial
times of incubation. Protease activity was in
general higher in soil with litter addition than
soil without this addition during the entire
incubation period. This extracellular enzymatic
activity is closely related with protein N content
and catalyses the release of amino acids
(Nannipieri and Eldor 2009). The factors
regulating protease activity have been studied
extensively with single bacterial and fungal
species (Kumar and Takagi 1999), and the
results have shown that N source is one of the
most important factors. Litter was an important
source of N to soils (Tables 2 and 3) and its
decomposition was accompanied by stimulation
of a succession of soil enzymes (Moorhead et al.
1999).
Conclusions
Despite its trace element content, white
poplar-litter positively modified soil properties
related with the N cycle, even in trace element
contaminated soils, showing the importance of
the litter in forest ecosystems. White poplar-
litter increased the availability of Cd and Zn in
acidic soil, but had little effect in neutral soils.
Our results showed the negative effect of the
acidity and trace element availability in
parameters related with the N-cycle.
Acknowledgments
AGL2008-00985 supported by the CICYT of
the Ministerio de Ciencia e Innovación of Spain
and FEDER (EU). L. Ciadamidaro thanks to
CSIC for funding her grant (JAE-PreDoc).
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V.3. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
107
V.3. GROWTH OF POPULUS ALBA AND ITS INFLUENCE ON SOIL
TRACE ELEMENT AVAILABILITY.
RESUMEN
Crecimiento de Populus alba y su influencia en la disponibilidad de elementos
traza en el suelo.
El uso de árboles de crecimiento rápido es una práctica común en la
fitorecuperación de suelos contaminados. Las raíces de las plantas pueden modificar
la biodisponibilidad de elementos traza en los suelos. Se ha estudiado el efecto del
Populus alba (álamo blanco) en la biodisponibilidad de elementos traza en dos
suelos contaminados (uno con pH neutro y otro pH con ácido) comparando dos
métodos (elementos traza extraíbles en el suelo con 0,01 M CaCl2 y la concentración
en las aguas de poro del suelo - SPW), la acumulación de elementos traza en las
hojas de las plantas y el desarrollo de las mismas durante 36 meses. Los resultados
se compararon con los obtenidos en un suelo no contaminado. El experimento se
llevó a cabo en contenedores (95 l de volumen y 1 m de altura). Para cada suelo, la
mitad de los contenedores se plantaron con árboles jóvenes de álamo blanco,
mientras que la otra mitad no se plantaron. En suelos neutros el crecimiento de las
plantas no influyó en el pH del suelo pero en el suelo ácido la presencia del sistema
radical disminuyó sensiblemente la acidez. Los valores de pH obtenidos en el SPW
mostraron una tendencia similar en comparación con los obtenidos después de la
extracción con KCl. La biodisponibilidad de elementos traza determinada por ambos
métodos mostró resultados comparables y predijeron la respuesta de la planta. En el
suelo no contaminado, las plantas tendieron a aumentar la disponibilidad de
micronutrientes (Cu, Mn y Zn). Sin embargo, en el caso del suelo neutro
contaminado, el crecimiento del álamo blanco no aumentó la disponibilidad de
elementos traza. Por otra parte, los resultados de los valores de altura y diámetro del
tronco de los árboles, durante 36 meses, demostraron que la presencia de elementos
traza total en el suelo no afectó el desarrollo de la planta.
Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
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Science of the Total Environment
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Growth of Populus alba and its influence on soil trace element availability
L. Ciadamidaro a,⁎, E. Madejón a, M. Puschenreiter b, P. Madejón a
a Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS), CSIC, Av. Reina Mercedes 10, P.O. Box 1052, 41080 Seville, Spainb BOKU, University of Natural Resources and Life Sciences Vienna, Department of Forest and Soil Sciences, Konrad Lorenz Straße 24, A-3430 Tulln, Austria
H I G H L I G H T S
• Populus alba in contaminated soils provide benefits: soil restoration and biomass production.• CaCl2 extraction and SPW analysis were accurate to predict trace element bioavailability.• An effect on pH due to plant growth was found in acid soil.• The growth of P. alba did not increase trace element availability in contaminated soil.• The selected soil contamination did not affect plant development.
⁎ Corresponding author. Tel.: +34 95 462 4711.E-mail address: [email protected] (L. Ciadamidaro)
0048-9697/$ – see front matter © 2013 Elsevier B.V. Allhttp://dx.doi.org/10.1016/j.scitotenv.2013.03.032
a b s t r a c t
a r t i c l e i n f oArticle history:Received 26 November 2012Received in revised form 11 March 2013Accepted 11 March 2013Available online 2 April 2013
Keywords:BioavailabilitySoil pore waterRhizospherePhytoremediation
The use of fast growing trees is a common practice for phytoremediation of contaminated soils. Plant rootscan change trace element bioavailability in soils. We studied the effect of Populus alba on trace element bio-availability on two contaminated soils (one with neutral pH and other with acid pH) comparing two methods(0.01 M CaCl2-extractable in soil and concentration in soil pore water SPW), trace element accumulationin leaves and plant development over 36 months. Results were compared to those obtained with a non-contaminated soil. The experiment was carried out in containers (95 L of volume and 1 m height). Half ofthe containers for each soil were planted with P. alba saplings and the others remained without plant. In neu-tral soils plant growth did not influence soil pH; the greatest effect due to plant growth was found in acid soil.Values of pH obtained by SPW showed a similar trend compared to those obtained after soil KCl extraction.Bioavailability of trace elements determined by both methods followed the same behavior in the three studiedsoils. Both methods for determining trace element bioavailability in soil were accurate to predict plant uptake.In non-contaminated soil, plants tended to increase micronutrients (Cu, Mn and Zn) availability. However, incase of contaminated soil, the growth of P. alba did not increase trace element availability. Moreover, resultson height and diameter of the trunk of the trees, during 36 months, demonstrated that the presence of totaltrace elements in soil did not affect plant development.
© 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.
1. Introduction
The use of fast growing trees is a common practice for phyto-remediation of contaminated soils in many regions of the world (DePaolis et al., 2011; Minogue et al., 2012). Short forest rotation planta-tions have been introduced with the aim of producing biomass forenergy and industry over the past two decades (Lucas-Borja et al.,2011). In this respect, Poplar is largely used, as it is known to be afast-growing tree, producing large yields and having a high energypotential (Calfapietra et al., 2010). For that reason phytoremediationof soils using these trees could provide twomajor services: the rehabil-itation and restoration of contaminated soils and biomass production.
.
rights reserved.
The efficiency of any phytoremediation system depends on thebioavailability of the targeted pollutants and root-microbial modifica-tions of their solubility and chemical speciation in the rhizosphere(Wenzel, 2009). In the case of trace elements, plants can controlmetal/metalloid bioavailability in their rhizosphere via uptake mecha-nisms, properties of their root system, and root activities as largelydocumented in non-accumulating plants (Hinsinger and Courchesne,2008) and in accumulating plants (Kidd et al., 2009). Plant roots androot debris can decrease thebioavailability of cationicmetals/metalloidsvia adsorption onto root surfaces or root-derived biomolecules (Breckleand Kahle, 1992; Cathala and Salsac, 1975). Directly or indirectly, rootexudatesmay also change the pH of the rhizosphere, which can increasenutrient availability and affect cell membrane permeability (Jones et al.,2004; Neumann and Römheld, 1999).
Several authors have shown that some Salix and Populus species areable to accumulate substantial amounts of trace elements in their leaves
338 L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
(Lepp andMadejón, 2007; Unterbrunner et al., 2007). As they are decid-uous trees, after the autumnal fall a ‘carpet’ of litter loaded with heavymetals is formed, which is not always viable to be removed entirely.There is little information regarding the influence of this litter on theproperties of the reforested soils (Scheid et al., 2009), especially ontrace element mobility. Moreover the impact of the roots on the mobi-lization of trace elements is unclear, as low molecular weight organicacids released by roots may affect trace element desorption, solubility,and mobility by reducing soil pH and forming soluble complexes withtrace elements (Renella et al., 2004; Schwab et al., 2008).
The potential toxic effects in exposed organisms and ecosystems arenot caused by the entire amount of trace elements released to the envi-ronment but only by the bioavailable fraction. Until now, only totalmetalconcentrations have been considered in national legal frameworks,although it has become clear that the bioavailable fraction reflects poten-tial risks much better (Adriano et al., 2004). However, the definition ofbioavailability and the concepts on which it is based are still unclearand very diverse (Kidd et al., 2009; Vangronsveld and Cunningham,1998). The methods adopted for its measurement vary and as suchthere is no single standard technique for the assessment of either plantavailability of contaminants or their ecotoxicological impacts on soilbiota. The bioavailable contaminant fraction in soil represents the rele-vant exposure concentration for soil organisms. The bioavailable fractionof trace element oftentimes refers to the most labile fraction (sum ofsoluble and weakly absorbed fractions; Adriano, 2001).
Our aim was to evaluate the effects of Populus alba growth undersemi-field conditions on trace element bioavailability in two soilscontaminated by a mine-spill during the Aznalcóllar mine accidentand to establish whether P. alba could be used for biomass productionon the same contaminated soils. We hypothesized that plant growthmight change soil pH and affect trace element bioavailability. To provethis we studied for 36 months the development of pH and trace ele-ment bioavailability, using differentmethods (0.01 MCaCl2-extractablein soil and concentration in soil pore water), trace element accumula-tion in P. alba leaves and plant development. Few studies are availableto compare pore water collected in situ from different soils in conjunc-tion with more conventional laboratory-based chemical assessments ofthe same soils to provide reliable and practical measures for determin-ing plant bioavailability.
2. Material and methods
2.1. Experimental design
The experiment was carried out under semi-field conditions usingtwo trace element contaminated soils, Aznalcázar (AZ pH 7.2) andDoblas (DO pH 2.7), and a non-contaminated control soil (CO pH 7.5).The trace-element polluted soils, AZ and DO, were collected in thearea affected by a mine spill, during the Aznalcóllar mine accident(28th April 1998) in South West of Spain, (Grimalt et al., 1999)in spots where P. alba trees were growing (37°18′4.7″ N, 6°15′39.1″W, AZ and 37°23′42.5″ N, 6°13′36.4″ W, DO). Soil CO was collected inthe experimental farm “La Hampa” (IRNAS-CSIC) in Coria del Río(Southern Spain). The experiment was carried out in 18 containers(95 L of volume and 1 m height) that were placed outdoors. The
Table 1Some characteristics of the studied soils (0–60 cm). Mean values ± standard errors (n = 3
Sample Texture As Cd
Sandy Lime Clay Pseudo-total content (mg kg−1
g kg−1
CO 869 15 115 8.40 ± 1.07 0.59 ± 0.0AZ 393 346 263 112 ± 3.05 3.82 ± 0.0DO 790 60 150 290 ± 8.54 3.53 ± 0.0
containers were filled with the different soils. In 3 containers per soila white poplar tree from a nursery (sixmonths-old)was planted: treat-ments AZ-P, DO-P, and CO-P. A further 3 containers per soil were leftwithout plants (AZ, DO, CO). The deepest layer of DO-P containers(last 25 cm) was filled with non-polluted soil, to reproduce naturalconditions of the DO area, in which we found high pollution and acidpH in the superficial layer (about 70 cm) and lesser severe pollutionand neutral pH in deeper layers. Soil texture and total trace elementcontent are shown in Table 1.
Containers were irrigated daily during the growth phase (April toNovember), through a drip irrigation hose with two emitters of 4 L/hper container. The mean water dose during this time was correspond-ing to 4 mm irrigation per container and day. This value was calculateddepending on the evapotranspiration demand to keep the soil moistureclose to its water holding capacity.
Soil pore water was sampled by ‘Rhizon’ samplers (EijkelkampAgrisearch Equipment, The Netherlands), inserted laterally into thecontainers at 20 cm depth. These were sampled every month, (exceptwhen it was not possible the extraction of soil pore water due to thehigh evapotranspiration) throughout the experimental period usingremovable needles attached by a Luer-Lock connection to the samplerand vacuum tubes to extract soil pore water from the sampler.
Soil samples at 0–15 cm depth were taken in spring and autumn ofeach year from 2009 until 2011 (six samplings). Soil samples wereair-dried and passed through a 2 mm sieve. Parameters related toplant development (height and diameter of the trunk) were measuredeverymonth.Moreover analysis of leaveswas performedevery autumn.At the end of the experiment total plant biomass (including shoot,leaves and trunk) was determined. Root development (measurementof the apical and lateral roots) was also evaluated.
2.2. Soil chemical property determination
Soil pHwasmeasured in a 1 MKCl extract (1:2.5,m/v) after shakingfor 1 h (Hesse, 1971) using a pH meter (CRISON micro pH 2002). The0.01 M CaCl2-extractable trace element concentrations in soils weredetermined in 0.01 M CaCl2 (1:10, m/v) extracts after shaking for 3 h(Houba et al., 2000) via ICP-OES. Pseudo-total trace element concentra-tions in soil (b60 μm) were determined by ICP-OES following “aquaregia” digestion in a microwave oven.
2.3. Soil pore water analysis
Field-based techniques that do not require highly invasive or de-structive procedures to sample the aqueous phase of the soil andthat allow repeated sampling from the same location over an extend-ed time course would be invaluable. ‘Rhizon’ soil moisture samplers,which can extract a 5–10 mL volume of interstitial soil pore waterwithout significantly disturbing the structure, chemistry or biologyof the soil have been proposed as a valid tool for monitoring andassessing eco-toxicity in soils (Beesley et al., 2010; Clemente et al.,2008). Soil pore water (SPW) samples were analyzed for pH andtrace elements using ICP-OES. Whenever necessary, improper sam-plers were replaced; data points were omitted from figures in these
).
Cu Mn Pb Zn
)
3 19.4 ± 1.17 214 ± 6.36 15.7 ± 0.24 52.0 ± 1.929 166 ± 3.61 450 ± 7.54 236 ± 7.80 506 ± 8.845 193 ± 6.03 287 ± 11.0 391 ± 14.8 227 ± 5.36
339L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
cases. The detection limits were as follows: Cd 0.1 μg L−1, Cu0.1 μg L−1, Mn 1 μg L−1, Pb3 μg L−1, and Zn 0.2 μg L−1.
2.4. Plant material
Vegetal material (leaves) was washed for 15 s with a 0.1 N HClsolution then for 10 s with distilled water. Washed samples were ovendried at 70 °C. Dried plant material was ground and passed through a500-μm stainless-steel sieve prior to preparation for analysis.
Plant samples were digested by wet oxidation with concentratedHNO3 (65%, trace analysis grade) under pressure in a microwavedigester. Analysis of trace elements (As, Cd, Cu, Pb and Zn) in theextracts was performed by ICP-OES.
The accuracy of the analytical methods was assessed through BCRanalysis (Community Bureau of Reference) of a plant sample (INCT-TL-1,Tea Leaves). The detection limits of the method used were: As0.1 mg kg−1, Cd 0.03 mg kg−1, Cu 0.03 mg kg−1, Pb 0.3 mg kg−1,and Zn 0.03 mg kg−1. The percentages of recovery for each element
pH Soil
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
COCO-P
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
AZAZ-P
Days after planting
2
3
4
5
6
7
8
DO DO-P
a
b
c
*
pH
p
H
pH
Fig. 1. Evolution in time of soil pH (graphs a, b and c) and soil pore water (SPW) (graphs d, econtainer with and without plant for each soil and time are marked with an asterisk.
were: 65.7 ± 3.5 % for As, 106 ± 9.12 % for Cd, 99.5 ± 0.85 % for Cu,94.1 ± 1.50 % for Pb and 110 ± 7.59 % for Zn.
2.5. Statistical analysis
All statistical analyses were carried out with the program SPSS15.0 for Windows. A Student's t-test (p b 0.05) was used to assess dif-ferences between the same soil with and without plant to test fortime-related differences within the same soil and treatment datawas also analyzed by ANOVA for repeated measures using “sampling”as factor. Significant differences for all variables between the differentsampling events within the same treatment were established byStudent's t-test pairwise comparisons using the Bonferroni correc-tion. A correlation matrix between concentrations of metal obtainedby the different methods to determine availability and metal con-centration in plant was calculated. The significance levels reported(**p b 0.01 and *p b 0.05) are based on Pearson coefficients.
pH SPW
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
COCO-P
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
AZAZ-P
Days after planting
2
3
4
5
6
7
8
DODO-P
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
d
e
f
pH
p
H
pH
and f) at the three studied soils without and with plant. Significant differences between
340 L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
3. Results and discussion
3.1. Soil pH
Generally, in neutral soils (CO and AZ) plant growth did not influ-ence soil pH significantly (Fig. 1a and b). A decrease of pH values inboth soils and treatments was observed approximately 800 days afterplanting. However, at the last sampling pH values increased, whichcould be related to the application of irrigation water (pH = 7.17) atthat time. Probably, this reduction might be also attributed to the highprecipitations, since this sampling was carried out at the beginning ofspring after frequent rainfall episodes.
Values of pH in the SPW followed a similar behavior (Fig. 1d and e)to that of the values measured in soil after KCl extraction. Few differ-ences between soil with and without plants were observed in neutralsoil being either contaminated (AZ) or not (CO). In general, values ofpH in neutral soils were very similar during the entire growth period.However, a different trend was obtained for acid soil (DO) (Fig. 1c),where pH tended to increase in time in both soils (DO and DO-P). Thisincrease was more pronounced in planted soils. Like for neutral soils,
Cu Soil
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25CO
CO-P
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
AZ
AZ-P
Days after planting
0
5
10
15
20
25DO
DO-P
a
b
c
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
Fig. 2. Evolution in time of available Cu extracted with 0.01 M CaCl2 (graphs a, b and c) and so
values of pH in SPW showed a similar trend to those values measuredafter KCl extraction. In fact a high correlation between both pH valueswas found for all soils (r = 0.917 **p b 0.001). For this soil and forboth treatments, the ANOVA for repeatedmeasures revealed significantdifferences between the first and the following samplings.
In this study an effect of plant growth on pHwas found for the acidsoil (Fig. 1c). Due to the activities of roots, the adjacent rhizospheresoil might become more alkaline (Nye, 1981), mainly because of H+
consumption and/or OH− exudation (Jones et al., 2004; Nye, 1981).Moreover, in acid soils root exudates can form stable complexes(e.g. with Al3+), thus reducing the acidity of the medium (Shi et al.,2011; Yang et al., 2011; Zhou et al., 2011).
3.2. Trace element bioavailability
Assessment of the total trace element concentration in soils maygive information concerning possible enrichment of soil with traceelements, but it is not sufficient for estimating their mobility and avail-ability for ecological processes (Bunzl et al., 1999). Naidu et al. (2008)defined the bioavailability of contaminants in soil as the fraction of
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
Cu SPW
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06 CO CO-P
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16AZ
AZ-P
Days after planting
0
2
4
6
8 DO
DO-P
d
e
f
mg
L-1
mg
L-1
mg
L-1
il pore water (SPW) (graphs d, e and f) at the three studied soils without and with plant.
341L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
the totalmetal(loid) in the interstitial porewater (i.e., soil solution) andsoil particles that is available to the receptor organism. There is contro-versy in the literature regarding the definition and the methods for themeasurement of bioavailability (Menzies et al., 2007). In this work weevaluated trace element bioavailability by twomethods: soil extractionwith 0.01 M CaCl2 and concentration in the soil pore water (SPW).Values of bioavailable trace metal determined by the two methods arepresented in Figs. 2, 3, 4, 5 and 6.
Values of CaCl2 extractable trace elements in neutral soils (CO andAZ) were in general close to background values (Figs. 2a and b; 3a andb, 4a and b; 5a and b; 6a and b).
Values of Cu ranged between 0.002 and 0.11 mg kg−1 in CO soilsand between 0.008 and 0.59 mg kg−1 in soil AZ through the threeyears of study (Fig. 2a and b). In the case of Mn, these values rangedbetween 0.21 and 1.28 mg kg−1 in CO soils and between 0.06 and3.3 mg kg−1 in soil AZ (Fig. 3a and b) and for Zn, values ranged be-tween 0.008 and 0.73 mg kg−1 in CO soils and between 0.04 and1.7 mg kg−1 in soil AZ (Fig. 4a and b). Concentration of Cu, Mn andZn presented fluctuations in time without a clear pattern throughoutthe time of experimentation. Concentration of these elements in SPW
Mn Soil
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
CO CO-P
0
1
2
3
4
AZ AZ-P
Days after planting
0
20
40
60
80
100 DO DO-P
a
b
c
Fig. 3. Evolution in time of available Mn extracted with 0.01 M CaCl2 (graphs a, b and c) and so
followed a similar tendency to values obtained with the CaCl2 extrac-tion and was also very low (Fig. 2, 3 and 4a, b and c respectively).In general the presence of plants tended to increase Cu, Mn and Znavailability in non-contaminated soil (CO-P). It is important to notethat these three elements are micronutrients necessary for plant de-velopment. For that reason CO soil roots may need to mobilize theseelements for sufficient supply to the plant. However, in neutral con-taminated soil (AZ-P) plants we did not find any influence on theavailability of these metals, because available Cu, Mn and Zn concen-trations in soil were, in general, higher than in CO soils and probablythese levels were enough to satisfy plant demand. Moreover in case ofZn and Mn higher concentration was found in soils without plantsshowing the demands of these micronutrients by the plant.
Cadmium and Pb are elements without physiological function andpotentially toxic for plants (Kabata-Pendias and Pendias, 1992). Al-though fluctuations in time were observed, Cd values in neutral soilswere very low and reached maxima values of 0.02 and 0.03 mg kg−1
for CO and AZ respectively. Concentration of Cd in SWP followed asimilar pattern to that obtained with the CaCl2 extraction with valuesalways lower than 0.001 mg L−1 in CO and lower than 0.01 mg L−1
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
Mn SPW
mg
L-1
mg
L-1
mg
L-1
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12 COCO-P
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25AZ AZ-P
Days after planting
0
20
40
60
DO DO-P
d
e
f
il pore water (SPW) (graphs d, e and f) at the three studied soils without and with plant.
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00 020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0 COCO-P
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
AZ AZ-P
Days after planting
0
20
40
60
80DODO-P
Zn SPW
mg
L-1
mg
L-1
mg
L-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05 COCO-P
0.0
0.2
0.4
0.6AZAZ-P
Days after planting
0
5
10
15
20DODO-P
a
b
c
d
e
f
Zn Soil
Fig. 4. Evolution in time of available Zn extracted with 0.01 M CaCl2 (graphs a, b and c) and soil pore water (SPW) (graphs d, e and f) at the three studied soils without and with plant.
342 L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
in AZ. Contents of available Pb (measured by CaCl2 extraction or inSPW) were also very low in these neutral soils; however the highestconcentration was found in the first sampling for bothmethods. Duringthe experiment, concentrations of Pb strongly decreased (Fig. 6). Thisreduced solubility might be due to the presence of Pb-bearing phasessuch as beudantite (PbFe3 (AsO4)(SO4)(OH)6), which have beenreported as main minerals resulting from the oxidation of sulfide-rich tailings (origin of contamination) (Roussel et al., 2000). It isalso possible that Pb is present in recalcitrant forms in the soil andthus shows less mobility than other elements from the toxic spillsuch as Cd, Cu and Zn.
The evolution of trace element bioavailability in DO soil was dif-ferent from that of the neutral soils, showing the highest concentra-tions at the beginning of the study and tended to decrease in time.In fact as occurred with pH values, the ANOVA for repeated measuresshowed in general significant differences between the first and thefollowing samplings. In this soil values of trace element concentra-tions were higher than those of neutral soils (Figs. 2, 3, 4, 5 and 6cand f), due to the acidity of the soil. It is well known that the availabil-ity of cationic elements increases as acidity increases (Brallier et al.,
1996). Bioavailability of trace elements determined by CaCl2 andSPW methods followed the same behavior: higher values at thebeginning of the experiment and a decrease in time, reaching theminimum at the end of the experiment, after 3 years of study. Thisdecrease was directly related with the increase of pH of this soil dur-ing the experiment.
Values of CaCl2 extractable trace elements in acid soil (DO) did notpresent a significant difference between treatments with or withoutplant, especially in the last sampling, and the values ranged between0.02 and 15.8 mg kg−1 for Cu, 2.42 and 85 mg kg−1 for Mn and 0.85and 70 mg kg−1 for Zn. A similar tendency was observed for Cd andPb but the concentrations were always lower (Fig. 5 and 6c). Indeed,values for Cd and Pb did not exceed 0.35 mg kg−1 and 0.4 mg kg−1,respectively. Concentrations of trace elements in SPW showed a sim-ilar behavior to those obtained with CaCl2 extraction (Figs. 2, 3, 4,5, 6f). The presence of plants did not seem to affect the trace ele-ment availability measured in SPW.
Data showed similar results for the two methods used for estimatesof trace element bioavailability, especially in acid soils. In fact, valuesobtained by both methods were significant and positively correlated
Cd Soil
020
040
060
080
010
00 020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00 020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04CO CO-P
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
AZAZ-P
Days after planting
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
DO DO-P
Cd SPW
mg
L-1
mg
L-1
mg
L-1
0.0000
0.0002
0.0004
0.0006
0.0008
0.0010 CO CO-P
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020 AZAZ-P
Days after planting
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
DO DO-P
a
b
c
d
e
f
Fig. 5. Evolution in time of available Cd extracted with 0.01 M CaCl2 (graphs a, b and c) and soil pore water (SPW) (graphs d, e and f) at the three studied soils without and with plant.
343L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
for all the studied elements (Table 2), showing a significant level higherthan 0.01.
However to prove the reliability of those methods values should becompared with trace element concentration in plants. In plant leavesgrown on AZ and CO soils, concentrations of Cu, Mn and Pb werein the normal range values for higher plants (Kabata-Pendias andPendias, 1992) during all the experimentation period, except for valuesof Pb in the first sampling (in plants just after the transplanting). Plantscame from a nursery and probably due to Pb aerial contaminationplants could uptake via stoma of this element (Schreck et al., 2012).At the beginning of the experiment the small size and scarce amountof the leaves could contribute to concentrate Pb on the leaves, due toa concentration effect. After the initial sampling the leaf concentrationof this element decreased drastically (dilution effect). In any caseexcluding these values, concentration ranged between 6.00 mg kg−1
and 15.0 mg kg−1 for Cu, between 23.0 mg kg−1 and 200 mg kg−1
for Mn and 0.05 mg kg−1 and 0.20 mg kg−1 for Pb. However in thecase of Cd and Zn concentrations in P. alba leaves from neutral contam-inated soils depended of soil contamination. Values in AZ were above
normal levels in plants due to the capacity of this plant species to accu-mulate both elements (Madejón et al., 2004). The values for these ele-ments in AZ soil ranged between 5.70 mg kg−1 to 7.94 mg kg−1 forCd and from 260 mg kg−1 to 291 mg kg−1 for Zn. Values in CO weremuch lower and ranged between 0.10 to 0.58 mg kg−1 for Cd and be-tween 35.0 to 123 mg kg−1 for Zn.
According to Hermle et al. (2006), concentration of trace elementsin P. alba leaves growing in the acid soil (DO) was in general higherthan in neutral soil, showing significant differences in most of thesamplings (Fig. 7). In the second sampling DO plant showed strongrise for Cd, Mn and Zn (Fig. 7b, c and d), reaching its maximum of17 mg kg−1 for Cd, 480 mg kg−1 for Mn and 650 mg kg−1 for Zn.In this sampling significant differences between the three studiedsoils were found for these elements (Fig. 7). However after this sec-ond sampling concentration of these elements decreased in time,demonstrating that pH is the principle factor in trace element solubil-ity. Probably a subsequent root penetration into non-polluted soillayers and the increase in pH (Fig. 1) may have contributed to thedecrease in tissue trace element concentrations with time.
Pb Soil
a
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
020
040
060
080
010
00
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0CO CO-P
b
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
AZAZ-P
Days after planting
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
DODO-P
Pb SPW
mg
L-1
mg
L-1
mg
L-1
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12
0.15 CO CO-P
0.00
0.03
0.06
0.09
0.12 AZAZ-P
Days after planting
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16 DO DO-P
c
d
e
f
Fig. 6. Evolution in time of available Pb extracted with 0.01 M CaCl2 (graphs a, b and c) and soil pore water (SPW) (graphs d, e and f) at the three studied soils without and with plant.
Table 2Correlation coefficients between available trace elements in soil extracted with CaCl2 andSPW, available trace elements in soil extracted with CaCl2 and plant and between SPWand plant (significance levels are **p b 0.01, and *p b 0.05). n = 36, 34 and 12 (numberof soil, rhizon and leave samples, respectively, used to calculate correlation coefficients).
Element SPW Leaves
Cd Soil 0.888** 0.690*SPW 1 0.701*Leaves 1
Cu Soil 0.645** 0.672*SPW 1 0.618*Leaves 1
Mn Soil 0.868** 0.911**SPW 1 0.902**Leaves 1
Pb Soil 0.828** −0.457SPW 1 −0.629*Leaves 1
Zn Soil 0.973** 0.745**SPW 1 0.758**Leaves 1
344 L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
Cu and Pb concentrations reflected a similar trend to that in neutralsoils (Fig. 7a and e). A marked decrease for both metals was observedjust at the beginning of the experiment, maintaining low values duringthe 3 years. For all soils the values ranged between 7 mg kg−1 and17 mg kg−1 for Cu and 0.01 mg kg−1 and 0.85 mg kg−1 for Pb, exclud-ing the values of the first sampling.
Further supports of these results are the correlations betweentrace element concentrations in SWP, extractable by CaCl2 and vege-tal material. Significant positive correlations were found for all ele-ments, except for Pb concentrations between leaves and soils (CaCl2extraction and SPW; Table 2). These results were in agreement withMadejón et al. (2004). In general the strongest correlations wereobserved for Mn, Zn and Cd, especially that Zn and Cd seem to havesimilar geochemical and environmental properties, and they caninteract during plant uptake, transport and accumulation in leaves(Das et al., 1997). Similar results for Cd were found by Robinsonet al. (2000) between poplar leaves and soil.
In case of Mn the high significant correlations obtained could berelated with the ability of this element to be rapidly taken up and
0
3
6
9
12
15
18
Cu
0 200 400 600 800 1000
0 200 400 600 800 1000
0 200 400 600 800 1000
0 200 400 600 800 1000
0 200 400 600 800 10004
6
8
10
12
14CO AZ DO
Mn
0
100
200
300
400
500
600
Pb
Days after planting
0.00.20.40.60.81.01.21.4
7.0
8.0
9.0
Zn
0
100
200
300
400
500
600
700
mg
kg
-1m
g k
g-1
mg
kg
-1
e
b
c d
a
Cd
a
b
c
a
b
b
b
b
a
b
b
a
a a a
a a
a
a
b
b
b
b
b
c
c
a a a a
b
b
b
b
b
c
Fig. 7. Evolution in time of trace element in leaves (Cu, Mn, Zn, Cd and Pb (graphs a, b, c, d and e)) at the three studied soils. In each graph and each time, values with the same letterdo not differ significantly by one way ANOVA (p b 0.05). In the case of Cu and Pb differences between plants were not significant.
345L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
translocated within plants; therefore, it is likely that Mn is not bindingto insoluble organic ligands, either in root tissue or in xylem fluid(Kabata-Pendias and Pendias, 1992).
The low correlations found for Cu (Table 2) could be attributed to thestrong capability of root tissues to hold Cu against the transport to shootunder conditions of both Cu deficiency and Cu excess (Kabata-Pendiasand Pendias, 1992). In a study using P. alba for biomonitoring traceelements in a contaminated riparian forest, similar results were foundfor Cu (Madejón et al., 2004).
Lead correlation coefficients showed different results. Negative cor-relationswere found between Pb in SPWand leaves and no correlationsbetween available Pb in soil and leaves were observed. Blaylock andHuang (2000) demonstrated that most of the absorbed Pb remainedin roots, which made the root the first barrier for its translocation tothe above-ground plant parts. Moreover lead is considered to havelow solubility and availability for plant uptake because it precipitatedas phosphates and sulfates found in the rhizosphere of plants in certainconditions (Blaylock and Huang, 2000).
3.3. Plant development
Total biomass of the trees (without roots), after three years ofgrowing was 770 ± 18 g (mean value ± SE) in CO soil, 910 ± 20 gin AZ soil and 920 ± 80 g in DO soil. Height and diameter of thetrunk of the trees were recorded once a month for 3 years. The datareported in Table 3 only presents values performed every six monthsfor trees. The height of the tree in neutral soils (CO and AZ) washigher, (until it reached 150 cm for CO and 138 cm for AZ in autumn2010), than in acid soil during the first year of the experiment(Table 3). Similar trend was shown for diameter of the trunk charac-terized by higher values for neutral soils, except in the first sampling(Table 3).
The plants growing in the acid soil needed more time for theirdevelopment and a strong increase was found just during the lastyear of experiment, exceeding the height of plants grew up in neutralsoils and reaching 167 cm during the spring 2011. Other authors(Martínez-Alcalá et al., 2012; Menon et al., 2007) have shown that
Table3
Heigh
tan
ddiam
eter
ofthetrun
kof
each
trea
tmen
tdu
ring
Spring
andAutum
nfor3ye
arsof
sampling.
Mea
nva
lues
±stan
dard
errors
(n=
3).Inea
chco
lumn,
values
withthesameletter
dono
tdiffer
sign
ificantly
byon
eway
ANOVA
(pb0.05
).
Sample
Heigh
t(cm)
Diameter
ofthetrun
k(m
m)
1ye
ar2ye
ars
3ye
ars
1ye
ar2ye
ars
3ye
ars
Spring
Autum
nSp
ring
Autum
nSp
ring
Autum
nSp
ring
Autum
nSp
ring
Autum
nSp
ring
Autum
n
CO66
.7±
2.33
a12
1±
3.93
a13
3±
2.96
a15
0±
5.90
a15
3±
4.06
a15
3±
9.28
a3.81
±0.39
a15
.4±
0.32
a21
.0±
0.97
a27
.8±
1.61
a28
.9±
1.82
a36
.7±
5.25
aAZ
64.7
±1.67
a11
7±
3.28
b12
4±
5.81
b13
8±
2.08
a14
1±
5.70
a15
6±
6.84
a3.57
±0.13
a18
.4±
1.00
b27
.9±
0.80
b34
.0±
0.18
ab35
.2±
0.33
a37
.8±
0.63
aDO
67.7
±2.91
a79
.3±
9.82
b85
.3±
10.9b
156±
9.87
a15
9±
10.1a
160±
13.8a
4.13
±0.12
a6.89
±1.71
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2.60
b27
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2.09
b30
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3.00
a31
.8±
0.99
a
346 L. Ciadamidaro et al. / Science of the Total Environment 454–455 (2013) 337–347
root growth was clearly reduced in the acid metal contaminated soil,as what occurred for plant growth, indicating phytotoxicity. Thisprobably occurred in the first period of plant development when a re-tard of the growing was observed in trees of DO soil. In the acid soilthe diameter of the trunk of the trees increased slowly and reached31.8 mm just in the last sampling, demonstrating a strong connectionwith height values.
In this study total trace element content in soil did not significantlyaffect the development parameters of plants which were rather depen-dent on soil pH and trace element availability. Indeed, the increase of pHin DO soil and the reduction of trace element availability were accom-panied by an improved plant growth (Table 3). Moreover the higherdevelopment of root system during the last year might have promotedthe contact with unpolluted soil present in the deeper layer of thecontainers.
4. Conclusions
P. alba growing in contaminated soils did not increase trace elementavailability in neutral or acid soils. In all the studied soils the estimationof trace element bioavailability showed similar results using soil extrac-tion with a neutral salt (CaCl2) or determining their concentration insoil water pore.
The results indicated that after a first adaptation period P. alba treeswere able to survive in acid contaminated and after three years thesetrees reached biomass production similar to or even higher than thatobtained in neutral soils that were contaminated or not. Therefore, theuse of this plant species for the recovery of trace-element polluted soilcould provide successful results in long-term application.
Acknowledgments
AGL2008-00985 is a support from the CICYT of the Ministerio deCiencia e Innovación of Spain and the FEDER (EU). L. Ciadamidarothanks CSIC for funding his grant (JAE-PreDoc).
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V.4. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
121
V.4. SOIL CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES UNDER
POPULUS ALBA GROWING: THREE YEARS STUDY IN TRACE
ELEMENT CONTAMINATED SOILS.
RESUMEN
Propiedades químicas y bioquímicas bajo el crecimiento de Populus alba: tres
años de studio en suelos contaminados por elementos traza.
Ciertas especies de plantas tienen la capacidad de crecer en suelos
contaminados por elementos traza sin mostrar síntomas de toxicidad. Estas especies
podrían ser consideradas útiles para las técnicas de fitorecuperación y su presencia
podría influir en la abundancia, actividad y estructura de las comunidades
microbianas del suelo. En este trabajo se investigaron los cambios inducidos por la
raíz de Populus alba en las propiedades químicas (pH, concentraciones solubles de
elementos traza, C orgánico total, C hidrosoluble y concentraciones de nitrógeno) y
bioquímicas (C de la biomasa microbiana, actividad β-glucosidasa y la actividad
proteasa) en dos suelos contaminados (uno con pH neutro (AZ) y otro con pH ácido
(DO)) durante 36 meses. Los resultados se compararon con los obtenidos en un
suelo no contaminado (CO). El experimento se llevó a cabo en contenedores. Al
final del experimento, también se estudió el suelo adherido directamente a la raíz y
el suelo situado a más de 5 cm de la raíz. Los resultados mostraron que en los suelos
neutros, la planta no influyó en el pH del suelo y el mayor efecto sobre este
parámetro se observó en el suelo ácido. La presencia de la planta aumentó el
contenido de C, a través de exudados radicales en todos los suelos. En el suelo AZ,
la presencia de Populus alba mantuvo las propiedades químicas y bioquímicas,
mientras que se observó una disminución importante de la calidad en del mismo en
el suelo sin plantas. El efecto del desarrollo de Populus alba en la calidad del suelo
fue aún más apreciable en el suelo contaminado ácido (DO), en el que el árbol
produjo también un fuerte incremento del pH del suelo, disminución en las
concentraciones de elementos traza y una mejora de las propiedades químicas y
bioquímicas. El Populus alba es una planta adecuada para la fitorecuperación de
suelos contaminados por elementos traza. Además los exudados de las raíces de esta
especie pueden ser responsables de la mejora de la calidad del suelo en estos suelos
contaminados.
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Applied Soil Ecology 73 (2014) 26– 33
Contents lists available at ScienceDirect
Applied Soil Ecology
journa l h om epa ge: www.elsev ier .com/ locate /apsoi l
oil chemical and biochemical properties under Populus alba growing:hree years study in trace element contaminated soils
. Ciadamidaro ∗, P. Madejón, E. Madejónnstituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS), CSIC, Avenida Reina Mercedes, 10, P.O. Box 1052, 41080 Sevilla, Spain
r t i c l e i n f o
rticle history:eceived 27 February 2013eceived in revised form 1 August 2013ccepted 6 August 2013
eywords:alicaceashizosphereicrobial biomass carbon
nzymatic activitiesoil quality
a b s t r a c t
Certain plant species have the ability to grow in trace element-polluted soils without showing anynegative symptoms. These species could be considered for phytoremediation techniques and their pres-ence might influence the abundance, activity and composition of soil microbial communities. In thiswork we investigated the root-induced changes in chemical (pH, soluble trace element concentrations,total organic C, water-soluble C, and nitrogen concentrations) and biochemical (microbial biomass C, �-glucosidase activity and protease activity) properties caused by Populus alba on two contaminated soils(one with neutral pH (AZ) and other with acid pH (DO)) for a period of over 36 months. The results werecompared to those obtained with a non-contaminated soil. The experiment was carried out in containers.At the end of the experiment, samples of the soil directly adhered to the root and that located more than5 cm from the root were also studied. The results showed that, in neutral soils, poplar did not influencesoil pH; the greatest effect on pH due to plant growth was found in acid soil. Poplar presence increased Csources, through root exudates, in all soils. In AZ soil, poplar maintained chemical and biochemical prop-
erties, whereas an important decrease in soil quality was observed in the same bare soils. The effect ofpoplar development on soil quality was even more appreciable in acid contaminated soil (DO), in whichthe tree also produced a strong increment of soil pH, a decrease in trace element concentrations and animprovement of chemical and biochemical properties. We concluded that P. alba is a suitable plant forthe phytoremediation of trace element contaminated soils. Moreover, root exudates of this species maybe responsible for the improvement of soil quality in trace element contaminated soils.. Introduction
Trace elements can to be toxic to living organisms when presentt excessive concentrations (Baath, 1989). Trace elements affect therowth, morphology and metabolism of microorganisms in soils,s well as protein denaturation or the destruction of the integrityf cell membranes (Leita et al., 1995). In case of plants, the gen-ral symptoms of trace element toxicity at the whole plant levelre stunted growth, root growth inhibition, chlorosis, burning andecrosis, which are caused by the inhibition of cell division and celllongation, reduced photosynthesis rates and water stress (Verkleijt al., 2009). However, metal tolerant plants can grow in trace ele-ent contaminated soils without any major adverse symptoms,
nd such plants can be used for soil phytoremediation (McGrath,998).
Plants influence the biomass, activity and composition of theoil microbial communities through their rhizodepositions con-aining a large variety of labile C compounds (Farrar et al., 2003),
∗ Corresponding author. Tel.: +34 95 462 4711.E-mail addresses: [email protected], [email protected] (L. Ciadamidaro).
929-1393/$ – see front matter © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.ttp://dx.doi.org/10.1016/j.apsoil.2013.08.003
© 2013 Elsevier B.V. All rights reserved.
which are rapidly utilized by rhizosphere microorganisms (Renellaet al., 2007). It has been reported that microbial utilization of rootexudates by rhizosphere microorganisms may be reduced in traceelement contaminated soils (Renella et al., 2006). However, plantroots may also change some major soil chemical properties in therhizosphere (e.g., pH, nutrient availability, heavy metal complexa-tion) (Neumann and Römheld, 1999; Wenzel, 2009), thus leadingto a general amelioration, allowing microorganisms to increase thelevels of their biochemical activity. It is well known that plantpresence promotes soil development and nutrient cycling. Thesechemical, biological and physical improvements accelerate thedevelopment of a viable nutrient cycle and self-sustaining veg-etative cover and restore the affected area to some acceptablesteady-state condition for secondary land use (Norland and Veith,1995).
For the restoration of heavy metal contaminated soils, differentstrategies can be adopted. Green plants have been employed inrecent years as a means of stabilizing and/or removing metals from
contaminated soils. The re-vegetation activity aims to stabilizethe site, to establish a cover crop that will prevent the dispersalof metal-contaminated particles by water or wind erosion andto reduce metal mobility by rhizosphere-induced adsorption
L. Ciadamidaro et al. / Applied Soil Ecology 73 (2014) 26– 33 27
Table 1Some characteristics of the studied soils. Mean values ± standard errors (n = 3).
Soil pH As Cd Cu Pb Zn
Pseudototal content (mg kg−1)CO 7.74 ± 0.059 8.40 ± 1.07 0.59 ± 0.03 19.4 ± 1.17 15.7 ± 0.24 52.0 ± 1.92AZ 7.41 ± 0.050 112 ± 3.05 3.82 ± 0.09 166 ± 3.61 236 ± 7.80 506 ± 8.84DO 3.00 ± 0.244 290 ± 8.54 3.53 ± 0.05 193 ± 6.03 391 ± 14.8 227 ± 5.36Background rangea 0.1–40 0.01–2 2–250 2–30 1–900
0.01 M CaCl2-extractable contents (mg kg−1)CO 0.01 ± 0.000 0.03 ± 0.002 0.12 ± 0.04 0.04 ± 0.01AZ 0.01 ± 0.000 0.08 ± 0.015 0.17 ± 0.04 0.04 ± 0.01
0.33 ±
aVcmb
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sia(nbCtr
2
2
ttCsC
t1Nlh(mrpaal(
satr
DO
a According to Bowen (1979).
nd precipitation processes (Vangronsveld et al., 1991, 1993).egetative stabilization also improves the chemical and biologicalharacteristics of the contaminated soil by increasing the organicatter content, nutrient levels, cation exchange capacity and
iological activity.Fast growing trees with high transpiration rates, such as poplar,
ave been of particular interest for phytoremediation of tracelement-polluted soils (Laureysens et al., 2005; Sebastiani et al.,004). The long-term goal of this technique is the creation of aelf-sustaining ecosystem that can support productive land usectivities and is esthetically pleasing.
We hypothesized that Populus alba growth under contaminatedoils could induce positive changes on the chemical and biochem-cal properties of contaminated soil. Therefore, we carried outn experiment in semi-field conditions, and measured chemicalpH, soluble trace element, total organic C, water-soluble C anditrogen concentrations) and biochemical parameters (microbialiomass C, �-glucosidase activity, protease activity) related to the
and N cycle during 36 months of poplar growth. At the end ofhe experiment, we also analyzed rhizosphere and bulk soil sepa-ately.
. Material and methods
.1. Experimental design
The experiment was carried out in semi field conditions usinghree different soils: a non-polluted soils, (CO pH 7.5), and tworace-element contaminated soils, (AZ pH 7.4 and DO pH 3.0). SoilO was collected in an experimental farm of the Instituto de Recur-os Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS-CSIC) located inoria del Rio, Seville (37◦17′08′′ N, 6◦04′1.5′′ W).
The trace-element polluted soils, AZ and DO, were collected inhe area affected by a mine spill (South West of Spain, Grimalt et al.,999) in special spots where P. alba trees were growing (37◦18′4.7′′
, 6◦15′39.1′′ W, AZ and 37◦23′42.5′′ N, 6◦13′36.4′′ W, DO). Col-ected soils (January 2009) were affected by a mine spill containingigh levels of As, Cd, Cu, Pb and Zn from a pyrite mine in 1998Cabrera et al., 1999). The toxic sludge covering the ground and a
ajor portion of the contaminated soil surface were mechanicallyemoved. In the more accessible areas (e.g., former croplands), aartial soil restoration was carried out by adding organic matternd calcium-rich amendments. However, despite these clean-upsnd partial restoration of the soils, the affected zone was still pol-uted consistently by trace metals with a fairly irregular distributionCabrera et al., 2008).
Containers filled with these soils were planted with white poplar
aplings (6 months old) in February 2009, treatments AZ-P, DO-Pnd CO-P. Containers without plants were also established as con-rol (AZ, DO and CO). The 18 containers were distributed in a fullyandomized scheme.0.004 15.2 ± 6.16 0.47 ± 0.33 69.5 ± 2.18
The main characteristics of the soils are shown in Table 1. Twoof the studied soils presented sandy-loam texture (CO and DO)whereas AZ soil showed a loam texture.
Containers were irrigated daily during the growth phase (Aprilto November), though a drip irrigation hose with two emitter of4 L/h per container. The mean water doses during this time were4 mm irrigation per container and day, sufficient to meet the plantdemand due to evapotranspiration, and to keep the soil moistureat the water holding capacity.
Soil samples were taken with an auger at 0–20 cm depth inspring and autumn of each year from April 2009 until October2011 (6 samplings in total). In each sampling, three soil cores (2 cmdiameter, 20 cm depth) regularly distributed were taken from eachcontainer to make a composite sample. Soils from the containerswith plants were collected around the tree trying to collect the soilclose to the root.
At the end of the experiment after the removal of the tree fromthe container the soil adhered to the root (RS) and soil located atmore than 5 cm of the root (bulk soil) were collected and analyzed.
2.2. Soil chemical properties determination
Soil pH was measured in a 1/2.5 sample/1 M KCl extract aftershaking for one hour (Hesse, 1971) using a pH meter (CRISON micropH 2002). The 0.01 M CaCl2-extractable trace element concentra-tions in soils were determined using a 1:10 w:v ratio, after shakingfor three h (Houba et al., 2000). Pseudo-total trace element concen-trations were determined by microwave (Microwave LaboratoryStation Mileston ETHOS 900, Milestone s.r.l., Sorisole, Italy) assistedaqua regia digestion on the fraction <60 �m fraction. Quantifica-tion of elements in the extracts was achieved using a Varian ICP720-ES (simultaneous ICP-OES with axially viewed plasma). Totalorganic carbon (TOC) in soil was analyzed by dichromate oxida-tion and titration with ferrous ammonium sulphate (Walkley andBlack, 1934). Water-soluble carbon (WSC) content was determinedon using a TOC-VE Shimadzu analyzer after extraction with waterusing a sample-to-extractant ratio of 1:10.
Kjeldahl N (N-Kjel) of soil was determined after digesting thesoil samples by the method described by Hesse (1971). ExtractableNH4-N+ in soil was determined by shaking a fresh sub-sample (2.5 gon an oven-dry basis) in 25 mL of 1 M KCl for 1 h. Extractable NO3-N− in soil was determined by shaking a fresh sub-sample (5 g on anoven-dry basis) in 25 mL of distilled water for 1 h. Determination ofNH4-N+ and NO3-N− in extracts was carried out in a Bran + LuebbeGmbH AA3 dual-channel, continuous-flow auto-analyzer (Norder-stedt, Germany).
2.3. Soil microbiological properties determination
Microbial biomass carbon (MBC) content was determined by thechloroform fumigation–extraction method modified by Gregorichet al. (1990). Concentration of C in the extract was measured by a
28 L. Ciadamidaro et al. / Applied Soil Ecology 73 (2014) 26– 33
Table 2Values of 0.01 M CaCl2-extractable trace element concentrations (mg kg−1) in root soil (RS) and bulk soil in October 2011. Mean values ± standard errors (n = 3).
Soil pH Cd Cu Pb Zn
CO-bulk soil 7.73 ± 0.18 0.002 ± 0.001 0.12 ± 0.050 <0.02 0.17 ± 0.03CO-RS 7.81 ± 0.64 0.001 ± 0.001 0.08 ± 0.009 <0.02 0.09 ± 0.02AZ-bulk soil 7.15 ± 0.15 0.004 ± 0.003 0.15 ± 0.005 <0.02 0.12 ± 0.03
T0fd0C
b�pt
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3
3
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TVv
AZ-RS 7.87 ± 0.26 0.004 ± 0.001
DO-bulk soil 6.79 ± 0.53 0.005 ± 0.001
DO-RS 7.57 ± 0.12 0.003 ± 0.001
OC-VE Shimadzu analyzer. An extraction efficiency coefficient of.38 was used to convert the difference in soluble C between theumigated and the unfumigated soil to MBC (Vance et al., 1987). Theetection limits for the TOC-VE Shimadzu analyzer were as follows:.5 mg kg−1 for TC (Total Carbon) and 0.04 mg kg−1 IC (Inorganicarbon) contents.
The soil �-glucosidase activity was measured as reportedy Tabatabai (1982) after soil incubation using p-nitrophenyl--d-glucopyranoside as substrate and by quantification of the-nitrophenol (PNP) as enzymatic reaction product by UV/vis spec-rometry absorbance at 400 nm wavelength.
Protease activity was measured using casein as substrate andolorimetric determination of the released tyrosine, according toadd and Butler (1972).
.4. Statistical analysis
All statistical analyses were carried out with the program SPSS5.0 for Windows. A Student’s t-test (p ≤ 0.05) was used to assessifferences between the same soil with and without plant. A cor-elation matrix between all chemical and biochemical parametersas calculated. The significance levels reported (**p < 0.01 and
p < 0.05) are based on Spearman coefficients, because the variablesequired non-parametric analyses.
Sun ray plots were constructed to compare graphically the meanalues of different studied parameters in each soil and treatment.he star shape and integrated area for each treatment allow a com-arison of visual and statistical presentations of multivariate data.oil chemical and biochemical properties for the three soils and soilontamination in the case of DO soil, were designed; the integratedrea of the plot for each treatment was measured using the mea-uring tools of Adobe Acrobat 9® (Adobe Systems Incorporated, CA,SA).
. Results
.1. Soil characteristics
The pH values of CO and AZ soils were close to neutral or slightly
lkaline, whereas DO soil presented an acid pH (Table 2). Controloil (CO) presented trace element concentrations in the same orderf magnitude of the background concentrations of the soils of therea, whereas the total concentrations of contaminated soils withable 3alues of total organic carbon content (TOC) and Kjeldahl nitrogen (N-Kjel) in soils at dalues ± standard errors (n = 3).
Sample Month = 0 Month = 18
TOC (g kg−1) N-Kjel (g kg−1) TOC (g kg−1)
CO 5.92 ± 0.13 0.53 ± 0.02 4.85 ± 0.41
CO-P 5.92 ± 0.13 0.53 ± 0.02 8.40 ± 0.86
AZ 10.2 ± 0.83 1.02 ± 0.17 11.9 ± 0.99
AZ-P 10.2 ± 0.83 1.02 ± 0.17 16.1 ± 0.62
DO 10.0 ± 0.50 0.81 ± 0.01 11.1 ± 0.66
DO-P 10.0 ± 0.50 0.81 ± 0.01 12.7 ± 0.72
0.16 ± 0.015 0.025 ± 0.005 0.17 ± 0.050.239 ± 0.027 <0.02 0.17 ± 0.04
0.22 ± 0.013 0.031 ± 0.004 0.10 ± 0.01
regard to the trace element contents were 5-fold higher for someelements (Table 1), and exceeded the current legislation limits foragricultural soils (Bowen, 1979). Values are higher than the back-ground values of the area before the accident (Cabrera et al., 1999).
Trace element concentrations extracted with 0.01 M CaCl2 werelower in neutral soils (CO and AZ) than in the acidic soil (DO)(Table 1), and significant negative correlations were found betweenpH and all of the measured trace elements, except for Pb.
Values of pH in root soil (RS) and bulk soils in the last sampling(October 2011) are shown in Table 2. Generally, the pH in RS hasalways been higher than that obtained in bulk soil, close to oneunit for AZ and DO (Table 2). The pH values in all RS samples wereslightly alkaline.
In this last sampling, available trace element concentrationsextracted with 0.01 M CaCl2 for RS were similar to the correspond-ing bulk soil (Table 2). Arsenic concentrations were below thedetection limit (As 0.1 mg kg−1).
3.2. Total soil carbon and nitrogen and biochemical properties
Total organic carbon (TOC) contents at different times of theexperiment (0, 18 and 36 months) are shown in Table 3. The lowestvalues of TOC corresponded to non-contaminated soil. Values ofTOC in soils with plants were higher than those detected in baresoils (month 18 and 36), showing the largest differences at the endof the experimental period.
The presence of P. alba increased water soluble carbon (WSC) inall soils, although significant differences were only found in somesamplings of AZ and DO soils (Fig. 1). The time evolution of the WSCvalues was similar for all soils; constant values until October 2010were followed by an increase in the next sampling (April 2011). Inthe last sampling, values of WSC decreased, especially in AZ soils.In general, the highest WSC values were observed for the AZ-P soil,reaching a maximum in April 2011 (221 mg kg−1), and the low-est in DO soils, with acidic pH values and higher trace elementcontamination occurring in October 2011 (61.8 mg kg−1); however,the lowest values were found for CO-P soil in the last sampling(74.3 mg kg−1).
Microbial biomass carbon (MBC) was positively affected by plant
growth and the highest concentrations were found in soils withpoplars, except in DO soils where this effect was only observedat some sampling times (Fig. 2). In the neutral soils (CO and AZ)higher mean values were presented compared with acid soil (DO).ifferent sampling times (initial, middle, and at the end of the experiment). Means
Month = 36
N-Kjel (g kg−1) TOC (g kg−1) N-Kjel (g kg−1)
0.43 ± 0.16 4.59 ± 0.31 0.46 ± 0.170.56 ± 0.08 8.86 ± 1.25 0.54 ± 0.140.89 ± 0.09 11.8 ± 0.19 0.89 ± 0.120.97 ± 0.07 17.3 ± 1.73 1.15 ± 0.021.00 ± 0.20 10.4 ± 0.17 1.35 ± 0.210.88 ± 0.07 16.5 ± 3.10 0.99 ± 0.14
L. Ciadamidaro et al. / Applied Soil Ecology 73 (2014) 26– 33 29
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Oct 09April 1
0Oct 10
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C k
g-1)
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250 DO DO-P
*
* *
*
**
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Fs
ig. 1. Evolution in time of water soluble carbon (WSC) in the three studied soils wnd time are marked with an asterisk.
he highest values were found for CO-P soil in the second samp-ing (533 mg kg−1) and the lowest for DO soil in October 201139.4 mg kg−1) (Fig. 2). Clear seasonal trends were not identified. Ineneral, WSC was significantly correlated with microbial biomassarbon (MBC) (r = 0.443; p < 0.01).
Values of �-glucosidase activity are shown in Fig. 3. For all cases,oils with poplars reached higher values than soils without plants.n the case of bare soils, a trend toward a decrease in time wasbserved. The highest �-glucosidase values were found in AZ soilnd showed the greatest difference between treatments with andithout poplars in all samplings. Moreover, in AZ-P soil, an increaseas observed during April 2009 when compared with values ofZ soil at the same sampling time (Fig. 3). All of the parameters
nvolved in the C cycle were positively correlated with pH valuesr = 0.232 for WSC; p < 0.05, r = 0.529 for MBC and r = 0.420 for �-lucosidase, respectively; p < 0.01), whereas no correlations wereound with soluble trace elements, except for negative correlationsetween MBC and Cd (r = −0.420; p < 0.01) and between MBC and-glucosidase activity and Zn (r = −0.518 for MBC and r = −0.282 for-glucosidase; p < 0.01).
For each soil, values of WSC and MBC were similar in RS to thoseound in the rest of the soil (bulk soil) (Table 4). In control soilCO), values of �-glucosidase activity were higher in RS than inulk soil, although significant differences were not found. For bothontaminated soils (AZ and DO), similar contents of �-glucosidase
ctivity were obtained in RS and bulk soil (Table 4).Contents of Kjeldahl N in the soils at the beginning of the exper-ment were higher in contaminated soils (AZ and DO) than in
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*
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Sam
ig. 2. Evolution in time of microbial biomass carbon (MBC) in the three studied soils wioil and time are marked with an asterisk.
d without poplar. Significant differences due to presence of plant in the same soil
control soils. These values (with and without poplars) were sim-ilar throughout the studied period and, in general, were slightlylower in bare soils (Table 3). A slight increment was observed foracidic contaminated soil (DO) for both treatments in the last samp-ling (1.35 g kg−1 for DO and 0.99 g kg−1 for DO-P), especially in baresoil.
In neutral soils (CO and AZ), values of NH4-N+ ranged between1.00 mg kg−1 and 8.00 mg kg−1; however, significant differencesbetween the soils with or without poplars were not found (Fig. 4).These values tended to decrease at the end of the study. In DO soils,NH4-N+ concentrations were much higher, especially during thefirst sampling in which values reached a maximum of 14 mg kg−1
and then decreased to 5 mg kg−1 in the following samplings (Fig. 4).Contents of NO3-N− were lower in soils with poplar than those
found in unplanted soils (Fig. 4). Major differences were foundbetween contaminated soils with and without poplar in the samp-ling performed in October 2010 (Fig. 4). However, in soils withpoplars, NO3-N− values were similar to or below 20 mg kg−1,except in DO soil, where values reached up to 60 mg kg−1. For baresoils, higher values were obtained in contaminated soils, up to60 mg kg−1 in AZ and up to 80 mg kg−1 in DO (Fig. 4).
Poplar presence also stimulated the soil protease activity,although differences with unplanted soils were not significant dueto the variability of the data (Fig. 5). The maximum values of thisactivity were found at the end of the experiment in contaminated
soils with poplar (AZ-P and DO-P) reaching values of 120 mg kg−1and 100 mg kg−1 respectively (Fig. 5). Higher protease activity wasdetected in soils planted with poplar than in bare soils. Positive
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th and without poplar. Significant differences due to presence of plant in the same
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Fig. 3. Evolution in time of �-glucosidase activity in the three studied soils with and without poplar. Significant differences due to presence of plant in the same soil andtime are marked with an asterisk.
Table 4Values of water soluble carbon (WSC), microbial biomass carbon (MBC) and �-glucosidase and protease activities in soils adhered to the root (RS) and bulk soil in October2011. Mean values ± standard errors (n = 3).
Sample WSC (mg kg−1) MBC (mg kg−1) �-Glucosidase (mg PNF kg−1 h−1) Protease (mg Tyr kg−1)
CO-bulk soil 74.3 ± 7.45 318 ± 46.0 83.2 ± 18.4 28.8 ± 5.18CO-RS 72.7 ± 11.2 310 ± 52.4 138 ± 41.5 54.7 ± 9.72
AZ-bulk soil 125 ± 13.4 329 ± 25.4 213 ± 15.6 117 ± 3.48AZ-RS 121 ± 24.4 313 ± 21.6 243 ± 45.5 109 ± 11.2
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3p
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DO-bulk soil 124 ± 16.7 366 ± 31.4
DO-RS 120 ± 12.5 371 ± 33.5
orrelations between this activity and some of the parameterselated with the C cycle were found (r = 0.292 for �-gluc, r = 0.327or MBC and r = 0.355 for TOC; p < 0.01), whereas significant nega-ive correlations with Cd and Zn were observed (r = −0.229 for Cdnd r = −0.284 for Zn; p < 0.01).
Protease values in the rhizosphere soils are shown in Table 4. Inhe non-contaminated soil, this activity was higher in RS comparedo bulk soil, although the difference was not significant. However,n contaminated soils, similar values were found in RS and bulkoils (Table 4).
.3. Evaluation of soil quality based on chemical and biochemical
ropertiesFor a general interpretation of all studied parameters referredn our samples, the data were represented in sunray plots and
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10Oct 10
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NO
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6
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10CO NH4-N CO-P NH4-N
ig. 4. Evolution in time of NO3-N and NH4-N in the three studied soils with and withou/�. Significant differences due to presence of plant in the same soil and time are marked
117 ± 37.5 93.0 ± 21.6110 ± 28.2 99.8 ± 10.9
the values of each parameter were transformed to their corre-sponding standard scores in order to fit them into the graphs(Figs. 6 and 7).
In general, in non-contaminated soil (CO) (Fig. 6a), poplarpresence did not produce any significant change in chemi-cal and biochemical properties during the experiment. Thiswas also proven by the calculation of the integrated area (IA)values of Fig. 6a, which are reported in Table 5. Values ofIA for CO without poplar soil were very similar during theexperiment (around 600 mm2) whereas a strong reduction wasobserved for the same soil with poplar (CO-P), from 1030 mm2
to 463 mm2. In neutral contaminated soils (AZ), poplar pres-
ence maintained chemical and biochemical properties, whereasan important decrease (a reduction of the IA value from 826 to289 mm2) in soil quality was observed in bare soils (Fig. 6b andTable 5).0April1
1Oct 11
ing
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t poplar. NO3-N concentration is represented by �/© and NH4-N is represented by with an asterisk.
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**
Fig. 5. Evolution in time of protease activity in the three studied soils with and without poplar. Significant differences due to presence of plant in the same soil and time aremarked with an asterisk.
Fig. 6. Sun ray plots of soil quality for different soils and treatments in the first (April2009) and in the last (October 2009) sampling. According to the clockwise, startingat the 12 o’clock, the parameters are pH, �-glucosidase activity (�-glucosidase),microbial biomass carbon (MBC), water soluble carbon (WSC), total organic carbon(TOC), Kjeldahl Nitrogen (N Kjel) and Protease activity (Protease).
Fig. 7. Sun ray plots of soil contamination for the two different treatments of DOsoil at different sampling times (at the begging and at the end of the experiment).According to the clockwise, starting at the 12 o’clock, the parameters are CaCl2-Cd(Cd), CaCl2-Cu (Cu), CaCl2-Pb (Pb), CaCl2-Zn (Zn).
The effect of poplar development on the improvement of param-eters related to soil quality was even larger in acid contaminatedsoil (DO), in which the tree also produced a strong increment of pH
values (Fig. 6c) and a decrease in trace element availability (Fig. 7;Table 6). The increase in chemical and biochemical properties wasalso proven by their IA values (Table 5); poplars were capable ofTable 5Index of the integrated area (IA, mm2) of sun-ray diagrams plotting the differentchemical (pH, water soluble carbon, total organic carbon, Kjeldahl nitrogen) andbiochemical (�-glucosidase activity, microbial biomass carbon and protease activ-ity) properties in each soil and treatment in the first (April 2009) and in the last(October 2009) sampling.
Soil Soil qualityIA (mm2)
CO (April-09) 633CO-P (April-09) 1030CO (Oct-11) 656CO-P (Oct-11) 463
AZ (April-09) 826AZ-P (April-09) 1466AZ (Oct-09) 289AZ-P (Oct-09) 1275
DO (April-09) 731DO-P (April-09) 1052DO (Oct-11) 1053DO-P (Oct-11) 1812
32 L. Ciadamidaro et al. / Applied So
Table 6Index of the integrated area (IA, mm2) of sun-ray diagrams plotting the 0.01 M CaCl2-extractable trace element concentrations in DO soil in the first (April 2009) and in thelast (October 2009) sampling. According to the clockwise, starting at the 12 o’clock,the parameters are Cd, Cu, Pb and Zn.
Soil Trace element contaminationIA (mm2)
DO (April-09) 1656DO-P (April-09) 879DO (Oct-11) 57.7
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4
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DO-P (Oct-11) 56.8
uplicating this value, passing from an initial area of 1051 mm2 to final area of 1812 mm2.
. Discussion
In our study, at the end of the experiment, TOC increased inoils planted with poplar compared to bare soil (Table 4), likelyue to the input of plant litter and root exudates; this exerted
positive influence on the measured soil biochemical proper-ies.
Water soluble C originates mainly from release of organic sub-tances from fresh material during decomposition and significantlyontributes to soil nutrient cycling (Qualls et al., 1991). Our resultsFig. 1) confirm the previous finding that WSC is significantly highern vegetated than in bare soils (Zhang et al., 2011). The root systemnd litter presence might be important for readily soluble C sources.n addition, pH values and soil and trace element availability seemo influence the WSC behavior, as was observed in DO soils. Otheruthors have also reported the negative effect of both pH soil andrace element concentrations on WSC content.
Microbial biomass plays a crucial role in nutrient cyclingNannipieri et al., 2002), and the measurement of MBC can be useds a parameter to assess the biotic impact of soil trace elementontamination (Zhang et al., 2008). The lowest values of MBC wereound in the DO soil, with the highest trace element concentra-ion and more acidic pH values. Poplar growth sustained a higher
icrobial biomass (Fig. 2), likely through the rhizodepositions, andtilization of readily mineralizable low molecular weight organicompounds by rhizosphere microorganisms has been reportedRenella et al., 2007). It is also known that root exudates haven impact on trace element availability, either directly or indi-ectly through the stimulation of microbial activity (Puschenreitert al., 2003). Indeed, several studies (Badalucco and Kuikman, 2001;alchini et al., 2003) have confirmed that root exudation is theain factor controlling microbial activity and community struc-
ure in the rhizosphere. This is reflected in a raise in MBC valuesn soils with poplar, especially in contaminated soils (AZ-P andO-P).
Values of �-glucosidase activity in soils with poplar were sig-ificantly higher than in bare soils, and the stimulation of variousnzyme activities during the mineralization of root exudates haseen reported (Renella et al., 2007). In our study, the increase of �-lucosidase activity in trace element contaminated soils with plantsight be related either to enzyme release by the plant roots and
o the enhanced microbial enzyme synthesis in the rhizosphereGeorge et al., 2005). An increase of �-glucosidase activity in re-egetated trace element contaminated soils has been also reportedy Pérez-de-Mora et al. (2006). In contrast, no correlations betweenrace element availability and �-glucosidase activity were found,
hus confirming the results obtained by Renella et al. (2006).Poplar growth also influenced the measured parameters relatedo N turnover in soil, thus confirming that N turnover is faster inlanted than in bare soils (Clarholm, 1985), and the lower values
il Ecology 73 (2014) 26– 33
of mineral N in planted than in bare soils were likely due to theN uptake by plants. Poplar rhizodeposition stimulated the N min-eralization processes, and led to N depletion in the rhizospheremainly by NO3-N− uptake. Cloutier-Hurteau et al. (2011) reportedhigher NH4-N+ and lower NO3-N− in soils planted with P. tremu-loides than in bare soils. In general, values of NO3-N− tended tobe lower in spring samplings (April) in soils with plants becauseof the high demand for nutrients in this season, when maximumplant growth is registered. Moreover, in DO soils, higher amountsof ammonia and lower amounts of nitrate were observed comparedto other soils, revealing a blockage in the nitrification reaction. SoilpH clearly affected the nitrification process in DO soil (Ste-Marieand Paré, 1999).
Protease activity is involved in N turnover in soil through thehydrolysis of proteins and peptides (Tate, 2002). In our study, pro-tease activity was stimulated by the release of poplar root exudates(Fig. 5). The stimulation of protease activity during decompositionof plant litter and root exudates has been previously reported (Plazaet al., 2004), even in trace element contaminated soils (Renella et al.,2006). Moreover, the increase of protease activity over time for DO-P soils might be related to the decrease in trace element availability.Other studies demonstrated that the reduction of exchangeableforms of several trace elements could have reduced the possibleaddictive or synergistic effects of different trace elements on soilmicroflora (Renella et al., 2003).
The general presentation of the data in the sun-ray plots (Fig. 6a)confirmed the low fertility of control soil; although it was notcontaminated with trace elements, soil chemical and biochem-ical properties decreased over time. Poplar presence seems toimprove chemical and biochemical fertility of only contaminatedsoils (Fig. 6b and c), with the greatest effects seen for the acidiccontaminated soils (DO). These results supported the hypothesisthat soil microbial activity responds to a decrease of trace elementavailability and to soil pH neutralization and an increase of WSC inre-vegetated trace element contaminated soils (Mench et al., 2006;Pérez-de-Mora et al., 2006).
The fact that there were no relevant differences between thesoil directly adhered to the roots and that located close to theroots could be due to the semi-field conditions of the experiment.Although several authors using Populus sp. under field conditions(Cloutier-Hurteau et al., 2011; Gamalero et al., 2012) have founddifferences between the soil directly adhered to the root and therest of the soil surrounding the tree, under container conditions,the development of the root system encompassed the entire soilcontainer by the end of the experiment. Therefore, the root systemof the P. alba influenced all of the soil in the container.
Poplar plantation increased MBC, �-glucosidase and proteaseactivities of trace element contaminated soils likely throughrhizodeposition, and aided in improving the quality of the contam-inated soils. The presence of a root system might prove importantfor readily soluble C and N sources that influence the biochemicalproperties related to C and N cycles. Indeed, the fresh input of nutri-ents, by litter decomposition and root exudation, should stimulatemicrobial activity and accelerate the recovery process. Moreover,biochemical properties seemed to be the appropriate indicators ofthe available heavy metal fraction after in situ stabilization of thesemetals with poplars.
Considering the complex role of the rhizosphere no relevant dif-ferences were observed between the soils directly adhered to theroots and bulk soil.
Our results suggest that P. alba is a suitable plant for the reme-diation of trace element contaminated soils and that root exudates
of this species may be responsible for the improvement in somechemical and biochemical properties of the soil. At the same time,these trees could produce an important biomass for energy pur-poses.
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L. Ciadamidaro et al. / App
cknowledgements
AGL2008-00985 supported by the CICYT of the Ministerio deiencia e Innovación of Spain and FEDER (EU). L. Ciadamidarohanks to CSIC for funding her grant (JAE-PreDoc).
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V.5. PUBLICACIONES CIENTÍFICAS
131
V.5. SOIL PLANT INTERACTIONS OF POPULUS ALBA IN
CONTRASTING ENVIRONMENTS.
RESUMEN
Interacciones suelo-planta de Populus alba en distintos suelos.
Este estudio se centró en el seguimiento en condiciones de campo de los
efectos del Populus alba (álamo blanco) sobre diferentes propiedades bioquímicas
de suelos contaminados con elementos traza durante dos años. Se estudiaron dos
tipos de suelos contaminados por elementos traza: un suelo neutro contaminado (NC
/ AZ en la memoria) y uno ácido contaminado (AC / DO en la memoria) además de
un suelo neutro no contaminado como control (RHU en la memoria). Las muestras
de suelo se muestrearon a dos profundidades (0-20 cm y 20-40 cm) para su análisis.
Se analizaron también muestras de hojas y de hojarasca en estas zonas. La adición
de materia orgánica, a través de los exudados de las raíces y de la hojarasca,
contribuyó al incremento del pH del suelo, especialmente en el suelo ácido. El
carbono de la biomasa microbiana (CBM) estuvo positivamente influenciado por la
presencia de la planta en todas las zonas de estudio, especialmente en la capa
superior del suelo. Resultados similares se observaron para la actividad proteasa.
Tanto el CBM como la actividad proteasa fueron más sensibles a la contaminación
que la actividad β-glucosidasa. La evolución en el tiempo dio lugar a una
disminución de las concentraciones de elementos traza disponibles en el suelo y a
una mejora de la calidad del suelo después de 2 años de estudio. El contenido total
de Cd y Zn en el suelo debido a la deposición de hojarasca no aumentó en el tiempo.
Los análisis de hojas de álamo revelaron cierto desequilibrio en la concentraciones
de nutrientes. Las concentraciones de elementos traza a excepción de Cd y Zn
presentaron valores normales para las plantas. Estos resultados llevan a pensar que el
Populus alba es adecuado para mejorar de la calidad del suelo en las zonas
contaminadas. Sin embargo, debido a la alta concentración de Cd y Zn en las hojas,
se requiere una continua monitorización de las zonas contaminadas.
lable at ScienceDirect
Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337
Contents lists avai
Journal of Environmental Management
journal homepage: www.elsevier .com/locate/ jenvman
Soil plant interactions of Populus alba in contrasting environments
Lisa Ciadamidaro a,*, Engracia Madejón a, Brett Robinson b, Paula Madejón a
a Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS), CSIC, Protection of the Soil-Water-Plant System, Av. Reina Mercedes, 10, 41012 Seville,SpainbDepartment of Soil and Physical Sciences, PO Box 84, Lincoln University, Lincoln 7647, Canterbury, New Zealand
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 25 June 2013Received in revised form24 October 2013Accepted 4 November 2013Available online
Keywords:PhytomanagementCadmiumZincPoplarsEnzymatic activities
* Corresponding author. Tel.: þ34 95 462 4711.E-mail addresses: [email protected], lisa.ciad@gm
0301-4797/$ e see front matter � 2013 Elsevier Ltd.http://dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2013.11.010
a b s t r a c t
The effects of the Populus alba tree on different biochemical soil properties, growing in a contaminatedarea, were studied for two years under field conditions. Two types of trace element contaminated soilswere studied: a neutral contaminated soil (NC) and an acid contaminated soil (AC). One neutral non-contaminated area was studied as control. Soil samples were collected at depths of 0e20 cm and 20e40 cm. Leaves and litter samples were analysed. The addition of organic matter, through root exudatesand litter, contributed to an increase in soil pH, especially in acid soil. Microbial Biomass Carbon (MBC)was significantly increased by the presence of the trees in all studied areas, especially in the upper soillayer. Similar results were also observed for protease activity. Both MBC and Protease activity were moresensitive to contamination than b-glucosidase activity. These changes resulted in a decrease of availabletrace element concentrations in soil and in an improvement of soil quality after a 2-year study. The totalconcentration of Cd and Zn in soil did not increase over time due to litter deposition. Analysis of P. albaleaves did not show a significant nutritional imbalance and trace element concentrations were normalfor plants, except for Cd and Zn. These results indicate that P. alba is suitable for the improvement of soilquality in riparian contaminated areas. However, due to the high Cd and Zn concentrations in leaves,further monitoring of this area is required.
� 2013 Elsevier Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Afforesting polluted sites is part of a low-cost, ecologically andsustainable reclamation strategy to gain value from otherwisederelict land (Dickinson, 2000). Planting trees on these sites pro-motes soil development and nutrient cycling. The success of phy-toremediation trials cannot only be evaluated in terms of reductionbioavailable trace elements in soils but also soil biological qualityimprovements that can restore multifuntionality of the soil(Hartley et al., 2011). A successfully phytomanaged area shouldhave limited leaching and limited plant uptake of contaminants.The soil surface must be stabilised so that wind and water erosionareminimised and there is a reduced risk of direct soil consumptionby humans and animals (Robinson et al., 2003).
A large-scale phytomanagement programme was implementedafter a toxic sludge spill in the Guadiamar River Valley (South-western Spain). This programme was one of the largest soil reme-diation operations in Europe. It included the use of soil amend-ments and the revegetation of the affected area (about 55 km2)
ail.com (L. Ciadamidaro).
All rights reserved.
with native woody plants (Domínguez et al., 2008). This vegetationacts as a sink for contaminants by uptake or assimilation, reducingthe amount of available contaminant for transport to groundwater.Poplar occurs in the riparian forest in the area of the phytoma-nagement programme of Guadiamar River Valley. Its response asbiomonitor was analysed in surviving trees shortly after the mine-spill (Madejón et al., 2004). Poplars are deciduous trees that canaccumulate inordinate concentrations of B, Cd and Zn in theirleaves (Lepp and Madejón, 2007; Robinson et al., 2005) with littleor no visual toxicity (Punshon and Dickinson, 1997). Their planta-tion in trace element contaminated areas may cause, after theautumnal fall, the presence of an extensive ‘carpet’ of litter loadedwith heavy metals. Some studies have investigated the possiblelong-term effects on soil quality of establishment of these trees insoils, focussing mostly on changes in soil organic carbon and soilmicrobial colonization and activity (Baum et al., 2009). However,there is little information regarding the influence of this heavymetal-rich litter on the properties of the afforested soils using thesetrees (Scheid et al., 2009), especially the biochemical propertiesinvolved in the dynamics of nutrients and organic matter undersemi-arid conditions.
We aimed to determine whether the elevated concentrations ofmetals in the leaves of deciduous trees used in the Guadiamar
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337330
phytomanagement programme would detrimentally affect soilquality. Specifically, we sought to (1) determine the effects of P. albaon contaminated soil investigating the chemical (pH, TOC, WSC,nutrients, pseudo-total trace elements and CaCl2 extractable traceelements) and biochemical properties (MBC, b-glucosidase andprotease) of the soils; (2) study the nutrients and pseudo-total traceelements in leaves and litter of the studied trees and (3) evaluatethe quality of these soils after 2 years study.
2. Materials and methods
2.1. Sampling sites
Soil and P. alba leaves were collected at two riparian contami-nated areas of the Guadiamar river valley affected by the Aznal-cóllar mine spill. A neutral contaminated area (NC, 37� 180 1200 N, 6�
150 3800 W) and an acid contaminated area (AC, 37� 230 4500 N, 6� 130
3500 W) where P. albawas growing. For comparison, soil and P. albaleaves from a non-contaminated area (Control, 37� 170 0800 N, 6� 040
1.500 W) were also collected. Control and AC soils are sandy loamswhereas NC could be classified as loam. Figure S1 shows the pre-cipitations and temperatures in the areas of study during the twoyears of monitoring.
Soil samples were collected at each sampling site in October2009 (sampling 1), April 2010 (sampling 2), October 2010 (sam-pling 3), April 2011 (sampling 4) and October 2011 (sampling 5).Three soil samples were taken around the six selected trees at twodepths (0e20 cm and 20e40 cm) to make a composite sample pertree. The field-moist soil was passed through a 2 mm sieve, ho-mogenized and then divided in two subsamples: one oven-dried at40 �C, for at least 48 h for various chemical analyses; a secondsubsample was stored at 4 �C in plastic bags for analysis of micro-bial biomass and enzymatic activities. Dry samples were ground to<60 mm for trace element analysis.
At each sampling site, leaves of the six selected trees at about5 m height, from the outer canopy were collected in autumn 2010and 2011, just before abscission. Leaf samples were washed for 15 swith a 0.1 N HCl solution, and finally with distilled water. Next, theywere dried at 70 �C for at least 48 h, and ground using a stainless-steel mill.
In autumn 2010 and 2011, three samples per site of litter werecollected and the amount of litter (kg (dw) m-2) at each site wascalculated by weighing the litter cover in an area of30 cm � 30 cm. Litter was washed for 15 s with a 0.1 N HCl so-lution then for 10 s with distilled water. Washed samples wereoven dried at 70 �C. Dried plant material was ground and passedthrough a 500 mm stainless-steel sieve prior to preparation foranalysis.
2.2. Soil and plant analysis
Soil and litter pH were measured using a pH meter (CRISONmicro pH 2002) in a 1/2.5 sample/1M KCl extract after shaking for1 h. Pseudo-total trace element concentrations in soil (<60 mm)were determined by ICP-OES (Inductively Coupled Plasma OpticalEmission Spectroscopy) following aqua regia digestion in a micro-wave oven (ISO, 1995). Available trace element concentrations fromthe soil were estimated using a 0.01M CaCl2-extraction using asample extraction ratio of 1:10 (Houba et al., 1996). Analysis of traceelements was performed by ICP-OES. Total organic carbon (TOC) insoil was analysed by dichromate oxidation and titration withferrous ammonium sulphate (Walkley and Black, 1934). The water-soluble carbon (WSC) content was determined on using a TOC-VEShimadzu analyser after extraction with water using a sample-to-extractant ratio of 1:10.
Microbial biomass carbon (MBC) content was determined by thechloroform fumigationeextraction method modified by Gregorichet al. (1990). The C concentration in the extract was measured bya TOC-VE Shimadzu analyser. An extraction efficiency coefficient of0.38 was used to convert the difference in soluble C between thefumigated and the unfumigated soil to MBC (Vance et al., 1987).
b-glucosidase activity in soil was measured as described by themethod of Tabatabai (1982) after soil incubation of soil with p-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside and measurement of PNPabsorbance at 400 nm.
Protease activity in soil was measured after incubation of soilwith casein and measurement of the absorbance of the extractedtyrosine at 700 nm (Ladd and Butler, 1972). Protease activity isexpressed as mg of tyrosine kg�1 2 h�1.
Total N in leaves was determined by Kjeldahl digestion (Hesse,1971). Nutrients (Ca, K, Mg, P y S) and trace elements (As, Cd, Cu,Fe, Mn, Pb and Zn) in leaves and litter were determined by wetoxidation with concentrated HNO3 under pressure in a microwavedigester. The analysis of these elements in the extracts was per-formed by ICP-OES. The accuracy of the analytical method wasdetermined using the plant reference materials. The recovery rateswere: Cd 105%, Cu 105%, Pb 82%, Mn 101% and Zn 96% in INCT-TL-1(Tea leaves), and As 103% in NCSDC 73348 (Bush branches andleaves).
2.3. Statistical analysis
Statistical analyses were carried out using SPSS 15.0 for Win-dows and the results are expressed as mean values with standarderrors. The results of nutrients and trace elements in leaves wereanalysed by ANOVA considering the site as the independent vari-able. Significant statistical differences of soil variables betweendepths were established by the Tukey test at p < 0.05.
3. Results
The amount of litter found in the different soils were 0.66 kg(dw) m�2 in Control soil, 1.71 kg (dw) m�2 in the NeutralContaminated soil (NC) and 1.10 kg (dw) m�2 in the AcidContaminated soil (AC). These results show that contamination didnot affect plant growth and, indirectly, plant biomass.
3.1. Changes on pH, TOC and pseudototal trace elements
Fig. 1 shows the change in soil pH during the study. In neutralsoils (Control and NC) pH values decreased in time although inControl soil an increase was recorded in the last sampling (October2011). In the AC, a continuous increase in values of soil pH wasobserved in the superficial layer (0e20 cm).
The TOC contents in all soils were below 2% (Table 1). In the firstsampling, values were higher in neutral (Control and NC) than inacid soil (AC). However, in the final sampling a noticeable decreasein TOC was observed in Control soil whereas in contaminated soils(NC and AC) TOC was maintained or even increased slightly. Thevalues in the superficial layer were higher than those of deepestlayer, presumably due to litter fall. Significant differences in timewere found only for TOC in Control soil at the deepest layer, may bedue to the minor provision of litter for this soil that produced astrong decrease in time for this parameter.
Concentrations of the pseudototal trace elements in NC and ACwere significantly higher than in Control soil (except for Mn)(Table 1). In general, values were lower at depth 20e40 cmcompared to the upper layer. Values in 2011were similar to those of2009, especially for Cd and Zn.
Control
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
pH
v
alu
es
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
0-20 cm
20-40 cm
NC
Sampling
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
AC
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
a) b) c)
*
*
*
*
Fig. 1. Evolution in time of soil pH (graphs a, b and c) at the three studied soils and at two different depths (0e20 cm and 20e40 cm). Mean values � standard error (n ¼ 3).Significant differences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337 331
3.2. Available trace elements in soil
Availability was evaluated for several trace elements (As, Cd, Cu,Mn, Pb and Zn), however in this work only Cd and Zn values arepresented (Fig. 2).
In neutral soils (Control and NC), no significant differences werefound between Control and NC soils of Cd and Zn for both depthsand general lower values of these elements were obtainedcompared to acid soil (AC) (Fig. 2). However, in the AC soil, theconcentration of these two elements decreased over time.Extractable concentrations in the final samplings were just 23.5%for Cd and 17.5% for Zn of the initial concentrations. Moreover,concentrations of Cd and Zn in the deepest layer (20e40 cm) werehigher than in the superficial layer (0e20 cm). This result highlightsthe important role that pH plays in trace element bioavailability.The most significant and negative correlations were found betweenpH and Cd and Zn availability (r ¼ �0.733 for Cd and r ¼ �0.677 forZn at 0e20 cm depth and r¼�0.751 for Cd and r¼�0.696 for Zn at20e40 cm depth; p < 0.01).
For neutral soils (Control and NC), values of As and Pb werebelow the detection limit (As 0.1 mg kg�1 and Pb 0.3 mg kg�1) atboth depths (data no shown). However, values above these limitswere obtained for AC soil in the first samplings (Figure S2). Valuesof Cu (Figure S3) at both depths ranged between 0.01 and0.06 mg kg�1 for Control, between 0.06 and 0.12 mg kg�1 for NC
Table 1Pseudo-total trace elements concentrations (mg kg�1) and total organic carbon (TOC %) atstudied sites at two depths.
Year Site Depth TOC As Ca Cd
2009 Control 0e20 1.5 � 0.3 9.2 � 0.5 27636 � 3498 0.1 � 020e40 0.7 � 0.1a 9 � 0.4 15589 � 2873 0.2 � 0
NC 0e20 1.3 � 0.2 80 � 36 43013 � 57.0 1.6 � 020e40 0.8 � 0.1 42 � 17 37235 � 3836 1.1 � 0
AC 0e20 1.1 � 0.02 165 � 19 6921 � 364 1.2 � 020e40 0.8 � 0.1 118 � 14 6856 � 733 1.2 � 0
2011 Control 0e20 1 � 0.1 8.2 � 0.5 17173 � 3339 0.1 � 020e40 0.5 � 0.1 7.5 � 0.5 8090 � 454 0.02 � 0
NC 0e20 1.5 � 0.1 75 � 4 44041 � 317 1.9 � 020e40 1 � 0.03 60 � 5 38187 � 1551 1.9 � 0
AC 0e20 1.1 � 0.2 157 � 22 6510 � 298 0.9 � 020e40 1 � 0.1 106 � 8 7181 � 313 1.4 � 0
Mean values � standard error (n ¼ 3).a Significant differences (p < 0.05) between the same soil and depth in time.
and between 3.50 and 26.1mg kg�1 for AC. Values of Mn (Figure S3)at both depths ranged between 0.08 and 1.03 mg kg�1 for Control,between 0.08 and 0.72 mg kg�1 for NC and between 0 and90 mg kg�1 for AC. In general, for these elements, available con-centration tended to decrease during the experimental period.
3.3. Water soluble carbon (WSC) and microbial biomass carbon(MBC)
As with the TOC, the concentrations of WSC were higher in theupper than in deeper layer (Fig. 3).
Maximum values were found in Control and NC soils in thesampling of April 2011, especially comparing these values to thoseobtained in the same sampling in the previous year (April 2010). Inthe AC soils, the concentrations of WSC were similar at depth andstable over time. These values were lower than those found inneutral soils (Fig. 3).
A similar increase was observed for MBC values in the threeanalysed soil during the study period, however, values obtained inthe non-contaminated (Control) soil were higher than those foundin contaminated soils (NC and AC) (Fig. 4). The largest increasesoccurred in the Control soil (up to 500 mg kg�1, Fig. 4), while in NCand AC soils values were not above 200 mg kg�1. In all the soilsvalues tended to be higher in the 0e20 cm layer, especially in thecontrol soil. The MBC was significantly and negatively correlated
the beginning (October 2009) and at the end of the study (October 2011) at the three
Cu Fe Mn Pb Zn
.02 26 � 1.6 30032 � 1203 550 � 18a 18 � 0.5 69 � 4
.01a 26 � 2.2 29461 � 1220 532 � 20a 18 � 1.8 63 � 4
.6 132 � 41 31609 � 2136 602 � 20a 167 � 72 476 � 140
.7 112 � 53 29658 � 1870 625 � 40a 108 � 49 327 � 162
.04 246 � 12 44247 � 978 557 � 16 264 � 37 315 � 32
.4 270 � 17 36829 � 1269 640 � 88 135 � 19 326 � 54
.1 67 � 39 26242 � 878 455 � 20 49.2 � 33 136 � 77
.01 21 � 2 25897 � 809 411 � 27 16.7 � 6 52.9 � 3
.1 131 � 4 26930 � 721 454 � 11 149 � 6 501 � 29
.2 152 � 10 27347 � 287 493 � 12 69.5 � 12 483 � 42
.2 226 � 12 40242 � 1937 465 � 106 243 � 35 248 � 10
.5 248 � 31 36071 � 1530 668 � 85 101 � 18 308 � 71
Cd Control
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
mg
kg
-1
0.0005
0.0010
0.0015
0.0020
0.0025
0-20 cm
20-40 cm
Cd NC
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
0.002
0.004
0.006
0.008
0.010
0.012
0.014
0.016
Cd AC
Oct 09
April 1
0
Oct 10
April 1
1
Oct 11
0.2
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Zn Control
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a) c)b)
f)d) e)
*
*
*
Sampling
Fig. 2. Evolution in time of available Cd and Zn extracted with 0.01M CaCl2 (graphs a, b and c) at the three studied soils and at two different depths (0e20 cm and 20e40 cm). Meanvalues � standard error (n ¼ 3). Significant differences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337332
with all available trace elements concentrations in soils, especiallywith Cd and Zn, in the upper layer (r¼�0.519 for Cd and r¼�0.482for Zn; p < 0.01).
3.4. b-glucosidase and protease activities
Values of b-glucosidase activity were higher in the neutral soils(Control and NC) than in acid soil (AC) (Fig. 5). Values observed inNCwere higher than those of Control soils. In each soil, the values ofthis activity were significantly higher in superficial layer than indeeper layers during the whole study period (Fig. 5).
Significant and positive correlations were found between thisactivity at depth 0e20 cm and pH, TOC,WSC andMBC (r¼ 0.612 forpH, r ¼ 0.698 for TOC, r ¼ 0.471 for WSC and r ¼ 0.366 for MBC;
Control
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0-20 cm
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a) b)
*
Fig. 3. Evolution in time of water soluble carbon (WSC) in the three studied soils and at twSignificant differences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
p< 0.01); at depth 20e40 cm only were found correlations with pHand WSC (r ¼ 0.562 for pH and r ¼ 0.235 for WSC; p < 0.01 andp < 0.05, respectively).
Protease activity (Fig. 6) was significantly higher in the super-ficial layer although differences between depths were lowercompared to those observed for b-glucosidase activity. This activitywas clearly higher in Control than in contaminated soils (Fig. 6) andtended to increase in time with maximum values at the last sam-pling. Significant and positive correlations were found betweenprotease activity at depth 0e20 cm and pH and MBC (r ¼ 0.729 forpH and r ¼ 0.628 for MBC; p < 0.01).
Correlations between available trace elements (especially Cd andZn) in soils for both activities were significant and negative(p < 0.01), showing higher values for protease activity (r ¼ �0.367
*
ampling
Oct 10
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c)
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o different depths (0e20 cm and 20e40 cm). Mean values � standard error (n ¼ 3).
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0-20 cm
20-40 cmACNCControl
a) b) c)
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Fig. 4. Evolution in time of Microbial Biomass Carbon (MBC) in the three studied soils and at two different depths (0e20 cm and 20e40 cm). Mean values � standard error (n ¼ 3).Significant differences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337 333
for Cd and r ¼ �0.326 for Zn with b-glucosidase and r ¼ �0.572 forCd and r ¼ �0.527 for Zn with protease, at 0e20 cm depth respec-tively; r ¼ �0.377 for Cd and r ¼ �0.317 for Zn with b-glucosidaseand r ¼ �0.448 for Cd and r ¼ �0.422 for Zn with protease, at 20e40 cm depth respectively; p < 0.01). The sampling season had noinfluence on either b-glucosidase or protease activity.
3.5. Nutrient and trace elements in P. alba leaves
Concentrations of nutrients in leaves are shown in Table 2. Ingeneral, in the trees of the Control soil the concentrations of N, Kand P in leaves were significantly higher than in leaves ofcontaminated soils. Values of these three elements in Controlleaves were slightly lower than the proposed by Reuter andRobinson (1997) for young leaves of P. deltoides (2.2% N, 1.4% Kand 0.3% P) and lower than leaves of contaminated soils used in thisexperiment. In contrast, the concentration of Ca, Mg and S tendedto be significantly higher in contaminated soils compared to Con-trol soils in both years. Djingova et al. (1995) reported concentra-tions of 1.82% of Ca and 0.42% of Mg, similar to our control leaves,and lower than in both contaminated soils (NC and AC).
Control
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a) b)
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Fig. 5. Evolution in time of b-glucosidase activity in the three studied soils and at two differdifferences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
Trace element concentrations in leaves either did not change ordecreased with respect to time, except for Cd and Zn (Table 3). Ingeneral, concentrations of As, Cu, FeMn and Pbwere similar or evengreater in the Control soil than in the NC soil. For all these elements,concentrations were always within the normal range considered inplants (Table 3).
In case of Cd and Zn, concentrations were significantly higher inboth contaminated soils. Concentrations of these elements in theleaves were above normal levels in plants, except for Control soil(Table 3).
4. Discussion
4.1. pH and trace elements in soils
The effect of plants on soil pH depends on the soil and the plantspecies (Pulford and Watson, 2003). Tree species influence soilacidity and exchangeable cations by several mechanisms. There areinterspecific differences in the uptake of exchangeable cations andanions (Alban, 1982), nitrogen fixation and nitrification (VanMiegroet and Cole, 1984), the production of litter high in organic
pling
t 10
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ent depths (0e20 cm and 20e40 cm). Mean values � standard error (n ¼ 3). Significant
Control
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a) b) c)
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Fig. 6. Evolution in time of protease activity in the three studied soils and at two different depths (0e20 cm and 20e40 cm). Mean values � standard error (n ¼ 3). Significantdifferences between depths for each soil and time are marked with an asterisk.
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337334
acid content (Ovington, 1953) and the stimulation of mineralweathering (Tice et al., 1996). Zinke (1962) found significant vari-ation in soil pH around tree bases of Pinus contorta and Crozier andBoerner (1986) demonstrated that stem-flow influenced soil pHand ex-changeable calcium around trees.
In this study, we only found a pH decrease in case of neutralcontaminated soils in the superficial layer (Fig. 1). This result maybe related to the acidification process due to the litter “carpet”witha pH more acid than the soil (Table S1). Moreover, the high con-centrations of Cd and Zn in the litter (Table S1) may retard itsdecompositionwhich could result in a decreased pH (Mertens et al.,2007). In a previous study (Madejón et al., 2012), similar resultswere obtained in a microcosm experiment using the same soils. Inthis case, the moderately acidic nature of the litter minimized thealkalinizing effect in soils.
However, in the acid contaminated soil, values tended to in-crease. The same result was obtained in semi-field experiment byCiadamidaro et al. (2013), inwhich poplar growth increased soil pHvalues of the same acid soil. This may be due to the action of theroot exudates that can form soluble complexes, for e.g. with Al3þ,reducing the acidity of the medium (Shi et al., 2011) or the adjacentrhizosphere soil may become more alkaline (Nye, 1981), mainlybecause of Hþ consumption and/or OH� exudation (Jones et al.,2004; Nye,1981). In this case, the value of the litter was higher thanthat of the soil there may raise soil pH (Table S1).
Despite the presence of this litter rich in trace elements in thecontaminated soils, the pseudototal trace element concentrationsof the soil at depths <40 cm did not increase during the experi-mental period (Table 1). Furthermore, a stabilization or generalreduction of extractable Cd and Zn was observed in contaminatedsoils (Fig. 3). Likewise, a significant decrease occurred in the AC soil,related with the increase on soil pH.
Table 2Nutrients concentrations (g 100 g�1) in leaves at two consecutive years (October 2010e2
Leaves Year N Ca K
Control 2010 2 � 0.1 b 1.7 � 0.3 a 1NC 1.3 � 0.03 a 3.7 � 0.4 b 0.8AC 1.5 � 0.1 a 3.2 � 0.2 b 0.5Control 2011 1.8 � 0.02 a 2 � 0.2 a 0.7NC 1.3 � 0.1 b 2.7 � 0.2 a 0.7AC 1.4 � 0.2 ab 2.7 � 0.2 a 0.6
Mean values � standard error (n ¼ 3). In each column, values with the same letter do n
The concentrations of Cd and Zn in NC soil during the studywere affected by the pH. Although in this soil values of Cd and Zn inthe litter were higher than in Control soil, values of these two el-ements extracted with CaCl2 were not significant higher than thoseobtained in Control soil. Madejón et al. (2012) demonstrated that,although the time-related decomposition of litter could lead to anincrease of trace element bioavailability, after 40 weeks of incu-bation, no increase in trace element concentration with time werefound in any of the contaminated soils. It is well known that anincrease in soil pH reduces metal availability through precipitationreactions and by increasing adsorption by variable charge colloids(Selin and Amacher, 1997).
In general, differences in trace element concentrations betweenthe two depths were not observed; therefore it seems that therewere negligible lixiviation process during the experimentationperiod, except in the last sampling of the AC soil. Here, the values ofthese elements at 20e40 cmwere lower than in previous samplingsbut still significantly higher than at the superficial layer (Fig. 2).Nevertheless, continual monitoring is advisable to ensure that theenrichment of the deepest layer does not pose a risk to ground-water, which is crucial for the sustainability of both natural andagricultural systems in theMediterranean area (Burgos et al., 2013).
4.2. Soil quality
In forest ecosystems, litter fall is the main source of organicmatter and nutrients for the humus layer (Kuzyakov and Domanski,2000). Low decomposition, resulting from acidic conditions,limited supply of essential nutrients and the presence of organic orinorganic pollutants, can lead to an accumulation of organic matterin soil and to immobilization of essential nutrients (Swift et al.,1979).
011) at the three studied sites.
Mg P S
� 0.1 b 0.3 � 0.04 a 0.2 � 0.01 b 0.2 � 0.01 a� 0.1 b 0.5 � 0.1 b 0.2 � 0.03 b 0.3 � 0.02 a� 0.04 a 0.7 � 0.02 c 0.1 � 0.01 a 0.6 � 0.1 b� 0.1 a 0.3 � 0.02 a 0.2 � 0.02 b 0.2 � 0.01 a� 0.1 a 0.4 � 0.02 b 0.2 � 0.01 ab 0.3 � 0.01 a� 0.1 a 0.5 � 0.04 c 0.1 � 0.01 a 0.5 � 0.1 b
ot differ significantly by one way ANOVA (p < 0.05).
Table 3Trace elements concentrations (mg kg�1) in leaves at two consecutive years (October 2010e2011) at the three studied sites.
Leaves Year As Cd Cu Fe Mn Pb Zn
Control 2010 0.7 � 0.1 a 0.2 � 0.02 a 8.3 � 0.3 a 203 � 50 a 48 � 14 a 0.7 � 0.2 a 78.6 � 5 aNC 0.7 � 0.2 a 3.1 � 0.3 b 7.5 � 0.3 a 170 � 25 a 56 � 12 a 0.3 � 0.1 a 283 � 39 aAC 1 � 0.1 a 5.5 � 0.5 c 8.8 � 1.2 a 218 � 15 a 204 � 35 b 1.2 � 0.1 b 860 � 111 bControl 2011 0.3 � 0.04 a 0.5 � 0.2 a 11 � 0.7 b 205 � 14 b 43 � 3 a 0.9 � 0.1 b 97 � 16 aNC 0.1 � 0.03 a 3.7 � 0.6 b 8.4 � 0.5 a 119 � 9 a 48 � 5 a 0.5 � 0.1 a 301 � 48 aAC 0.5 � 0.1 b 3.8 � 0.6 b 9.2 � 0.6 ab 195 � 16 b 138 � 23 b 1.1 � 0.1 b 603 � 106 bNormal 1.0e1.7 0.05e0.2 5e30 2e250 30e300 5e10 27e150
Mean values � standard error (n ¼ 3). Normal values (range) for trace elements in plants, according to Kabata-Pendias and Pendias (1992), and for Fe according to Bowen(1979). In each column, values with the same letter do not differ significantly by one way ANOVA (p < 0.05).
L. Ciadamidaro et al. / Journal of Environmental Management 132 (2014) 329e337 335
In the contaminated soils (NC and AC) the addition of organicmatter through the litter fall resulted in the maintenance or in-crease of organic matter in these soils during the 2 years of thestudy. It is well known that maintenance of OM levels in Mediter-ranean soils is important for adequate water holding capacity.Madejón et al. (2012) obtained similar results in microcosm ex-periments. Several authors (Tyler et al., 1989; Gadd, 1993)demonstrated that organic matter sustains microbial growth andimmobilizes trace elements.
Water-soluble organic carbon (WSC) is the most mobile andreactive soil carbon source which modulates a number of physical,chemical and biological processes (Marschner and Kalbitz, 2003;Halvorson and Gonzalez, 2008). The decrease of WSC in the soilsduring the first year may be due to the consumption of labile C bythe microorganisms and the mineralization process, especially inApril 2010 due to the lixiviation process after an intense period ofprecipitation (Figure S1). The increase in April 2011 could berelated with the lower precipitation occurred in the previousautumnewinter period that probably tended to maintain the WSCcoming from the decomposition of organic matter. Alternatively,the lower WSC content in AC soil might be related to the low pHand with the retard of litter decomposition. Several authors statethat many environmental factors affect WSC in soils, includingecosystem acidification (Shamrikova et al., 2006; Karavanovaet al., 2007), litter quality as influenced by forest composition(Shamrikova et al., 2006; Ohno et al., 2007) and soil temperature(Tao and Lin, 2000).
Microbial biomass is one of the most sensitive indicators of soilchanges (Perucci, 1993). The effect of contamination was moreevident for this parameter than for the others (Fig. 4). The generalincrease in time of this value in all soils may be linked with theorganic matter through the presence of extra C from plant rootexudates and from litter decomposition, especially in the superfi-cial soil layer. The plants may have contributed to the activation ofthe biochemical and microbial functionality of the Control and thepolluted soils (Hernández-Allica et al., 2006).
In a microcosm experiment using the same soils, Madejón et al.(2012) observed that litter addition promoted the growth ofmicroorganism and increased WSC and MBC content in soils.Otherwise, Madejón et al. (2012)demonstrated that WSC and MBCwere affected by soil conditions and positively correlated with soilpH.
b-glucosidase activity was less sensitive to trace elementcontamination (Fig. 5) than MBC. This activity, involved in the Ccycle, is more likely to be influenced by the amount ofWSC and TOCrather than the degree of contamination. This hypothesis is sup-ported by the strong positive correlations between b-glucosidaseactivity and WSC and TOC and by the higher b-glucosidase activityfound in the upper layer soils. This would explain why the NC soilhad a higher b-glucosidase activity compared to the Control. Thebehaviour of b-glucosidase activity is consistent with the resultsobtained byMadejón et al. (2012). In this study, in fact, the nature of
organic input was the major cause of increase of b-glucosidaseactivity lesser affected by soil contamination. This hypothesis doesnot account for AC soil because of its acidity, since soil pH is crucialfor enzymatic survival and functioning (Acosta-Martínez andTabatabai, 2000). In the AC soil, b-glucosidase activity was signifi-cantly lower than in the other soils, demonstrating the effects ofsoil pH on this parameter: there was a significant positive corre-lation between pH and b-glucosidase activity. Furthermore, differ-ences in microbial activity between the two depths may due to thelitter that was in contact with the upper soil layer and the differ-ences in the composition of microbiota.
In general, for all soils and different depths the values of pro-tease increased with time (Fig. 6). This demonstrates the positiveeffect of P. alba on soil quality. The protease activity may be stim-ulated in soil by the plant presence via litter fall and root exudates(Madejón et al., 2009). As with b-glucosidase, trees would be ex-pected to introduce organic C and microorganisms into the soil bylitter, resulting in a large difference in enzymatic activity betweenthe upper and the deepest soil layers. Moreover, the organic matteradded through litter addition increased pH that might be respon-sible for the final increase of protease activity, especially in acidcontaminated soil (AC). The provision of organic matter in form oflitter caused an important increase in MBC and consequently anincrease in this activity. The significant and positive correlationcoefficient between protease activity and MBC supports this hy-pothesis. Likewise, the highest values of protease activity wasfound for uncontaminated soil (Control), proving that soil pH wasnot the only interacting parameter but also trace element con-centrations could influence this enzymatic activity. Therefore, inthis study, protease activity was sensitive to the trace elementtoxicity and high negative correlations with Cd and Zn confirm theadverse effects provoked on this parameter.
4.3. Nutrients and trace elements in P. alba leaves
When plants are used to stabilize contaminants and improvesoil quality, it is important to monitor the nutritional levels in theseplants to determine their health status. The nutrients in leavesaffected by the soil contamination were N, P and K only in 2010,showing lower values than in Control soil. These results indicatethat trace elements interfere with the uptake processes, possiblybecause of the competitive interaction that may be taking place atthe root level (Madejón et al., 2004; Domínguez et al., 2009) or theinterference with the mechanisms of absorption of the essentialnutrients for the plant, altering its nutritional balance (Kabata-Pendias and Pendias, 1992).
In contrast, higher concentrations of Ca, Mg and S in contami-nated soils were found (Table 2). Higher foliar Ca concentrationscould be related to the protective role of this element against traceelements toxicity (Carbonell et al., 1998). The higher Mg concen-trations in AC soils were directly correlated with soil pH. MoreoverS values were also correlated to the higher concentration of this
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nutrient in the contaminated soil, due to the sludge that contami-nated the soils was from the pyrite extraction.
For all the trace elements studied, the concentrations were ator under the normal values established reported for plants,except for Cd and Zn. The highest concentrations of trace ele-ments were found in contaminated soils (NC and AC) comparedto the Control soil, especially for Zn and in the AC trees. Thesedata confirm that soil pH is one of the most important parame-ters explaining nutrient variability in the leaves of trees. Bastaet al. (2005) showed that even small changes in soil pH couldresult in large changes in trace element phytoavailability. Thehighest differences due pH were found in case of Mn and Zn,being both elements known for their highly dependence to pHand to be easily taken up by plants when they occurs in soil(Kabata-Pendias, 2001). Moreover Domínguez et al. (2009)proved with their study that the bioavailability of the cationictrace elements in the Guadiamar area (same study area) is pri-mary determined by soil pH.
The acidity of the AC soil could be attenuated by litter presenceand this factor influenced the bioavailability of trace elements forplant uptake in the last sampling (Table 3). The rhizosphereenriched with biomolecules of plant and microbial origins thatinclude organic acids, sugars, amino acids, proteins, carbohydratesand other substances could also influence trace element availability(Chang et al., 2002).
5. Conclusions
Despite some researches stating that P. alba is not advisable forphytostabilization, due to the accumulation of high concentrationsof Cd and Zn in its leaves that might cause a risk of soil contami-nation because of autumn litter, our study showed that pseudototalconcentrations remained similar over time and the bioavailavilityof Cd and Zn decreased.
The chemical and biochemical properties of soil were notnegatively affected by litter contamination in NC soils and wereimproved in AC soil. Natural processes appear to be enhanced bythe addition of organic matter content coming from the litter thatinfluence soil pH. Soil pH was the most important factor affectingthe soil contamination and quality. All these factors may makewhite poplar suitable in biomonitoring and in maintaining thestability of riparian zones.
The use of P. alba for phytomanagement in the study area mayincrease the risk of Cd and Zn entering the food chain. For thisreason, even if our results confirm that P. alba is recognized toimprove soil quality, further long-term analysis are required in thisarea to establish potential risk due to the accumulation of traceelement concentrations in the topsoil due to litter fall.
Acknowledgements
AGL2008-00985 supported by the CICYT of the Ministerio deCiencia e Innovación of Spain and FEDER (EU). L. Ciadamidarothanks to CSIC for funding her grant (JAE-PreDoc).
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data related to this article can be found at http://dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2013.11.010.
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VI. DISCUSIÓN GENERAL
VI. DISCUSIÓN GENERAL
145
VI.1. EVOLUCIÓN DEL pH
En el experimento en microcosmos, en general, la presencia de hojarasca en
los suelos neutros (RHU, CO y AZ) condujo a un ligero aumento de los valores de
pH. En el caso del suelo ácido (DO) el aumento fue mucho más significativo. Estos
resultados están relacionados con los incrementos de pH que se producen tras la
adición de MO a los suelos (Brady y Weil, 2002). En los suelos neutros el
incremento fue muy leve, como corresponde a la naturaleza ligeramente ácida de la
hojarasca que pudo minimizar los efectos alcalinizadores de la MO en estos suelos.
Sin embargo, en el suelo ácido la acción de la MO proveniente de la hojarasca fue
mucho más notable. Resultados similares han sido publicados por Pérez-de-Mora y
col. (2006b) en un suelo ácido enmendado con hojarasca procedente de bosque de
hoja caduca.
En el experimento en contenedores, en suelos neutros (CO y AZ), la
presencia de planta y en menor medida de hojarasca tampoco produjo cambios
significativos en los valores de pH. En el caso del suelo ácido (DO), sin embargo la
presencia del álamo influyó considerablemente aumentando el pH en el tiempo.
Varios estudios han demostrado que las raíces pueden alterar las condiciones del pH
del suelo mediante la asimilación/liberación de aniones/cationes, la liberación de
ácidos orgánicos y CO2, el consumo de O2 y las reacciones redox (Nye, 1981; Jones
y col., 2004). Sin embargo, parece ser que el pH inicial del suelo contribuye de
manera decisiva a la dirección y la magnitud en que cambia el pH en el entorno de la
rizosfera. Youssef y Chino (1989) comprobaron que la rizosfera de plantas de
cebada y soja aumentaban el pH del suelo cuando era inicialmente menor de 5 y lo
disminuían cuando era cercano a la neutralidad. Además, en suelos ácidos, los
exudados radicales pueden formar complejos solubles, p.ej. con el Al3+
, que
disminuyen la acidez del medio. Por consiguiente, la revegetación de este tipo de
suelos puede ser importante no sólo desde el punto de vista ecológico y paisajístico,
sino también como medida para contrarrestar la acidez del suelo. De la misma
forma, es importante considerar los procesos de lixiviación y de atenuación natural
del propio suelo (Bradshaw, 2000; Vázquez y col., 2011), como se pudo comprobar
en el suelo ácido sin planta. A pesar de que en este suelo no se estableció el cultivo
de álamo, también se observó un aumento del pH al término del estudio, aunque
menos pronunciado que en los suelos con plantas (DO-P). Al igual que para los
VI. DISCUSIÓN GENERAL
146
suelos neutros, los valores de pH medido en el agua de poro (SPW) mostraron una
tendencia similar a los valores medidos mediante la extracción con KCl.
En el experimento de campo, en general, en los suelos neutros (RHU y AZ)
los valores de pH se mantuvieron constantes durante los 2 años de estudio. El pH de
la profundidad 0-20 cm fue generalmente más alto que en 20-40 cm, debido a la
mayor presencia de materia orgánica en la capa superficial en forma de hojarasca o
por efecto de la rizosfera (Bolan y col., 2013). Sólo en el suelo neutro contaminado
(AZ) se apreció un descenso con el tiempo de los valores de pH en la profundidad
más superficial, debido probablemente a la acción de la hojarasca con un pH más
ácido respecto al suelo. Además el alto contenido de Cd y Zn en la hojarasca podría
haber retrasado su descomposición y producido una reducción del pH (Mertens y
col., 2007). En el suelo ácido contaminado (DO) los valores para ambas
profundidades siguieron una evolución parecida a la de los suelos neutros, aunque
con cierta tendencia a aumentar el pH a lo largo de los dos años de estudio. Estos
resultados confirmaron lo observado tanto en el experimento de microcosmos como
en el experimento en contenedores.
Analizando los resultados obtenidos en el experimento de microcosmos y en
contenedores, se observó que la planta juega un papel más importante en la
evolución del pH del suelo que la hojarasca. Por otro lado, en el experimento de
campo la influencia de la planta parece tener menos efecto, debido a que el sistema
está más estabilizado y los efectos producidos parecen menos evidentes en
comparación con los otros dos experimentos, diseñados a corto y medio plazo y en
condiciones controladas.
VI.2. EVOLUCIÓN DE LA DISPONIBILIDAD DE ELEMENTOS TRAZA
(ET)
La evaluación de la concentración total de ET en suelos puede dar
información sobre el posible enriquecimiento del suelo con estos elementos, pero no
es suficiente para estimar su movilidad y disponibilidad (Bunzl y col., 1999). Como
se ha explicado anteriormente, Naidu y col. (2008) definen la biodisponibilidad de
contaminantes en el suelo como la fracción total de metal(loides) en el agua
intersticial (es decir, la solución del suelo) y en las partículas del suelo que estan
disponibles para el organismo receptor.
VI. DISCUSIÓN GENERAL
147
En el experimento de microcosmos, el aporte de hojarasca no supuso en
ninguno de los suelos, un incremento del contenido total de ET y/o la disponibilidad
de los mismos en el tiempo, que estuvo más relacionada con el pH del suelo que con
otros parámetros estudiados. De hecho, aunque las concentraciones totales de ET en
los dos suelos contaminados (AZ y DO) fueron muy similares, las concentraciones
de ET biodisponibles fueron mucho más altas en el suelo DO. Este hecho pone de
manifiesto que el pH es un factor determinante en la disponibilidad y solubilidad de
ET (Brallier y col., 1996), confirmado por las correlaciones significativamente
negativas entre el pH y las concentraciones de Cd, Cu y Zn extraíbles con CaCl2
0,01 M (Capítulo V.1).
En el experimento en condiciones de semi-campo, tanto la concentración de
ET extraídos con CaCl2 0,01 M como la obtenida en el agua de poro (SPW) fueron
más dependientes del pH que del contenido de ET total en el suelo. En los suelos
neutros (AZ y CO), las concentraciones de Cu, Mn y Zn obtenidas por ambos
métodos de análisis fueron muy bajas y se mantuvieron prácticamente constantes
durante todo el experimento aunque tendieron a aumentar ligeramente en el suelo no
contaminado en presencia de plantas. Hay que tener en cuenta que estos tres
elementos son micronutrientes necesarios para el desarrollo de las plantas y, al
encontrarse en los suelos no contaminados a bajas concentraciones, las raíces los
solubilizan para asegurar su biodisponibilidad (Kabata-Pendias y Pendias, 1992).
Sin embargo, en el suelo neutro contaminado (AZ-P) las raíces no ejercieron el
mismo efecto, ya que sus concentraciones fueron, en general, mayores que en el
suelo neutro no contaminado y, probablemente, estos niveles fueron suficientes para
satisfacer la demanda de la planta. En el caso de Mn y Zn las concentraciones
disponibles de ambos elementos fueron en algunos muestreos más altas en los suelos
donde no había planta (CO y AZ), reflejando el poder de absorción de la planta de
ambos micronutrientes.
En el caso de Cd y Pb, elementos sin funciones fisiológicas y considerados
tóxicos para las plantas a determinadas concentraciones, los contenidos disponibles
obtenidos con ambas técnicas se mantuvieron muy bajos en los suelos neutros. Las
concentraciones más altas se encontraron sólo al principio del experimento y, en
particular las de Pb, que disminuyeron considerablemente con el tiempo. Esta
reducción en la solubilidad del Pb podría ser debida a la presencia de complejos de
Pb, como beudantita (PbFe3 (AsO4)(SO4)(OH)6), que es considerado el principal
VI. DISCUSIÓN GENERAL
148
mineral obtenido de la oxidación del suelo de las minas ricas en sulfuros (Roussel y
col., 2000), o a la presencia de formas recalcitrantes en el suelo que reducen su
movilidad respecto a los otros elementos, como Cd, Cu y Zn, provenientes del
vertido tóxico (Cabrera y col., 1999; López-Pamo y col., 1999).
Por el contrario en el suelo ácido contaminado (DO) las concentraciones de
todos los ET biodisponibles fueron siempre, como corresponde a su naturaleza
ácida, superiores a los encontrados en los suelos neutros. Sin embargo, estos valores
tendieron a disminuir en el tiempo como consecuencia del aumento del pH indicado
anteriormente. Estos resultados confirman que la disponibilidad de elementos
catiónicos disminuye a medida que disminuye la acidez (Brallier y col., 1996;
Conesa y col., 2011).
Las dos aproximaciones utilizadas para determinar las concentraciones de los
ET biodisponibles en el suelo están principalmente basadas en procedimientos de
extracción físicos y químicos para determinar las concentraciones de los ET
biodisponibles en el suelo. Estas dos técnicas están estrechamente relacionadas entre
ellas puesto que ambas reflejan el potencial de transferencia de los ET desde el suelo
hasta las plantas, además en el caso del SPW, nos permiten evaluar directamente el
efecto de la rizosfera sobre la disponibilidad de los ET en el suelo (McLaughlin y
col., 2000; Wang y col., 2002; Pérez-de-Mora y col., 2006a; Madejón y col., 2006b;
Maderova y col., 2011). Los resultados de biodisponibilidad de los ET para los
métodos utilizados en este estudio fueron comparables entre ellos, especialmente los
observados para el suelo ácido (DO), obteniéndose correlaciones significativamente
positivas entre los valores SPW y CaCl2 para todos los ET. Ambos métodos dan una
información similar de la evolución de la disponibilidad de los ET en los suelos.
En el experimento de campo, a pesar de que la hojarasca en las zonas DO y
AZ es rica en ET, las concentraciones pseudo-totales de estos elementos en los
suelos de las zonas estudiadas a profundidades <40 cm no aumentaron durante el
período de monitorización. Además se observó una estabilización o reducción
general de Cd y de Zn extraíbles con CaCl2 en ambos suelos contaminados (AZ y
DO). Del mismo modo, se observó un descenso más pronunciado para el suelo ácido
contaminado (DO), relacionado de nuevo con el incremento del pH del suelo. Las
concentraciones de ET disponibles en el suelo, como se observó en el resto de los
ensayos, estuvieron relacionadas con el pH del suelo y con el contenido total de ET.
En general, las concentraciones fueron bastante bajas para todos los metales, excepto
VI. DISCUSIÓN GENERAL
149
para el Cd y Zn. Aunque en suelo neutro contaminado (AZ) los valores de Cd y Zn
en la hojarasca eran más altos que en el suelo control (RHU), los valores de estos
dos elementos extraídos con CaCl2 fueron sólo ligeramente superiores a los
obtenidos en el suelo RHU, como también se pudo comprobar en el experimento de
microcosmos. Como ya se ha comentado a lo largo de esta discusión, la reducción
de la movilidad de los metales, mediante reacciones de precipitación y un aumento
de adsorción por coloides de carga variable (Selin y Amacher, 1997), se vio afectada
bajo las condiciones de pH del suelo AZ. En general, no se observaron diferencias
en los contenidos de ET entre las dos profundidades analizadas, lo que pone de
manifiesto los posibles procesos de lixiviación en el suelo durante todo el periodo de
estudio que, transportando los ET a través de las diferentes capas, diluyeron la
contaminación del suelo. Por ello, el monitoreo continuo es muy recomendable para
asegurarse de que el enriquecimiento de la capa más profunda no represente un
riesgo para las aguas subterráneas, crucial para la sostenibilidad de los sistemas
naturales y agrícolas (Burgos y col., 2013).
A pesar de la fiabilidad de los métodos de estimación de biodisponibilidad de
contaminantes, es la planta la que nos va a dar la respuesta definitiva sobre la
validez de los mismos para la determinación de la biodisponibilidad de ET en suelo.
Para ello se realizó una monitorización de las concentraciones de estos elementos en
hojas de álamo blanco tanto en el experimento de contenedores (con condiciones
controladas) como en el experimento de campo.
En el experimento en contenedores, en los suelos neutros (CO y AZ) las
concentraciones de Cu, Mn y Pb se encontraron dentro de los intervalos normales
para plantas superiores (Kabata-Pendias y Pendias, 1992) durante todo el período de
experimentación, a excepción de los valores de Pb en el primer muestreo (en las
plantas justo después del transplante). Las plantas provenían de un vivero cercano a
una autovía y probablemente, debido a la contaminación aérea por Pb, absorbieron
este elemento a través de los estomas (Schreck y col., 2012). Las concentraciones de
Cu, Pb y Mn en el suelo ácido (DO) reflejaron una tendencia similar a la de los
suelos neutros aunque los valores se mantuvieron siempre más altos.
En el caso de las concentraciones de Cd y Zn, los resultados obtenidos
dependieron de los contenidos totales del suelo. Los valores de estos dos elementos
en las hojas de los álamos que crecieron en los suelos contaminados (AZ y DO) se
mantuvieron por encima de los niveles normales en plantas debido a la capacidad de
VI. DISCUSIÓN GENERAL
150
esta especie de acumular ambos elementos (Madejón y col., 2006a). De acuerdo con
Hermle y col. (2006), en general la concentración de ET en hojas de álamo que crece
en un suelo ácido, como DO, es mayor que en un suelo neutro contaminado. En
cualquier caso, en el suelo ácido las concentraciones en hojas de álamo blanco
tendieron a disminuir en el tiempo, lo que demuestra como ya se ha indicado varias
veces a lo largo de la memoria, que el pH es el factor principal en la regulación de la
biodisponibilidad de ET. Además del aumento del pH del suelo, la penetración de
las raíces a la zona más profunda de suelo no contaminada podría haber contribuido
a la disminución de las concentraciones de ET en el tiempo.
La fiabilidad de ambos métodos de estimación de la biodisponibilidad viene
avalada por las correlaciones entre las concentraciones de los ET obtenidas en el
agua de poro (SWP), por extracción mediante CaCl2 0,01 M en el suelo y por el
contenidos de estos elementos en el material vegetal. De hecho, se encontraron
correlaciones significativamente positivas para todos los elementos, excepto para el
Pb, entre concentraciones en hojas y suelos (extracción con CaCl2 0,01 M y SPW).
Estos resultados concuerdan con los obtenidos en otros estudios (Robinson y col.,
2000; Madejón y col., 2004). En general, las mejores correlaciones suelo-planta se
encontraron para Cd, Mn y Zn. En el caso de Cd y Zn los resultados obtenidos
confirman que ambos elementos tienen propiedades geoquímicas y ambientales muy
similares, de forma que pueden competir durante su absorción, transporte y
acumulación (Das y col., 1997). Además, las Salicáceas como ya se ha indicado, se
caracterizan por su capacidad para acumular Cd y Zn (Sawidis y col., 2001),
circunstancia que explicaría que las mejores correlaciones se hayan obtenido para
estos dos elementos. En el caso del Cd, a pesar de no ser esencial para la planta,
como lo es el Zn, es un elemento que se absorbe pasivamente (al menos en parte) y
es transportado fácilmente hacia las partes superiores (Greger, 1999). En el caso de
Mn las correlaciones obtenidas podrían estar relacionadas con la capacidad de este
elemento de ser rápidamente absorbido y transportado dentro de las plantas además
de no formar enlaces orgánicos insolubles a nivel de la rizosfera (Kabata-Pendias y
Pendias, 1992).
Los coeficientes de correlación más bajos (aunque significativos) se
encontraron para el Cu, elemento que tiende a formar complejos muy estables en
suelos y por tanto con una baja movilidad (Brun y col., 2001) además de que se
acumula preferentemente en la raíz en condiciones de exceso (Kabata-Pendias y
VI. DISCUSIÓN GENERAL
151
Pendias, 1992). En el caso del Pb se obtuvieron correlaciones significativas y
negativas entre las concentraciones en hojas y agua de poro (SPW) mientras que no
se observaron correlaciones significativas entre concentraciones en hojas y suelo
mediante extracción con CaCl2 0,01 M. Blaylock y Huang (2000) demostraron que
la mayor parte del Pb absorbido permanece en las raíces, y éstas representan la
primera barrera para su translocación a la parte aérea de las plantas. Además el Pb
presenta una baja disponibilidad para las plantas, ya que precipita con los fosfatos y
sulfatos que se encuentran en la rizosfera en ciertas condiciones (Blaylock y Huang,
2000).
En el experimento de campo, los resultados fueron similares. Como se ha
comentado anteriormente, el álamo es capaz de acumular altas concentraciones de
Cd y Zn en su parte aérea y, como se ha demostrado en condiciones controladas en
esta memoria y por otros autores, no presenta aparentes respuestas de toxicidad (Di
Baccio y col., 2003; Madejón y col., 2004; Robinson y col., 2005). Además algunos
trabajos han apuntado la posibilidad de su uso como bioindicador de Cd y Zn en el
suelo (Madejón y col., 2004 y 2006a).
Como ocurría para el ensayo en contenedores, los valores más altos de ET se
encontraron en hojas provenientes de álamos que crecen el suelo ácido contaminado
(DO). Los datos obtenidos en la monitorización efectuada en campo confirman que
el pH del suelo es uno de los parámetros más importantes y que mejor explica la
variabilidad de las concentraciones de ET en las hojas de los árboles. Basta y col.
(2005) demostraron que incluso pequeños cambios en el pH del suelo podrían dar
lugar a grandes cambios en la disponibilidad de ET. En particular, las mayores
diferencias debidas al pH se encontraron en el caso de Mn y Zn, siendo ambos
elementos conocidos por su alta dependencia del pH y por ser fácilmente absorbidos
por las plantas cuando están presentes en el suelo (Kabata-Pendias, 2001).
Domínguez y col. (2009) demostraron también que la biodisponibilidad de los ET
catiónicos en la zona del Guadiamar (misma área de estudio) es dependiente del pH
del suelo.
VI.3. ESTADO NUTRICIONAL DE LAS PLANTAS DE ÁLAMO BLANCO
En los estudios en contenedores y de campo, con el fin de profundizar el
efecto de las plantas en la estabilización de la contaminación y la mejora de la
VI. DISCUSIÓN GENERAL
152
calidad del suelo, se han evaluado los niveles nutricionales en las hojas de los
álamos de las zonas estudiadas. En general, al final del experimento y para ambos
estudios, los valores más altos de N, P y K en las hojas de álamo se encontraron en
los suelos control (CO y RHU respectivamente). Estos valores demuestran la
influencia de los ET en los procesos de absorción de las plantas capaces de crear
mecanismos de competición a nivel de las raíces (Madejón, 2004; Domínguez y col.,
2009; Kabata Pendias, 2001) o interferir con los mecanismos de absorción de los
nutrientes esenciales para las plantas, alterando el equilibrio nutricional (Kabata
Pendias, 2001).
En el experimento en contenedores las concentraciones de N, P y K en hoja
en el año 2010 fueron similares en plantas creciendo en los tres tipos de suelos
estudiados. Esto se explica por la reducida biomasa que aún tenían estos árboles
capaces de mantenerse con la propia reserva nutricional de la planta y menos
dependiente de los nutrientes disponibles del suelo. A medida que la planta crece la
demanda nutricional es mayor (Vogt y col., 1996). Esta teoría está confirmada por
las concentraciones menores de N, P y K encontradas en suelos contaminados
respecto al suelo no contaminado en el muestreo de 2011. En la monitorización de
campo se observó este efecto en los dos muestreos realizados. Estos resultados
ponen de manifiesto la influencia de los ET sobre la disponibilidad de estos
nutrientes para la planta (Markert, 1987; Barceló y Poschenreider, 1990).
Los nutrientes Ca, Mg y S tuvieron un comportamiento parecido en 2010 a lo
encontrado para N, P y K, en cuanto que no se observaron diferencias de
concentración en las hojas de los árboles de los tres suelos. Este dato confirma lo
comentado anteriormente para los otros tres nutrientes. Sin embargo para el
muestreo de 2011 se observó un comportamiento opuesto para Ca y Mg en
comparación con N, K y P. En el experimento de campo las concentraciones más
altas de Ca, Mg, S se encontraron también en los suelos contaminados (AZ y DO) en
ambos muestreos. Resultados similares han sido publicados por Madejón (2004).
En caso del Ca, en ambos experimentos, las concentraciones más altas en
suelos contaminados podrían interpretarse como una respuesta de “protección” de la
planta ante la situación de estrés creada por los ET, aspecto descrito con anterioridad
por otros autores (Carbonell y col., 1998). Este aumento de Ca en los suelos
contaminados también puede ser debido a pequeños cambios de pH en estos suelos,
lo que hace que aumente el Ca en la solución. Wallace y col. (1966) demostraron
VI. DISCUSIÓN GENERAL
153
que las necesidades de Ca para la planta aumentan ante la presencia de metales
pesados.
Por otro lado, en la monitorización de campo en los suelos contaminados,
especialmente en el suelo ácido (DO), la asimilación de nutrientes como Mg y S por
parte de la planta aumentó posiblemente como respuesta a la liberación de cationes
del complejo de cambio en estos suelos ácidos y a la alta disponibilidad de sulfatos
debido a la oxidación de los restos de polisulfuros metálicos del suelo (Alastuey y
col., 1999). El álamo, al ser una especie caducifolia de crecimiento rápido, podría
responder más rápidamente a la liberación de nutrientes que otras especies. La
acidificación del suelo, asociada a la contaminación, parece ser uno de los factores
más importantes para la nutrición de las especies estudiadas. El contenido de S en
plantas, además, está muy relacionado con la alta concentración del mismo en los
suelos contaminados, debido a la presencia de lodos (Alastuey y col., 1999).
Por otro lado, en el experimento en contenedores las concentraciones de Mg
y S se mantuvieron siempre bastante parecidas entre los diferentes suelos o incluso
más altas en el control (CO), demostrando nuevamente que los ET presentes en el
suelo compiten, a nivel de las raíces, con los nutrientes para su absorción (Markert,
1987; Barceló y Poschenrieder, 1990).
VI.4. MATERIA ORGÁNICA Y PROPIEDADES RELACIONADAS CON
EL CICLO DEL C EN EL SUELO
VI.4.1. Carbono orgánico total (COT) y tasas de mineralización (TM)
La materia orgánica (MO) es un componente fundamental del suelo ya que
de ella dependen muchas de sus propiedades químicas, físicas y biológicas. Como ya
se ha indicado, en los ecosistemas forestales, la hojarasca es la principal fuente de
MO y nutrientes para la capa superficial del suelo (Kuzyakov y Domanski, 2000).
Una baja descomposición, debida a condiciones ácidas, un suministro limitado de
nutrientes esenciales y presencia de contaminantes orgánicos o inorgánicos, puede
conducir a una acumulación de MO no descompuesta en el suelo y a la
inmovilización de estos nutrientes esenciales (Swift y col., 1979).
En el ensayo en microcosmos se pudo comprobar que, en general, las tasas
de mineralización más altas, después de 40 semanas de estudio se observaron en los
suelos con hojarasca. Nuevamente hay que destacar las diferencias entre los suelos
VI. DISCUSIÓN GENERAL
154
debidas al efecto del pH y de los ET. Comparando los suelos entre sí, el suelo CO
presentó las mayores tasas de mineralización, seguido de los suelos RHU y AZ,
demostrando que la degradación de la MO en el suelo depende de factores como la
textura, el contenido de arcilla y el pH del suelo (Simard y N’Dayegamiye, 1993),
además del contenido en ET. En el suelo ácido (DO) las tasas de mineralización
fueron mucho más bajas que en los demás suelos, debidas al pH ácido y a las
elevadas concentraciones de ET disponibles. De hecho se ha demostrado que la
presencia de contaminantes y especialmente de ET puede producir cambios en la
composición de la biomasa microbiana (Perry y col., 1989), afectando al
crecimiento, la morfología y el metabolismo de los microorganismos del suelo
responsables de la degradación de la MO (Leita y col., 1995). Resulta claro que en
este experimento el pH y la presencia de ET solubles influyeron sobre este
parámetro.
En el caso del experimento en contenedores el carbono orgánico total (COT)
aumentó con el tiempo, sobre todo al final del experimento (36 meses), en los suelos
con plantas en comparación con los suelos sin ellas. Este incremento se debió al
aporte de carbono por parte de los exudados de las raíces y en menor medida de la
hojarasca, lo que influye positivamente sobre las propiedades bioquímicas del suelo
analizado (Tiessen y col., 1994; Hobbie y col., 2007).
Un estudio de Kuzyakov y Domanski (2000) demostró que en ecosistemas
forestales, la caída estaciónal de hojas es la principal fuente de MO y nutrientes en la
capa superficial del suelo. Una menor descomposición, debida a condiciones ácidas,
un limitado aporte de nutrientes esenciales y la presencia de contaminantes tanto
orgánicos como inorgánicos, podría producir acumulación de MO en el suelo y a la
inmovilización de nutrientes esenciales (Swift y col., 1979). En la monitorización
realizada en condiciones de campo, se observó que en los suelos contaminados (AZ
y DO) el contenido de MO se mantuvo igual o aumentó ligeramente durante los 2
años de estudio y los valores en la capa superficial fueron superiores a los de la capa
más profunda, debido a la presencia directa de la hojarasca.
VI.4.2. Carbono hidrosoluble (CH)
El carbono hidrosoluble (CH) representa la fracción más lábil del “pool” de
C del suelo. El C extraíble con agua se considera la parte más fácilmente degradable
por los microorganismos, por lo que tiene gran influencia en todos los procesos
VI. DISCUSIÓN GENERAL
155
biológicos del suelo (Kuiters y Mulder, 1993). Además es la fuente de carbono más
móvil y reactiva en el suelo y condiciona importantes procesos físicos, químicos y
biológicos (Marschner y Kalbitz, 2003; Halvorson y González, 2008).
En el experimento en microcosmos, el contenido de CH también estuvo
marcado por la presencia de hojarasca. La disminución del CH con el tiempo en los
suelos estudiados podría estar relacionada con el consumo del C lábil por los
microorganismos y por el proceso de mineralización de la MO (García y Hernández,
1996). Esta disminución fue más evidente en los suelos con presencia de hojarasca,
en los que era esperable un mayor desarrollo y número de la población microbiana.
Del mismo modo, en el experimento en contenedores, los valores del CH se
vieron incrementados por la presencia de la planta gracias, sobre todo, a la
contribución del sistema radical. En particular en el suelo contaminado AZ, con
mayor contenido en MO, se evidenció como la presencia de la planta influye en la
disponibilidad de carbono. Qualls y col. (1991) establecieron que la primera fuente
de C hidrosoluble son los lixiviados de las substancias derivadas de los productos de
los residuos de descomposición de las plantas. También en este experimento, los
valores más bajos de CH se encontraron en el suelo ácido contaminado (DO) en el
tratamiento sin planta.
En el experimento de campo se observaron resultados similares a los
obtenidos en los experimentos en microcosmos y en contenedores. El contenido de
CH generalmente fue mayor en la primera profundidad (0-20 cm), debido al aporte
de C por medio de la hojarasca. La disminución del CH en los suelos durante el
primer año podría estar relacionada con el consumo de C lábil por los
microorganismos del suelo y también con los procesos de mineralización. Hay que
resaltar también que pudo producirse cierta lixiviación de CH anterior al muestreo
de 2010, debido al intenso período de precipitaciones durante el invierno de 2010
(Capítulo V.5., figura S1). De nuevo observamos que los valores más bajos de CH
se encuentran en el suelo ácido contaminado (DO), probablemente y como se ha
comentado anteriormente, como consecuencia de la incidencia de la acidez en la
ralentización del proceso de descomposición de la hojarasca. Varios autores afirman
que el contenido de CH en el suelo se ve afectado por factores como la acidificación
del ecosistema (Shamrikova y col., 2006; Karavanova y col., 2007), así como por la
calidad de la hojarasca, la composición del bosque (Shamrikova y col., 2006; Ohno
y col., 2007) y la temperatura del suelo (Tao y Lin, 2000).
VI. DISCUSIÓN GENERAL
156
VI.4.3. Carbono de la biomasa microbiana (CBM)
El carbono de la biomasa microbiana (CBM) juega un papel crucial en el
ciclo de nutrientes (Nannipieri y col., 2002), y se puede utilizar como parámetro
para evaluar el impacto de la contaminación por ET en el suelo (Zhang y col., 2008).
En el experimento en microcosmos durante las 40 semanas de la incubación,
los valores más altos de CBM se alcanzaron en suelos neutros con adición de
hojarasca (CO-L, RHU-L y AZ-L), mientras que los valores más bajos se obtuvieron
en el suelo ácido (DO), especialmente donde no se añadió hojarasca. La medida del
CBM da una idea del proceso de la descomposición y reconversión de la materia
orgánica y de la transformación de nutrientes (Dalal y Meyer, 1987; Smith y Paul,
1990; Witter, 1996). Resulta evidente que la materia orgánica añadida con la
hojarasca permitió el desarrollo de los microorganismos en el suelo y
consecuentemente un incremento en la población microbiana. De esta forma el
aporte de hojarasca demostró ser el factor principal en el aumento en el contenido de
CH y de CBM. Deng y Tabatabai (1996, 1997) también encontraron aumentos de
estos parámetros debidos a la adición de materia orgánica en forma de lodos de
depuradora y compost. Por otra parte, una alta concentración de ET disponibles
podría reducir el desarrollo microbiano como en el caso del suelo ácido, DO.
Algunos autores han puesto de manifiesto los efectos tóxicos de los ET para los
microorganismos del suelo (Kandeler y col., 1996) y la reducción de la biomasa
microbiana en presencia de concentraciones elevadas de ET (Chander y col., 1995).
El experimento en contenedores demostró que la presencia de planta también
incrementó los valores del CBM, aunque de nuevo en el suelo contaminado ácido
(DO) se observaron menores diferencias entre suelo con y sin planta. Por tanto, el
crecimiento de los árboles parece haber contribuido al desarrollo de los
microorganismos del suelo, probablemente a través de su rizosfera, proporcionado
una amplia variedad de sustratos para los mismos. Se ha comprobado que los
microorganismos de la rizosfera utilizan los compuestos orgánicos de bajo peso
molecular fácilmente mineralizables (Renella y col., 2007). Puschenreiter y col.
(2003), también comprobaron que los exudados de las raíces afectan la
biodisponibilidad de los ET de manera directa o indirecta, mediante la estimulación
de la actividad microbiana, explicando así el aumento en los valores de CBM en los
suelos contaminados en presencia de plantas.
VI. DISCUSIÓN GENERAL
157
En el experimento en condiciones de campo el contenido en CBM pareció
estar más afectado por la contaminación que el resto de los parámetros analizados,
como demostraron las correlaciones significativamente negativas encontradas entre
el CBM y todos los ET, especialmente Cd y Zn. A pesar de la influencia de la
contaminación, los valores de CBM resultaron inicialmente bajos para los 3 suelos y
aumentaron en el tiempo. Este aumento de los valores de CBM en el tiempo pudo
estar relacionado con el aporte de materia orgánica proveniente de los exudados
radical de las plantas y de la descomposición de la hojarasca, similar a lo obtenido
en los ensayos de microcosmos y contenedores. El incremento fue más apreciable en
los suelos neutros (AZ y RHU), especialmente en la capa superficial (0-20 cm), ya
que las plantas y la hojarasca estimularon la actividad microbiana en la capa de
suelo más superficial (Hernández-Allica y col., 2006). En el suelo ácido aunque la
tendencia se mantiene igual a la de los suelos neutros, no se evidenciaron diferencias
entre las 2 profundidades. Para este suelo, probablemente el menor ritmo de
descomposición de la hojarasca, debida a las condiciones ácidas, podría haber
limitado el aporte de MO para los microorganismos en la capa superficial del suelo,
igualando de esta forma los valores de CBM entre las dos profundidades (Swift y
col., 1979). Además, la mayor concentración de ET disponibles en el suelo parece
afectar negativamente a este parámetro, reduciendo los efectos positivos producidos
por las plantas.
VI.4.4. Actividad enzimática -glucosidasa (-gluc)
Una de las actividades enzimáticas involucradas en el ciclo del C es la β-
glucosidasa, siendo esta actividad una de las más empleadas para evaluar la calidad
del suelo (Bandick y Dick, 1999).
En el experimento en microcosmos, los valores más altos de la actividad se
encontraron en los suelos donde se añadió hojarasca, independientemente del nivel
de contaminación y del pH. Al ser la -glucosidasa la enzima limitante en la
degradación de la celulosa a glucosa, la mayor actividad encontrada en los
tratamientos con hojarasca puede explicarse por el alto contenido en celulosa de la
misma. Esta actividad enzimática no estuvo relacionada directamente con el
contenido de ET en el suelo, puesto que, en general, los valores más altos de la
actividad se obtuvieron en AZ (suelo contaminado de pH neutro) y, también durante
las primeras semanas de estudio, en el suelo ácido con adición de hojarasca (DO-L),
VI. DISCUSIÓN GENERAL
158
aunque estos valores disminuyeron en el tiempo. Algunos autores, han observado
que el aumento de la disponibilidad de C orgánico añadido por medio de la
hojarasca juega un papel más importante en la funcionalidad de la enzima que la
posible toxicidad de los ET (Pérez-de-Mora y col., 2006b; Renella y col., 2007).
En el experimento en contenedores, todos los tratamientos con planta
mostraron valores más altos respecto a los tratamientos sin planta, confirmando que
la presencia del sistema radical estimuló esta actividad (Renella y col., 2007).
Además, el incremento registrado para la actividad β-glucosidasa en los suelos
contaminados con presencia de plantas podría estar relacionado con la liberación de
enzimas por parte de las raíces de las plantas y con la mejora en la síntesis de
enzimas microbianas en la rizosfera (George y col., 2005). Cabe destacar que la
adición de materia orgánica mediante los exudados radicales y la presencia de
hojarasca (en menor medida) en los contenedores con plantas produjo un aumento
de todas las propiedades bioquímicas relacionadas con el ciclo del C del suelo
(Pérez-de-Mora y col., 2006b; Madejón y col., 2009).
En el experimento de monitorización en campo, la actividad β-glucosidasa en
suelos neutros presentó siempre valores más altos en la primera profundidad y
generalmente mantuvo una tendencia constante en el tiempo. Como se evidenció en
los ensayos de microcosmos y en contenedores, la β-glucosidasa no se vió afectada
por la presencia de ET, si no que parece estar más relacionada con el contenido en
CH y COT del suelo. Esta hipótesis está confirmada por las fuertes correlaciones
positivas entre la actividad β-glucosidasa, el CH y el COT. Este hecho explica los
valores más altos de β-glucosidasa en el suelo neutro contaminado (AZ) respecto al
suelo control (RHU). Sin embargo, esta hipótesis no se ajusta al suelo ácido (DO) en
cuanto sus valores suelen ser más bajos que los otros suelos (RHU y AZ),
demostrando que en condiciones forestales el pH influye sobre el funcionamiento y
la supervivencia enzimática (Acosta-Martínez y Tabatabai, 2000).
V.4.5. Respiración microbiana
La respiración del suelo es un parámetro que refleja la actividad biológica del
mismo y se determina a través del desprendimiento de CO2 o del consumo de O2
resultante del metabolismo de los organismos vivos existentes en el suelo
(Nannipieri y col., 1990). Para poder medir la respiración del suelo en cada uno de
los tiempos de incubación se puso a punto una técnica a través de la medida con
VI. DISCUSIÓN GENERAL
159
Oxitops. Esta técnica se basa en una medida manométrica que registra los cambios
de presión debido al consumo de oxígeno, lo que permite, mediante la ecuación de
los gases, calcular la respiración tanto basal como inducida. Los valores de
respiración basal (RB) se atribuyen generalmente a la actividad metabólica latente
mientras que la inducida por sustrato (SIR) se refiere a la actividad metabólica activa
de la población microbiana (Sahoo y col., 2010).
Los valores de respiración del suelo se midieron solamente en el ensayo de
microcosmos en los que las condiciones controladas permiten reducir la alta
variabilidad existente en campo y obtener resultados más fiables.
En concordancia con los resultados de -glucosidasa, los valores de
respiración basal (RB) y de la respiración inducida por sustrato (SIR) parecen estar
más afectados por la disponibilidad del C que por la propia contaminación de los
suelos. Entre todos los parámetros estudiados relacionados con la respiración basal
del suelo, tlag y tpeak son los que mejor indican la respuesta microbiana del suelo.
Varios autores han tratado de utilizar parámetros microbianos para evaluar la
contaminación del suelo por metales pesados, demostrando los efectos negativos de
los ET en la actividad microbiana (Giller y col., 1998; Liao y Xie, 2007). En la
técnica a través de la medida con Oxitops, los valores umbrales para los parámetros
de respiración que se proponen en la norma ISO 17155, indicativos de
contaminación, y que fueron utilizados como referencia en nuestros experimentos,
son: QR> 0,3, tlag> 20 h, tpeak> 50 h.
Giller y col., (1998) intentaron resumir las dificultades de extrapolar los
efectos tóxicos significativos de corto a largo plazo en condiciones de campo, con
escasos resultados, lo que motivó que se volviera a prestar atención en los estudios
“in situ”. Algunos trabajos (Giller y col., 1998; Liao y Xie, 2007) han demostrado el
efecto inhibidor de los ET para los microorganismos, señalando los efectos
específicos sobre su actividad (Sandaa y col., 2001; Ellis y col., 2003).
Destacar que en nuestro estudio, todos los factores relacionados con el
crecimiento microbiano (SIR, tlag y tpeak) demostraron estar influenciados por el tipo
de suelo (características de acidez y concentración de metales) y por la adición de
hojarasca. Además, el cálculo de los valores de respiración inducida por sustrato
(SIR) mostró la diferencia entre la actividad de crecimiento de los organismos r, que
comienzan a crecer inmediatamente en respuesta a la adición del sustrato y los
organismos K, que aumentan su tasa de producción de CO2 a un nivel constante. Los
VI. DISCUSIÓN GENERAL
160
valores de r son en general bajos en los suelos sin adición reciente de sustratos pero
pueden aumentar significativamente en suelos con alta disponibilidad de materia
orgánica (Stenström y col., 1998). Los resultados obtenidos en este estudio muestran
que la población microbiana en suelos con hojarasca se mantuvo más alta y tendió a
disminuir en el tiempo. Asimismo, en los suelos contaminados la población
microbiana parece adaptarse a estas condiciones (Chander y Joergensen, 2008).
VI.5. NITRÓGENO Y PROPIEDADES RELACIONADAS CON EL CICLO
DEL N EN EL SUELO
La evolución de los parámetros relacionados con el ciclo del N, estuvo
también marcada por el pH y por la disponibilidad de ET en los suelos. Según
Mertens y col. (2009) el paso limitante en la velocidad de nitrificación es la
oxidación del amonio a nitrito y de nitrito que se oxida rápidamente a nitrato por los
organismos nitrito-oxidantes.
VI.5.1. Mineralización del N orgánico
En el experimento en microcosmos, en general, después de una fase inicial
de inmovilización de N, las concentraciones de nitrato (NO3-N-) aumentaron de
manera exponencial en los suelos neutros donde se añadió hojarasca, lo que indica
que el amonio (NH4-N+) liberado del proceso de amonificación, se oxida
rápidamente para dar NO3-N- (He y col., 2000). Otros autores obtuvieron los
mismos resultados en experimentos de incubación aeróbica (Cabrera y col., 2005;
Madrid y col., 2011). A pesar de los contenidos de ET en el suelo AZ, el proceso de
nitrificación no se vio afectado y en este suelo parece seguir una tendencia similar a
la del suelo no contaminado. Sin embargo, en el suelo DO, especialmente con
adición de hojarasca, se observaron mayores concentraciones de NH4-N+ y menores
de NO3-N- en comparación con los otros suelos, lo que revela una inhibición en la
reacción de nitrificación. En este caso, el pH del suelo y la disponibilidad de ET
claramente afectaron el proceso de nitrificación. Cabe destacar que la
desnitrificación y las pérdidas por volatilización de NH4-N+ también podrían haber
dado lugar a una subestimación de la mineralización neta en este suelo. De hecho,
algunos autores (Ste-Marie y Paré, 1999; Smolders y col., 2004) han demostrado
que en condiciones de pH ácido la capacidad de los agentes nitrificantes de
VI. DISCUSIÓN GENERAL
161
transformar el N se reduce de forma importante, lo que explica la disminución de la
nitrificación neta en suelos ácidos.
Las raíces de las plantas juegan también un papel fundamental en el proceso
bioquímico del ciclo del N. Bajo la influencia de las raíces los procesos que
participan en el metabolismo del N pueden ser más rápidos que en un suelo sin
plantas (Clarholm, 1985; Jones y col., 1994). Por ello, en el experimento en
contenedores, de acuerdo con esta teoría, encontramos valores más bajos de N
mineral en los suelos con planta, debido a la capacidad de la misma de absorber este
N. Cloutier-Hurteau y col. (2011) obtuvieron resultados similares en la rizosfera de
Populus tremuloides, con contenidos más altos de amonio y menores de nitratos con
respecto a los suelos sin plantas. Es evidente que el N orgánico presente en el suelo
se mineraliza y, tras el desarrollo de los árboles, las plantas reducen drásticamente el
contenido de NO3-N- a través de su absorción para promover su crecimiento. En el
caso del suelo ácido (DO) se observaron contenidos mayores de NH4-N+ en
comparación con los otros suelos estudiados, demostrando, como en el experimento
de incubación, que el proceso de nitrificación se ve afectado por el pH del suelo
(Ste-Marie y Paré, 1999; Zhang y col., 2011).
En el experimento de campo los valores iniciales de nitrato (NO3-N-) fueron
muchos más altos en el suelo control (RHU) que en los suelos contaminados (AZ y
DO). Por el contrario, los valores de amonio (NH4-N+) fueron más altos en el suelo
ácido (DO) respecto a los suelos neutros (RHU y AZ). Sólo en el caso del amonio
(NH4-N+) del suelo control (RHU) se observaron diferencias significativas entre las
dos profundidades. Estas diferencias no fueron tan evidentes en los dos suelos
contaminados (AZ y DO), debido a una menor descomposición de la hojarasca que
se tradujo en un menor aporte de MO. Sin embargo, en el suelo ácido la presencia de
un alto contenido de ET parece influir más que otros parámetros y que en otros
experimentos en el proceso de nitrificación. De hecho varios autores encontraron
que la mineralización neta de N era inhibida por la presencia de una concentración
muy alta de metales pesados en suelos (Tyler, 1975; Chang y Broadbent, 1982;
Babich y Stotzky, 1985).
V.5. 2. Potencial de nitrificación (PNR)
El término ''potencial de nitrificación'' se utiliza comúnmente para estudiar el
proceso de nitrificación en suelos con concentraciones de sustrato saturantes, es
VI. DISCUSIÓN GENERAL
162
decir, la nitrificación que se observa inmediatamente después de añadir el sustrato en
forma amonio (Dušek, 1995; Wilson, 1977; Suavé y col., 1999).
En general, los resultados del ensayo de incubación mostraron que la
presencia de hojarasca no tuvo ninguna influencia en los valores de este parámetro.
Los valores de PNR en los suelos neutros fueron similares en los suelos con y sin
adición de hojarasca. Para los ensayos en contenedores y de campo se observaron
comportamientos parecidos para los suelos neutros (RHU, CO y AZ), excepto que
para la monitorización de campo se encontraron algunas diferencias entre
profundidades (0-20 y 20-40 cm) para los suelos neutros (RHU y AZ) durante el
primer año de estudio.
Hay que destacar, que en el caso de los contenedores, las plantas jugaron un
papel muy importante en el proceso de nitrificación del N ya que los valores de PNR
en suelo con presencia de planta se mantuvieron siempre más altos. De la misma
forma, en la monitorización de campo, parece claro que la rizosfera del suelo y la
presencia de hojarasca influyen notablemente en los valores de PNR, evidenciando
además diferencias entre las dos profundidades en el primer año de estudio. Yin y
col. (2012) demonstraron que el potencial de mineralización del suelo era mayor en
general en el suelo de la rizosfera que en el suelo alejado de la misma (“bulk soil”).
Probablemente, el aporte de MO por parte de las plantas podría haber estimulado la
actividad microbiana y paralelamente el proceso de nitrificación (Binkley and
Menyailo, 2005). Además, la estimulación de la mineralización de N inducida por
las raíces se ha demostrado en estudios con especies forestales (Phillips y Fahey,
2006).
Sin embargo, en el suelo ácido (DO) los valores de PNR fueron
prácticamente nulos para todos los ensayos y sin diferencias entre tratamientos,
confirmando el efecto negativo de la acidez y de los ET disponibles en suelos sobre
el proceso de nitrificación. La alta disponibilidad de ET puede ser un factor
inhibidor de algunas reacciones involucradas en el ciclo del N, probablemente
porque los ET producen desnaturalización de las proteínas y/o daños en la integridad
de las membranas celulares (Leita y col., 1995). Así los resultados de este estudio,
indican que de acuerdo con los obtenidos por otros autores (Dancer y col., 1973;
Ste-Marie y Paré; 1999), los valores de pH ácidos del suelo unido al contenido
elevado de ET disponibles afectan fundamentalmente al proceso de nitrificación,
VI. DISCUSIÓN GENERAL
163
mientras que el proceso de amonificación se ve menos influenciado por estos
factores.
VI.5.3. Actividad enzimática proteasa
La actividad proteasa, juega un papel principal en la transformación del
nitrógeno y en la hidrólisis de enlaces peptídicos de proteínas en el suelo (Tate,
2002). Esta actividad enzimática extracelular está estrechamente relacionada con el
contenido de N y cataliza la liberación de aminoácidos (Nannipieri y Eldor, 2009).
En el ensayo de incubación se observó que la hojarasca, al tratarse de una importante
fuente de N para el suelo, produjo la estimulación de la proteasa en los suelos
neutros (Moorhead y col., 1999). El suelo contaminado ácido con y sin hojarasca
presentó una escasa actividad, muy influenciada por el pH ácido y como
consecuencia de la elevada disponibilidad de ET (Burgos y col., 2010). Los efectos
negativos de la acidez del suelo y de la presencia de elevadas concentraciones de ET
solubles sobre las propiedades biológicas se conocen muy bien (Yang y col., 2006).
La funcionalidad del suelo está muy influenciada por el pH y la concentración de ET
desde el momento que afectan los parámetros relacionados con la calidad del suelo
(Speir y col., 1995). De hecho, en este ensayo, los dos suelos contaminados (AZ y
DO) presentan tendencias diferentes: en el caso de AZ, suelo neutro con más baja
concentración de ET solubles, los valores de actividad proteasa son parecidos o
incluso mayores que los suelos control, mientras que en DO, suelo ácido y con alta
concentración de ET solubles, es apreciable una menor actividad microbiana y por
eso valores más bajos de actividad proteasa.
En el ensayo realizado en contenedores, se apreció que esta actividad estuvo
ligeramente estimulada por la presencia de las raíces del álamo. La estimulación de
la actividad proteasa debida a los procesos de descomposición de la hojarasca y a la
acción de los exudados radicales ha sido ampliamente discutida y demostrada
también en suelos contaminados por ET disponibles (Plaza y col., 2004; Renella y
col 2003). Además, el incremento de la actividad proteasa encontrado en DO-P
podría estar relacionado con la reducción de la disponibilidad de ET. Otros estudios
demostraron que la disminución de disponibilidad de ET puede reducir el posible
efecto aditivo o sinérgico de los diferentes ET sobre la inhibición de la microflora
del suelo (Renella y col., 2003).
VI. DISCUSIÓN GENERAL
164
Durante la monitorización de campo, la actividad proteasa aumentó en el
tiempo para todos los suelos y ambas profundidades a causa de los efectos positivos
de las plantas, debido probablemente a la continua liberación de exudados radicales
y el aporte de hojarasca. Estos resultados pueden compararse con los obtenidos en el
experimento en contenedores y en microcosmos, demostrando la importancia de la
materia orgánica en los procesos bioquímicos del suelo. De esta manera, como
ocurre para la β-glucosidasa, la introducción de materia orgánica y N y la
estimulación de la actividad microbiana a través de la presencia de hojarasca y del
sistema radical produjeron incrementos importantes en la actividad proteasa
(Madejón y col., 2009).
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
167
CONCLUSIONES
1) La mineralización de la materia orgánica y algunos parámetros relacionados con
el ciclo del C, como el carbono de la biomasa microbiana y respiración del suelo, y con
el ciclo del N, como el proceso de nitrificación, se vieron afectados por la ácidez del
suelo y la mayor disponibilidad de ET. En el suelo contaminado neutro los valores de
estos parámetros no se vieron afectados e incluso presentaron valores más altos que en
los suelos no contaminados.
2) A pesar de la contaminación por ET (especialmente de Cd y Zn) de la hojarasca
procedente de los álamos, el aporte de materia orgánica que se realiza a través de la
misma resultó ser más beneficioso que su remoción del suelo. Este aporte, junto con el
sistema radical del álamo, produjo en general efectos positivos en todos los parametros
relacionados con el ciclo del C y del N. La hojarasca no contribuyó al aumento de las
concentraciones pseudototales de ET en el suelo. La evolución de la biodisponibilidad
de los ET en los suelos no estuvo condicionada por el sistema radical o por la hojarasca
de los álamos y sí claramente influenciada por los valores iniciales de pH del suelo. En
el suelo contaminado de pH neutro, la biodisponibilidad de ET fue muy similar a la
obtenida en los suelos no contaminados. En el suelo ácido, las concentraciones de ET
fueron más altas que en los suelos neutros, aunque el aumento del pH ocasionado por la
hojarasca produjo un descenso en la biodisponibilidad con el tiempo.
3) El Populus alba (álamo blanco) puede ser una planta adecuada para la
reforestación de suelos contaminados con ET. Al mismo tiempo, la biomasa producida
por los álamos podría ser considerada de utilidad para fines energéticos. Los resultados
obtenidos demostraron que, después de un primer periodo de adaptación de la planta, el
álamo es capaz de sobrevivir en suelos contaminados incluso en aquellos con alta
biodisponibilidad de ET y pH ácido. Además, el sistema radical de esta especie estimuló
las propiedades bioquímicas del suelo, especialmente aquellas relacionadas con el ciclo
del C y del N.
4) Como conclusión general y teniendo en cuenta los resultados obtenidos a corto -
medio plazo podemos confirmar que la utilización del álamo blanco puede resultar
CONCLUSIONES
168
beneficiosa para mejorar la calidad de los suelos en los que crece aunque en el caso de
zonas contaminadas con elementos traza sea necesario continuar con la monitorización
a largo plazo de la hojarasca producida así como su influencia en las propiedades del
suelo.
CONCLUSIONES
169
CONCLUSIONS
1) Organic matter mineralization and other parameters related with the C cycle,
such as microbial biomass and soil respiration, and the N cycle, such as the nitrification
process, were affected by soil acidity and availability of trace elements. Effects were
most clearly observed in neutral contaminated soil, relative to neutral uncontaminated
soils.
2) Although trace element contamination (especially of Cd and Zn ) is high in
poplar litter, the addition of this organic matter was found to be more beneficial than its
removal. Both litter and the presence of the poplar root system produced generally
positive effects on all parameters related to the C and N cycles. Litter did not contribute
to an increase in total concentrations of trace elements in soil. The bioavailability of
trace elements was not influenced by the root system or poplar litter, but it was affected
by soil pH. In the neutral contaminated soil, the bioavailability of trace elements was
very similar to that obtained in neutral uncontaminated soil. In acidic soil, trace element
concentrations were higher than in neutral soils, although the increase of pH caused a
decrease in bioavailability over time.
3) Populus alba (white poplar) is a suitable plant for phytoremediation in soils
contaminated with trace elements. Moreover, the biomass produced by this fast-growing
species could be considered a valuable energy resource. The results showed that, after
an initial period of adaptation, poplars can survive in soil contaminated with a high
bioavailability of trace elements and acidic pH. In addition, the root system of this
species stimulated changes to soil biochemistry, especially factors related to the cycling
of C and N.
4) As a general conclusion and taking into account the results obtained in the short
- medium term it is confirmed that the use of white poplar trees can be beneficial to
improve the quality of the soil in which they grow, although in the case of areas
contaminated by trace elements it is necessary a continuous monitoring of litter and its
influence on soil properties in long-term application.
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