Revisión de la utilidad del método simplificado de determinación de amilosa para el arroz blanco, en los Programas de Mejoramiento varietal. Por: Dámaso Castillo Toro (1), Ana Adelfa Hernández López (1), Pura María Martínez García (1),

Victoria Obregón Ceballos (1) y Michely Vega (2). /1) Instituto de Investigaciones del Arroz., km 16 ½ Autopista del Meidodía, Apartado postal 5, Bauta, La Habana, Cuba, Teléfono: (53-47) 373750 y 373260. E-mail: poscosecha@iiarroz.cu (2) Instituto Nacional de Investigaciones Fundamentales de Agricultura Tropical. Santiago de las Vegas. Ciudad de la Habana. Teléfono (53-7) 579308. E-mail: mvega@inifat.esihabana.cu RESUMEN: El método simplificado de determinación de amilosa del grano de arroz blanco, vio la luz hace algo mas de 35 años; desde entonces se usa en el mundo, con mucha intensidad, en los laboratorios de estudio de la calidad de cocción y comestible de este cereal. En Cuba también se utiliza desde esa fecha. La experiencia acumulada en estos años en el país demuestran que el método colorimétrico sirve para indicar sólo la cantidad de este polisacárido en el grano de arroz blanco, o la relación amilosa/amilopectina en el almidón, pero no dice sobre la inter-relación molecular de estos polisacáridos, la cual es la decisiva para definir la propiedad químico – física o calidad de cocción del grano de una variedad de arroz. En este trabajo, basado en un estudio bibliográfico y en la propia experiencia del laboratorio del instituto de Investigaciones del Arroz de la Habana, se concluye que la determinación del contenido de amilosa por el método simplificado, no debe usarse aisladamente sino acompañado por la determinación indirecta de la temperatura de gelatinización (solución de KHO 1,7 %), para cumplir el propósito del mejoramiento genético de la calidad del grano de arroz. Review of the Simplified assay for Milled-Rice Amylose in a Rice Plant Breeding Program. Abstract The simplified assay for milled rice amylose determination is well known since 35 years ago. From this time this method has been used, with intensity in the world, in the laboratories; in Cuba this method has also been applied for 35 years and it has been observed during this period that amylose content obtained with this assay could be used to know this polysaccharide content in milled rice and the amylose / amylopectin relation in the starch granule, but it does not offer which is the molecular inter-relation between them which is necessary to show the grain quality or the grain physicochemistry relation of a rice variety. In this paper is demonstrated, through a bibliography study and by means of study of Cuban rice varieties that the amylose content colorimetric method may not have an isolated use becouse it must be also joined with the Alkali Test (KOH 1.7 %) in the Plant Breeding Program to get the appropriate rice grain quality.

INTRODUCCION: El método simplificado de determinación de amilosa del arroz blanco reportado por Juliano (1), se utiliza internacionalmente desde hace más de 35 años; se basa en un ajuste químico al método estándard empleado por Virginia R. Williams y otros, en 1958 (2), en el estudio de almidones de variedades de arroz. Con anterioridad, en 1956, Halick y Keneaster (3) utilizaron un ensayo de valor azul del complejo almidón – yodo como indicador de la calidad del arroz blanco. La reacción del yodo frente al almidón produce la coloración azul característica, explicada por Harris (4) y descrita por otros autores (5) a causa de la penetración de 11 moléculas de yodo y del ión triyoduro, dentro de cada uno de los tantos segmentos helicoidales continuos y compuestos de 66 unidades de glucosa y 11 vueltas, los cuales en conjunto estructuran al polímero lineal del almidón. La amilosa recristalizada puede fijar entre 18 y 20 % del peso de yodo (28). La amilosa del arroz tiene un grado numérico medio de polimerización de 900 a 1100 unidades de glucosa (6, 7). Sin embargo, el otro polimero, mayoritario en peso y volumen en el almidón, la amilopectina, también compuesta de unidades de glucosa, con enlaces alfa 1-4 en la estructura lineal y alfa 1-6 en la ramificada (8), no ha sido igualmente estudiado y utilizado como la amilosa en la caracterización de la calidad del grano de arroz. Actualmente existe un convencimiento en muchos investigadores científicos (9-13) de que este biopolimero ramificado juega un importante papel en las propiedades de cocción del grano de arroz. Tsai y colaboradores, en 1960 (14), estudiaron los almidones de variedades de arroz norteamericanas; el contenido de amilosa lo determinaron por 2 métodos, colorimétrico y amperométrico, por los cuales llegaron a los mismos resultados, con un porcentaje de yodo enlazado máximo de 18,1. También determinaron que el porcentaje de amilosa analizada por variedad de arroz está más relacionada al peso por muestra que al peso molecular, determinado éste por la oxidación con peryodato (15). Este resultado favorece la idea de que el registro de la cantidad de yodo enlazado por la molécula de amilosa , en solución acuosa, por los métodos expectrofotométrico, electrométrico o petenciométrico, solo ofrece una información cuantitativa acerca de la presencia de este polisacárido en el grano de arroz; no expresa sin embargo, la interrelación de este biopolímero desde el punto de vista químico- físico, donde el peso molecular de su molécula juega un importante papel (16), especialmente en el fenómeno de la retragradación (17 y 18), la cual es la causante del endurecimiento del grano de arroz cocinado, después de enfriarse (19), entre otros comportamientos. Es una realidad de que el método simplificado de determinación de amilosa establecido por Juliano en 1971(1), ha sido por mucho tiempo, y lo es hoy, muy útil para definir la calidad de cocción y comestible del grano de arroz blanco (20); su resultado expresa la cantidad total de amilosa liberada del almidón de una variedad de arroz, después de haber sido éste gelatinizado. Sin embargo las propiedades químico-físicas que se le miden al grano de arroz, para establecer su calidad, se determinan al grano natural, tal cuál se emplea para su cocción. Además, el fundamento físico de este método simplificado se basa en la absorción de luz natural del complejo amilosa- yodo para producir un efecto de emisión de radiación electromagnética característica del color azul, la cual, medida como densidad óptica en un espectrofotómetro, resulta mediante la ley de Lambert-Beer (21), la concentración de la sustancia activa coloreada. A medida que el número de segmentos helicoidales de la molécula de amilosa sea mayor, la densidad óptica medida será de valor más elevado, pero no informa si este valor se debe al aumento del peso molecular, o al aumento del número de moléculas con estructura más pequeña. Las dos cosas pudieran suceder: a) muchas moléculas con bajo peso molecular, o, b) pocas moléculas con alto DP; pero como el peso molecular ejerce una acción químico-física diferente en el gránulo de almidón, en dependencia de su grado de asociación (39), tal vez esto sea una razón natural por

la que el método de laboratorio de consistencia de gel (22) determina la dureza o blandura del grano de arroz, después de cocinado y enfriado, cuando el contenido de amilosa es determinado superior a 25%: Es duro si el DP es alto y es blando si es bajo. También, una rica experiencia observada mundialmente por años, lo es la escasa correspondencia entre los valores de la temperatura de gelatinización del almidón y su contenido de amilosa, medida a través del Método Simplificado (1), el cual es empleado en muchos laboratorios de varios países (23-27); esta experiencia se emplea en este trabajo, el cual tiene como objetivo demostrar que el método simplificado de determinación de amilosa no se debe utilizar aisladamente en un Programa de Mejoramiento genético de variedades de arroz, para determinar la calidad de cocción del grano. Sería conveniente tener en cuenta otros métodos más sencillos que junto a este complemente la información de la calidad de cocción de este cereal. MATERIALES Y METODOS I. Métodos de análisis de amilosa en el grano de arroz: Se emplearon dos métodos de análisis del contenido de amilosa del grano de arroz blanco:

a) Método amperométrico empleado por Larson y colaboradores en 1953 (29), para determinar el contenido de yodo absorbido por los segmentos helicoidales de lamolécula de amilosa, utilizando como valorante una solución de yodo 0,01 N, recomendada por Holló y Szejtli en 1960 (30).

b) Método colorimétrico utilizado por Juliano (1) en 1971, con el fin de simplificar el método de Williams y colaboradores, en 1958 (3), para determinar el contenido de amilosa de almidones de variedades de arroz.

II. Variedades de arroz:

Para determinar el contenido de amilosa del grano de arroz se emplearon las siguientes variedades: • IR 8; IR 22; IR 24; IR 880-C9; Cica 4; IR 1529-430; Naylamp; Basmati 370 (Mutante

cubano); Bolito Bahía; INCA-LP2; INCA-LP3; INCA-LP4; INCA-LP5, INCA-LP6; Jucarito 104; Perla de Cuba; IACuba 14 hasta la IACuba 24.

III. Experiencia documental del uso del método simplificado de determinación (colorimétrico) de

amilosa. 1.1. Quality Characteristics of Milled Rice grown in diferent countries. Juliano, B.O. y Pascual;

C.G., 1980 (25). 1.2. Grain Quality Evaluation ofWorld Rices. Juliano, B.O. y Villarreal, C.P., 1993 (24). 1.3. Criterios de calidad del grano para la industrialización y el consumo. Benedito, c. Y

Martínez, J., 1997 (26). 1.4. El grano de arroz: Características físico-químicas de sus almidones relacionados con las

propiedades mecánicas y de cocción. Parte I. Castillo, D., 1981 (23). 1.5. Análisis y Mejora de la Tecnología Postcosecha del Arroz y la calidad industrial de la

materia prima. CSIC. 1992 (33). 1.6. International Cooperativa Testing on the Amylose Content of Milled Rice. Juliano, B.O. y

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B.O. y col. 1980 (32).

IV. Análisis estadístico. El Análisis Estadístico se ejecutó mediante el programa Statgraphics Plus. Primeramente, se lograron los resultados de la estadística descriptiva (media, valor mínimo, valor máximo y desviación standard) para los valores reportados de las variables analizadas en los continentes de Asia, Africa, América y Europa. Posteriormente, se determinaron los coeficientes de correlación lineales de Pearson teniendo en cuenta los porcentajes de amilosa, los valores de la Prueba de Alcali( KOH 1,7 %), Consistencia de Gel y la Viscosidad Pico del Amilógrafo Brabender. RESULTADOS Y DISCUSION La correlación estadística irregular (24 y 25), observada por casi 35 años, entre el contenido de amilosa del grano de arroz blanco y su correspondiente calidad de cocción y comestible, es un hecho que hasta hoy en día no se ha podido corregir; sin embargo, se sigue determinando el contenido de amilosa del grano blanco, por el Método Simplificado (1) y se repite la expresión, entre los investigadores de la calidad de cocción y comestible del grano de arroz, de que existen valores altos, medios y bajos de amilosa, a partir de su determinación por el método colorimétrico. Las cifras correspondientes a esta escala (34) representan cantidad del polisacárido lineal, pero ni su estructura ni su interacción intramolecular ni intermolecular se reflejan en estas mediciones. No obstante, hoy se especifican los países que gustan más del arroz con contenido de amilosa alto, medio o bajo (6 y 35) de una forma absoluta, como si hubiera una correspondencia exacta entre los valores de esta escala y las propiedades químico-físicas cuantificables del grano de arroz blanco. En la actualidad se observa diferencia del contenido de amilosa en el grano de arroz individual, en una misma panícula, usando el mismo método simplificado de Juliano, B.O. (36), así como en el contenido del papel de la amilosa sobre la configuración del gránulo de almidón (37). Sin embargo, se reporta por Noda y col. en 2004 (38) un método nuevo basado en el valor azul del yodo, en el estudio de propiedades de almidones de grano de arroz con bajo contenido de amilosa. Con la finalidad de predecir que el grano de arroz blanco, recién cocinado, con contenido de amilosa superior a 25 %, se endurece o se mantiene blando, después de enfriarse, se estableció el método de consistencia de gel (22), cuyo comportamiento puede estar relacionado con el tamaño molecular del polisacárido lineal del almidón, debido al fenómeno de retrogradación y causante éste de la dureza, al enfriarse, el arroz recién cocinado (39). El contenido de amilosa no expresa entonces, si la molécula de esté biopolimero es más larga, para facilitar la retrogradación; es necesario acudir a otro método (22) para confirmar este comportamiento químicofísico. El Método Simplificado (1) si confirma que hay alto contenido de segmentos helicoides capaces de absorber moléculas de I2 y I3, para formar el color azul. Se pudiera interpretar que cuando el arroz recién cocinado enfría blando, es porque existe la presencia de moléculas de amilosa de mediano o bajo peso molecular, con limitaciones para retrogradarse, como se describe con el estudio térmico (Differential Scanning Calorimeter) de almidones de 11 variedades de arroz, donde el porcentaje de retrogradación es superior para las muestras con alto y medio contenidos de amilosa e inferior para las de bajo contenido (40), resultados que conducen a pensar que los valores de más alto peso molecular de la amilosa pudieran estar presentes en la escala media y alta de contenido de este polisacárido lineal. En la tabla I se registran los valores del contenido de amilosa, del grano blanco de variedades de arroz cubanas, con los correspondientes valores de la dispersión en solución de KOH al 1.7 % (11), adhesividad y consistencia del arroz cocinado (26). Se observa, entre los valores de esta

tabla, que ninguna de las variedades, con contenido de amilosa similares, muestran parecidas calidad de cocción o comestible. Este mismo efecto ya se había reportado por Kongseree y Juliano (41) en 1972, pero prevaleció la idea, en el análisis, del factor genético como causa principal. Tabla I: Contenido de amilosa y propiedades químicofísicas del grano blanqueado de variedades

de arroz cubanas.

Propiedades comestibles Variedades de arroz Contenido de

amilosa (% b.s.)Álcali

(KOH 1,7 %) Consistencia (Kgf/cm2) (1)

Adhesividad (g/cm ) (2)

Basmati 370 Mutante 20.58 4.7 0.96 3.20 Gloria Mutante 20.60 - 0.98 2.17 Bolito bahía 24.84 4.3 1.25 0.60 INCA LP-2 13.80 - 0.68 7.56 INCA LP-3 17.07 - 0.71 5.63 INCA LP-4 20.97 - 0.99 2.88 INCA LP-5 16.77 5.8 0.77 5.17 INCA LP-6 13.79 - 0.71 5.68 Jucarito104 20.38 3.2 0.96 3.29 Perla de Cuba 18.69 5.8 0.75 5.53 IACuba-14 16.16 5.2 0.76 6.79 IACuba-15 15.24 5.8 0.78 5.96 IACuba-16 14.50 5.7 0.76 6.00 IACuba-17 18.13 2.7 0.90 4.49 IACuba-18 18.13 6.0 0.69 4.58 IACuba-19 22.72 4.0 1.11 0.55 IACuba-20 18.70 5.0 0.83 3.97 IACuba-21 15.69 4.4 0.65 5.89 IACuba-22 18.50 4.3 0.75 3.84 IACuba-23 22.39 3.4 0.83 4.31 IACuba-24 29.01 3.2 1.35 0.71 b.s.- base seca (1) Valores ≤ 2.50 buena calidad. (2) Valores ≥ 0.85 buena calidad. Basado en estos resultados y otros alcanzados pero no descritos en este trabajo, es que se confirmó, con la evidencia bibliográfica, de que los valores correspondientes al contenido de amilosa del grano de arroz blanco no se pueden aceptar como una guía exclusiva para juzgar la calidad de cocción y comestible del grano blanco de una variedad de arroz. La temperatura de gelatinización del grano blanco, determinada mediante la digestibilidad en KOH al 1,7 % (11 y 13) es una forma indirecta de estimar esta característica, a través de una escala numérica cuyos valores están correlacionados negativamente con esta temperatura (41). Este procedimiento ha tenido una aceptación generalizada entre los mejoradores de arroz en el mundo, motivado, primordialmente, por lo sencillo y rápido que se obtiene la información deseada, así como por la poca cantidad de muestra que se requiere en cada análisis (42).

Usando la generosidad que nos brinda el Instituto Internacional de Investigaciones del Arroz (25) y del propio conductor del estudio de la calidad del grano, por más de 30 años, en esa institución, B.O. Juliano (24, 25), se utilizan en este trabajo sus datos publicados, para demostrar la variabilidad de las propiedades químicofísicas el grano de arroz blanco con relación a igual contenido de amilosa. Los datos utilizados se dividieron, de acuerdo a 4 regiones geográficas del mundo, con la finalidad de resaltar la influencia de los factores climáticos, en los continentes de Africa, Asia, América y Europa. Los datos correlacionados son: -Prueba de KOH al 1.7 %, -Consistencia de gel y –Pico de la viscosidad en el amilógrafo Brabender. En la tabla II se describen las correlaciones lineales de los datos acumulados de la temperatura de gelatinización contra el contenido de amilosa en el grano de arroz blanco, para los cuatro continentes estudiados; se evidencia una dispersión amplia de los valores de alkali para valores muy cercanos del contenido de amilosa. No hay significación en las correlaciones y en el coeficiente de determinación los cuales reafirman la falta de correspondencia entre estos valores. Es decir, entre los cuatro continentes no se puede hacer una distinción que contradiga esta falta de relación lineal de ambas propiedades del grano de arroz blanco. Tabla II: Análisis estadístico de los datos de digestibilidad en KOH 1,7 % de muestras de arroz

blanco con diferentes contenidos de amilosa

Regiones geográficas Análisis estadístico Africa América Asia Europa Y = 0,64 X +27,99 Y = 0,01 X +23,3 Y = 1,34 X +31,08 Y = 0,54 X +16,68 R2 = 0,018 R2 = 0,000 R2 = 0,029 R2 = 0,019 r = 0,135 r = 0,0,002 r = 0,171 r = 0,137

Correlación lineal digestibilidad en KOH 1.7 % VS % amilosa

N = 76 N = 158 N = 660 N = 125 • N 10 70 135 67 • mínimo 18.0 14.4 1.0 9.0 • máximo 27.6 31.3 31.5 24.7 • promedio 20.2 24.0 22.6 20.8

% amilosa:

• ds 2.7 4.6 6.9 2.3 • N 10 70 135 57 • Mínimo 7.0 2.0 2.2 3.8 • Máximo 7.0 7.0 7.0 7.0 • Promedio 7.0 5.7 5.6 6.8

KOH 1,7 %

• ds 0.0 1.3 1.2 0.6 Otra propiedad físicoquímica que está relacionada con la característica de cocción del grano de arroz es la consistencia de gel (22); en la tabla III se describen las correlaciones lineales alcanzadas para los cuatro continentes específicados anteriormente. Se observa una alta dispersión de estos valores, con relación a un rango muy estrecho de contenido de amilosa, en las cuatro regiones geográficas indicadas. No cabe dudas de que estos datos no aseguran una correspondencia lineal entre el contenido de amilosa y la consistencia dura o blanda que nos indica esta última prueba. Este método se destina para demostrar este comportamiento tan diverso de la formación del gel y para indicar cuando un tipo de arroz tiene un alto poder de retrogradación de la molécula de amilosa, que provoca el endurecimiento del arroz recién cocinado, al enfriarse, cuando hay un alto contenido de este polisacarido lineal del almidón. Es decir, que el ensayo de consistencia de gel rectifica el valor alto del contenido de amilosa en el

almidón; cuando la consistencia de gel es alta, quiere decir que las moléculas de amilosa tienen un tamaño promedio de DP bajo, por lo que no puede producirse la retrogradación (39), aunque el método simplificado de determinación de amilosa exprese un alto contenido de este componente químico. Los países asiáticos incluidos en el análisis tienen una mayor dispersión de estos datos, que incluyen los de endurecimiento del grano cocinado recién enfriado. Tabla III: Análisis estadístico de los datos de consistencia de gel de muestras de arroz blanco con

diferentes contenidos de amilosa.

Regiones geográficas Análisis estadístico Africa América Asia Europa Y = 0,01 X + 23.72 Y = 0,05 X + 27.14 Y = 0.1 X + 31.12 Y = 0,54 X + 24.86 R2 = 0,003 R2 = 0,073 R2 = 0,052 R2 = 0,020 r = 0,053 r = 0,002 r = 0,227 r = 0,448

Correlación lineal consistencia de gel VS % amilosa

N = 44 N = 129 N = 428 N = 107 • N 10 70 135 67 • mínimo 46.0 0.0 6.0 36.0 • máximo 100.0 100.0 100.0 95.0 • promedio 88.6 59.3 68.8 76.7

Consistencia de gel (mm)

• ds 15.9 20.5 25.0 15.5 Un tercer grupo de datos, que están íntimamente relacionados con el punto final de la gelatinización del gránulo de almidón, son los de viscosidad pico del amilografo Brabender (43). Estos datos también se correlacionaron linealmente con el contenido de amilosa, con muestras de arroz de los cuatro continentes conocidos. En la tabla IV se relacionan estos datos donde se observa como la ruptura de los gránulos de almidón se produce para un estrecho número de valores de contenido de amilosa, especialmente para los pueblos analizados de Africa y América. Para los pueblos e Africa y Europa se concentran más estos valores de pico de viscosidad, con mayor magnitud, hacia un rango estrecho de contenido de amilosa. Se confirma por igual que esta propiedad físicoquímica del gránulo de almidón no se relaciona linealmente con el contenido de amilosa determinado por el complejo amilosa-yodo. Tabla IV: Análisis estadístico de los datos de viscosidad pico del amilógrafo Brabender de

muestras de arroz blanco con diferentes contenidos de amilosa.

Regiones geográficas Análisis estadístico Africa América Asia Europa Y = - 0,01 X + 30.92 Y = - 0,003X + 25.89 Y = 0.01 X + 17.21 Y = -0.01 X + 30.28 R2 = 0,095 R2 = 0,004 R2 = 0,016 R2 = 0,209 r = - 0,307 r = 0,002 r = 0,126 r = - 0,457

Correlación lineal: Viscosidad pico vs % Amilosa

N = 29 N = 80 N = 323 N = 86 • N 10 70 135 67 • mínimo 720 365 0 550 • máximo 895 985 1290 900 • promedio 797 755 790 693

Viscosidad pico

• ds 65 102 210 82 Las tres tablas inmediatamente anteriores son una demostración práctica del uso del ensayo de determinación del contenido de amilosa por el método simplificado, el cual parece ser muy efectivo para indicar el contenido de amilosa que tiene el grano de arroz (o el gránulo de almidón), pero no

es capaz; aunque se utilice generalmente con este propósito, de indicar el comportamiento químicofísico real que tiene, genéticamente, el grano de una variedad de arroz. Sirve para definir la relación amilosa/amilopectina de una variedad de arroz, para que a partir de esta proporción en peso de carbohidratos, establecer una aproximación cualitativa del comportamiento químicofísico del grano blanco de una variedad de arroz, mediante el uso de un segundo ensayo de laboratorio, que establezca la temperatura de gelatinización del almidón, como la prueba de álcali (solución de KHO 1,7 %) y la prueba de consistencia de gel. Para el mejoramiento de variedades de arroz lo aconsejable sería determinar el contenido de amilosa y la digestibilidad en álcali (KOH 1,7), como dos pruebas inseparables y asequibles para emitir el veredicto de la calidad de una variedad de arroz, como condición mínima y más sencilla para un laboratorio de estudio genético. Cuando el contenido de amilosa sea superior al 25 %, hay que agregar la prueba de consistencia de gel, con el mismo fin en que esta está destinada. CONCLUSIONES 1. El Método Simplificado de determinación de amilosa del grano de arroz blanco por el complejo

almidón-yodo no sirve para identificar su propiedad de cocción, de una forma directa. Su utilidad, en los Programas de Mejoramiento genético de variedades, se restringe a las características comestibles del arroz cocinado.

2. Los valores de contenido de amilosa del grano de arroz blanco no siempre se corresponden

con los valores de propiedad de cocción de un conjunto de líneas o variedades que están sometidas a estudio de mejoramiento genético. No se ha encontrado correlación estadística significativa entre estos datos.

3. Para los Programas de Mejoramiento genético de calidad del grano de arroz blanco, el

contenido de amilosa por el método simplificado del complejo almidón-yodo es más útil cuando se acompaña de la determinación indirecta de la temperatura de gelatinización con solución de KHO 1,7 %.

RECOMENDACIÓN 1. Incluir, de forma necesariamente inseparable, para la determinación de la calidad del grano de

arroz blanco, en los Programas de Mejoramiento genético de variedades, la prueba de álcali (solución de KHO 1,7 %), recomendada por Little, Hilder y Dawson (11).

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Un segmento helicoidal de la molécula de amilosa (*)

(*) Tomado de la idea de Takeiko, M., Koso, O., y Soza, B.O.1970. Bull.Chem Soc. Japan.43, 950(5).