determinaciÓn del potencial genotÓxico de las nanopartÍculas de...
TRANSCRIPT
Departament de Genètica i de Microbiologia
DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL GENOTÓXICO
DE LAS NANOPARTÍCULAS DE PLATA
MEDIANTE EL ANÁLISIS DEL CICLO CELULAR, LA
APOPTOSIS Y EL ENSAYO DEL COMETA EN LA
LÍNEA CELULAR BEAS-2B.
Lourdes Amparo Vela Romero
Máster de Genética Avanzada
Julio 2012
DETERMINACIÓN DEL POTENCIAL GENOTÓXICO DE LAS
NANOPARTÍCULAS DE PLATA MEDIANTE EL ANÁLISIS DEL
CICLO CELULAR, LA APOPTOSIS Y EL ENSAYO DEL COMETA
EN LA LÍNEA CELULAR BEAS-2B.
Memoria presentada para optar al grado de Máster en Genética Avanzada por Lourdes
Amparo Vela Romero.
Este trabajo se ha realizado en el Grupo de Mutagénesis de la Unidad de Genética del
Departamento de Genética y de Microbiología de la Universitat Autònoma de Barcelona,
bajo la dirección del Dr. Ricard Marcos.
Universitat Autònoma de Barcelona, Julio 2012.
Dr. Ricard Marcos Lourdes Amparo Vela Romero
AGRADECIMIENTOS
Primeramente a Dios por darme la oportunidad de continuar con mis estudios, guiarme a lo
largo del camino y por ayudarme a lograr mis metas y mis sueños.
Al Dr. Ricard Marcos por haberme dado la oportunidad de formar parte de su equipo de
investigación, y por la ayuda otorgada a lo largo del presente trabajo de investigación.
A todo el Departamento de Genética y Microbiología de la UAB, por su ayuda y colaboración a
lo largo de la investigación, pero principalmente por su amistad y compañerismo durante mi
estancia en el laboratorio, gracias a todos por haberme permitido ser parte de su grupo y
hacer que el camino más fácil.
Gracias también a todos mis compañeros del Máster de Genética Avanzada y del laboratorio
por darme su amistad, y por haberme permitido compartir buenos momentos dentro y fuera
del laboratorio.
Agradezco a mi familia por su apoyo incondicional, por su confianza y por estar a mi lado a
pesar de la distancia. Gracias a mi padre por alentarme a seguir adelante con mis estudios y
por confiar en mí, gracias a mi madre por darme ánimos para seguir adelante y apoyarme
siempre, gracias a mi hermana por estar a mi lado en cada momento y por hacerme sentir
cerca de mi hogar, gracias a mi cuñado Luis Cerón por cuidar de mi familia en mi ausencia y
gracias a Dennys Páez por alentarme, apoyarme y por seguir a junto a mí a pesar de la
distancia y del tiempo.
A Yanara Astudillo por su amistad y por ser mi testigo y compañera a lo largo de esta
aventura. A todos mis amigos que a través de la distancia me han apoyado y han estado
conmigo animándome a seguir adelante. A todos los amigos becarios SENESCYT por ser mi
grupo de apoyo en buenos y malos momentos, y por haberme permitido vivir momentos de
esparcimiento en su compañía.
Finalmente un agradecimiento muy especial a la Secretaria Nacional de Educación Superior,
Ciencia, Tecnología e Innovación de la República del Ecuador (SENESCYT), por el apoyo y la
confianza depositada en cada uno de sus becarios y por su contribución al desarrollo
tecnológico y científico del Ecuador.
CONTENIDO
1. Introducción ...............................................................................................................................1
1.1. Nanotecnología: antecedentes y momento actual ................................................................1
1.2. Propiedades de los nanomateriales ......................................................................................2
1.3. Nanopartículas de plata ........................................................................................................3
1.4. Riesgos para la salud ............................................................................................................4
1.5. Toxicidad y genotoxicidad de las nanopartículas ...................................................................6
1.6. Análisis de la toxicidad y genotoxicidad ................................................................................7
1.6.1. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo .................................................7
1.6.2. Análisis apoptosis mediante citometría de flujo ..........................................................7
1.6.3. Ensayo del cometa.......................................................................................................8
2. Objetivos .................................................................................................................................. 11
3. Materiales y métodos ............................................................................................................... 13
3.1. Cultivos celulares ............................................................................................................... 13
3.2. Protocolo de descongelación .............................................................................................. 13
3.3. Mantenimiento y pasaje de los cultivos .............................................................................. 13
3.4. Nanopartículas de plata ..................................................................................................... 14
3.4.1. Protocolo de dispersión de la nanoplata .................................................................... 14
3.4.2. Caracterización de las nanopartículas de plata ........................................................... 15
3.5. Ensayos de toxicidad y de genotoxicidad ........................................................................... 15
3.5.1. Ensayo de toxicidad ................................................................................................. 15
3.5.2. Análisis del ciclo celular a mediante citometría de flujo............................................ 17
3.5.1. Análisis de apoptosis mediante citometría de flujo .................................................. 17
3.5.2. Ensayo del cometa ................................................................................................... 18
4. Resultados ................................................................................................................................ 21
4.1. Caracterización de las nanopartículas de plata ................................................................... 21
4.2. Toxicidad ............................................................................................................................ 22
4.3. Análisis del ciclo celular ...................................................................................................... 23
4.4. Análisis de la apoptosis ....................................................................................................... 25
4.5. Ensayo del cometa ........................................................................................................... ..27
4.5.1. Daño basal .............................................................................................................. 28
4.5.2. Daño oxidativo ........................................................................................................ 29
5. Discusión .................................................................................................................................. 33
5.1. Caracterización de las nanopartículas de plata ................................................................... 33
5.2. Ensayos de toxicidad .......................................................................................................... 34
5.3. Análisis del ciclo celular y de la apoptosis ............................................................................ 35
5.4. Ensayo del cometa ............................................................................................................. 37
6. Conclusiones y futuro ............................................................................................................... 41
7. Bibliografía ............................................................................................................................... 43
RESUMEN
El uso de nanomateriales en productos de consumo diario está incrementándose
rápidamente. Por lo tanto, dadas las propiedades de las nanopartículas, su exposición
puede representar un riesgo para la salud de los trabajadores de la industria y de la
población en general.
Entre los nanomateriales, debido a su capacidad antimicrobiana, las nanopartículas de
plata muestran un gran potencial en las aplicaciones médicas y así su uso cada vez más
extendido.
Dada la escasa información existente sobre el potencial genotóxico de las nanopartículas
de plata en este estudio nos hemos planteado obtener información sobre dicho potencial.
Para ello hemos utilizado la línea celular BEAS-2B, que son células epiteliales bronquiales
humanas, para ver efecto de las nanopartículas de plata sobre distintos parámetros como
la viabilidad celular, el ciclo celular, la apoptosis y el daño en el DNA.
El análisis del ciclo celular y de la apoptosis se realizó por citometria de flujo, y los
resultados obtenidos nos indican que la nanoplata no muestra un efecto significativo
sobre el ciclo celular ni sobre la apoptosis, bajo las condiciones ensayadas.
Para medir el daño en el DNA se utilizó el ensayo del cometa el cual se complementó con
el uso de la enzima formamidopirimidina-DNA glicosilasa (FPG) para determinar la
oxidación de las bases del DNA como posible mecanismo de acción de las nanopartículas.
Los resultados muestran que, tras los tratamientos, no hay incrementos ni en el daño
basal ni en el daño oxidativo del DNA, bajo las condiciones experimentales utilizadas en
las células BEAS-2B.
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Nanotecnología: antecedentes y momento actual
Ya desde el principio el ser humano ha estado expuesto a nanopartículas de origen natural
como son los aerosoles de origen marino (O'Dowd et al., 2004), las nanopartículas
resultantes de las erupciones volcánicas y los fullerenos o nanotubos generados por la
combustión. Desde la llegada de la revolución industrial esta exposición se ha
incrementado dramáticamente debido a la presencia de fuentes antropogénicas como la
combustión interna de los motores de explosión, las centrales térmicas y otras fuentes de
termodegradación (Oberdorster et al., 2005a; Xia et al., 2009). Sin embargo, en la
actualidad la fuente principal de exposición a nanopartículas para los humanos se asocia
con la existencia de nuevas nanopartículas fruto del rápido desarrollo de la
nanotecnología.
La industria de la nanotecnología está sufriendo un rápido crecimiento dados los
beneficios que se asocian a los nuevos nanomateriales, los cuales van a tener un
importante impacto económico y científico, ya que son aplicables en una amplia variedad
de áreas desde la ingeniería aeroespacial y la nano-electrónica hasta la remediación
medioambiental y el cuidado de la salud (Singh et al., 2009). El diseño y desarrollo de
nuevos nanomateriales tienen una importancia fundamental debido a las nuevas
características físico-químicas que éstos ofrecen, tales como aumento de la conductividad
térmica o eléctrica, aumento de la resistencia y dureza de los materiales, aumento de la
actividad catalítica y propiedades ópticas avanzadas, entre otras (Oberdorsen et al.,
2005b).
Estimas recientes indican que en los últimos años ha habido un crecimiento exponencial
de productos que contienen nanomateriales, hasta el año 2010 se estimó que
aproximadamente unos 1300 productos comerciales contenían nanomateriales,
esperándose que en el trascurso de los próximos años la cantidad de productos
incremente de manera significativa (Woodrow Wilson database). Entre los productos que
contienen nanomateriales se encuentran los cosméticos, cremas solares, aditivos
alimenticios, sistemas de administración de medicamentos, productos terapéuticos,
biosensores, y fármacos, entre otros (Wijnhoven et al., 2009; Liu et al., 2010).
Desde el punto de vista biofísico, las características biocinéticas de las nanopartículas son
cualidades atractivas para su aplicación en medicina como dispositivos de diagnóstico y
terapéuticos, así como en herramientas para investigar y entender los procesos
moleculares y las estructuras en las células vivas (Akerman et al., 2002). Por ejemplo, para
la administración de fármacos a tejidos que son difíciles de acceder como el sistema
nervioso central, o para la lucha contra el cáncer o para procedimientos de diagnóstico e
imagen (Oberdorster et al., 2005a).
1.2. Propiedades de los nanomateriales
Un nanomaterial se define como un material con una o más dimensiones externas o
internas o estructura superficial en la nanoescala (alrededor de 1-100 nm) (Shigh et al.,
2009). Las propiedades fisicoquímicas de los materiales a nanoescala pueden diferir
sustancialmente de los materiales de mayor tamaño con la misma composición. Estas
nuevas propiedades pueden resultar en un incremento de la cantidad admitida y en
modificar la interacción con tejidos y células (Galluzzi et al., 2011).
Las nanopartículas tienen propiedades únicas debido a su pequeño tamaño. Todas las
nanopartículas, sin tomar en cuenta su constitución química, poseen una proporción área/
volumen que es extremadamente grande, ya que al reducir el tamaño de un material hay
un incremento del área con respecto al volumen. También muchas otras de las
propiedades físicas de las nanopartículas como la solubilidad y la estabilidad están
determinadas por la naturaleza de la superficie de la nanopartícula (Oberdorsen et al.,
2005b; Wijnhoven et al., 2009).
Otro factor importante es la relación superficie con el total de átomos, la cual incrementa
exponencialmente con la disminución del tamaño de la partícula. Así, a menor tamaño,
mayor proporción de átomos en la superficie, incrementando la reactividad de la
superficie de las nanopartículas, que pueden reaccionar con diferentes estructuras o
compuestos (Oberdorsen et al., 2005b)
Se predice que las nanopartículas exhiben gran actividad biológica por unidad de masa en
comparación con partículas de mayor tamaño (Oberdorsen et al., 2005a). Este incremento
de la actividad biológica puede ser positivo y deseable (como en el caso de la actividad
antioxidante), o ser portador de capacidad terapéutica y atravesar las barreras celulares
para la administración de fármacos, entre otras) o ser negativo e indeseable (mayor
toxicidad, inducción de estrés oxidativo y disfunción celular), entre otros (Oberdorsen et
al., 2005a).
Además del tamaño, la forma de las nanopartículas también les confiere propiedades
distintas, ya que la forma afecta directamente a la superficie expuesta, de tal manera que
afecta a su reactividad ya que a más superficie expuesta hay mayor reactividad en la
nanopartícula.
La estabilidad de las nanopartículas en el medio es otro factor importante ya que
determina el patrón de agregación de las mismas, utilizándose el denominado potencial Z
como medida de la estabilidad de las partículas. Normalmente las nanopartículas con
potencial zeta mayor de 20 mV o menor de -20 mV tienen suficiente repulsión
electrostática para mantenerse estables en solución de tal forma que habrá una menor
agregación y se encontraran más dispersas (Oberdorsen et al., 2005 a; b)
1.3. Nanopartículas de plata
Una de las sustancias más utilizadas en nano formulaciones es la nanoplata, de acuerdo a
la base de datos Woodrow-Wilson (www.nanotechproject.org.). La plata (Ag) se ha
utilizado desde tiempos antiguos para la joyería, utensilios, aleaciones dentales,
fotografía, explosivos, etc. (Chen y Schluesener, 2008). Ya las civilizaciones antiguas eran
consientes de las propiedades antibacterianas de la plata, y compuestos de plata solubles
como las sales de plata se han utilizado para el tratamiento de enfermedades mentales,
epilepsia, adicción a la nicotina, gastroenteritis y enfermedades infecciosas (Wijnhoven et
al., 2009)
Los mayores fabricantes de productos de consumo en el área médica ya han tomado nota
de las propiedades antimicrobianas de la nanoplata y la están utilizando en productos
como vendajes de heridas, medias para prevenir infecciones en los pies y diversos
ungüentos (Foldjerg et al., 2009; Wijnhoven et al., 2009). Adicionalmente la nanoplata se
ha utilizado para prevenir la colonización bacteriana en varias superficies como catéteres y
prótesis (Foldbjerg et al., 2009). En la vida diaria se puede encontrar nanoplata en
productos como aerosoles, detergentes de lavandería, purificadores de agua, pinturas de
pared, así como en textiles para la fabricación de ropa , ropa interior, medias, etc (Lee et
al., 2011).
Por lo que respecta a su estructura, las partículas de nanoplata son menores de 100 nm y
consisten en alrededor de 20-15000 átomos de plata (Oberdorster et al., 2005 a; b; Lee et
al., 2011). En la nanoescala las partículas de plata, al igual que las demás nanopartículas,
exhiben propiedades físico-químicas diferentes a los materiales a gran escala, y estas
propiedades pueden estar afectando su toxicidad; sin embargo, a pesar del rápido
crecimiento de los nanoproductos en el mercado, existe un gran desconocimiento con
respecto al posible riesgo que supone la exposición a nanopartículas (Wijnhoven et al.,
2009).
1.4. Riesgos para la salud
A pesar del aparente beneficio de las nanopartículas, tanto en los usuarios como en la
economía, el incremento en su uso puede resultar en un aumento de la exposición tanto
en investigadores, trabajadores de la industria nanotecnológica, como consumidores, en
los que se pueden generar efectos adversos en su salud. Debido a su tamaño
extremadamente pequeño los nanomateriales son capaces de entrar en el cuerpo
humano por inhalación, ingestión, a través de la piel, inyección intravenosa o por
dispositivos médicos, pudiendo interactuar con las macromoléculas intracelulares. Debido
a su gran estabilidad las nanopartículas son capaces de mantenerse en el organismo y en
el ambiente durante largos períodos de tiempo; además, como ya se ha comentado, la
información de sus potenciales efectos adversos sobre la salud es bastante limitada. Así,
las mismas propiedades que hacen atractivas a las nanopartículas para el desarrollo de
procesos industriales específicos y en nanomedicina, puede provocar efectos deletéreos
cuando las nanopartículas interactúan con las células, aunque no se conoce a que
concentración o tamaño estas nanopartículas pueden exhibir efectos perniciosos (Xia et
al., 2009).
Entre los distintos blancos de las nanopartículas, el sistema respiratorio representa el
mayor puerto de entrada para las nanopartículas. La distribución y disposición de las
nanopartículas de plata en el tracto respiratorio depende de varios factores incluyendo el
tamaño de la partícula y la fuerza de inhalación. El tamaño de la nanopartícula de plata
también determina la profundidad a la que ésta va a penetrar en los pulmones y la
difusión de las mismas hacia el área alveolar (Wijnhoven et al., 2009). Hay pocos trabajos
acerca de las respuestas patológicas a altas dosis de nanopartículas o a exposiciones a
largo plazo, aunque entre éstas se puede citar la inflamación crónica alveolar, pequeñas
lesiones granulomatosas y disminución del volumen de los pulmones (Lee et al., 2011).
Diversas nanopartículas, incluyendo la nanoplata, se han descrito que causan efectos
genotóxicos como roturas de las cadenas de DNA, mutaciones puntuales y daño oxidativo
(Ahamed et al., 2008; Foldbjerg et al., 2011). Así, dado que las nanopartículas pueden
atravesar fácilmente la membrana nuclear, éstas pueden interactuar con el DNA directa o
indirectamente, aunque los mecanismos exactos de internalización no son bien conocidos
(Asare et al., 2012).
1.5. Toxicidad y genotoxicidad de las nanopartículas
Diversas nanopartículas han mostrado tener la capacidad, directa o indirecta, de inducir la
formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), tanto en estudios in vitro como in vivo,
incrementando el estrés oxídativo en las células. El estrés oxidativo producido por las
nanopartículas se considera que es el principal mecanismo generador del potencial
genotóxico de las mismas (Nel et al., 2006). Hay tres hipótesis principales según las cuales
las nanopartículas pueden inducir estrés oxidativo. 1) Las nanopartículas pueden ser
redox-activas o tener superficies o propiedades que catalicen la actividad redox,
provocando estrés oxidativo y la generación de exceso de ROS (especies reactivas de
oxígeno) (Petersen y Nelson, 2010). 2) Las nanopartículas pueden ser bio-persistentes, lo
que significa que una vez que entran en el sistema biológico éstas no se degradan o se
descomponen a lo largo del tiempo, si no que permanecen en el sistema induciendo una
inflamación en el sitio específico o una inflamación sistemática, esta inflamación inicia el
reclutamiento de leucocitos los cuales se activan y generan un exceso de ROS (Knappen et
al., 1999). 3) Las nanopartículas pueden entrar en la célula e interactuar físicamente
causando daño estructural en orgánulos como la mitocondria. El daño a la mitocondria
puede permitir la disrupción de la cadena trasportadora de electrones y la producción de
adenosina trifosfato (ATP), lo que provoca la generación de un exceso de ROS (Petersen y
Nelson, 2010).
La generación de ROS tienen la capacidad de atacar al DNA a través de diferentes
mecanismos para generar roturas de cadena simple (SSBs), roturas de cadena doble
(DSBs), e inducir daño oxidativo a las bases, entre otras lesiones (Petersen y Nelson,
2010). La acumulación de SSBs y la inducción de daño oxidativo en las bases del DNA
puede provocar (DBSs), las cuales se consideran el tipo más letal de daño oxidativo en el
DNA (Kanna y Jackson, 2001). Las roturas del DNA bloquean la transcripción y la
replicación dando como resultado una aceleración de la citotoxicidad y de la inestabilidad
genómica (Kanna y Jackson, 2001).
1.6. Análisis de la toxicidad y de la genotoxicidad
1.6.1. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
El daño oxidativo usualmente supone una interferencia con el desarrollo del ciclo celular.
Dependiendo del tipo de daño las células se van a acumular en la fase G1, en la fase S o en
la fase G2/Mitosis (G2/M). Cuando el daño es irreversible las células entran en apoptosis
(AshaRani et al., 2009). Así, los estudios básicos de toxicidad se pueden complementar con
el análisis del ciclo celular y de la apoptosis , dado que comparten mecanismos comunes.
Tanto los efectos sobre el ciclo celular como sobre la apoptosis se pueden valorar
mediante la técnica de citometría de flujo. El análisis del ciclo celular permite cuantificar la
cantidad de DNA en cada etapa del ciclo celular, y para su determinación se emplean
fluorocromos (yoduro de propidio, DAPI o naranja de acridina) que se intercalan de
manera estequiométrica en el DNA, por lo que es posible determinar el contenido relativo
en cada una de las células y por lo tanto diferenciar la fase del ciclo en que se encuentra
cada una de ellas. Así, las células en la fase G0 o G1 presentan un contenido de DNA=2N,
cuando entran en división e inician la síntesis de material genético la cantidad de DNA es
mayor (fase S), mientras que las células en mitosis tienen exactamente el doble de DNA
justo antes de separase en dos células hijas (fase G2 y M), siendo su contenido igual a 4N;
las células apoptóticas en las que hay una degradación de la cromatina, presentan un
contenido menor a 2N, cuantificándose por la aparición de un pico en la región Sub G0.
(Nicoletti et al., 1991; McCloskey et al., 1994).
1.6.2. Detección de la apoptosis mediante citometría de flujo
La apoptosis es una forma de deceso celular caracterizado por la ejecución de un
programa de muerte que tienen todas las células y que está codificado genéticamente. En
la apoptosis las células se inactivan, se desensamblan y degradan su propia estructura y
componentes de manera coordinada y característica (Ameisen, 1996).
La apoptosis es posible medirla a través de la detección de moléculas involucradas en la
muerte apoptótica. Uno de los eventos tempranos en la apoptosis es la pérdida de la
asimetría de la membrana. Durante la muerte apoptótica, la fosfatidilserina queda
expuesta hacia el exterior y, bajo ciertas condiciones de calcio, la molécula de anexina V,
tiene una afinidad específica por este fosfolípido, por lo que se utiliza acoplada a un
fluorocromo como el FITC, y a la par con yoduro de propidio (PI) como colorante
supravital, lo que permite diferenciar entre células apoptóticas, que fijan la anexina V y
excluyen al PI y las células necróticas que captan tanto la anexina V como el PI. Las células
vivas son negativas para ambas tinciones (Vermes et al., 1995).
1.6.3. Ensayo del cometa
El ensayo del cometa es una herramienta rápida y sencilla que permite detectar roturas de
simple cadena (SSBs) y de doble cadena (DSBs), sitios álcali-lábiles (apurínicos y
apirimidínicos), así como roturas ocurridas durante el proceso de reparación por escisión
(Karlsson, 2010).
El principio del ensayo se basa en lisar células fijadas en una matriz de agarosa, cuyo DNA
es sujeto a electroforesis bajo condiciones neutras o alcalinas, dependiendo de si uno
quiere detectar predominantemente roturas de doble cadena (neutro) o roturas de simple
cadena (alcalino). Posteriormente el DNA se marca usando un agente fluorescente o
intercalante como el SYBRGold o el bromuro de etidio. La imagen (el cometa) que se
forma comprende el DNA intacto (la cabeza) y las cadenas de DNA dañado (cola) que
emigran del núcleo. Las imágenes del cometa sirven para determinar el porcentaje de
daño en el DNA, de manera que cometas con colas largas suponen un mayor número de
roturas del DNA (Petersen y Nelson, 2010).
El ensayo del cometa alcalino se puede modificar especialmente para detectar la
presencia de purinas oxidadas o de pirimidinas oxidadas, mediante la incorporación de
enzimas que intervienen en la reparación por escisión de bases (BER). Para detectar
purinas oxidadas generalmente se utiliza formamidopirimidina glicosilasa (FPG) y para
pirimidinas oxidadas la endonucleasa III (Endo III) (Petersen y Nelson, 2010). La enzima
FPG reconoce diversas purinas oxidas como la 8-oxo-7,8-dihidro-2-guanosina (8-oxo-G),
que representa un importante daño genotóxico en las bases, y se considera como un
indicador de daño oxidativo en las bases del DNA (Asare et al., 2012). Estas enzimas
incrementan la especificidad y la sensibilidad del ensayo porque reconocen daños en
bases particulares y crean roturas adicionales en el DNA incrementando la cantidad de
DNA migrado (Karlsson, 2010). Por tanto, el uso de enzimas BER en el ensayo del cometa
permite estimar el nivel relativo de daño oxidativo inducido en las bases del DNA.
Aunque una de las ventajas que tiene el ensayo del cometa es su alta sensibilidad, esta
técnica es muy variable ya que pequeños cambios en las soluciones, concentraciones de
agarosa y condiciones de electroforesis, pueden variar los resultados obtenidos.
2. OBJETIVOS
GENERALES:
Evaluar los posibles efectos genotóxicos de las nanopartículas de plata en células
del epitelio bronquial humano (BEAS-2B).
ESPECÍFICOS:
1) Caracterizar a las nanopartículas de plata determinando distintas propiedades
como tamaño, forma y dispersión ya que estos parámetros afectan su actividad y
comportamiento en medios biológicos.
2) Establecer si las nanopartículas de plata son capaces de alterar las fases del ciclo
celular en la línea celular BEAS-2B, a través de la utilización de citometría de flujo.
3) Determinar si las nanopartículas de plata son capaces de causar apoptosis en la
línea celular BEAS-2B.
4) Analizar la capacidad de las nanopartículas de plata de generar daño en el DNA,
mediante el ensayo del cometa.
5) Evaluar si las nanopartículas de plata generan daño oxidativo en el DNA,
mediante el uso de la endonucleasa FPG (formamidopirimidina DNA glicosilasa) y
el ensayo del cometa.
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Cultivos celulares
Se utilizó la línea celular BEAS-2B para la los distintos ensayos de toxicidad, genotoxicidad
determinación del daño en el ciclo celular e inducción de apoptosis.
Las BEAS-2B son células epiteliales aisladas a partir del epitelio bronquial humano normal,
obtenidas a partir de la autopsia de individuos no cancerosos y, posteriormente
infectadas con el virus hibrido adenovirus 12-SV49 (Ad12SV40) para su inmortalización.
Estas células crecen en suspensión y se cultivan en medio BEGM libre de suero (Lonza/
Clonetics Kit Catalog No. CC-3170); este medio consiste en un medio de cultivo para
Células de Epitelio Bronquial Basales (BEBM, 550 mL almacenado a 4 °C) y suplementos de
crecimiento como extracto pituitario bovino BPE (2 mL), hydrocortisona (0,5 mL),
epinefrina (0,5 mL), trasferrina (0,5 mL), insulina (0,5 mL), ácido retinoico (0,5 mL),
triyodotironina (0,5 mL), GA-1000 (0,5 mL). Todos los componentes se deben almacenar a
-20 °C hasta su uso.
3.2. Protocolo de descongelación
Las células se mantienen congeladas en un tanque de nitrógeno líquido a -196 °C. Para
descongelarlas se las calentó en baño maría a 37 °C y posteriormente se diluyeron en
medio fresco para después centrifugarse a 130 g durante 7 min con la finalidad de
eliminar el DMSO del medio. Finalmente las células se resuspendieron en medio de
cultivo BEMG precalentado a 37 °C.
3.3. Mantenimiento y pasaje de los cultivos
Una vez establecidos los cultivos de las células se incrementó el número de éstas para
obtener suficiente material para los distintos experimentos. Para ello se hizo un lavado del
cultivo celular con PBS 1X (tampón fosfato salino) y posteriormente las células se
tripsinizaron con tripsina 1X durante algunos minutos. Para inactivar la tripsina se colocó
medio celular con 10% de suero o PBS 1X con 1% de suero. Para eliminar el suero
presente en la suspensión, ésta se centrifugó a 130 g y las células se resuspendieron en
medio BEMG precalentado a 37 °C.
Es necesario conocer la concentración de células en el medio tanto para realizar el pase
como para el mantenimiento, para ello se tomaron 9,9 mL de isotón más 100 L de cultivo
celular y se analizaron con un contador automático de células (Z2 Coulter particle count
and size analizer, Beckman coulter).
Una vez determinada la concentración celular, se generó una concentración aproximada
de 1x106 células/mL, las cuales se mantuvieron en un nuevo frasco de cultivo junto con 15
mL de medio de cultivo BEMB fresco precalentado a 37 °C.
Aproximadamente cada dos días se llevó a cabo el cambio de medio de cultivo y una vez
que el cultivo llega a la confluencia se tripsinizó para establecer nuevos cultivos o para
llevar a cabo los ensayos.
3.4. Nanopartículas de plata
Las nanopartículas de plata utilizadas en este estudio se compraron en la casa comercial
Sigma-Aldrich con número de producto 576832-SG y número de lote MKBG0262V. Estas
nanopartículas poseen un tamaño menor a 100 nm y se encuentran en forma de nano
polvo. Su peso molecular es de 107,87 gramos por mol (gr/mol).
3.4.1. Protocolo de dispersión de la nanoplata
Para realizar todos los ensayos (caracterización, toxicidad, genotoxicidad, ciclo celular y
apoptosis) es necesario llevar a cabo una buena dispersión de la nanoplata. En este
estudio se ha utilizado el protocolo "Nanogenotox" desarrollado dentro del proyecto
europeo del mismo nombre. Este método permite obtener un estado altamente disperso
de las nanopartículas. Para realizar la dispersión y las diferentes concentraciones de los
tratamientos el nanomaterial a ser utilizado (solución stock) debe tener una
concentración fija de 2,56 mg/mL, para lo cual se pesaron 15,36 mg de nanoplata pre
humedecida con 30 L de etanol absoluto. Posteriormente la nanoplata se dispersó en 6
mL de albúmina de suero bovino (BSA-agua al 0,05% w/v, Sigma Aldrich). La
homogenización de la dispersión se realizó por sonicación con el sonicador Branson Digital
Sonifier modelo S250-D equipado con una sonda de disrupción de 13 mm durante 16 min
a 400 W y 10% de amplitud, en un baño de hielo. Este protocolo asegura una dispersión
estable durante al menos una hora.
3.4.2. Caracterización de las nanopartículas de plata
La caracterización de las nanopartículas es necesaria para llevar a cabo cualquier ensayo
de toxicidad/genotoxicidad. Es necesario conocer algunas de las características como
tamaño y estado de dispersión de las nanopartículas ya que estas condiciones pueden
modificar las propiedades físico-químicas de las partículas, así como su interacción en el
medio celular (Asare et al., 2012).
La morfología y el tamaño de las nanopartículas en la dispersión stock se determinaron a
partir de microscopía electrónica de transmisión (TEM). Para lo cual, tras la sonicación de
la nanoplata se colocó una gota de la suspensión stock de la nanoplata en una rejilla de
cobre recubierta por carbono. Se dejó secar la gota en la rejilla durante varios minutos
antes de observarse en el microscopio (Hitachi H-700). La caracterización de las partículas
incluye forma, tamaño, distribución y tendencia a formar agregados.
2.5. Ensayos de toxicidad y de genotoxicidad
3.5.1. Ensayo de toxicidad
Los ensayos de toxicidad son un paso importante en los estudios de genotoxicidad ya que
estos nos dan información del porcentaje de células muertas y vivas en los tratamientos y
nos ayuda a ajustar los rangos de concentraciones a ensayar en los demás ensayos de
genotoxicidad. Para los ensayos de genotoxicidad, y en particular el del cometa, se
necesita que el porcentaje de supervivencia luego de los tratamientos sea de un 70%
como mínimo.
Para realizar el ensayo se sembraron 2 X 104 células por pocillo en una placa de 24 pocillos
y se incubaron durante 24 h. Para el tratamiento se utilizaron las concentraciones de 5,
10, 20, 50, 75, 100 y 200 g/mL de nanopartículas de plata previamente dispersa con el
protocolo de dispersión descrito anteriormente. Para el control negativo se utilizó H2O, y
como control positivo se utilizó 1,25 mM de bromato de potasio (KBrO3), los tratamientos
duraron 24 h.
Luego de las 24 h de incubación las células se lavaron con PBS y se tripsinizaron.
Posteriormente se transfirieron las células a tubos epperndorf, se centrifugaron y se
resuspendieron en 0,5 mL de PBS. Por último, las células se tiñeron con 0,5 mL de una
concentración de 4,5 g/mL de yoduro de propidio (Invitrogen, # de catalogo SF7949600),
el yoduro de propidio es un agente intercalante que se une al DNA insertándose entre las
bases y, cuando se excita con una longitud de onda de 488 nm, emite una fluorescencia
roja. El yoduro de propidio es impermeable a la membrana celular de tal forma que
permite distinguir entre células viables y muertas, ya que sólo las muertas emitirán
fluorescencia (Vermes et al., 1995).
Para el análisis se transfirieron 20 L de la suspensión celular teñida con yoduro de
propidio a una cámara de Neubauer y se realizó el contaje en un microscopio de
fluorescencia (Olympus BX50), distinguiendo las células vivas de las muertas gracias a que
éstas últimas presentan coloración roja o naranja. Se calculó el porcentaje de células vivas
y células muertas por concentración. Para este estudio se realizaron dos ensayos, cada
uno con su réplica. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS statistics v. 19
utilizando el test de Kruskal-Wallis para muestras independientes.
3.5.2. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo
Para este estudio se sembraron 2,5 X 105 células en placas de 6 pocillos, incubándose
durante 24 h. Éstas células se trataron con concentraciones de 5, 10, 50 y 100 g/mL de
nanopartículas de plata preparadas mediante el protocolo de dispersión anterior. Para el
control negativo se utilizó agua y para el control positivo se usaron las concentraciones de
50 y 100 mM de mitomicina-C (MMC). Las células tratadas se incubaron durante 24 h
luego del tratamiento. Posteriormente se tripsinizaron, lavaron con PBS, se recuperaron y
fijaron en etanol (70%) frio durante 24 h. Posterior a la fijación se eliminó el etanol y se
tiñeron las células con PBS + 40 g/mL de yoduro de propidio (Invitrogen, # de catalogo
SF7949600), y 0,1 mg/mL de RNAsa A ( Sigma-Aldrich, # de catálogo 12091-021).
El yoduro de propidio se utilizó para teñir el DNA de la célula y medir el contenido de DNA
durante el análisis del ciclo celular (Sánchez y Vargas, 2003). El ciclo celular se analizó a
través de citometría de flujo con el citómetro FACSCalibur Flow Cytometer (Becton
Dickinson Company). Los histogramas obtenidos se analizaron con el programa Flow Jo v.
7.2.5.
Para este estudio se realizaron un máximo de 7 réplicas y un mínimo de 4 réplicas,
dependiendo de la concentración. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS
Statistics v. 19 utilizando el test de Kruskal- Wallis para muestras independientes.
3.5.3. Análisis de apoptosis mediante citometría de flujo
La apoptosis se midió usando el kit Annexin-V-FLUOS Staining Kit de Roche (catalogo #
11988549001), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sembraron 2,5 X 105 células
en placas de 6 pocillos. Estas células se trataron con concentraciones de 5, 10, 50, 100 y
200 g/mL de nanopartículas de plata preparadas mediante el protocolo de dispersión
antes indicado. Para el control negativo se utilizó agua y para el control positivo se usaron
las concentraciones de 10 y 20 mM de camptotecina (CPT). Las células tratadas se
incubaron durante 24 h; posteriormente se tripsinizaron y se colectaron por
centrifugación. El pellet celular se lavó con PBS y se resuspendió en 100 L de tampón de
incubación (vial 3) más 2 L del reactivo Annexin-V-Fluos labeling (vial 1) y 2L de
solución de yoduro de propidio (vial 2). Se incubaron durante 10-15 min a 25 °C y se les
añadieron 500L de tampón de incubación.
La anexina se utiliza para identificar a las células apoptóticas. La anexina se une a la
fosfatidil serina, la cual se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática.
Cuando empieza el proceso de apoptosis la fosfatidil serina se transloca al exterior
uniéndose a la anexina (Sanchez y Vargas, 2003).
La tinción con yoduro de propidio nos permite diferenciar las células vivas de las
apoptóticas.
La apoptosis se analizó por citometría de flujo usando el citómetro FACSCalibur Flow
Cytometer (Becton Dickinson Company).
Se realizaron un total de cinco réplicas para cada concentración. El análisis estadístico se
realizó con el programa SPSS Statistics v. 19 con el test de Kruskal-Wallis para muestras
independientes.
3.5.4. Ensayo del cometa
Para llevar a cabo este ensayo se sembraron 2 X 104 células por pocillo en una placa de 24
pocillos y se incubaron durante 24 h. Estas células se trataron con concentraciones de 1,
10 y 100 g/mL de nanopartículas de plata. Para el control negativo se utilizó agua y para
el control positivo se utilizó bromato de potasio (KBrO3) a la concentración de 1,25 mM.
Las células tratadas se incubaron durante 24 h luego del tratamiento. Posteriormente, se
tripsinizaron y se pasaron a tubos eppendorfs. Se determinó la densidad celular en cada
tubo mediante el uso de la cámara de Neubauer. Se centrifugó cada tubo a 4 °C durante 8
min a 0,3 g, se eliminó el sobrenadante y se resuspendieron las células con PBS, ajustando
a una concentración aproximada de 500 células/L. Para poder analizar 100 células por
muestra se necesita partir aproximadamente de 17.800 células por muestra en 25 L de
agarosa.
Al inicio del experimento se preparó la agarosa de bajo punto de fusión al 0,75%, la cual se
diluyó en PBS con EDTA 10 mM ajustando a un pH de 7,4. La agarosa se depositó en una
superficie plástica (Gelbond®) que posee una cara hidrofílica para una fuerte adherencia
del gel de agarosa. Para cada Gelbond (GBF) se necesitan aproximadamente 2 mL. La
agarosa preparada se calentó a 60 °C y se colocó en un termobloque a 37 °C.
Se colocaron en el termobloque a 37 °C tubos eppendorfs de 0,2 mL, uno por tratamiento.
Se añadieron 225 L de agarosa y 25 L de la suspensión celular de cada tratamiento en el
tubo correspondiente. Se colocaron 3 gotas de 7 L de cada tratamiento en la primera
mitad del GBF, mientras que en la segunda mitad del mismo se colocó la réplica
respectiva. En total se utilizaron 3 GBF.
Se incubaron los 3 GBF en una bandeja con solución de lisis (20 mL de DMSO, 2 mL de
Tritón-X en 300 mL de una solución de 2,5 M NaCl; 0,1 M EDTA; 10 mM Tris y 1% lauril-
sarcosinato a pH 10) a 4 °C durante toda la noche.
Dos de los tres GBF se retiraron de la solución de lisis, y se realizó un primer lavado de 10
min con el tampón de enzima ( 0,04 M HEPES; 0,10 M KCl; 0,0005 M EDTA; 0,2 mg/mL BSA
ajustado a pH de 8) precalentado a 37 °C; posteriormente, se realizó un segundo lavado
de 50 min en el mismo tampón. El tercer GBF se utilizó para medir el daño basal, y se
mantuvo en la solución de lisis.
Uno de los dos GBF que se encontraban en el tampón de enzima se transfirió a un
tratamiento enzimático con enzima FPG (5 g/mL) (Sigma, # de producto F3174) disuelta
en 25 mL de tampón de enzima precalentado durante 30 min a 37 °C. La enzima FPG
(formamidopirimidina DNA glicosilasa) es una enzima que interviene en la reparación por
escisión de bases, la cual reconoce y remueve un amplio rango de purinas oxidadas del
DNA dañado (Karlsson, 2010).
Para detener la reacción se realizó un lavado de 5 min con solución de electroforesis (0,3
M NaOH; 0,001 M de EDTA a pH de 13,2) a 4 °C. Después, se realizó el tratamiento alcalino
colocando los 3 GBF en solución de electroforesis durante 35 min. Tras la incubación se
realizó la electroforesis a 20 V y 300 mA durante 20 min, asegurándose que la cámara de
electroforesis esté nivelada y que los GBF estén cubiertos por la solución.
Una vez finalizada la electroforesis se lavaron los GBF con PBS a 4 °C, y con agua durante
1 min.
Antes de fijar los GBF se les realizó un lavado con etanol absoluto 100% durante 5 min, y
luego se los dejó en un baño con el mismo compuesto durante 1 h. Posteriormente, se los
dejó secar en la oscuridad aproximadamente durante unas 2 h. Finalmente se marcaron
los carriles de los GBF con rotulador.
La tinción se realizó sumergiendo a los GBF durante 20 min en un recipiente que contenía
20 L de una solución stock congelada del fluorocromo SYBRGold (Invitrogen) disuelta en
25 mL de Tris-EDTA (10 mM Tris; 1 mM EDTA a pH 8,0) manteniéndolo en agitación
durante 20 min a 50 rpm (revoluciones por minuto). Posteriormente, se lavaron con agua
destilada y se dejaron secar.
Para llevar a cabo el análisis en el microscopio cada GBF se cortó en dos mitades, se los
colocó sobre el soporte para el microscopio y se los cubrió con un cubreobjetos.
El contaje se llevó a cabo con un microscopio de fluorescencia Olympus BX50 utilizándose
el programa Komet 5.5 200X. Se contaron 100 células por tratamiento y el parámetro
medido fue el porcentaje de DNA en la cola de los cometas. Para este estudio se
realizaron dos ensayos, cada uno con su réplica. El análisis estadístico se realizó con el
programa SPSS Statistics v. 19 con el test de Kruskal-Wallis para muestras independientes.
4. RESULTADOS
4.1. Caracterización de las nanopartículas de plata
Por medio de microscopía electrónica de trasmisión podemos observar los tamaños,
forma y agregación de las nanopartículas de plata dispersas en BSA-agua al 0,05%. Las
nanopartículas de plata observadas en su mayoría van de 20 nm a 50 nm. En las Figs. 1a
y 1b los puntos oscuros representan a partículas regulares de nanoplata, en las cuales
no se observa aglomeración entre ellas. En las Figs. 1c y 1d se observan nanopartículas
con formas irregulares y con un mayor tamaño. En estas figuras se observa un cierto
grado de aglomeración de las nanopartículas de plata.
A B
C D
Figura 1. Caracterización de la nanoplata a través de microscopía electrónica de transmisión de la solución stock de nanoplata (2,56 mg/mL) dispersa en 6 mL de BSA-agua al 0,05%.
4.2. Toxicidad
La toxicidad se midió utilizando las concentraciones de 5, 10, 20, 50, 75, 100 y 200 g/mL
de nanoplata luego de 24 h de tratamiento. Se contaron el total de células vivas y muertas
y el porcentaje de células vivas se utilizó para el análisis.
Tabla 1. Porcentaje de células vivas en las diferentes concentraciones de nanoplata (5-200 g/mL) luego de 24 h de tratamiento.
Tratamiento % de células vivas
Control - (agua) 96,62
5 g/mL nanoplata 93,76
10 g/mL nanoplata 95,92
20 g/mL nanoplata 94,95
50 g/mL nanoplata 93,15
75 g/mL nanoplata 76,46
100 g/mL nanoplata 77,77
200 g/mL nanoplata 75,89
Control + (1,25 mM KBrO3) 57,75
Como podemos observar en la Fig. 2, a partir de la concentración de 75 g/mL de
nanoplata se observa una disminución del porcentaje de células vivas, en comparación
con el control negativo. Este porcentaje de células vivas está dentro del rango admitido,
70% de células viables para llevar a cabo estudios de genotoxicidad. Por lo tanto, las
concentraciones usadas en el ensayo del cometa, análisis del ciclo celular y apoptosis van
de 5 a 200 g/mL de nanoplata.
Figura 2. Efectos de la nanoplata en la viabilidad. Células BEAS-2B se trataron con diferentes
concentraciones de nanoplata (5-200 g/mL) durante 24 h, como control positivo se utilizó 1,25 mM de KBrO3. Las células se tiñeron con yoduro de propidio para distinguir viables de muertas. Los datos se analizaron con el test de Kruskal-Wallis, el asterisco indica una diferencia estadística significativa comparando con los controles (P<0,05)
4.3. Análisis del ciclo celular
Una vez tratadas las células con nanoplata (5-100 g/mL) durante 24 h, las células
tripsinizadas y lavadas con PBS se fijaron con etanol y se tiñeron con yoduro de propidio
para medir el contenido de DNA durante el análisis del ciclo celular. El ciclo celular se
analizó por citometría de flujo.
0
20
40
60
80
100
120
Control- 5 10 20 50 75 100 200 Control +
% d
e c
élu
las
viva
s
Concentración g/mL
*
* *
*
*
*
Tabla 2. Porcentaje de células que se encuentran en cada fase del ciclo celular (G1,S y G2/M) después de los tratamientos con nanoplata a las 24 h de exposición.
Tratamiento
% de células en el ciclo celular
Control-
5 g/mL nanoplata
10 g/mL nanoplata
G1 S G2
42,96 41,41 42,51
31,33 30,65 30,99
18,73 20,16 20,13
50 g/mL nanoplata
100 g/mL nanoplata 50 mM MMC 100 mM MMC 300 mM MMC
44,67 44,81 33,77 27,57 21,11
27,81 27,40 26,27 30,17 26,26
20,79 22,00
30,93 35,71
48,25
En la Fig. 3 podemos observar los resultados de manera gráfica. Se observa que tanto en
el control negativo como en los diferentes tratamientos con nanoplata hay una mayor
población de células en la fase G1 comparada con las fases S y G2/M. Sin embargo, al
comparar entre el control negativo y las distintas concentraciones de nanoplata no existen
diferencias significativas entre las poblaciones de células que se encuentran en las fases
G1, S y G2/M. En esta línea celular se observa que al tratarse con mitomicina-C (MMC), a
concentraciones de 50, 100 y 300 mM, se observa una disminución significativa de la
población de células en la fase G1 y un incremento de la población de células en la fase
G2/M, en comparación con lo observado en el control negativo.
Figura 3. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata, 5-100 g/mL para estudiar su efecto en el ciclo celular. Como control positivo se utilizó la mitomicina-C, 50, 100 y 300 mM. No se observan diferencias significativas entre las poblaciones de células que se encuentran en las fases G1, S y G2/M de los distintos tratamientos con nanoplata comparados con el control negativo. La significación estadística se analizó mediante el test de Kruskal-Wallis. El asterisco indica una diferencia estadística significativa comparando con los controles (*P<0,05, **P<O,01).
4.4. Análisis de apoptosis
Luego del tratamiento de 24 h a concentraciones de 5, 10, 50, 100 y 200 g/mL de
nanoplata las células tripsinizadas se tiñeron con anexina V y yoduro de propidio para
evidenciar las células apoptóticas a través de citometría de flujo.
0
10
20
30
40
50
60
Control- 5 10 50 100 50 mM MMC
100 mM MMC
300 mM MMC
% d
e c
élu
las
Concentración g/mL
G1
S
G2
* *
** **
**
Tabla 3. Porcentaje de células que se encuentran en apoptosis después de los tratamientos con nanoplata
luego de 24 h de tratamiento.
Tratamiento % de células apoptóticas
Control -
5 g/mL nanoplata
10 g/mL nanoplata
50 g/mL nanoplata
100 g/mL nanoplata
200 g/mL nanoplata Control + CPT 10mM Control + CPT 20mM
10,59 9,38 9,95 8,55 9,74 9,13
30,96 27,21
Los resultados anteriores se visualizan en la Fig. 4 donde se puede evidenciar que no hay
un incremento significativo de la población de células apoptóticas en las diferentes
concentraciones de nanoplata, cuando se comparan los valores observados con los del
control negativo. Los controles positivos, camptotecina (CPT) a las concentraciones de 10
y 20 mM si producen incrementos significativos de la población de células apoptóticas en
la línea celular BEAS-2B.
Figura 4. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata, 5 - 200 g/mL, para estudiar su efecto en la apoptosis. Como control positivo se utilizó la camptotecina (CPT) a las concentraciones de 10 y 20 mM. El porcentaje de células apoptóticas es bajo y no se observan diferencias significativas entre las poblaciones de células apoptóticas de los distintos tratamientos comparados con el control negativo. Los valores se analizaron mediante el test de Kruskal-Wallis. El asterisco indica una diferencia estadística significativa comparando con los controles (*P<0,05).
4.5. Ensayo del cometa
El ensayo del cometa se llevó a cabo mediante tratamientos de 24 h con las
concentraciones de 1, 10 y 100 g/mL de nanoplata. El nivel del daño se midió en base al
porcentaje de DNA en la cola. En este ensayo hemos analizado el tanto el daño basal
como el daño oxidativo inducido por la nanoplata. Para medir el daño basal unicamente se
utilizó tampón de lisis para la incubación, mientras que para medir el daño oxidativo se
utilizó tampón de enzima y FPG.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Control - 5 10 50 100 200 Control+ CPT 10 mM
Control+ CPT 20 mM
% C
élu
las
apo
ptó
tica
s
Concentración g/mL
* *
4.5.1. Daño basal
El daño basal lo definimos como aquel que induce la nanoplata en ausencia de la enzima
FPG.
Luego del tratamiento de 24 h a concentraciones de 1, 10, y 100 g/mL de nanoplata las
células se embebieron en agarosa y se incubaron con tampón de lisis. Posteriormente, se
sometieron a electroforesis y para su visualización se tiñeron con SYBRGold.
En la tabla 4 podemos observar los porcentajes de DNA en la cola obtenidos con las
diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10 y 100 g/mL). Como se observa, ninguno
de estos tratamientos incrementa de manera significativa el porcentaje de DNA en la cola.
Tabla 4. Porcentaje de DNA en la cola producido luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e incubados con tampón de lisis.
Tratamiento % de DNA en la cola
Control- 6,5
1 g/mL nanoplata 7,43
10 g/mL nanoplata 7,45
100 g/mL nanoplata 6,98
Control+ (1,25 mM KBrO3) 7,73
Los valores del daño genotóxico también se evidencian en la Fig.5. Como se aprecia de manera
gráfica ninguna de las concentraciones de nanoplata parece inducir aumento en los niveles de
daño comparado con el control negativo. Tampoco se observan diferencias significativas en los
tratamientos con KBrO3, que es un agente seleccionado específicamente para inducir daño
oxidativo.
Figura 5. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata 1, 10, 100 g/mL, para analizar el daño basal provocado por la exposición a dichas concentraciones de nanoplata. Como control positivo se utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para el efecto genotóxico se toma como valor el porcentaje de DNA en la cola. No se observan diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola en los distintos tratamientos comparados con el control negativo. Los datos se analizaron por el test de Kruskal-Wallis.
4.5.2. Daño oxidativo
Para medir el daño provocado por el tampón de enzima, las células tratadas durante 24 h
con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, y 100 g/mL) se embebieron en
agarosa y se incubaron con tampón de enzima. Posteriormente, se sometieron a
electroforesis y se tiñeron con SYBRGold para su visualización.
En la tabla 5 podemos observar los porcentajes de DNA en la cola obtenidos tras los
tratamientos con distintas concentraciones de nanoplata e incubación con el tampón de
enzimas. Estos valores se utilizan como valores de referencia para comparar con los que
se obtienen cuando se utiliza la enzima FPG.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Control- 1 10 100 Control+
% d
e D
NA
en
la c
ola
Concentración g/mL
Tabla 5. Porcentaje de DNA en la cola producido luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e incubados con tampón de enzima.
Tratamiento % de DNA en la cola
Control- 7,93
1 g/mL nanoplata 8,02
10 g/mL nanoplata 7,87
100 g/mL nanoplata 8,12
Control+(1,25 mM KBrO3) 8,21
Los resultados obtenidos con la incubación con tampón de enzima se presenta de manera
gráfica en la Fig. 6, donde se observa claramente que no hay diferencias significativas
entre las diferentes concentraciones de nanoplata y el control negativo. El control positivo
KBrO3 tampoco muestra una diferencias significativas comparadas con el control negativo.
Estos resultados se asemejan a los obtenidos con tampón de lisis, indicando que el
tampón de enzimas no ejerce ningún tipo de efecto.
Figura 6. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, 100 g/mL), para analizar el efecto del tampón de enzima sobre el daño provocado por la exposición a estas concentraciones de nanoplata. Como control positivo se utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para determinar el efecto genotóxico se tomó como valor el porcentaje de DNA en la cola. No se observan diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola en los distintos tratamientos comparados con el control negativo. Los datos estadísticos se analizaron mediante el test de Kruskal-Wallis.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Control- 1 10 100 Control+
% d
e D
NA
en
la c
ola
Concentración g/mL
Para medir el daño oxidativo neto en las células, las células se sometieron a tratamientos
de 24 h a concentraciones de 1, 10, y 100 g/mL de nanoplata, estas células se
embebieron en agarosa y se incubaron con tampón de enzima junto con la enzima FPG,
posteriormente se sometieron a electroforesis y para su visualización se tiñeron con
SYBRGold.
Cuando los tratamientos se incubaron con la enzima FPG se obtuvieron los resultados
indicados en la Tabla 6, donde podemos observar el porcentaje de DNA en la cola luego
del tratamiento con la enzima FPG.
Tabla 6. Porcentaje de DNA en la cola producida luego de 24 h de exposición a los distintos tratamientos e
incubados con la enzima FPG.
Tratamiento % de DNA en la cola
Control- 3,29
1 g/mL nanoplata 2,23
10 g/mL nanoplata 3,36
100 g/mL nanoplata 4,33
Control+ 1,25 mM KBrO3 57,79
Como en los casos anteriores estos valores también se expresan de manera gráfica en la
Fig. 7. En donde podemos observar que ninguna de las concentraciones de nanoplata
producen un incremento significativo del daño oxidativo neto. Hay que remarcar que en el
control positivo (KBrO3) si se produce un incremento significativo del daño oxidativo, con
lo que comprobamos el potente efecto oxidante del KBrO3.
Fig 7. Las células BEAS-2B se trataron con diferentes concentraciones de nanoplata (1, 10, 100 g/mL) para analizar el daño oxidativo provocado por la exposición dichas concentraciones. Como control positivo se utilizó bromato de potasio (1,25 mM). Para determinar el efecto genotóxico se tomó el porcentaje de DNA en la cola. No se observan diferencias significativas entre el porcentaje de DNA de la cola en los distintos tratamientos de nanoplata comparados con el control negativo. El control positivo (KBrO3) muestra un efecto altamente significativo. Los valores se analizaron utilizando el test de Kruskal-Wallis. (**P<O,01).
0
10
20
30
40
50
60
70
Control- 1 10 100 Control+
% d
e D
NA
en
la c
ola
Concentración g/mL
**
5. DISCUSIÓN
Considerando las aplicaciones potenciales de la nanoplata en la vida diaria, las
nanopartículas de plata, por sus características, pueden entrar al cuerpo humano a través
de varias rutas como el tracto respiratorio, gastrointestinal, piel y sangre (Liu et al., 2010).
Por lo que se refiere a su exposición, ciertos estudios como los realizados por
Sohaebuddin et al. (2010) indican que dependiendo de la línea celular utilizada la
nanoplata induce respuestas específicas resultando en diferentes niveles de toxicidad.
Son varios los estudios que han evaluado la citotoxicidad de la nanoplata en diversos
sistemas celulares in vitro (Hackenberg et al., 2011), así como en sistemas in vivo
(Hackenberg et al., 2011), sin embargo, existe poca información acerca del potencial
genotóxico de la nanoplata.
Aunque algunos estudios sobre rutas de exposición sugieren que los pulmones son un
blanco fácil para las nanopartículas (Wijnhoven et al., 2009; Lee et al., 2011), pocos
estudios se han dirigido a analizar los posibles efectos tóxicos de la inhalación de
nanoplata. Además se conoce poco acerca de los mecanismos de citotoxicidad de la
nanoplata en células pulmonares in vitro. Es por esta razón que en este estudio hemos
utilizado la línea celular BEAS-2B que son células epiteliales bronquiales humanas para ver
el efecto de las nanopartículas de plata en distintos parámetros como la viabilidad celular,
el ciclo celular, la apoptosis y el daño en el DNA.
5.1. Caracterización de las nanopartículas de plata
El tamaño, forma y agregación se consideran propiedades importantes cuando se estudia
la toxicidad mediada por los nanomateriales (Foldbjerg et al., 2011) y, generalmente, el
tamaño se ha considerado como el factor más importante en la toxicidad de las
nanopartículas (Asare et al., 2012). Para determinar el tamaño, forma y agregación de las
nanopartículas utilizadas en este estudio, éstas se caracterizaron a través de microscopía
electrónica de transmisión. La nanoplata utilizada en nuestro estudio, dispersada en BSA-
agua al 0,05%, muestra una forma esférica con un tamaño aproximado de entre 30 y 50
nm, tamaño que concuerda con el indicado por el fabricante <100 nm. Además, hemos
podido evidenciar que la nanoplata forma agregados en la dispersión de BSA-agua (Fig.1c
y 1d), lo cual afecta al tamaño de las partículas. Sin embargo, estos agregados son
relativamente pequeños en relación con lo que se observa con otros nanomateriales y/o
utilizando otros protocolos de dispersión.
El uso de microscopia electrónica de transmisión nos brinda una información visual de la
distribución, pero no nos da conocimiento de cómo se aglomeran las partículas, o del
comportamiento de las mismas en condiciones fisiológicamente relevantes que puedan
afectar significativamente su agregación. Para resolver estas preguntas se deberían
realizar mediciones con DLS (Dynamic Light Scattering) (Foldbjerg et al., 2009), esta
técnica nos daría una mayor información acerca de cómo se aglomeran las nanopartículas
de plata en BSA-agua.
5.2. Ensayos de toxicidad
Los ensayos de toxicidad son pasos importantes cuando se quiere determinar la respuesta
celular a las sustancias tóxicas. Éstos proveen información sobre la muerte celular y la
supervivencia celular al tratamiento (AshaRani et al., 2009), además de que nos ayudan a
determinar el rango de concentraciones a utilizar en ensayos posteriores, incluidos los de
genotoxicidad. Para los ensayos de genotoxicidad, y cuando se utiliza el ensayo del
cometa, se requiere que el porcentaje de supervivencia de las células luego de los
tratamientos sea de un 70% como mínimo.
En las células tratadas en nuestro estudio (BEAS-2B) se observa que tras 24 h de
tratamiento la nanoplata incrementa la mortalidad de las células a partir de la
concentración de 75 l/mL. A partir de esta concentración la viabilidad disminuye hasta el
80% respecto a lo observado en el control; sin embargo, esta viabilidad no disminuye más
con el resto de concentraciones (100 y 200 g/mL).
En los estudios realizados por Eom y Choi (2010) analizaron la sensibilidad de distintas
líneas celulares a la nanoplata así como a iones de plata. Las distintas líneas utilizadas
Jurkat T, NCI-H460, HeLa, HepG2, MCF-7 y BEAS-2B muestran diferencias de
susceptibilidad entre sí, lo que indica la existencia de factores intrínsecos en cada línea
celular. En dicho estudio no se encontraron diferencias significativas en la disminución de
la viabilidad en células BEAS-2B, NCI-N460 y HeLa expuestas a concentraciones de 0,05,
0,10, 0,5 y 1 mg/L de nanoplata, mientras que las células MCF-7 y HepG2 muestran
decrecimientos de la viabilidad a concentraciones de 1 mg/L. En las células Jurkat T se
observó una disminución de la viabilidad en todas las concentraciones, revelando que esta
línea celular exhibe una alta sensibilidad a la nanoplata (Eom y Choi, 2010).
Esta variación de la sensibilidad de las células frente al estrés químico causado por los
tratamientos, incluyendo la exposición a nanopartículas, ha sido evidenciada con
frecuencia, sin embargo no se han dilucidado los mecanismos subyacentes (Eom y Choi.
2010).
5.3. Análisis del ciclo celular y de la apoptosis
Estudios previos han enfatizado el papel que juega el estrés oxidativo en la toxicidad de
las nanopartículas (Xia et al., 2006; AshaRani et al., 2009). Se asume que la toxicidad de las
nanopartículas actúa mediante la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y que
el nivel de ROS depende de la composición química y de la estructura de la nanopartícula.
El estrés oxidativo tiene efectos específicos en las células, incluyendo daño oxidativo a las
proteínas y al DNA.
El estrés oxidativo ocurre cuando la cantidad de ROS excede la capacidad del mecanismo
de defensa antioxidante (Hackenberg et al., 2011). Asharani et al. (2009) sugieren que la
disrupción de la cadena de respiración de la mitocondria por la nanoplata incrementa la
producción de especies de oxígeno reactivas y el daño al DNA puede ser consecuencia de
la interrupción de la síntesis de ATP. Estos autores indican que el estrés oxidativo
producido en células tratadas con nanoplata afectan a la progresión del ciclo celular. Así,
células con daño en el DNA se acumulan en la fase G1, síntesis (S) o en la fase G2/mitosis
(G2/M) del ciclo celular y, además, células con daño irreversible van a sufrir apoptosis
dando lugar a la acumulación de células en la fase sub G1 (AshaRani et al., 2009).
La fase G1 es importante en el ciclo celular porque las células crecen y preparan a los
cromosomas para su replicación. La detención en la fase S permite a las células reparar el
DNA dañado antes de entrar en mitosis; sin embargo, si el daño inducido es severo e
irreparable, o si los mecanismos de reparación fallan, las células derivan hacia apoptosis o
necrosis (Liu et at., 2010).
En estudios previos como los realizados por Lee et al. (2011) en células pulmonares A549,
AshaRani et al. (2009) en células de glioblastoma humano y fibroblastos humanos y por
Eom y Choi (2010) en células Jurkat T, [expuestas a nanopartículas de plata], todas estas
líneas celulares muestran una detención del ciclo celular en la fase G2/M con una
disminución de la población de células en la fase G1. Una detención del ciclo celular en la
fase G2/M o S y un decrecimiento en la fase G1 sugiere que las nanopartículas de plata
están causando un serio daño celular (Eom y Choi, 2010).
A pesar de estos resultados, nuestros estudios con la línea celular BEAS-2B tratadas con
nanopartículas de plata no revelan un decrecimiento de la fase G1, al compararla con el
control negativo, ni tampoco muestran una detención del ciclo celular en la fase G2/M.
Estos resultados pueden estar indicando una ausencia de daño en el DNA o posiblemente
esté ocurriendo una apoptosis temprana, o una resistencia específica de nuestra línea
celular.
Las células con un daño importante van a sufrir apoptosis, dando lugar a la acumulación
de DNA dañado. La apoptosis se ha descrito como el mayor mecanismo de muerte celular
en la exposición a nanopartículas, encontrándose que el incremento de los niveles
celulares de ROS está asociado a la inducción de muerte celular por apoptosis y necrosis
en cultivos celulares (Ott et al., 2007).
Cuando evaluamos el grado de apoptosis generado en nuestra línea celular, los datos del
experimento con anexina-V indican que las células BEAS-2B tratadas con nanopartículas
de plata no están sufriendo apoptosis ni necrosis.
De manera conjunta los datos obtenidos en el análisis del ciclo celular y de la apoptosis
nos indican que las nanopartículas de plata utilizadas en este estudio no están causando
un serio daño al DNA de nuestras células ya que en éstas no se provoca una detención del
ciclo celular en ninguna de las fases y tampoco hay la acumulación de DNA dañado que les
pudiese provocar apoptosis.
De acuerdo a estudios previos donde se menciona que el estrés oxidativo es el
mecanismo principal de la toxicidad de las nanopartículas a través del incremento en la
producción de ROS, podemos pensar que la nanoplata ensayada no provoca aumentos
significativos de ROS en BEAS-2B, o que tal vez BEAS-2B posee mecanismos celulares que
pueden estar contrarrestando este incremento de niveles de ROS, los cuales evitan que
haya daño oxidativo en las células.
Para probar si la nanoplata utilizada está provocando daño al DNA y en especial daño
oxidativo a las bases del DNA en BEAS-2B se realizó el ensayo del cometa.
5.4. Ensayo del cometa
Muchas nanopartículas han mostrado tener la capacidad directa o indirecta de inducir la
formación de ROS en estudios in vitro o in vivo. La generación de ROS tiene la capacidad
de atacar al DNA y generar roturas de simple cadena (SSBs), roturas de doble cadena
(DSBs), e inducción del daño oxidativo en las bases, entre otras lesiones al DNA, las cuales
se pueden detectar mediante el ensayo del cometa (Petersen y Nelson, 2010).
De acuerdo con los resultados obtenidos en el ensayo del cometa en la línea celular BEAS-
2B no parece existir un incremento en el daño basal ocasionado por la exposición a la
nanoplata; es decir, la nanoplata no produce un incremento de roturas de simple o doble
cadena en el DNA de nuestra línea celular. Asimismo al analizar el daño oxidativo
inducido en las bases con la enzima FPG se aprecia que no hay un incremento del daño
oxidativo en las distintas concentraciones de nanoplata; sin embargo, cuando se analiza el
daño provocado en el control positivo (KBrO3), el cual es un potente agente oxidante, si
que se evidencia daño oxidativo, lo que indica que nuestro estudio se llevó a cabo de
manera apropiada. Estos resultados nos indican que las nanopartículas utilizadas no están
generando daño oxidativo en el DNA de las células BEAS-2B bajo las condiciones en las
que hemos llevado a cabo el estudio.
En algunos estudios se ha demostrado el potencial genotóxico de la nanoplata como en el
realizado por AshaRani et al. (2009) en células de fibroblastos de pulmón humano (IMR -
90) y en células de glioblastoma (U251) expuestas a concentraciones de 25-400 g/mL de
nanopartículas de plata, en este estudio se evidencia un incremento al daño en el DNA a
dichas concentraciones, mediante el ensayo del cometa y mediante la técnica de
micronúcleos.
En otro estudio realizado por Li et al. (2012) en el cual se analizó el efecto de las
nanopartículas de plata en células linfoblastoides humanas TK6 a concentraciones de 10-
30g/mL de nanoplata mediante la técnica de micronúcleos, evidenciaron un incremento
en la frecuencia de micronúcleos en una manera dosis dependiente. Kawata et al. (2009)
también demostraron un incremento en la frecuencia de micronúcleos en células de
hepatoma humanas HepG2 expuestas a 1 mg/mL de nanopartículas de plata. Estos
resultados, evaluados con la técnica de micronúcleos, sugieren que las nanopartículas de
plata pueden estar causando un daño severo a los cromosomas.
En un estudio previo, de nuestro grupo, realizado en células BEAS-2B expuestas a
nanoplata, pero utilizando un protocolo de dispersión distinto al utilizado en este estudio
(dispersión en etilenglicol-10% agua), se observó un incremento en los niveles de daño
oxidativo en las concentraciones de 1-100 g/mL. Este hecho nos muestra que el método
de dispersión y el medio pueden jugar un papel importante en el nivel de daño al DNA
detectado por el ensayo del cometa ya que la dinámica de las nanopartículas dispersas y
su interacción con las células pueden cambiar, dependiendo de estos factores.
Otro factor importante es la línea celular elegida para los ensayos de genotoxicidad de
nanomateriales ya que se ha evidenciado que hay diferentes respuestas al daño en el DNA
dependiendo de la línea celular ensayada.
6. CONCLUSIONES Y FUTURO.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, podemos concluir que:
1. La nanoplata evaluada no muestra potencialidad genotóxica en las células BEAS-
2B al utilizar el ensayo del cometa.
2. Esta falta de genotoxicidad se asocia con una falta de alteración del ciclo celular y
la ausencia de apoptosis.
3. Según los resultados obtenidos con la enzima FPG la nanoplata no parece generar
especies reactivas de oxígeno, con lo cual no se estaría generando estrés oxidativo
en las células y por lo tanto el DNA no estaría siendo dañado.
FUTURO
Dada la trascendencia que el uso de la nanoplata puede tener en un futuro es necesario la
realización de más estudios para dilucidar los posibles mecanismos de toxicidad y
genotoxicidad de este nanomaterial.
Estudios que incluyan: a) efecto de distintos tamaños, b) capacidad de internalización en
la célula, c) efecto en función de la línea celular, entre otros, pueden ayudan a entender
mejor el posible riesgo asociado con la exposición a la nanoplata.
7. BIBLIOGRAFÍA.
Ahamed M., Karns M., Goodson M., Rowe J., Hussain S., Schalager J., Hong Y. 2008. DNA
damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in
mammalian cells. Toxicology and Applied Pharmacology 233: 404-410.
Akerman M., Chan W., Laakkonen P., Bhatia S., Ruoslahti E. 2002. Nanocrystal targeting in
vivo. Proccedings of the National Academy of Sciences USA 99: 12617-12621.
Ameisen J.C. 1996. The origen of programmed cell death. Science 1279: 272-278.
Asare A., Instanes C., Sandberg W., Refsnes M., Schwarse P., Kruszewski M., Bruborg G.
2012. Cytotoxic and genotoxic effects of silver nanoparticles in testicular cells.
Toxicology 291: 65-72.
AshaRani P.V., Kan Mun G., Hande M., Valiyaveettil S. 2009. Citotoxicity and genotoxicity
of silvernanoparticles in human cells. ACS Nano 3: 279-290.
Chen X., Schluesener H.J. 2008. Nano-silver: A nanoproduct in medical application.
Toxicological Letters 176: 1-12.
Eom H., Choi J. 2010. p38 MAPK activation, DNA damage, cell cycle arrest and apoptosis
as mechanisms of toxicity of silver nanoparticles in Jurkat T cells. Enviromental and
Science Technology 44: 8337-8342.
Foldberjerg R., Olesen P., Hougaard M., Dang D., Hoffmann H., Autrup H. 2009. PVP-
coated silver nanoparticles and silver ions induce reactive oxygen species,
apoptosis and necrosis in TPH-1 monocytes. Toxicology Letters 190: 156-162.
Foldberjerg R., Dang D., Autrup H. 2011. Cytotoxicity and genotoxicity of silver
nanoparticles in the human lung cancer cell line, A549. Archives of Toxicology 85:
743-750.
Galluzzi L., Chiarantini l., Pantucci E., Curci R., Merikhi J., Hummel H., Bachmann P.,
Manuali E., Pezzotti G., Magnani M. 2011. Development of a multilevel approach
for the evaluation of nanomaterials toxicity. Nanomedicine 7: 393-409.
Hackenberg S., Scherzed A., Kessler M., Hummel S., Technau A., Froelich K., Ginzkey C.,
Koehler C., Hagen R., Kleinsasser N. 2011. Siver nanoparticles: Evaluation of DNA
damage, toxicity and functional impairment in human mesenchymal stem cells.
Toxicology Letters 201: 27-33.
Karlsson H. 2010. The comet assay in nanotoxicology research. Analytical Bioanalisis
Chemistry 398: 651-666.
Kawata K., Osawa M., Okaba S. 2009. In vitro toxicity of silver nanoparticles at
noncytotoxic doses to HepG2 human hepatoma cells. Environmental and Science
Technology 43: 6046–6051.
Khanna K., Jackson S. 2001. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer
connection. Nature Genetics 27: 247–254.
Knaapen A., Seiler F., Schilderman P., Nehls P., Bruch J., Schins R., Borm P. 1999.
Neutrophils cause oxidative DNA damage in alveolar epithelial cells. Free Radical
Biological and Medicine 27: 234–240.
Lee Y., Kim D., Lee Y., Oh J., Yoon S., Choi M., Lee S., Kim J., Lee K., Song C. 2011. Silver
nanoparticles induce apoptosis and G2/M arrest via dependent signaling in
A549 lung cells. Archives of Toxicology 85: 1529-1540.
Li Y., Chen D., Yan J., Chen Y., Mittelstaedt R., Zhang Y., Biris A., Heflich R. 2012. Mutation
Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. Mutation Research
745: 4–10.
Liu W., Wu Y., Wang C., Li H., Wang T., Liao C., Cui L., Zhou Q., Yan B., Jiang G. 2010.
Impact of silver nanoparticles on human cells: Effect of particle size.
Nanotoxicology 4: 319-330.
McCloskey TW., Oyaizu N., Coronesi M., Pahwa S. 1994. Use a flow cytometric assay to
quantitate apoptosis in human lymphocytes. Clinical Immunology and
Immunopathology 71: 114-118.
Nel A., Xia T., Madler L., Li N. 2006. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science
311: 622-627.
Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci MC., Grignami F., Riccardi C. 1991. A rapid and a simple
method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow
cytometry. Journal of immunological Methods 139: 271-279.
O´Down C., Facchini M., Cavalli F., Ceburnis D., Mircea M., Decesari S., Fuzzi S., Jun Yoon
Y., Putaud J. 2004. Biogenically driven organic contribution to marine aerosol.
Nature 43: 676-680.
Oberdörster G., Oberdorster E., Oberdorster J. 2005a. Nanotoxicology: An emerging
discipline evolving from studies of ultrafine particles. Enviromental and Health
Perspectives 113: 823-839.ss
Oberdörster G., Maynard A., Donaldson K., Castranova V., Fitzpatrick J., Ausman K.,
Carter J., Karn B., Kreyling W., Lai D., Olin S., Monteiro-Riviere N., WarheitD., Yang
2005b. Principles for characterizing the potential human health effects from
exposure to nanomaterials: elements of a screening strategy. Particle and Fibre
Toxicology 2: 8.
Ott M., Gogvadze V., Orrenius S., Zhivotovsky B. 2007. Mitochondria, oxidative stress and
cell death. Apoptosis 12: 913-922.
Petersen E.J., Nelson B.C. 2010. Mechanisms and measurements of nanomaterial-induced
oxidative damage to DNA. Analytical and Bioanalytical Chemistry 398: 613–650.
Sánchez L., Vargas F. 2003. Apoptosis: el fenómeno y su determinación. Tecnología
Pecuaria Mexicana. 4: 49-62.
Singh N., Manshian B., Jenkins G., Griffiths S., Williams P., Maffeis T., Wright C., Doak S.
2009. Nanogenotoxicology: The DNA damaging potential of engineered
nanomaterial. Biomaterials 30: 3891-3914.
Sohaebuddin S., Thevenot P., Baker D., Eaton J., Tang L. 2010. Nanomaterial cytotoxicity is
composition, size, and cell type dependent. Particle and Fibre Toxicology 7: 22.
Vermes I., Haanen C., Steffens H., Reutlingsperger CPM. 1995. A novel assay for apoptosis
flow citometric detection of phosphatidyl serine expression on early apoptotic cells
using labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods 71: 14-18.
Wijnhoven S., Peijnenburg W., Herberts C., Hagens W., Oomen A., Heugens E., Roszek B.,
Bisschops J., Gosens I., Van De Meent D., Dekkers S., De Jong W., Van Zijverden M.,
Sios A., Geertsma R. 2009. Nano-silver a review of available data and knowledge
gaps in human and environmental risk assessment. Nanotoxicology 3: 109-138.
Woodrow Wilson International Centre for Scholars. 2011. Project on Emerging
Nanotechnologies. Consumer Products Inventory of Nanotechnology Products.
Accessed May 2012 from the website:
http://www.nanotechproject.org/inventories/consumer/.
Xia T., Li N., Nel A. 2009. Potential health impact of nanoparticles. Annual Review of
Public Health 30: 137–150.